Αφηρημένο

Σκοπός

αντίσταση του καρκίνου των ναρκωτικών είναι ένα μεγάλο εμπόδιο για την επιτυχία της χημειοθεραπείας. Δεδομένου ότι τα περισσότερα κλινικά αντικαρκινικά φάρμακα θα μπορούσαν να επάγουν αντοχή φαρμάκου, είναι επιθυμητή η ανάπτυξη υποψήφια φάρμακα τα οποία είναι πολύ αποτελεσματική, αλλά ανίκανος να επάγει αντίσταση στο φάρμακο. Πολυάριθμες προηγούμενες μελέτες έχουν αποδείξει ότι η shikonin και τα ανάλογά της, όχι μόνο είναι ιδιαίτερα ογκοκτόνο αλλά επίσης μπορεί να παρακάμψει τα ναρκωτικά μεταφορέα και αποπτωτικά μεσολάβηση ελάττωμα αντοχής φαρμάκου. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να διερευνηθεί εάν ή όχι shikonin είναι ένας ασθενής επαγωγέας της αντίστασης καρκίνου του φαρμάκου.

Πειραματικός Σχεδιασμός

Οι διαφορετικές κυτταρικές σειρές (Κ562, MCF-7, και μια κυτταρική γραμμή MDR Κ562 /ADR), μετά από επανειλημμένα αντιμετωπίζονται με shikonin για 18 μήνες, αναλύθηκαν για αντοχή στα φάρμακα και προφίλ γονιδιακής έκφρασης.

Αποτελέσματα

μετά την θεραπεία των 18 μηνών, τα κύτταρα αναπτύσσονται μόνο μια απλή 2- fold αντίσταση στην shikonin και οριακή αντοχή στην σισπλατίνη και πακλιταξέλη, χωρίς διασταυρούμενη αντοχή στη shikonin ανάλογα και άλλων αντικαρκινικών παραγόντων. προφίλ γονιδιακής έκφρασης έδειξε ότι τα καρκινικά κύτταρα δεν ανταποκρίνονται σε μεγάλο βαθμό στην shikonin θεραπεία, αλλά δεν κατάφερε να κινητοποιήσει αποτελεσματικά ανθεκτικά στα φάρμακα μηχανήματα. Shikonin επαγόμενη αδύναμη αντίσταση συνδέθηκε με την ανοδική ρύθμιση του βΙΙ-τουμπουλίνης, η οποία φυσικώς αλληλεπιδράσει με shikonin.

Συμπέρασμα

Στο σύνολό τους, εκτός από ισχυρή αντικαρκινική δραστηριότητα, shikonin και τα ανάλογά της είναι αδύναμη επαγωγείς της αντίστασης καρκίνου του φαρμάκου και μπορεί να παρακάμψει την αντίσταση φάρμακο για τον καρκίνο. Αυτά τα πλεονεκτήματα κάνουν shikonin και τα ανάλογά της εν δυνάμει υποψήφιες χώρες για τη θεραπεία του καρκίνου με τα πλεονεκτήματα της αποφυγής επαγωγή της ανθεκτικότητας στα φάρμακα και παρακάμπτοντας τα υπάρχοντα αντίστασης στα φάρμακα

Παράθεση:. Wu Η, Xie J, Παν Q, Γουάνγκ Β, Χου D, Χου X (2013) αντικαρκινικός παράγοντας shikonin Είναι μια ανίκανη επαγωγέας του Καρκίνου ανθεκτικότητας στα φάρμακα. PLoS ONE 8 (1): e52706. doi: 10.1371 /journal.pone.0052706

Επιμέλεια: Arun Ρίσι, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο Wayne, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 Ιουν του 2012? Αποδεκτές: 19 Νοέμβρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 3 Ιανουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Wu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό 863 του έργου (2007AA02Z143), έργα Κίνα Φυσικών Επιστημών Ίδρυμα (30772544, 81071802) και των Θεμελιωδών Κονδυλίων Έρευνας για τις Κεντρικές πανεπιστήμια, Υπουργείο Εθνικής Παιδείας, την Κίνα, για να X. Χου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

αντίσταση του καρκίνου των ναρκωτικών είναι μία από τις σημαντικότερες. εμπόδια παρεμβαίνει σημαντικά με την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας του καρκίνου. Cellular παράγοντες που συμβάλλουν στην αντοχή φαρμάκου περιλαμβάνουν: (1) φάρμακο μεταφορέα μεσολάβηση αυξημένη εκροή και μειωμένη εισροή των αντικαρκινικών φαρμάκων, (2) ενεργοποίηση της επιδιόρθωσης του DNA, (3) ενεργοποίηση του συστήματος αποτοξίνωσης, και (4) απέκλεισε την απόπτωση [1] , [2], [3], [4], [5], [6]. Όλα αυτά τα προβλήματα προκύπτουν ως αποτέλεσμα της προσαρμογής των καρκινικών κυττάρων »σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, δηλαδή, ο πρώην έχουν την ικανότητα να εξασθενήσει την διέγερση από την τελευταία. Έτσι, προκειμένου να λύσει το πρόβλημα, οι αντικαρκινικά φάρμακα τα οποία είναι τοξικά προς τα καρκινικά κύτταρα, αλλά ανίκανο να επάγει αντίσταση στο φάρμακο είναι επιθυμητό.

shikonin είναι ένα φυσικό ένωση ναφθοκινόνης, και το κύριο συστατικό του κόκκινου εκχυλισμάτων χρωστικής από

Lithospermiun erythrorhizon Sieb et Zucc

της Ανατολικής Ασίας. Shikonin και τα ανάλογά της είναι πιθανοί φαρμακευτικοί παράγοντες με αντικαρκινική δραστηριότητα καλά τεκμηριωμένη. Shikonin και τα ανάλογά της θα μπορούσαν να σκοτώνουν τα καρκινικά κύτταρα μέσω αναστολής της τοποϊσομεράσης-Ι [7], [8], [9], πόλο-όπως κινάση 1 (PLK1) και της πρωτεΐνης κινάση της τυροσίνης (ΡΤΚ) [10], [11], που ρυθμίζουν την δραστηριότητες φωσφορυλιωμένου εξωκυτταρικής ρυθμίζονται πρωτεϊνική κινάση (pERK), c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK), και πρωτεΐνη κινάση Ca (PKC-α) [12], καταστέλλοντας την έκφραση της πρωτεΐνης υποδοχέα που σχετίζεται με τον παράγοντα νέκρωσης όγκου 1 (TRAP1) [13], ενεργοποιώντας δραστηριότητες κασπάσης [14], [15], την αναστολή του πρωτεασώματος [16], μεταξύ άλλων. Sankawa

et al.

Διαπίστωσε ότι shikonin και μια σειρά απλών παραγώγων εντελώς ανάπτυξη ανέστειλε όγκου σε ποντικούς σε μία δόση 5-10 mg /kg /ημέρα [17], [18]. Η LD50 της shikonin και μερικά παράγωγα σε ποντικούς με χορήγηση intraperitonal κυμαινόταν από 20 mg /kg έως 48 mg /kg [19], [20]. Αξίζει να σημειωθεί ότι μια κλινική μελέτη έδειξε ότι shikonin μίγμα ήταν αποτελεσματική στην θεραπεία 19 ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα αργότερα στάδια που δεν ήταν κατάλληλα για χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία, χημειοθεραπεία και [21]. Έχουμε αναφερθεί ότι φυσικώς ενυπάρχουσα shikonin και τα ανάλογά της (Εικ. 1) θα μπορούσε να παρακάμψει τον καρκίνο αντίσταση φαρμάκων που επιτελείται από τους μεταφορείς ναρκωτικών P-γλυκοπρωτεΐνης (P-gp), πολυφαρμακευτική αντίσταση που σχετίζεται με πρωτεΐνη 1 (MRP1) και πρωτεΐνη αντίστασης καρκίνου του Μπρεστ (BCRP1 ), και με αντιαποπτωτικά πρωτεΐνες Bcl-2 και Bcl-xL, με επαγωγή necroptosis [22], [23], [24], [25], [26], ένα κυτταρικό θάνατο πρόσφατα ορίζονται και μελετηθεί σε βάθος από Degterev α και Yuan J [27], [28], [29]. Πρόσφατα, ταυτοποιήσαμε shikonin και τα ανάλογά του ήταν ισχυροί αναστολείς σε πυροσταφυλικό ισοένζυμο κινάσης Μ2 (PKM2) ή του όγκου Μ2-ΡΚ [30], το οποίο εκφράζει σχεδόν πανταχού παρούσες σε κύτταρα όγκου [31] και παίζει σημαντικό ρόλο στο μεταβολισμό των καρκινικών κυττάρων και ανάπτυξη [32 ], [33], [34]. Στο σύνολό τους, όλες αυτές οι γραμμές υποστήριξης αποδείξεων που shikonin και τα ανάλογά της είναι ισχυρές αντικαρκινικές ουσίες. Ωστόσο, τα στοιχεία δεν σημαίνει ότι shikonin και τα ανάλογά της δεν είναι σε θέση να επάγει αντίσταση στο φάρμακο. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι shikonin είναι ένας ασθενής επαγωγέας της αντίστασης καρκίνου του φαρμάκου.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

shikonin αγοράστηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο για την ελέγχου Φαρμακευτικών και Βιολογικών Προϊόντων (Πεκίνο, Κίνα) με καθαρότητα & gt? 99%. Η δοξορουβικίνη, πακλιταξέλη, βινκριστίνη, μεθοτρεξάτη, σισπλατίνη, δικουμαρόλη, και ΜΤΤ (3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich. Shikonin ανάλογα (Σχ. 1) αγοράστηκαν από την Tokyo Chemical Industry (TCI, Tokyo).

Οι κυτταρικές σειρές

Όλες οι κυτταρικές σειρές ελήφθησαν από και που χαρακτηρίζεται από το κύτταρο Bank of Type Culture Collection της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών, σύμφωνα με τη δοκιμή κυτταρικής σειράς γνησιότητας (ζωτικότητα, η επιβεβαίωση των ειδών και μεταξύ των ειδών μόλυνση, το DNA λήψη δακτυλικών αποτυπωμάτων και μόλυνσης από μυκόπλασμα). MCF-7 κυττάρων διατηρήθηκε σε DMEM που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). MCF-7 /ADR κύτταρο αναπτύχθηκε εντός RPMI 1640 που περιέχει 10% FBS και 1 μg /mL δοξορουβικίνη. Κ562 διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS. Κ562 /Adr κύτταρο αναπτύχθηκε σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS και 500 ng /ml δοξορουβικίνη.

Αντισώματα

Το κουνέλι πολυκλωνικό αντίσωμα α-τουμπουλίνης αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology, Inc. (Boston, ΜΑ). Mouse μονοκλωνικά αντισώματα για α-τουμπουλίνη, β-τουμπουλίνης II και β-τουμπουλίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Η β-τουμπουλίνης Ι, ΙΙΙ και IV Mouse μονοκλωνικά αντισώματα αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich. Ποντικού αντι-ακτίνης IgG αγοράστηκε από την Biomedical Technologies Inc (Stoughton, ΜΑ). Τα δευτερεύοντα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι συζευγμένο με HRP IgG αντι-ποντικού και συζευγμένο με HRP IgG αντι-κουνελιού (Santa Cruz Biotechnology, CA).

Δημιουργία MCF-7 /SHK, MCF-7 /SHK-ϋΟΧ, Κ562 /ΚΕΔΑ, Κ562 /ΚΕΔΑ-DOX και Κ562 /ADR /ΚΕΔΑ κυτταρικές σειρές

MCF-7 /ΚΕΔΑ προήλθε από επανειλημμένη έκθεση των MCF-7 και 4-6 μΜ shikonin. Εν συντομία, κύτταρα MCF-7 (1 χ 10

6) επωάστηκαν με shikonin (4 μΜ) για 4 ώρες, στη συνέχεια shikonin απομακρύνθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν σε πλήρες μέσο DMEM. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και πάλι αμέσως μετά την ανάπτυξη των κυττάρων ανακτήθηκε. Οι συνολικές κύκλους θεραπείας ήταν 25 με το χρονικό διάστημα των 18 μηνών. Ομοίως, Κ562 /ΚΕΔΑ και Κ562 /ADR /ΚΕΔΑ προήλθαν από επανειλημμένη έκθεση των Κ562 και MDR κυτταρική γραμμή Κ562 /Adr να shikonin.

MCF-7 /ΚΕΔΑ-DOX δημιουργήθηκε με εναλλακτική θεραπεία του shikonin (4 μΜ) και δοξορουβικίνη (250 ng /mL). Εν συντομία, τα κύτταρα κατ ‘αρχάς σε επεξεργασία με shikonin. Μετά ανακτήθηκε κυτταρική ανάπτυξη, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δοξορουβικίνη. Όταν τα κύτταρα επανέλαβε την ανάπτυξη, και πάλι τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με shikonin. Η χρονική περίοδος είναι 1,5 έτη, με 13 κύκλους θεραπείας. Ομοίως, Κ562 /ΚΕΔΑ-DOX αναπτύχθηκε από εναλλακτική θεραπεία της shikonin και δοξορουβικίνη.

Η ανάπτυξη των κυττάρων δοκιμασία αναστολής

Το φάρμακο που σχετίζονται με επίδραση της shikonin αναλόγων κατά των ναρκωτικών-ευαίσθητη και ανθεκτικών κυττάρων προσδιορίζεται με δοκιμασία ΜΤΤ όπως περιγράφεται [23]. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων (καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα για προσκολλημένα κύτταρα) και επεξεργάστηκε με shikonin αναλόγων σε σειριακές συγκεντρώσεις. Μετά από 72 ώρες επώασης, 20 μΙ ΜΤΤ (5 mg /ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο για άλλες 4 ώρες επώασης. Μετά από αυτό, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και 150 μΙ διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO, Sigma) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο για να διαλυτοποιηθούν τα μπλε-μωβ κρυστάλλους φορμαζάνης. Η απορρόφηση μετρήθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ELX800 Micro Plate Reader (Bio-Tek Instruments, Inc.) στα 570 nm. Ο ρυθμός αναστολής υπολογίστηκε σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: ρυθμός Αναστολή = (απορρόφηση του ελέγχου απορρόφησης της θεραπείας) /Απορρόφηση του ελέγχου × 100% [35]

Western blotting

δοκιμασία

Western. Κηλίδωση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται από εμάς προηγουμένως [22], [25]. Η πρωτεΐνη εφαρμόστηκε σε μια 12% πηκτή πολυακρυλαμιδίου SDS, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF, και στη συνέχεια ανιχνεύονται με την κατάλληλη πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα πριν από οπτικοποίηση EZ-ECL (Biological Industries, Israel). Φιλμ σαρώθηκε και πυκνομετρία προσδιορίστηκε με Ποσότητα Ένα λογισμικό (Bio-Rad Laboratories, CA).

Αναγνώριση της αλληλεπίδρασης μεταξύ shikonin και βΙΙ-τουμπουλίνης χρησιμοποιώντας στερεάς φάσης shikonin εκχύλιση σε συνδυασμό με Western Blot

shikonin στερεάς φάσης παρασκευάστηκε σύμφωνα με τα προηγούμενα αναφερθείσα μέθοδο μας [36]. Η διαδικασία για τον προσδιορισμό της αλληλεπίδρασης μεταξύ βΙΙ-τουμπουλίνης και στερεάς φάσης shikonin έχει ως εξής. Τα κύτταρα MCF-7 λύθηκαν στους 4 ° C για 0,5 ώρα με το αντιδραστήριο M-PER θηλαστικών Protein Extraction (Pierce βιοτεχνολογία, Rockford, IL) συν Ανάσχεση Κοκτέιλ Αναστολέα Πρωτεάσης (Pierce βιοτεχνολογία, Rockford, IL), που ακολουθείται από φυγοκέντρηση στις 13.000 rpm στους 4 ° C για 15 λεπτά. Το διαυγές υπερκείμενο συλλέχθηκε και το σφαιρίδιο απορρίφθηκε. Η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης στο υπερκείμενο προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ πρωτεΐνης BCA ποσοτικό προσδιορισμό (Pierce βιοτεχνολογία, Rockford, IL). 4 mg πρωτεΐνης αναμίχθηκε με 100 μΐ shikonin-συζευγμένου εποξυ-ενεργοποιημένη Sepharose 6Β-(GE Healthcare, Σουηδία) σε ένα συνολικό όγκο 300 μΙ. Το μίγμα επωάστηκε για 6 ώρες στους 4 ° C με σταθερή και ήπια ανάδευση. Το μίγμα περιστράφηκε στις 5000 σ.α.λ. για 5 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο απορρίφθηκε και το ίζημα πλύθηκε με παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης (50 mM Tris-HCl (ρΗ 7.0), 500 mM NaCl, 10% γλυκερόλη, 1 mM DTT, 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο) με ή χωρίς 1 mM shikonin με φυγοκέντρηση ( 5000 rpm για 5 λεπτά στους 4 ° C) για πέντε φορές. Το ίζημα αναμίχθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS-PAGE (Pierce βιοτεχνολογία, Rockford, IL) και έβρασε για 10 λεπτά. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοκηλίδωσης για βΙΙ-τουμπουλίνης.

Παρασκευή RNA για συστοιχίες γονίδιο

Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, και το ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας RNeasy κιτ (Qiagen, Germany). Η ποιότητα του ολικού RNA επαληθεύτηκε χρησιμοποιώντας ένα BioAnalyzer (Agilent, Santa Clara, CA). Δείγμα προετοιμασία, την επισήμανση και την υβριδοποίηση σε Ανθρώπινου Γονιδιώματος U133 Plus 2.0 Πίνακες (Affymetrix, Santa Clara, CA) διεξήχθησαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή σε ShanghaiBio Corporation (Σαγκάη, Κίνα). Οι πρώτες και επεξεργασία δεδομένων έχουν κατατεθεί στη γονιδιακή έκφραση Omnibus (GSE34298).

μικροσυστοιχιών ανάλυση των δεδομένων

Χρησιμοποιήσαμε το Affymetrix Human U133 Plus 2.0 μικροσυστοιχιών, η οποία ανακρίνει πάνω από 47.000 μεταγραφές, με μέσο όρο 27 ανιχνευτές ανά γονίδιο. πρωτογενή αρχεία Affymetrix [ένταση κυττάρων (CEL) αρχείων] για πρώτη φορά αναλύεται με Ανθεκτική multi-array Μέση (RMA) εξομάλυνση όπως εφαρμόζεται στην έκφραση Affymetrix Console λογισμικού (έκδοση 1.1) για να απομακρυνθούν μεταξύ συστοιχία εφέ και την τυποποίηση της χαμηλού επιπέδου δεδομένων [37]. Με σκοπό την ανίχνευση διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια, ανάλυση σημασία των μικροσυστοιχιών (SAM) αλγόριθμο [38] χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των τιμών-Q (ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη) για γονίδια στα ενδεικνυόμενα χρονικά σημεία. SAM έγινε με το εργαλείο λογισμικού του Ινστιτούτου για την έρευνα του γονιδιώματος (TIGR) MeV (https://www.tigr.org/software/tm4/mev.html) [39]. Είχαμε τρεις επαναλήψεις για κάθε κυτταρικές γραμμές. Ο κατάλογος των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων από κάθε χρονικό σημείο αναφέρεται ελήφθησαν με SAM με την πολλαπλή μεταβολή ≥1.75, και Q-values≤0.0015 σύγκριση με τον έλεγχο.

Gene Ontology ανάλυση (GO) εμπλουτισμός κατηγορία έγινε σε διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων με τη χρήση της διαθέσιμης στο κοινό λογισμικό DAVID (βάση δεδομένων για το σχολιασμό, την απεικόνιση και την Ολοκληρωμένη Discovery, https://david.abcc.ncifcrf.gov/, Bethesda, MD) με τις προεπιλεγμένες παραμέτρους [40]. Ο στόχος αυτής της ανάλυσης ήταν να αναζητήσετε όρους GO στην μοριακή λειτουργία, βιολογική διαδικασία, και κυτταρικό συστατικό που εμπλουτίζεται σημαντικά στις λίστες γονίδιο που λήφθηκε παραπάνω.

Η στατιστική ανάλυση

Εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά, δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD, και αναλύθηκαν με δοκιμή t δύο ουρών unpaired Student.

Αποτελέσματα

1. Χρονικό πλαίσιο για την ανάπτυξη sublines κυττάρων

Η παρατεταμένη έκθεση των καρκινικών κυττάρων σε αντικαρκινικά φάρμακα θα οδηγήσει στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας στα φάρμακα καρκίνου τελικά. Προηγουμένως, πολυάριθμες αναφορές κατέδειξαν ότι ο χρόνος που απαιτείται για την επαγωγή της ανθεκτικότητας στα φάρμακα με διαφορετικά φάρμακα συνήθως πήρε ημέρες έως μήνες (Πίνακας S1). Σε αυτή τη μελέτη, τα καρκινικά κύτταρα επανειλημμένα σε επεξεργασία με shikonin για χρονικό διάστημα 18 μηνών, η οποία ήταν επαρκώς μακρά εμπειρικά για επαγωγή αντίστασης φαρμάκου.

2. Shikonin επάγει οριακή αντοχή σε shikonin, σισπλατίνη, πακλιταξέλη και

Σε γενικές γραμμές, η αντίσταση που προκαλείται από shikonin είναι αδύναμη. Μετά από 18 μήνες θεραπείας με shikonin, MCF-7 /ΚΕΔΑ και Κ562 /ΚΕΔΑ έδειξε ένα 2-φορές ανθεκτικότητα στο shikonin αλλά καμία διασταυρούμενη αντοχή με τα ανάλογά της. MCF-7 /ΚΕΔΑ παρουσίασαν οριακή αντοχή σε πακλιταξέλη και σισπλατίνη, αλλά χωρίς εμφανή διασταυρούμενη αντοχή με άλλα συμβατικά αντικαρκινικά φάρμακα (Πίνακας 1 και 2).

Η

Επίσης, Κ562 /ΚΕΔΑ μόνο εκτίθενται οριακή αντοχή σε shikonin και σισπλατίνη, χωρίς διασταυρούμενη αντίσταση σε άλλες shikonin ανάλογα και άλλα συμβατικά αντικαρκινικά φάρμακα (Πίνακας 1 και 2).

Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν μια αδύναμη δραστικότητα της shikonin σε επαγωγή αντίστασης φάρμακο για τον καρκίνο.

3. Shikonin προκαλεί μια παγκόσμια αλλαγή της γονιδιακής έκφρασης προφίλ

Νομίζαμε ότι η αποτυχία να προκαλέσει ανθεκτικότητα στα φάρμακα από shikonin θα μπορούσε να οφείλεται στην ανεπαρκή αλληλεπίδραση μεταξύ καρκινικών κυττάρων και την ένωση. Για να αποκλειστεί αυτό το ενδεχόμενο, συγκρίναμε τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων shikonin επεξεργασμένα και τα κύτταρα ελέγχου, η οποία έδειξε μια παγκόσμια αλλαγή της γονιδιακής έκφρασης σε κύτταρα shikonin-αγωγή (Πίνακας S2), η οποία περιλαμβάνει όλες τις κυτταρικές διεργασίες όπως κατηγοριοποιούνται από τους όρους GO συμπεριλαμβανομένων, μεταξύ άλλων, (Πίνακας S3 και S4) του κυτταρικού κύκλου, του κυτταρικού θανάτου /επιβίωσης, το μεταβολισμό, την οργάνωση οργανίδιο, κίνηση κυττάρων,. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα καρκινικά κύτταρα απάντησε σε shikonin αλλά δεν κατάφερε να κινητοποιήσει αποτελεσματικά τα ανθεκτικά στα φάρμακα μηχανημάτων.

4. Shikonin επαγόμενη αντίσταση δεν συνδέεται με DT diaphroase

shikonin είναι δομικά παρόμοια με βιταμίνη Κ3. Τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να αναπτύξουν αντίσταση σε βιταμίνη Κ3 μέσω προς τα πάνω ρύθμιση του DT διαφοράση, η οποία μπορεί να αντιστραφεί με δικουμαρόλη, έναν αναστολέα προς το ένζυμο [41]. Εμείς δοκιμάζεται αν DT διαφοράση συμμετείχε στην αντίσταση στο φάρμακο shikonin επαγόμενη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι με την παρουσία ή απουσία δικουμαρόλη, δεν υπήρχε σημαντική μεταβολή της ευαισθησίας των MCF-7 /SHK προς shikonin, υποδεικνύοντας DT διαφοράση δεν παίζουν σημαντικό ρόλο στην αντίσταση shikonin (Σχ. 2).

MCF-7 και MCF-7 /SHK κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με shikonin παρουσία ή απουσία 20 μΜ δικουμαρόλη.

η

5. Shikonin επαγόμενη αντίσταση συνδέεται με βΙΙ-τουμπουλίνης

Δεδομένου ότι MCF-7 /SHK έδειξε μία ασθενή διασταυρούμενη αντοχή σε πακλιταξέλη και σισπλατίνη, και δεδομένου ότι η αντίσταση σε αυτούς τους 2 παράγοντες θα μπορούσε να συνδεθεί με αλλοιωμένη έκφραση της τουμπουλίνης [42 ], εξετάσαμε την έκφραση τουμπουλίνης και διαπίστωσε ότι MCF-7 /SHK είχαν αυξημένη έκφραση του βΙΙ-τουμπουλίνης (Σχήμα 3Α & amp?. Β).

(Α) Προσδιορισμός της κυτταρικής τουμπουλίνες με κηλίδα Western. (Β) Η πυκνομετρία του βΙΙ-τουμπουλίνης μπάντα σε κηλίδα Western (Τα δεδομένα είναι μέσες ± SD, η = 3). (C) Η ειδική δέσμευση του βΙΙ-τουμπουλίνης με shikonin στερεάς φάσης. MCF-7 και Κ562 υλικό κυτταρικής λύσεως επωάσθηκε με Sepharose 6Β ή shikonin-συζευγμένο Sepharose 6Β απουσία ή παρουσία ελεύθερων shikonin, που ακολουθείται από διεξοδική πλύση. Η ρητίνη στη συνέχεια αναμιγνύεται με ρυθμιστικό φόρτωσης, βραστά, και υποβλήθηκαν για Western Blot (για λεπτομέρειες, βλέπε Υλικά και Μέθοδοι).

Η

Τότε γιατί Κ562 /SHK δεν ήταν εγκάρσια ανθεκτικά στην πακλιταξέλη, αφού έδειξε επίσης μια προς τα πάνω ρυθμισμένη βΙΙ-τουμπουλίνης (Σχήμα 3Α & amp?. Β). Ίσως, κύτταρα από διαφορετικές προελεύσεις μπορούσε να ανταποκριθεί στα φάρμακα διαφορικά, π.χ., MCF-7 είναι ένας καρκίνος του μαστού κυτταρική γραμμή των οποίων η ανάπτυξη εξαρτάται από την προσκόλληση, έτσι ώστε ο ρόλος της τουμπουλίνης είναι προφανώς πιο σημαντικό για MCF-7 από ότι για Κ562, μία κυτταρική λευχαιμία γραμμή των οποίων η ανάπτυξη δεν εξαρτάται από την κατάσχεση.

Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι βΙΙ-τουμπουλίνης ήταν ο στόχος από shikonin. Για να το επικυρώσει, χρησιμοποιήσαμε στερεάς φάσης shikonin εξόρυξη συγγένειας της κυτταρικής πρωτεΐνης σε συνδυασμό με Western Blot. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι βΙΙ-τουμπουλίνης σε κυτταρικό λύμα MCF-7 και Κ562 δεσμεύονται με shikonin-συζευγμένο ρητίνη και απέδειξε τη φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ shikonin και βΙΙ-τουμπουλίνης (Σχ. 3C).

Τα αποτελέσματα εξήγησε το μηχανισμό της αντίσταση στην shikonin, αλλά όχι τη μη διασταυρούμενη αντοχή σε ανάλογά της. Ίσως, shikonin ανάλογα με διαφορετική ομάδα R (Εικ. 1) μπορεί να έχουν χαμηλότερη συγγένεια για να βΙΙ-τουμπουλίνης από shikonin, που μπορεί να κάνει η οριακή αντοχή ασήμαντη.

6. MDR κυτταρική γραμμή Κ562 /Adr επανειλημμένα εκτεθεί σε shikonin αναπτύσσεται αδύναμη αντίσταση σε αυτού του παράγοντα

Κ562 /Adr είναι μια κυτταρική γραμμή που αναπτύχθηκε από την επαναλαμβανόμενη έκθεση του Κ562 στη δοξορουβικίνη [43]. Η κυτταρική γραμμή χαρακτηρίζεται με υπερέκφραση της Ρ-gp και διασταυρούμενη ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά ανθρακυκλίνης, αλκαλοειδή Vinca, ταξάνες, και επιποδοφυλλοτοξίνες [43], [44], [45], [46], [47]. Αν και P-gp παίζει σημαντικό ρόλο στην αντοχή σε φάρμακα αυτή την κυτταρική σειρά, δεδομένου ότι η δοξορουβικίνη σκοτώνει τα καρκινικά κύτταρα μέσω παράγουν ελεύθερες ρίζες μέσω ποδηλασία κινόνης οξειδοαναγωγής, αναστέλλοντας DNA τοποϊσομεράσης, παρεμβαλλόμενα σε έλικα DNA, κλπ [48], αυτή η κυτταρική σειρά θα πρέπει να είναι προφανώς εξοπλισμένο με πολλαπλές γραμμές άμυνας εκτός από την P-gp κατά αντικαρκινικό φάρμακο. Από το Κ562 /Adr είναι πολύ πιο προσαρμοσμένη στο περιβάλλον του φαρμάκου από τη γονική κυττάρων Κ562 του, εμείς υποτίθεται ότι Κ562 /ADR θα μπορούσε να αναπτυχθεί ισχυρότερη και ταχύτερη αντίσταση στην shikonin και τα ανάλογά της, αν αυτή η αντίσταση θα μπορούσε να προκληθεί. Ωστόσο, μετά από μια θεραπεία 18 μηνών, Κ562 /ADR /ΚΕΔΑ, όπως Κ562 /ΚΕΔΑ, έδειξε μόνο ένα 2-φορές ανθεκτικότητα στο shikonin και καμία διασταυρούμενη αντοχή με τα ανάλογά της (Πίνακας 1), αν και Κ562 /ADR /ΚΕΔΑ διατηρείται μια διασταυρούμενη αντοχή σε πακλιταξέλη, δοξορουβικίνη, βινκριστίνη και, παρόμοια με γονική κυτταρική του (Πίνακας 2). Αυτά τα αποτελέσματα να ενισχύσει περαιτέρω την αντίληψη ότι shikonin είναι ανίκανη επαγωγέας της αντίστασης στα φάρμακα.

7. Κύτταρα εναλλακτικά σε επεξεργασία με shikonin και δοξορουβικίνη αναπτύσσουν αντίσταση σε δοξορουβικίνη, βινκριστίνη, και πακλιταξέλη, αλλά όχι shikonin και τα ανάλογά της

Υπάρχουν 2 πιθανές συνέπειες της επαγωγής φαρμακευτικής αντίστασης με τη συνδυασμένη κατεργασία κυττάρων με shikonin και δοξορουβικίνη. Πρώτον, δεδομένου ότι shikonin είναι ανίκανη να προκαλέσει ανθεκτικότητα στα φάρμακα, προσθέτοντας δοξορουβικίνη (ένας ισχυρός επαγωγέας της αντίστασης στα φάρμακα) σε διαδικασία αντίσταση που προκαλεί το φάρμακο ενδεχομένως θα βοηθούν τα κύτταρα να αποκτήσουν ισχυρότερη αντίσταση στην shikonin. Αντιστρόφως, εφόσον shikonin και δοξορουβικίνη σκοτώνουν τα καρκινικά κύτταρα με διακριτά μηχανισμό, η συνδυασμένη θεραπεία με αυτά τα φάρμακα μπορεί 2 αμοιβαία μείωση το μέγεθος της αντίστασης.

Για ένα 18-μηνών εναλλακτικά έκθεση σε shikonin και δοξορουβικίνη, MCF-7 /SHK-DOX και Κ562 /SHK-ϋΟΧ έδειξαν διασταυρούμενη αντίσταση σε πακλιταξέλη, δοξορουβικίνη, βινκριστίνη και, αλλά όχι να shikonin και τα ανάλογά της.

Η αντίσταση στην πακλιταξέλη, δοξορουβικίνη, βινκριστίνη και προφανώς επάγεται από δοξορουβικίνη, γιατί shikonin μόνη της δεν προκαλεί ανθεκτικότητα σε αυτά τα φάρμακα (Πίνακας 2), ενώ η δοξορουβικίνη είχε επιβεβαιωθεί ότι είναι ένας ισχυρός επαγωγέας της αντίστασης στα φάρμακα με πολλαπλούς μηχανισμούς [48].

Προφανώς, το μέγεθος της αντίστασης των MCF- 7 /SHK-DOX και Κ562 /SHK-Dox σε σύγκριση με το (2 κυτταρικές σειρές που προέρχονται από την έκθεση των κυττάρων στη δοξορουβικίνη μόνο) MCF-7 /ADR και Κ562 /Adr ήταν εντολές χαμηλότερη (Πίνακας 2). Κύτταρα είτε πάλλονται με υψηλή συγκέντρωση ή διατηρείται σε χαμηλή συγκέντρωση ντοξορουμπικίνη μόνο αναπτύσσονται γρήγορα και ισχυρή αντίσταση [49], [50], [51], [52], [53], η οποία θα μπορούσε να διαμεσολαβείται από την Ρ-gp, MRP1, DNA τοποϊσομεράσης ΙΙ, μεταξύ άλλων [48], [49], [50], [51], [52], [53]. Έτσι, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η εναλλακτική θεραπεία με shikonin και δοξορουβικίνη θα αμοιβαία μείωση του μεγέθους της ανθεκτικότητας στα φάρμακα.

Συζήτηση

Εν ολίγοις, shikonin και πιθανόν τα ανάλογά της είναι ανίκανοι επαγωγείς της ανθεκτικότητας στα φάρμακα. Διαφορετικές κυτταρικές σειρές (Κ562, MCF-7, και MDR κυττάρων Κ562 /Adr), υποβλήθηκε σε επεξεργασία με shikonin μόνο ανέπτυξαν μόνο περίπου 2-φορές αντοχή σε shikonin, σισπλατίνη, και η πακλιταξέλη, χωρίς διασταυρούμενη αντίσταση σε άλλες shikonin ανάλογα και αντικαρκινικά φάρμακα. Shikonin επαγόμενη αντίσταση συνδέθηκε με την ανοδική ρύθμιση του βΙΙ-τουμπουλίνης, η οποία ήταν ένας στόχος από shikonin. Σε συνδυασμό με τις προηγούμενες εκθέσεις μας που shikonin και τα ανάλογά της θα μπορούσαν να παρακάμψουν τη μεταφορά ναρκωτικών και την απόπτωση που συνδέονται αντίσταση φάρμακο για τον καρκίνο [23], [24], [25], [26], [54], αυτή η κατηγορία των σύνθετων χρήζει μεγαλύτερης προσοχής.

Η αντίσταση που προκαλείται από φάρμακο shikonin είναι ασήμαντο, εάν είναι γνωστοί αντικαρκινικοί παράγοντες που χρησιμοποιούνται σαν αναφορές. Σε γενικές γραμμές, υπάρχουν δύο βασικά κριτήρια για την αξιολόγηση της ικανότητας ενός φαρμάκου να επάγει αντίσταση στο φάρμακο του καρκίνου, ο χρόνος που απαιτείται για την εμφάνιση αντοχής μετά από έκθεση στο φάρμακο και το μέγεθος της αντίστασης στο φάρμακο και διασταυρούμενη αντοχή σε άλλα δομικά και λειτουργικά παρόμοια ή άσχετο φάρμακα. Αυτό συνήθως αξιολογείται από την έκθεση των κυτταρικών σειρών καρκίνου του να δοκιμαστεί φάρμακα. Έχει καλά τεκμηριωμένο ότι ισχυρή αντίσταση φαρμάκου μπορεί να προκαλείται από αντικαρκινικούς παράγοντες που καλύπτουν τις κατηγορίες πλατίνα, Vinca αλκαλοειδή, ανθρακυκλίνες, ταξάνες, αντιμεταβολική παράγοντες, παράγοντες αλκυλίωσης, αναστολείς τοποϊσομεράσης, αναστολείς κινάσης τυροσίνης, και ρετινοειδή (Πίνακας S1).

Ένα κρίσιμο σημείο είναι ο λόγος shikonin και τα ανάλογά της είναι ανίκανοι επαγωγέας της αντίστασης φάρμακο για τον καρκίνο. Η «άσχημη» χαρακτήρας της shikonin – στόχευση πολλαπλών σημαντικά μόρια – είναι ίσως το κλειδί για τη λύση αυτή. Έχει αποδειχθεί ότι η shikonin και τα ανάλογά της στοχευμένη μια πληθώρα σημαντικών μορίων συμπεριλαμβανομένων τοποϊσομεράσης-Ι [7], [8], [9], PLK1, ΡΤΚ [10], [11], pERK, JNK, και PKC-α [12], TRAP1 [13], κασπάσες [14], [15], του πρωτεασώματος [16], PKM2 [30], μεταξύ άλλων. Η δραστηριότητα ευρέος φάσματος των shikonin μπορεί να «μπερδεύουν» τα καρκινικά κύτταρα για να ανταποκριθεί σωστά στην διέγερση. μελέτη Απομαγνητοφώνηση προφίλ παρέχεται έμμεση απόδειξη για την προτεινόμενη έννοια (πίνακες S2, S3, S4). επεξεργασία shikonin έκανε να προκαλέσει μια παγκόσμια αλλαγή της γονιδιακής έκφρασης, αλλά η αλλαγή προφανώς δεν συμβάλλουν στην αντοχή, υποδεικνύοντας ότι τα καρκινικά κύτταρα, ενδεχομένως, «σύγχυση» για να λάβει μια απόφαση πώς να κινητοποιήσει σωστά άμυνα μηχανήματα στη διέγερση.

Εν ολίγοις, shikonin και τα ανάλογά της έχουν 3 ουσίας, δηλαδή, είναι ισχυρά αντικαρκινικά φάρμακα, ασθενής επαγωγέας της αντίστασης φάρμακο για τον καρκίνο, και μπορούν να παρακάμψουν μεταφορέα ναρκωτικών και αποπτωτικών μεσολάβηση ελάττωμα αντίστασης φάρμακο για τον καρκίνο. Επί της ουσίας υποδηλώνουν την πιθανή υποψηφιότητα αυτής της κατηγορίας χημικών ουσιών για τη θεραπεία του καρκίνου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

Αντικαρκινικό παράγοντες επάγουν ισχυρή αντίσταση των ναρκωτικών.

doi: 10.1371 /journal.pone.0052706.s001

(PDF)

Πίνακας S2.

Ο κατάλογος των σημαντικά γονιδίων που ρυθμίζονται σε Κ562 /ΚΕΔΑ κυττάρων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με shikonin για 18 μήνες, τα κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι

DOI:. 10.1371 /journal.pone.0052706.s002

(PDF)

Πίνακας S3.

Οι όροι κοινό γονίδιο οντολογίας μέχρι ρυθμιζόμενα γονίδια στα κύτταρα Κ562 /ΚΕΔΑ. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με shikonin για 18 μήνες, τα κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι

DOI:. 10.1371 /journal.pone.0052706.s003

(PDF)

Πίνακας S4.

Οι όροι οντολογίας κοινό γονίδιο κάτω ρυθμιζόμενα γονίδια στα κύτταρα Κ562 /ΚΕΔΑ. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με shikonin για 18 μήνες, τα κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι

DOI:. 10.1371 /journal.pone.0052706.s004

(PDF)