Αφηρημένο

Στόχος

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να διερευνήσει nanobubbles μεταφέρουν υποδοχέα ανδρογόνων (AR) και siRNA τους

in vitro

και

in vivo

αντι-καρκινικές επιδράσεις, όταν συνδυάζεται με υπερηχητική ακτινοβολία, επί μη εξαρτώμενου από ανδρογόνα καρκίνου του προστάτη (AIPC).

Υλικά και μέθοδοι

nanobubbles μεταφέρουν AR siRNA παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας πολυ-Ε-λυσίνη και ηλεκτροστατικές μέθοδοι απορρόφησης. Χρησιμοποιώντας τη δράση των κυττάρων C4-2 ως δείκτης δοκιμής, οι βέλτιστες παράμετροι ακτινοβολία (συμπεριλαμβανομένου του nanobubble αναλογία αριθμός /αριθμός κυττάρων, μηχανικό δείκτη [ΜΙ], και ο χρόνος ακτινοβόλησης) προσδιορίστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για επιμόλυνση των τριών καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές ανθρώπου (C4 -2, LNCaP, και PC-3 κύτταρα). Τα επίπεδα έκφρασης AR ερευνήθηκαν με RT-PCR και ανάλυση κηλίδας Western. Επιπλέον, τα αποτελέσματα των nanobubbles και μικροφυσαλίδες ελέγχου που ονομάζεται SonoVue αξιολογήθηκαν μέσω απεικόνισης σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος C4-2. Τέλος, η έκφραση της ανάπτυξης και AR των επτά ομάδων ιστών όγκου αξιολογήθηκαν με χρήση του μοντέλου ξενομοσχεύματος ποντικού C4-2.

Αποτελέσματα

Οι nanobubbles είχαν μέση διάμετρο 609,5 ± 15,6 nm και θα μπορούσε αποτελεσματικά συνδέονται με AR siRNA. Σύμφωνα με τις βελτιστοποιημένες συνθήκες αναλογία nanobubble αριθμό /κελί τον αριθμό των 100:1, ένα ΜΙ 1,2, και ένα χρόνο ακτινοβόλησης 2 λεπτά, τα υψηλότερα ποσοστά επιμόλυνσης με C4-2, LNCaP και PC-3 κύτταρα ήταν 67,4%, 74,0%, και 63,96%, αντίστοιχα. Στα κύτταρα C4-2 και LNCaP, η θεραπεία με αυτά τα δεσμευτικά nanobubbles συν ακτινοβολία υπερήχων ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων και είχε σαν αποτέλεσμα την καταστολή της AR mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης. Επιπλέον, αυξημένης αντίθεσης υπερήχων έδειξε ότι τα nanobubbles επιτευχθεί ισχυρότερα σήματα από τον έλεγχο SonoVue στην κεντρική περιοχή υποαγγειακές των όγκων. Τέλος, η αντικαρκινική δράση αυτών των nanobubbles συν ακτινοβολία υπερήχων ήταν πιο σημαντική στο μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες.

Συμπέρασμα

nanobubbles μεταφέρουν AR siRNA θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν δυνητικά ως γονίδιο φορείς σε συνδυασμό με υπερηχητική ακτινοβολία για τη θεραπεία της AIPC

Παράθεση:. Wang L, Zhang Μ, Tan Κ, Guo Υ, Tong η Fan Χ, et al. (2014) Προετοιμασία της nanobubbles μεταφοράς ανδρογόνων υποδοχέων siRNA και Ανασταλτικά τις επιπτώσεις τους στην ανδρογόνων-Ανεξάρτητη τον καρκίνο του προστάτη, όταν συνδυάζονται με ακτινοβολία υπερήχων. PLoS ONE 9 (5): e96586. doi: 10.1371 /journal.pone.0096586

Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Αυστρία

Ελήφθη: 23 Φεβρουαρίου 2014? Αποδεκτές: 9 Απρίλη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 5 Μαΐου του 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30970830) και βασικό έργο του Ιδρύματος Φυσικών Επιστημών της Chongqing City (cstc2012jjB0072). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

είναι καλά τεκμηριωμένο ότι ο καρκίνος του προστάτη εξαρτάται από ανδρογόνα [1]. Ως εκ τούτου, στέρησης ανδρογόνων υπήρξε η κύρια θεραπεία για τον προχωρημένο καρκίνο του προστάτη. Με αυτή τη θεραπεία, ωστόσο, η νόσος εξελίσσεται ταχέως σε ανεξάρτητο από ανδρογόνο καρκίνο του προστάτη (AIPC) στους περισσότερους ασθενείς [2], [3]. Επί του παρόντος, δεν υπάρχουν αποτελεσματική μακροπρόθεσμη θεραπείες για AIPC. Την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών για AIPC παραμένει ελκυστική, αλλά είναι ένα δύσκολο πρόβλημα στην κλινική ογκολογία. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η ανάπτυξη του AIPC εξαρτάται από τον υποδοχέα ανδρογόνων (AR). Έτσι, ο αποκλεισμός της έκφρασης AR έχει μεγάλες δυνατότητες για τη θεραπεία της AIPC [4].

Μελέτες έχουν δείξει ότι καταστολή της έκφρασης AR με τεχνολογία παρεμβολής RNA (RNAi) είναι ένας αποτελεσματικός τρόπος για να αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη, υποδεικνύοντας ότι αυτή η μέθοδος μπορεί να έχει τη δυνατότητα να ξεπεραστούν εμπόδια που σχετίζονται με τη θεραπεία AIPC [5]. Σε προηγούμενες μελέτες μας, AR δίκλωνο RNA (dsRNA) με υψηλή εξειδίκευση για γονίδια AR σχεδιάστηκε για να μπλοκάρουν την έκφραση του AR σε κύτταρα AIPC και να αναστέλλουν την κυτταρική ανάπτυξη [6]. Ωστόσο, αυτός ο τύπος προσέγγισης γονιδιακής θεραπείας είναι δύσκολο να εφαρμοστεί σε κλινικό περιβάλλον λόγω της χαμηλής απόδοσης γονίδιο διαμόλυνσης. Ένας από τους βασικούς λόγους για την χαμηλή αποδοτικότητα επιμόλυνσης είναι η έλλειψη ενός αποτελεσματικού, μη επεμβατική

in vivo

στοχευμένο σύστημα παροχής γονιδίου. Τα τελευταία χρόνια, έχουν υπέρηχος-φθαρτά μικροφυσαλίδες έχουν δειχθεί ότι είναι μια πολλά υποσχόμενη μέθοδος για γονιδιακή θεραπεία. Πράγματι, οι υπέρηχοι μεσολάβηση μικροφυσαλίδων καταστροφή μπορούν όχι μόνο να βελτιώσουν την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης του γονιδίου, αλλά μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την ιστο-ειδική παροχή θεραπευτικών παραγόντων [7], [8].

Με την ανάπτυξη της μοριακής απεικόνισης υπερήχων και νανοτεχνολογία, το μέγεθος των μικροφυσαλίδων συνεχίζει να μειώνεται, και μικρο σε μεγέθη νανο-κλίμακα είναι πλέον εφικτό. Nanobubbles προσφέρουν πολλά πλεονεκτήματα σε στοχευμένη γονιδιακή επιμόλυνση [9]. Για παράδειγμα, οι nanobubbles χαρακτηρίζονται από ισχυρή δύναμη διείσδυσης και σταθερή απόδοση, που τους επιτρέπουν να εισέλθουν ιστούς όγκου μέσω της αγγείωσης του όγκου [10]. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη, σε συνδυασμό τεχνολογίας RNAi με τη νανοτεχνολογία με την προετοιμασία nanobubbles μεταφέρουν AR μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA). Οι φυσικές ιδιότητες αυτών των φυσαλίδων στη συνέχεια αναλύθηκαν. Επιπλέον, οι έτοιμοι nanobubbles χρησιμοποιήθηκαν για την επιμόλυνση των κυττάρων siRNA AIPC μαζί με υπερηχητική επεξεργασία με ακτινοβολία για να προκληθεί η απελευθέρωση των μεταγραφών siRNA. Η

in vitro

αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης αξιολογηθεί συστηματικά. Επιπλέον, η αποτελεσματικότητα κατά του όγκου των nanobubbles αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μελέτες απεικόνισης και δοκιμασία αναστολής ανάπτυξης όγκου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου του προστάτη ποντικού. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ παρέχουν πειραματική υποστήριξη για τη χρήση των nanobubbles μεταφέρουν AR siRNA σε συνδυασμό με υπερηχητική ακτινοβολία ως πιθανή αποτελεσματική θεραπεία για AIPC.

Υλικά και Μέθοδοι

Σύνθεση AR siRNA

με βάση την προηγουμένως προσδιορισθείσα 19-bp αλληλουχίας στόχου του AR cDNA, AR siRNA συντέθηκε με τον σιγαστήρα siRNA κατασκευής Kit (Ambion, Austen City, USA) [6]. Cy3-επισημασμένο AR siRNA στη συνέχεια συντίθεται με τη χρήση του σιγαστήρα siRNA Cy3 Labeling Kit (Ambion) για μελέτες φθορισμού ανίχνευσης. Η συγκέντρωση του συντεθεί siRNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο, και τα siRNAs αραιώθηκαν σε 50 μΜ για χρήση σε αυτή τη μελέτη.

Παρασκευή nanobubbles μεταφέρουν AR siRNA και ο χαρακτηρισμός των φυσικών ιδιοτήτων τους

ένα εναιώρημα εκδόχων λιπιδίων, συμπεριλαμβανομένων διπαλμιτοϋλοφωσφατιδυλοχολίνη (DPPC), διπαλμιτοϋλφωσφατιδυλαιθανολαμίνη (DPPE), διπαλμιτοϋλοφωσφατιδικό οξύ (ϋΡΡΑ), και διπαλμιτοϋλοφωσφατιδυλογλυκερόλη (DPPG) (σε μια μοριακή αναλογία 90:2:5:3), παρασκευάστηκε σε πολυαιθυλενογλυκόλη (σε μια μοριακή αναλογία 94:6). Το αιώρημα κλασματοποιήθηκαν σε 1-ml φιαλίδια και λυοφιλοποιήθηκε. Τα λυοφιλοποιημένα εναιωρήματα επανυδατώθηκαν με 1 ml διαλύματος ενυδάτωσης με 50% γλυκόζη, προπυλενογλυκόλη και γλυκερίνη κατ ‘όγκο σε 8:01:01. Υπερφθοροπροπάνιο (C

3F

8) Στη συνέχεια προστέθηκε στα φιαλίδια για να αντικαταστήσει τον αέρα, και αμαλγάματος σειρά ST-B (AT & amp? Μ Βιοϋλικά Co. Ltd., Πεκίνο, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε για να προετοιμάσει το κενό nanobubbles με συχνότητα λειτουργίας μεγαλύτερη από 4.500 σ.α.λ. και χρόνο ταλάντωσης 90 s [11].

ένα πολυ-L-λυσίνη (PLL) διάλυμα (1 mg /ml) παρασκευάστηκε με στείρο διπλά αποσταγμένο νερό . Το διάλυμα PLL στη συνέχεια αναμίχθηκε με τα τυφλά nanobubbles σε (ν /ν) αναλογία 1:01 και επωάστηκαν στους 4 ° C για 30 λεπτά. Το μίγμα στη συνέχεια πλύθηκε δύο φορές με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS) για την απομάκρυνση τυχόν μη δεσμευμένου PLL. Cy3-επισημασμένο AR siRNA προστέθηκε σε αυτό το διάλυμα nanobubble σε αναλογία 1:01 (ν /ν), και το μίγμα επωάστηκε στους 4 ° C για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, 200 μΙ PBS προστέθηκε στο μίγμα nanobubble, και το εναιώρημα πλύθηκε με φυγοκέντρηση δύο φορές σε 600 rpm για 3 λεπτά για την απομάκρυνση τυχόν μη δεσμευμένου AR siRNA, μετά την οποία nanobubbles επισημασμένο με ελήφθησαν τόσο AR siRNA και PLL. Το διάλυμα nanobubble και το υδατικό διάλυμα που περιέχει τα μη δεσμευμένο siRNA στη συνέχεια έβρασε για 5 λεπτά, μετά την οποία μετρήθηκε η οπτική πυκνότητα στα 260 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο. Ο αριθμός των nanobubbles μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα αιμοκυτταρόμετρο [10]. Ο ακόλουθος τύπος χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί η ικανότητα φόρτωσης siRNA:

Το μέγεθος, η κατανομή, και ζήτα δυναμικό τόσο των κενό και παρασκευασμένα nanobubbles με AR siRNA μετρήθηκαν με έναν αναλυτή μεγέθους σωματιδίων Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments Ltd , Worcestershire, Ηνωμένο Βασίλειο). Το σχήμα και η διασπορά αυτών των nanobubbles Εξετάστηκαν επίσης χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού (Olympus LX71, η Olympus Corporation, Tokyo, Japan).

Κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας

Τρεις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, χρησιμοποιήθηκαν στις μελέτες διαμόλυνσης: LNCaP (εξαρτώμενων από ανδρογόνα κυττάρων με έκφραση AR, ATCC, Manassas, VA, USA), C4-2 (κύτταρα AIPC με έκφραση AR, ViroMed Laboratories Inc., Minnetonka, ΜΝ, USA), και PC-3 (χωρίς έκφραση AR, ATCC, Manassas, VA, USA). Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου σε ατμόσφαιρα 5% CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C. Ρουτίνας περάσματα διεξήχθησαν με θρυψίνη πέψη. Μία ημέρα πριν από τη θεραπεία με ακτινοβολία υπερήχων, όλα τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας σε μία συρροή 50%.

Βελτιστοποίηση των συνθηκών ακτινοβόληση για επιμόλυνση nanobubbles μεταφέρουν AR siRNA

Για να αποφευχθεί η μη ειδική αρνητικός επιπτώσεις στη δραστηριότητα των κυττάρων, το κατάλληλο εύρος συγκέντρωσης για τα κενά nanobubbles και μη καταστρεπτική συνθήκες ακτινοβολίας καθορίστηκαν πριν από τις

in vitro

πειράματα κυττάρων.

υπερήχων ακτινοβολία έγινε με το σύστημα υπερήχων PHILIPS iU22 ( Royal Dutch Philips Electronics Ltd, The Netherlands). Ο ανιχνευτής υπερήχων καθορίστηκε με ένα στήριγμα? η ακτινοβολούσα επιφάνεια αντιμετωπίζουν κατακόρυφα προς τα πάνω και καλύφθηκε ομοιόμορφα με υπερήχους γέλη σύζευξης? μια πλάκα 24 φρεατίων με 1.5 × 10

5 C4-2 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε κάθε φρεάτιο τοποθετείται οριζόντια στην ακτινοβολούσα επιφάνεια του καθετήρα για να εξασφαλιστεί ότι κάθε φρεάτιο ήταν εντελώς εκτεθειμένη στην πηγή ακτινοβολίας? Το εναιώρημα nanobubble προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επαρκώς αναμιγνύεται? και υπερηχητική ακτινοβολία διεξήχθη με παραλλαγές σε διάφορες παραμέτρους, μεταξύ των οποίων η συγκέντρωση του τυφλού nanobubbles (που αξιολογείται ως η αναλογία nanobubble αριθμός /αριθμός κυττάρων), το μηχανικό δείκτη (ΜΙ, μια αντανάκλαση της ενέργειας υπερήχου που υπολογίζεται διαιρώντας την αιχμή αρνητικής ακουστική πίεση από η τετραγωνική ρίζα της συχνότητας), και ο χρόνος ακτινοβόλησης. Πιο αναλυτικά, για να αξιολογήσει τον αντίκτυπο του τυφλού συγκέντρωσης nanobubble, έξι ομάδες ιδρύθηκαν με βάση την αναλογία αριθμός /αριθμός κυττάρων τους nanobubble, η οποία ήταν 0, 45:1, 90:1, 135:1, 180:1, ή ο έλεγχος ομάδα (φυσιολογικά κύτταρα χωρίς καμία επεξεργασία ως μάρτυρας)? η συχνότητα μετατροπέα ήταν 1,0-5,0 MHz, η διάρκεια ήταν 30 s, και ο ΜΙ ήταν 1,0. Ένα επιπλέον πέντε ομάδες καθορίστηκαν με ποικίλες εμφραγμάτων, δηλαδή, 0,1, 0,6, 1, 1,4, ή την ομάδα ελέγχου (φυσιολογικά κύτταρα χωρίς καμία επεξεργασία ως μάρτυρας)? η συχνότητα μετατροπέα ήταν 1.0-5.0 MHz, η διάρκεια ήταν 30 s, και ο nanobubble δείκτης /αριθμός κυττάρων ήταν 100:1. Πέντε ομάδες ιδρύθηκαν για να αξιολογήσει τον αντίκτυπο της διάρκειας, η οποία ήταν 10 s, 30 s, 1 λεπτό, 2 λεπτά, ή η ομάδα ελέγχου (φυσιολογικά κύτταρα χωρίς καμία επεξεργασία ως μάρτυρας)? η συχνότητα μετατροπέα ήταν 1.0-5.0 MHz, το ΜΙ ήταν 1,0, και ο nanobubble δείκτης /αριθμός κυττάρων ήταν 100:1. Μετά υπερηχητική ακτινοβολία, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες, και την ανάπτυξη των κυττάρων τους αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα όργανο μέτρησης του αίματος? οι μετρήσεις κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν ως δείκτης δοκιμής για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των παραμέτρων αυτών επί της δραστικότητας των κυττάρων. Όλες οι δοκιμασίες επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές, και μια σειρά από μη καταστρεπτική συνθηκών για

in vitro

ακτινοβολία υπερήχων προσδιορίστηκε.

δοκιμασίας αποτελεσματικότητας επιμόλυνσης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη

LNCaP , C4-2, και τα κύτταρα PC-3 σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα. Nanobubbles μεταφέρουν Cy3-επισημασμένο AR siRNA στη συνέχεια προστέθηκαν στα φρεάτια της κάθε πλάκας κυτταρικής καλλιέργειας και διαμολύνονται σε αυτές τις τρεις κυτταρικές γραμμές κάτω από το προκαθορισμένο εύρος του μη καταστροφική συνθήκες. Η αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης στη συνέχεια αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού. Το ποσοστό των φθοριζόντων κυττάρων (ρυθμός επιμόλυνση) προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Εν συντομία, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν μετά από πέψη με θρυψίνη για να δημιουργήσει ένα μονού κυτταρικού εναιωρήματος. Η κυτταρομετρία ροής (FACSCalibur, Becton Dickinson, NJ, USA) χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η ένταση του φθορισμού των κυττάρων 10000, και τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τη χρήση FlowJo 7,65 λογισμικού. Τα κύτταρα gated να υπολογιστεί το ποσοστό των επιμολυσμένων κυττάρων εντός του συνολικού κυτταρικού πληθυσμού, επιτρέποντας τον καθορισμό των βελτιστοποιημένων παραμέτρων για την επίτευξη του υψηλότερου αποτελεσματικότητα μορφομετατροπής. Όλες οι αναλύσεις επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Η ανάπτυξη των κυττάρων δοκιμασία αναστολής

Κάθε μία από τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη τρία διαιρέθηκε σε έξι ομάδες θεραπείας κύτταρο σύμφωνα με τα αντιδραστήρια και τις συνθήκες που χρησιμοποιούνται (Πίνακας 1). Όλες οι ομάδες επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας την προαναφερθείσα μέθοδο ακτινοβολίας υπερήχου υπό τις κατάλληλες παραμέτρους: συχνότητα 1,0-5,0 MHz, μηχανικό δείκτη (ΜΙ) 1,2, και η διάρκεια της έκθεσης σε Β-τρόπου υπέρηχο των 2 λεπτών. Η Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 (CCK-8) χρησιμοποιήθηκε καθημερινά από την πρώτη έως την έκτη ημέρα μετά την επιμόλυνση για την εκτίμηση της κυτταρικής ανάπτυξης. Κάθε ομάδα είχε 10 ισοδύναμα φρεάτια δοκιμών και 2 πηγάδια αρνητικό μάρτυρα. Οι τιμές απορρόφησης στα 450 nm [D (450 nm)] αναλύθηκαν με έναν αναγνώστη μικροπλάκας (Model 550, Bio-Rad, USA). Μια καμπύλη ανάπτυξης των κυττάρων ελήφθη με χρόνο (Χ-άξονας) έναντι της αντίστοιχης τιμής απορρόφησης (Υ-άξονας) γραφήματα, και ο ρυθμός αναστολής ανάπτυξης κυττάρου (IR) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο:

Η

Επιπλέον, η μορφολογία των κυττάρων 48 ώρες μετά την επιμόλυνση παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού.

επίπεδο έκφρασης Ανίχνευση AR mRNA με RT-PCR

κύτταρα

LNCaP και C4-2 επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας την προαναφερθείσα υπερήχων μέθοδος ακτινοβόλησης με τις παραπάνω παραμέτρους. Ολικό RNA εκχυλίστηκε από όλες τις ομάδες 48 ώρες μετά την ακτινοβολία υπερήχων. Μία ανάλυση RT-PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα RNA PCR Kit (AMV Ver. 3.0, Kyoto, Japan), και αφυδρογονάση φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης (GAPDH) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Οι αλληλουχίες των εκκινητών (5 ‘→ 3’) για AR ήταν AAG CCA TTG AGC CAG GTG TAG TG (ανάντη) και AAC CAG ATG ΑΓΓ GGC ΟΑΑ GTA GA (κατάντη), και οι ακολουθίες αλφαβητάρι για GAPDH ήταν ACC CAT CAC CAT CTT CCA GGA G (ανάντη) και GAA GGG GCG GAG ATG ATG AC (κατάντη). Αυτοί οι εκκινητές ενίσχυσαν ένα 275-bp AR και 159-bp GAPDH, αντίστοιχα. Οι συνθήκες αντίστροφης μεταγραφής ήταν 50 ° C για 30 λεπτά, 99 ° C για 5 λεπτά, και 5 ° C για 5 λεπτά. Οι συνθήκες PCR ήταν 94 ° C για 2 λεπτά? 32 κύκλοι των 94 ° C για 30 s, 57 ° C για 30 s, και 72 ° C για 1 λεπτό? και 72 ° C για 10 λεπτά. Τα προϊόντα RT-PCR φορτώθηκαν σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 2%. Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι ταινίες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Bio-Rad σύστημα απεικόνισης γέλης GelDoc 2000 (Bio-Rad, CA, USA) και πυκνομετρικά αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ (ΝΙΗ, https://rsb.info.nih.gov/ij/). Όλες οι αναλύσεις επαναλήφθηκαν πέντε φορές.

Ανίχνευση επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης AR με ανάλυση Western blot

LNCaP και C4-2 κύτταρα επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας την προαναφερθείσα μέθοδο υπερηχητικής ακτινοβόλησης με τις βελτιστοποιημένες παραμέτρους. Ολικής κυτταρικής πρωτεΐνης εκχυλίστηκε από όλες τις ομάδες χρησιμοποιώντας ένα ρυθμιστικό διάλυμα λύσης κυττάρου 48 ώρες μετά την ακτινοβολία υπερήχων. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμασία Bradford. Ένα κλάσμα 50-μg του κάθε κυτταρόλυμα διαχωρίστηκαν σε μια ηλεκτροφόρηση γέλης δωδεκυλο θειικού-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) γέλης νάτριο 12% και μεταφέρθηκε σε ένα φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα για 4 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού κατά της ανθρώπινης AR? Santa Cruz Biotechnology, California, USA) σε αραίωση 1:400 στους 37 ° C για 4 h. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλένονται με Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα /Τννεεη (TBST) ρυθμιστικό διάλυμα και επωάστηκαν με ένα δευτερεύον αντίσωμα (γίδινο αντι-ποντικού IgG? Zsjqbio, Πεκίνο, Κίνα) (1:1200 αραίωση) στους 37 ° C για 2 ώρες. Μια ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL) αντιδραστήριο στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των ζωνών πρωτεϊνών με έκθεση των κηλίδων σε αυτοραδιογραφική μεμβράνη. Μια ποσοτική ανάλυση εικόνας διεξήχθη χρησιμοποιώντας Ποσότητα One 4.52 λογισμικού (Bio-Rad). GAPDH χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση των δειγμάτων. Όλες οι αναλύσεις επαναλήφθηκαν πέντε φορές.

Απεικόνιση των nanobubbles μεταφέρουν AR siRNA σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού

Αυτή η μελέτη σε ζώα εγκρίθηκε από την Πρόνοια και την Επιτροπή Δεοντολογίας Εργαστήριο Ζώων του τρίτου Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο , Κίνα. Πέντε αρσενικά ποντίκια SCID που ζυγίζουν 22-25 g (ηλικίας 5-7 εβδομάδων) ήταν ξενομόσχευμα με 3 × 10

6 C4-2 καρκίνου του προστάτη κύτταρα σε 100 μΙ Matrigel (BD Biosciences, Βασιλεία, Ελβετία). Οι όγκοι αφέθηκαν να εδραιωθεί και να αναπτυχθεί σε διάμετρο 10-15 mm. Τα ζώα στη συνέχεια αναισθητοποιούνται με ενδοπεριτοναϊκή ένεση 100 μΐ 1% διαλύματος νατριούχου πεντοβαρβιτάλης και έπειτα ασφαλίζεται σε πρηνή θέση. Δύο-διαστάσεων υπέρηχο εικόνες των ξενομοσχευμένων όγκων αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα υπερήχων PHILIPS iU22. Nanobubbles μεταφέρουν AR siRNA στη συνέχεια χορηγήθηκαν στα ποντίκια μέσω ένεσης φλέβας της ουράς σε δόση 5 ml /kg σωματικού βάρους. Οι παράμετροι που χρησιμοποιούνται για τη λήψη των εικόνων υπερήχων ήταν ως εξής: συχνότητα καθετήρα = 5-12 MHz? ΜΙ = 0.4? και κέρδος = 70%. Ο ανιχνευτής ήταν σταθερή, και η αντίθεση ενισχυμένη δυναμικές εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό υπερηχογράφημα εργασίας. Micron μεγέθους mircrobubbles ονομάζεται SonoVue παράγοντα αντίθεσης (Bracco, Milan, Italy) χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας υπό τις ίδιες συνθήκες. Μια ποσοτική ανάλυση έγινε με τη χρήση της Philips QLab 8.1 του λογισμικού (Royal Dutch Philips Electronics Ltd, The Netherlands).

In vivo

ανάπτυξη του όγκου

δοκιμασία αναστολής

Αυτή η μελέτη σε ζώα εγκρίθηκε από την Πρόνοια και την Επιτροπή Δεοντολογίας Εργαστήριο ζώων του τρίτου Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Κίνα. Πενήντα έξι αρσενικούς SCID ποντικούς βάρους 22-25 g (ηλικίας 5-7 εβδομάδων) ήταν ξενομόσχευμα με 3 × 10

6 C4-2 κύτταρα σε 100 μΙ Matrigel. Η μελέτη σε ζώα εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας Ζώων της Κίνας Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου. Οι όγκοι αφέθηκαν να εδραιωθεί και να αυξηθεί σε διάμετρο 7-10 mm. Τα ζώα που φέρουν ξενομοσχεύματα όγκου στη συνέχεια διαιρέθηκαν τυχαία σε επτά ομάδες (οκτώ ζώα ανά ομάδα). Οι θεραπείες που χρησιμοποιούνται για τις Ομάδες 1-6 παρατίθενται στον Πίνακα 1. Ομάδα 7 χορηγήθηκε nanobubbles μεταφέρουν ανοησίες siRNA + ακτινοβολία υπερήχων. Πιο αναλυτικά, οι δόσεις των nanobubbles μεταφέρουν AR siRNA (περίπου 1,6 × 10

6 /μl), κενό nanobubbles, και αλατούχο διάλυμα ήταν 5 ml /kg σωματικού βάρους. Το γυμνό δοσολογία AR siRNA ήταν 100 μg ανά ποντίκι. Όλες οι nanobubbles, γυμνά AR siRNA, και αλατούχο διάλυμα χορηγήθηκαν ως ενδοφλέβιος βλωμός μέσω μιας φλέβας της ουράς. Οι ποντικοί στις Ομάδες 3-7 στη συνέχεια αναισθητοποιούνται με ισοφλουράνη και ασφαλίζεται σε πρηνή θέση. Αμέσως μετά την ένεση, εξετάστηκε το ξενομοσχεύματα όγκου χρησιμοποιώντας ένα σύστημα υπερήχων Philips iU22. Η διάχυση του nanobubbles εντός του όγκου οπτικοποιήθηκε σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας υπερήχους (5-12 MHz) σε χαμηλή ηχητική ισχύ (MI 0,4) για να ελαχιστοποιηθεί nanobubble καταστροφή. Μετά την οπτικοποίηση των nanobubbles εντός ενός όγκου, τα nanobubbles είχαν σκάσει με την αύξηση της ΜΙ έως 1.2 με συχνότητα 1-5 MHz. Ένα διάρκεια της έκθεσης υπερήχων των 30 λεπτών εφαρμόστηκε για να εξασφαλιστεί ότι όλα τα nanobubbles καταστράφηκαν. Κατά τη διάρκεια της θεραπείας, ο μετατροπέας εφαρμόστηκε σε μια κυκλική κίνηση για να εξασφαλιστεί ότι το σύνολο του ξενομοσχεύματος όγκου έλαβε έκθεση υπερήχων. Για όλα τα ζώα, η θεραπεία διεξήχθη τρεις φορές, μία φορά κάθε 3 δ (την ημέρα 0, ημέρα 3 και την ημέρα 6). Η μέγιστη διάμετρος (a, mm) και η μικρότερη διάμετρος (b, mm) κάθε όγκου μετρήθηκαν κάθε 3 d αρχίζει την πρώτη ημέρα της θεραπείας (ημέρα 0) και τελειώνει 21 ημέρες μετά την πρώτη θεραπεία (ημέρα 21). Ο όγκος του όγκου (TV) υπολογίστηκε σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: TV = 1/2 × a × b

2. Ο όγκος σχετική όγκου (RTV) υπολογίστηκε ακολούθως χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: RTV = TV

n /TV

0 × 100%, όπου τηλεόραση

n είναι ο όγκος του όγκου μετρήθηκε την ημέρα η και τηλεόραση

0 είναι ο όγκος του όγκου την ημέρα 0. η καμπύλη ανάπτυξης όγκου χαράσσεται με βάση το RTV. Την ημέρα 21, όλα τα ζώα θυσιάστηκαν, και οι όγκοι ασκήθηκαν και ζυγίστηκαν. Ο ρυθμός αναστολής της ανάπτυξης του όγκου (TGIR) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο:. TGIR = (1-TWT /TWC) χ 100%, όπου TWT και TWC είναι τα βάρη μέσες όγκων στις υπό θεραπεία και ελέγχου ομάδες, αντίστοιχα

Ανίχνευση της έκφρασης AR mRNA σε όγκους του προστάτη από qRT-PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από ιστούς όγκων, ακολουθώντας τις οδηγίες που παρέχονται με το SuperScript Vilo Kit RT-PCR Synthesis (Invitrogen). Η συγκέντρωση και η ακεραιότητα του RNA προσδιορίστηκαν με φασματοφωτομετρική ανάλυση στα Α260 και Α280. Περίπου 500 ng του συνολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με Superscript III (Invitrogen) με τη χρήση τυχαίων εκκινητών Ν6. Περίπου 2 μΐ cDNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας ενός σταδίου PCR πραγματικού χρόνου σε ένα FAST μηχανή Applied Biosystems 7500 με το πρότυπο πρόγραμμα. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του mRNA AR υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον τύπο, όπου.

Ανίχνευση επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης AR σε όγκους του προστάτη με ανάλυση Western blot

καρκινικό ιστό ξενομοσχεύματος ομογενοποιήθηκε με 1 ml ραδιοανοσοκαθίζησης δοκιμασίας (RIPA) ρυθμιστικό που περιέχει αναστολέα πρωτεάσης και φυγοκεντρείται σε 12.000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C, και το υπερκείμενο αποθηκεύθηκε στους -80 ° C. Η συνολική πρωτεΐνη διαχωρίστηκε σε πήκτωμα 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF στα 100 V για 50 λεπτά. Τα βήματα στυπώματος Western ήταν οι ίδιες με αυτές που περιγράφονται για την

in vitro

πείραμα.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Τα ποσοτικά δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± τυπική απόκλιση (± SD). Μία μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθούν τα μέσα πολλαπλές ομάδες (n & gt? 2). Ανεξάρτητα δείγματα t-tests χρησιμοποιήθηκαν για να συγκριθούν τα μέσα της κάθε ομάδας θεραπείας και της σχετικής ομάδας ελέγχου. Μια Ρ-τιμή (P) & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Φυσικές ιδιότητες των nanobubbles μεταφέρουν AR siRNA

Εικόνες που λαμβάνονται στο πλαίσιο μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου έδειξε ότι. οι nanobubbles ήταν ομοιογενές σε μέγεθος και κατανέμονται ομοιόμορφα χωρίς σημαντική συνάθροιση (Εικ. 1Α). Οι τακτικές nanobubbles παρατηρήθηκαν υπό ένα οπτικό μικροσκόπιο (1000 χ) (Εικ. 1 C). μικροσκόπιο φθορισμού επιβεβαίωσε ότι η προσέγγιση επισήμανση siRNA μας ήταν αποτελεσματική? μόνο nanobubbles συζευγμένο με Cy3-επισημασμένο AR siRNA εμφάνισαν ερυθρό φθορισμό (Εικ. 1Β), και όχι φθορισμός παρατηρήθηκε με τις τακτικές nanobubbles (Σχ. 1D). Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με ένα αναλυτή μεγέθους σωματιδίων έδειξε ότι οι nanobubbles είχαν μέση διάμετρο 609,5 ± 15,6 nm (εύρος, 269 να 1030 nm), και ζήτα δυναμικό τους ήταν -29,9 ± 6,6 mV. Οι κενές nanobubbles είχαν μέση διάμετρο 509,3 ± 45,19 nm (εύρος, 324 να 930 nm), και το δυναμικό ζήτα αυτών των φυσαλίδων ήταν -27,3 ± 6,4 mV. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, το ποσό του siRNA φορτωμένο αυξήθηκε με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Η μέση ικανότητα φόρτωσης AR siRNA των nanobubbles ήταν (18.94 ± 0.35) × 10

-9 nmol /nanobubble.

(Α) nanobubbles PLL κάτω από μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου. (Β) Εμφανή φθορισμός παρατηρήθηκε στις nanobubbles PLL. (C) Κενό nanobubbles υπό μικροσκοπία φωτεινού πεδίου. (D) αριθ φθορισμός παρατηρήθηκε στις κενό nanobubbles. Τα κόκκινα βέλη στις εικόνες δείχνουν nanobubbles (1.000 ×).

Η

Βέλτιστες συνθήκες ακτινοβολίας για την επιμόλυνση

Εικ. 3 δείχνει τις επιπτώσεις των διαφόρων παραμέτρων της υπερηχητικής ακτινοβολίας στην κυτταρική ανάπτυξη C4-2. Ένας όγκος nanobubbles μεγαλύτερη από 6 μΐ (ο nanobubble αναλογία αριθμού /κύτταρο ήταν 135:1) είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων (Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο) (σχήμα 3Α).. Μια MI μεγαλύτερη από 1.4 προκάλεσε επίσης σημαντική αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων (Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο) (σχήμα 3Β).. Παρ ‘όλα αυτά, η επίδραση του χρόνου ακτινοβολίας στην ανάπτυξη των κυττάρων βρέθηκε να είναι μάλλον χαμηλή? υπήρχαν σχεδόν καθόλου σημαντικές διαφορές στην ανάπτυξη των κυττάρων μεταξύ των ομάδων που έλαβαν θεραπεία με διαφορετικούς χρόνους ακτινοβολίας (Σχ. 3C). Έτσι, οι μη καταστροφική συνθήκες ακτινοβολίας έγιναν τελικά καθορίστηκε να είναι ένας αριθμός nanobubble /αριθμός κυττάρων αναλογία & lt? 135:1 (& lt? 6 μλ nanobubbles), ΜΙ & lt?. 1.4, και μια ακτινοβολία χρόνο ≤2 λεπτά

(Α) Η επίδραση της συγκέντρωσης nanobubble (με ΜΙ 1,0 και ένα χρόνο ακτινοβόλησης 30 s), U: εκτίθεται σε υπερήχους? (Β) η επίπτωση εμφράγματος του μυοκαρδίου, με nanobubble αναλογία αριθμός /αριθμός των κυττάρων του 100:1 και χρόνο ακτινοβόλησης 30 s? και (Γ) η επίδραση του χρόνου ακτινοβολίας, με ένα nanobubble αναλογία αριθμού /κύτταρο 100:1 και ένα ΜΙ 1.0. Τα κύτταρα μετρήθηκαν 24 ώρες μετά την ακτινοβολία υπερήχων. Όλες οι δοκιμασίες επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD (η = 3). Οι αστερίσκοι (*) αντιπροσωπεύουν το επίπεδο σημαντικότητας σε σύγκριση με τον έλεγχο (P & lt? 0,05)

Η

δοκιμασία αποτελεσματικότητας επιμόλυνσης σε κύτταρα καρκίνου προστάτη

Red φθορισμού

(ενδεικτική Cy3-επισημασμένο AR. siRNA) παρατηρήθηκε στα περισσότερα μέρη του κυτταροπλάσματος σε όλες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη τρία, αλλά δεν ανιχνεύθηκε στον πυρήνα (Εικ. 4). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η Cy3-επισημασμένο AR siRNA διαμολύνθηκε με επιτυχία. Τα ποσοστά των επιμολυσμένων κυττάρων σε αυτές τις κυτταρικές σειρές υπό διαφορετικές συνθήκες υπερηχητικής ακτινοβολίας παρουσιάζονται στον Πίνακα 2.

Red φθορισμό στο κυτόπλασμα δείχνει ότι η Cy3-επισημασμένο AR siRNA επιτυχώς επιμολυσμένα (400 × μεγέθυνση).

η

Όπως φαίνεται στον πίνακα 2, όταν nanobubbles μεταφέρουν AR siRNA χορηγήθηκε σε αναλογία nanobubble αριθμός /αριθμός κυττάρων 100:1 (5 μΙ nanobubbles), το ποσοστό των επιμολυσμένων κυττάρων αυξήθηκε μαζί με αυξήσεις στο ΜΙ και χρόνου ακτινοβολίας. Η υψηλότερη αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης επιτεύχθηκε με ΜΙ 1,2 και χρόνο ακτινοβολίας των 2 λεπτών. Ως εκ τούτου, οι βελτιστοποιημένες παράμετροι για την επίτευξη του υψηλότερου αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης ήταν ως ακολούθως: 5 μΐ nanobubbles, ένα ΜΙ από 1,2, και μία φορά ακτινοβόληση 2 min? η ακόλουθη

in vitro

δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση αυτών των παραμέτρων.

αναστολή ανάπτυξης κυττάρων

Η ανάλυση CCK-8 από την πρώτη έως την έκτη ημέρα μετά την επιμόλυνση έδειξε ότι η κυτταρική ανάπτυξη ανεστάλη στις Ομάδες 3, 5, και 6 των κυττάρων C4-2 και LNCaP (Εικ. 5Α και 5Β). Την έκτη ημέρα μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα C4-2 σε ομάδα 6 εμφανίζεται το υψηλότερο ποσοστό αναστολής της ανάπτυξης κατά 64,7%. Ωστόσο, σημαντική αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης παρατηρήθηκε στα κύτταρα PC-3, και ο ρυθμός αναστολής της ανάπτυξης στην ομάδα 6 ήταν μόλις 0,9% (Πίνακας 3).

σημαντική αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης παρατηρήθηκε στις ομάδες 3, 5, και 6 και για τις δύο κυτταρικές γραμμές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD (η = 10). Ομάδες 1-6 αντιπροσωπεύουν γυμνά AR siRNA + κενό nanobubbles, nanobubbles μεταφέρουν AR siRNA, γυμνά AR siRNA + ακτινοβολία υπερήχων, κενό nanobubbles + υπερηχητική ακτινοβολία, γυμνό siRNA AR + κενό nanobubbles + ακτινοβολία υπερήχων, και nanobubbles μεταφέρουν AR siRNA + υπερηχητική ακτινοβολία, αντίστοιχα .

η

επίπεδα έκφρασης AR mRNA προσδιορίστηκαν με RT-PCR

Τα αγαρόζης αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης γέλης μετά από RT-PCR φαίνεται στο Σχ. 6Α. Συγκροτήματα των 275 bp (AR) και 159 bp (GAPDH) παρατηρήθηκαν σε όλες τις ομάδες των δύο κυττάρων C4-2 και LNCaP. AR ζώνες δεν παρατηρήθηκαν σε κανένα από τα PC-3 ομάδες επειδή το PC-3 κύτταρα δεν εκφράζουν AR. Τα αποτελέσματα της ποσοτικής ανάλυσης (Σχ. 6Β) έδειξε ότι σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, η έκφραση του mRNA AR κατεστάλη σημαντικά σε ομάδες 3, 5, και 6 σε σύγκριση με το μάρτυρα (Ομάδα 1). Η υψηλότερη καταστολή επιτεύχθηκε στην ομάδα 6.

Οι λωρίδες 1-6 αντιπροσωπεύουν Ομάδες 1-6, αντίστοιχα (Ομάδα1: siRNA + NB, Group2: siRNA-NB, Group3: siRNA + ΗΠΑ, Group4: ΝΒ + ΗΠΑ , Ομάδα 5: siRNA + ΝΒ + ΗΠΑ, Group6: siRNA-ΝΒ + ΗΠΑ). Τα μεγέθη των δεικτών (λωρίδα Μ, από κάτω προς τα πάνω) είναι 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, και 450 bp. GAPDH χρησίμευσε ως εσωτερική αναφορά. Η υψηλότερη καταστολή της έκφρασης AR mRNA παρατηρήθηκε στην ομάδα 6. (Α) και (Β): Συγκροτήματα των προϊόντων RT-PCR και των αποτελεσμάτων του ποσοτικού προσδιορισμού εικόνας? τα δεδομένα στα ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν τα μέσα ± SD πέντε ανεξάρτητα πειράματα. (* P & lt? 0.05 και ** Ρ & lt? 0,01 vs. Ομάδα 1 C4-2 κύτταρα? # P & lt? 0,05 και ## Ρ & lt? 0,01 vs. Ομάδα κύτταρα LNCaP 1).

Η

Μετα-επιμόλυνση τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης AR προσδιορίστηκε με ανάλυση Western blot

Τα αποτελέσματα στυπώματος Western φαίνεται στο Σχ. 7. Η έκφραση πρωτεΐνης AR κατεστάλη σε ομάδες 3, 5, και 6 των κυττάρων C4-2 και LNCaP. Η μεγαλύτερη καταστολή παρατηρήθηκε στην ομάδα 6, η οποία ήταν σύμφωνη με τα αποτελέσματα RT-PCR

Οι λωρίδες 1-6 αντιπροσωπεύουν Ομάδες 1-6, αντίστοιχα (Ομάδα1:. SiRNA + NB, Group2: siRNA-NB, Group3 : siRNA + ΗΠΑ, Group4: ΝΒ + ΗΠΑ, Ομάδα 5: siRNA + NB ΗΠΑ +, Group6: siRNA-ΝΒ + ΗΠΑ). πρωτεΐνη GAPDH χρησίμευσε ως εσωτερική αναφορά. Η υψηλότερη καταστολή παρατηρήθηκε στην ομάδα 6. (Α) και (Β): Ανοσο-ταινίες και τα αποτελέσματα του ποσοτικού προσδιορισμού εικόνας? τα δεδομένα στα ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν τα μέσα ± SD πέντε ανεξάρτητα πειράματα. (* P & lt? 0.05 και ** Ρ & lt? 0,01 vs. Ομάδα 1 C4-2 κύτταρα? # P & lt? 0,05 και ## Ρ & lt? 0,01 vs. Ομάδα κύτταρα LNCaP 1).

Η

Απεικόνιση των nanobubbles μεταφέρουν AR siRNA στο C4-2 καρκίνο του προστάτη μοντέλο ξενομοσχεύματος

Αντίθεση ενισχυμένη δυναμικές εικόνες της nanobubbles μεταφέρουν AR siRNA φαίνεται στο Σχ. 8. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι nanobubbles επιτευχθεί ισχυρότερα σήματα από SonoVue στην κεντρική περιοχή υποαγγειακές των όγκων. Η ανάλυση των δεδομένων απεικόνισης (Πίνακας 4) έδειξε ότι αυτοί οι nanobubbles είχαν σημαντικές αυξήσεις στην ένταση κορυφής και απεικόνισης διάρκεια σε σύγκριση με τον έλεγχο SonoVue (Ρ & lt? 0,05). Στη γύρω περιοχή του όγκου, οι nanobubbles εμφανίζεται επίσης σημαντικά μεγαλύτερη απεικόνιση διάρκειες από SonoVue (P & lt? 0,05).

(α) ένα υπόδειγμα ξενομοσχεύματος όγκου?