Abstract

αναστολείς αποακετυλάσης ιστόνης (HDACIs) έχουν ισχυρή αντικαρκινική δράση σε μια ποικιλία μοντέλων καρκίνου. Η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στη θεραπευτική ανταπόκριση των HDACi είναι απαραίτητη πριν από την κλινική εφαρμογή της. Η παρούσα μελέτη στοχεύει να καθορίσει εάν ένας ισχυρός HDACi, LBH589 (Panobinostat), είχε διαφορική θεραπευτική ανταπόκριση προς κύτταρα PC-3 καρκίνου του προστάτη (PCA) LNCaP και. Ο πρώην έδειξε προμεταφασικά σύλληψη με επακόλουθη απόπτωση κατά την αγωγή LBH589, ενώ η τελευταία ήταν λιγότερο ευαίσθητη και είχε αργά σύλληψη G2. Η θεραπεία LBH589 κάτω-ρυθμίζονται HDAC6 και διαρκή ενεργοποίηση ERK, και συνέβαλε στην προμεταφασικά σύλληψη. Μηχανιστικά, LBH589 ανέστειλε δραστηριότητα HDAC6, προκάλεσε διαχωρισμό της από την πρωτεϊνική φωσφατάση PP1α, και αυξημένη 14-3-3ζ ακετυλίωση. Ακετυλιωμένο 14-3-3ζ κυκλοφόρησε μάσκα επίδρασή της στην σερίνη 259 του c-Raf και σερίνη 216 του Cdc25C μετά την απο-φωσφορυλίωση από PP1α, η οποία συνέβαλε στην ενεργοποίηση ERK. Ενισχυμένη δραστηριότητα ΕΚΚ από LBH589 πιο κάτω-ρυθμίζονται τα επίπεδα της πρωτεΐνης HDAC6 και παρατεταμένη ενεργοποίηση ERK από τις ελεύθερες προς τα εμπρός ρύθμιση. Η παρατεταμένη Cdc25C και ενεργοποίηση ERK οδήγησε σε πρώιμη φάση Μ (προμεταφασικά) σύλληψη και μετέπειτα απόπτωση στα πλέον ευαίσθητα κύτταρα LNCaP, αλλά όχι σε κύτταρα PC-3. Αυτή η μελέτη παρέχει προ-κλινικές ενδείξεις ότι HDAC6 μπορεί να χρησιμεύσει ως ευαίσθητη θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη με HDACi LBH589 για κλινική μετάφραση. Η μελέτη αυτή προϋποθέτει επίσης ένα νέο μηχανισμό συμμετοχής HDAC6 στη ρύθμιση του μονοπατιού σηματοδότησης c-Raf-ΡΡ1-ΕΚΚ και συμβάλλοντας στη Μ μετάβαση του κυτταρικού κύκλου φάσης

Παράθεση:. Chuang MJ, Wu ST, Tang SH, Lai XM, Lai HC, Hsu KH, et al. (2013) Η HDAC αναστολέα LBH589 Προκαλεί ERK-Εξαρτημένη προμεταφασικά σύλληψης για τον καρκίνο του προστάτη μέσω HDAC6 Απενεργοποίηση και ρύθμιση προς τα κάτω. PLoS ONE 8 (9): e73401. doi: 10.1371 /journal.pone.0073401

Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Αυστρία

Ελήφθη: 20 Φεβρουαρίου του 2013? Αποδεκτές: 19, Ιουλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 4 Σεπτέμβρη 2013

Copyright: © 2013 Chuang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο (97 – 2314-B-016-023-my3 και 99 με 2628-B-016-012-my3) και από την Tri-Service Γενικό Νοσοκομείο Ίδρυμα Ερευνών (TSGH-C101-009 -S02, TSGH-C100-128 και TSGH-C99-012-13-S03), Ταϊβάν, ROC. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η ταχεία ανάπτυξη των αναστολέων HDAC (HDACi) ως θεραπευτικοί παράγοντες καρκίνου έχει διακαώς εφαρμοστεί σε περισσότερες από 80 κλινικές δοκιμές [1]. Η κατανόηση των λεπτομερών μοριακών μηχανισμών πώς HDACi μεσολαβεί αντικαρκινική δράση είναι απαραίτητη, προκειμένου να διευκολυνθεί επιτυχώς κλινική μετάφραση. Καταστέλλει επιβίωση των καρκινικών κυττάρων μέσω διαφόρων μηχανισμών, συμπεριλαμβανομένης της παρεμπόδισης της αγγειογένεσης, αναστέλλοντας οδούς ενδοκυτταρική απόκριση στρες, αυξάνοντας την παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου, και επηρεάζοντας ενδοπλασματικό δίκτυο απόκριση στρες λόγω εξασθενημένη χειρισμό mis-διπλωμένα πρωτεΐνες [2-4]. Μεταξύ αυτών των δραστηριοτήτων αντικαρκινικά, HDACi μεσολάβηση G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου προκαλεί μία αύξηση στην έκφραση του γονιδίου ρ21 καταστολέα όγκου σε μεταγραφή με τρόπο που εξαρτάται [5]. Έχει επίσης δειχθεί ότι επάγει HDACi G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου μέσω ενός μονοπατιού μεταγραφής-ανεξάρτητος μέσω μειορύθμιση Aurora Α και κινάσες B [6-8]. Επιπλέον, HDACi πυροδοτεί μία αντίδραση σημείο ελέγχου G2 φάση σε φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα και ότι αυτή η απόκριση σημείου ελέγχου είναι ελαττωματική σε μια σειρά κυττάρων όγκου [9]. Ως εκ τούτου, με στόχο την αναστολή της G2 /M εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου είναι ένας πιο ευεργετική στρατηγική για να καταστείλει ειδικά την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων χωρίς να αναστέλλει τα φυσιολογικά κύτταρα.

Η επαγωγή της μίτωσης του κυτταρικού κύκλου ρυθμίζεται αυστηρά από συντονισμένη ενεργοποίηση και αδρανοποίηση των πολλαπλών κινασών πρωτεΐνης και φωσφατασών. Κατά την έναρξη της μίτωσης, Cdc25C (μια διπλή φωσφατάση) ενεργοποίηση είναι ένα κρίσιμο στάδιο για την ενεργοποίηση του συμπλόκου Cdc2 /κυκλίνη Β. Η ανασταλτική υπόλειμμα Ser216 για Cdc25C πρέπει να αποφωσφορυλιώνεται από ΡΡ1 προκειμένου να ενεργοποιηθεί Cdc25C [10,11]. Η πλήρης δραστικότητα του Cdc25C ρυθμίζεται από ERK κατά τη διέγερση από μιτογόνο κατά τη διάρκεια της G2 /M μετάπτωσης σε κύτταρα θηλαστικών [12]. ERK ανήκει στον καταρράκτη ΜΑΡΚ και δραστηριότητα της ελέγχεται από ανάντη σηματοδότηση Raf /MEK. Σε αδρανή κύτταρα, 14-3-3 συνδέεται με c-Raf μέσω φωσφορυλίωσης S259 και S621 και διατηρεί c-Raf αδρανοποίηση [13,14]. Όταν τα κύτταρα εισέρχονται στη μίτωση, η ΡΡ1 ή ΡΡ2Α μεσολάβηση αποφωσφορυλίωση S259 αποτελεί προϋπόθεση για την φωσφορυλίωση του S338 για c-Raf και περαιτέρω σκανδάλες c-Raf και την ενεργοποίηση ERK [15,16].

Αξιοσημείωτα, ΡΡ1 και δραστηριότητες ERK είναι απαραίτητες για την ενεργοποίηση Cdc25C κατά την έναρξη της μίτωσης, που ακολουθείται από μείωση δραστηριότητας ΕΚΚ κατά τη διάρκεια της μετάβασης φάσης Μ [12,17]. ΡΡ1 μπορεί να δεσμεύεται κατευθείαν στην καταλυτική υπομονάδα του C-τερματικού του HDAC6. Η αλληλεπίδραση του HDAC6 και ΡΡ1 μπορούν να διασπαστούν με αναστολή της δραστικότητας είτε HDAC6 ή ΡΡ1 [18]. HDAC6 είναι η κύρια αποακετυλάσης που είναι υπεύθυνο για απακετυλίωση των α-τουμπουλίνης και θερμικού σοκ πρωτεΐνη 90 (Hsp90) [19]. Ωστόσο, αν HDAC6 συμβάλλει στη ρύθμιση της G2 /M μετάβαση του κυτταρικού κύκλου παραμένει ασαφής.

LBH589 (Panobinostat), ένα HDACi, εμφανίζει τουλάχιστον δέκα φορές πιο ισχυρή ανασταλτική δράση ενάντια σε κάθε κλάσης I, II, και IV HDACs σε σύγκριση με SAHA (vorinostat) [20]. LBH589 διαθέτει ισχυρά αποτελέσματα αναστολής της ανάπτυξης σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων, αλλά με ποικίλες θεραπευτική αποτελεσματικότητα, η οποία μπορεί να αντιπροσωπεύει το δυναμικό αντίστασης ορισμένων τύπων καρκίνου και εμποδίζουν την κλινική μετάφραση του LBH589. Παρά το γεγονός ότι LBH589 προκαλεί G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου μέσω της υποβάθμισης των δύο Aurora Α και Β κινάσες [6,7], οι λεπτομερείς μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται, καθώς και τις πιθανές HDACs στόχο LBH589 παραμένει απροσδιόριστο.

Η παρούσα μελέτη χαρακτηριζόμενη δύο διαφορετικοί τύποι G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου που προκαλείται από LBH589 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. LBH589 όχι μόνο ανέστειλε HDAC6 και ενισχυμένη 14-3-3ζ ακετυλίωση, αλλά και εξαντλημένα HDAC6 να προκαλέσει την αποσύνδεση της PP1α από HDAC6. LBH589 ακολούθως παρενέβαινε στη ρύθμιση του μονοπατιού σηματοδότησης c-Raf-ΕΚΚ, συμβάλλοντας στην μετάβαση του κυτταρικού κύκλου φάση Μ. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη δείχνει ότι HDAC6 μπορεί να είναι ένα ευαίσθητο θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη χρησιμοποιώντας LBH589 για κλινική μετάφραση στο μέλλον.

Αποτελέσματα

επάγεται LBH589 G2 /M του κυτταρικού κύκλου σύλληψης και αναστολή της ανάπτυξης σε κύτταρα καρκίνου προστάτη μέσω διαφορετικών μηχανισμών

Ως αρχική προσπάθεια να διερευνηθεί η κυτταροτοξική δράση του LBH589, τέσσερις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, LNCaP, PC-3, DU-145 και 22Rv1, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις LBH589 και κυτταρική βιωσιμότητα μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Σε γενικές γραμμές, LBH589 έδειξαν ισχυρή επίδραση αναστολής της ανάπτυξης σε κάθε καρκινική κυτταρική γραμμή σε μια δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Μεταξύ των κυτταρικών γραμμών, LNCaP και PC-3 ήταν η πιο ευαίσθητη και ανθεκτική στη θεραπεία LBH589, αντίστοιχα (Σχήμα 1Α). Διερευνώντας τα προφίλ του κυτταρικού κύκλου μετά την έκθεση LBH589, θεραπεία LBH589 δεν προκάλεσε G2-M, αλλά όχι G1, διακοπή της ανάπτυξης στις καρκινικές κυτταρικές σειρές προστάτη τέσσερα για 24 ώρες (Εικόνα 1Β). LBH589 που προκαλείται G2-M αναστολή της ανάπτυξης ήταν περισσότερο εμφανής σε PC-3 και LNCaP. Παρά το γεγονός ότι LBH589 προκάλεσε συγκρίσιμο βαθμό G2-M σύλληψης σε LNCaP και PC-3 κύτταρα, η σημαντική διαφορά της απόπτωσης μεταξύ αυτών των δύο κυτταρικές σειρές κάτω από παρατεταμένη έκθεση LBH589 (Σχήμα 1C) πρότεινε ότι οι υποκείμενοι μηχανισμοί που εμπλέκονται μπορεί να είναι διαφορετική.

(Α) LBH589 είχε μια δοσο-εξαρτώμενη επίδραση στην αναστολή της ανάπτυξης σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη. Οι κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε αγωγή με 50, 75, 100, και 150 ηΜ LBH589. Η επιβίωση των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ΜΤΤ δοκιμασία όπως περιγράφεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι. Διαγράμματα σύγκριση του ποσοστού της αναστολής της ανάπτυξης για τον έλεγχο του οχήματος στα 24 (άνω) και 48 (κάτω) ώρες. (Β) LBH589 επάγεται G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Όλες οι κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με LBH589 ή όχημα ελέγχου για 24 ώρες. Οι κύκλοι των κυττάρων αναλύθηκαν με ΡΙ-βαφή και κυτομετρία ροής σύμφωνα με το περιεχόμενο DNA. Τα αυξημένα ποσοστά G2 κύτταρα /M συγκρίθηκαν με εκείνη του ελέγχου του οχήματος. (Γ) LBH589 επάγεται απόπτωση σε PC-3 και LNCaP κύτταρα. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 75 ηΜ LBH589 ή ελέγχου του οχήματος για 24 (άνω) και 48 (κάτω) h. Τα ποσοστά των αποπτωτικών κυττάρων αναλύθηκαν μετρώντας τον πληθυσμό του κατακερματισμού του DNA με κυτταρομετρία ροής. (D-Ε) HDACIs επάγεται Aurora αποικοδόμηση της κινάσης βρίσκονται σε PC-3 αλλά όχι σε LNCaP. κύτταρα PC-3 και LNCaP υπέστησαν κατεργασία με διαφορετικές HDACIs σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις LBH589, SAHA και SBHA για 24 ώρες και κυτταρολύματα αναλύθηκαν με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. (F) Προφίλ των πρωτεϊνών όσον αφορά την εξέλιξη της G2 /M του κυτταρικού κύκλου. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές δοσολογίες του LBH589 για 24 ώρες. Το προϊόν λύσης αναλύθηκε με κηλίδωση Western.

Η

Μια προηγούμενη μελέτη έχει δείξει LBH589 μεσολάβηση G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου μέσω μειορύθμιση Aurora Α και Β κινάσης σε νεφροκυτταρικό καρκίνωμα [6]. θεραπεία LBH589 αύξησε τα ίδια επίπεδα ιστόνης Η3 ακετυλίωση τόσο LNCaP και PC-3 κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι LBH589 ήταν λειτουργικό σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη. Ωστόσο, κάτω ρύθμιση Aurora Α και Β κινασών με LBH589 παρατηρήθηκε μόνο σε κύτταρα PC-3 αλλά όχι σε κύτταρα LNCaP (Σχήμα 1 D). Προκειμένου να διερευνηθεί κατά πόσον άλλα παράγωγα υδροξαμικού οξέος είχε παρόμοια αποτελέσματα επί LNCaP και PC-3 κύτταρα, δύο άλλα HDACIs, SAHA και SBHA, δοκιμάστηκαν και έδειξαν ότι η ρύθμιση προς τα κάτω των κινασών Aurora Α και Β μόνο συνέβη σε κύτταρα PC-3 αλλά όχι σε LNCaP (Σχήμα 1 Ε). Για την περαιτέρω αντιμετώπιση της απόκλισης μεταξύ LNCaP και κυττάρων υπό θεραπεία LBH589 3 PC-συγκρίθηκαν δύο μόρια μετάβαση G2-M Οάο2 και Cdc25C. LBH589 μειωμένη Cdc25C και φωσφορυλιωμένων επίπεδα Cdc2 σε PC-3 κύτταρα αλλά όχι σε κύτταρα LNCaP. LBH589 επάγεται επίσης ένα μοτίβο μετατόπισης ζώνης του Cdc25C σε κύτταρα LNCaP σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1 F).

επαγόμενη LBH589 ενεργοποίηση ERK και Cdc25C υπερ-φωσφορυλίωση

Οι μοριακοί μηχανισμοί συμμετέχουν στις διακριτές LBH589-προκαλούμενα αποτελέσματα μεταξύ των δύο κυττάρων του προστάτη ερευνήθηκαν. Οι οδοί σηματοδότησης εμπλέκονται σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση, συμπεριλαμβανομένης Akt και ρ38, δεν έδειξε σημαντική διαφορά μεταξύ LNCaP και PC-3 προστάτη κύτταρα (Σχήμα 2Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία LBH589 οδήγησε σε αυξημένη φωσφορυλίωση ERK μόνο σε κύτταρα LNCaP, όχι σε κύτταρα PC-3. Κάτω ρύθμιση της ιστόνης Η3 σερίνης 10 φωσφορυλίωση (ως δείκτης της φάσης-Μ) παρατηρήθηκε σε κύτταρα PC-3, αλλά όχι σε κύτταρα LNCaP (Σχήμα 2Α).

(Α) LBH589 επαγόμενη δραστικότητα ERK είναι επιλεκτικά ενεργοποιούνται σε LNCaP κυττάρων. κύτταρα PC-3 και LNCaP υπέστησαν αγωγή με 75 ηΜ LBH589 ή ελέγχου του οχήματος για 24 ώρες. Τα επίπεδα των πρωτεϊνών που αναφέρονται ανοσο-κηλιδώθηκαν κατά μεμονωμένων αντισωμάτων. GAPDH ήταν ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. (Β) δόση και το χρόνο που εξαρτάται από τους συσχετισμούς της ενεργοποίησης ERK LBH589 μεσολάβηση και Cdc25C υπερ-φωσφορυλίωση. LNCaP εκτέθηκε σε διάφορες συγκεντρώσεις LBH589 για 24 ώρες (αριστερά) ή 25 ηΜ LBH589 σε διαφορετικούς χρόνους (δεξιά). (C) Δόση εξαρτώμενη συσχέτιση του LBH589 επαγόμενης G2 /M σύλληψης. LNCaP υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις LBH589 για 24 ώρες. κυτταρικούς κύκλους αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (D) Cdc25C υπερ-φωσφορυλίωση επιβεβαιώθηκε με δοκιμή αποφωσφορυλίωσης. LNCaP υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 50 ηΜ LBH589 για 24 ώρες. Τα προϊόντα λύσης επωάστηκαν με φωσφατάση (CIP) ή σε συνδυασμό με αναστολέα της φωσφατάσης. Η υπερ-φωσφορυλιωμένη και αποφωσφορυλιωμένο Cdc25C αναλύθηκαν με ανοσοστύπωμα με αντίσωμα Cdc25C. (Ε) Cdc25C υπερ-φωσφορυλίωση κατεστάλη με αναστολείς ΜΕΚ. LNCaP υπέστησαν αγωγή με αναστολείς ΜΕΚ, PD (100 μΜ PD98059) ή UO (20 μΜ UO126) για 30 λεπτά. LBH589 Στη συνέχεια προστέθηκε στην καλλιέργεια μετά από 24 ώρες. δραστηριότητα ERK και Cdc25C υπερ-φωσφορυλίωσης αναλύθηκαν με Pi-ERK και Cdc25C αντισώματα σε στύπωμα Western.

Η

Επιπλέον, η θεραπεία LBH589 οδήγησε σε αυξημένη φωσφορυλίωση ERK και μετατόπισης ζώνης του Cdc25C σε μια δόση και το χρονικό εξαρτώμενο τρόπο σε LNCaP κύτταρα (Σχ. 2Β), η οποία συσχετίζεται με την αύξηση του πληθυσμού των G2 /M φάση κύτταρο (Σχ. 2C). Για να διερευνήσουν κατά πόσον η μετατόπιση ζώνης του Cdc25C εκπροσωπούνται υπερ-φωσφορυλίωση υπό θεραπεία LBH589, το επεξεργασμένο λύμα LBH589 LNCaP υποβλήθηκε σε επεξεργασία με CIP (φωσφατάση) μόνο, ή σε συνδυασμό, που έλαβαν θεραπεία με έναν αναστολέα της φωσφατάσης. Η μετατόπιση ζώνης του Cdc25C που προκαλείται από LBH589 αφαιρέθηκε από το CIP, αλλά αναστηλώθηκε από τον αναστολέα φωσφατάσης (Σχήμα 2D), υποδεικνύοντας Cdc25C υπερ-φωσφορυλίωση.

Περαιτέρω διερεύνηση της συσχέτισης μεταξύ της ενεργοποίησης ERK και Cdc25C υπερ-φωσφορυλίωση της κύτταρα υπό θεραπεία LBH589, η Cdc25C υπερ-φωσφορυλίωση που προκαλείται από LBH589 έχει αποκλειστεί από αναστολείς ΜΕΚ U0126 και PD98059 στα κύτταρα LNCaP. Αυτό έδειξε ότι Cdc25C υπερ-φωσφορυλίωσης ήταν ένας μεταγενέστερος περίπτωση ενεργοποίησης ERK LBH589 επαγόμενης (Σχήμα 2Ε).

LBH589 επαγόμενη G2 ή Μ φάση σύλληψης και ERK ενεργοποίηση και συνέβαλαν στην προμεταφασικά διακοπή του κυτταρικού κύκλου

Με ανοσο-φθορισμού, τα σχήματα κατανομής των Οάο2 και Cdc25C μεταξύ LNCaP και PC-3 κύτταρα ερευνήθηκαν περαιτέρω. θεραπεία LBH589 οδήγησε σε απώλεια της έντασης ανοσο-φθορισμού του Cdc25C σε PC-3 κύτταρα αλλά όχι σε κύτταρα LNCaP. κυτταρική μορφολογία και ϋΑΡΙ πυρηνική χρώση αντιπροσωπεύει LBH589 επεξεργασμένα PC-3 και LNCaP κύτταρα συνελήφθησαν στα τέλη του G2 και πρώιμη φάση Μ, αντίστοιχα (Σχήμα 3Α, πράσινο, βέλη). Για να προσδιορίσετε αν LBH589 που προκαλείται από κύτταρο συνελήφθη στην G2 ή Μ φάση, με την επίδραση των LBH589 για κεντροσωμάτων διαχωρισμό, τα χαρακτηριστικά μορφολογικά πρόωρης μίτωσης, ερευνήθηκαν από ανοσο-χρώση με αντισώματα γ-τουμπουλίνης. Ο διαχωρισμός των δύο κεντροσωμάτων παρατηρήθηκε μόνο σε κύτταρα LNCaP LBH589 φάρμακο (Σχήμα 3Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι κατά την κατεργασία LBH589, κύτταρα PC-3 συνελήφθησαν στα τέλη του G2 φάση και τα κύτταρα LNCaP συνελήφθησαν στην πρώιμη φάση Μ (πιθανότατα προμεταφασικά ).

(Α-Β) ανοσο-χρώση LNCaP και PC-3. Αμφότερα τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία 75 ηΜ LBH589 για 24 ώρες. Ανοσο-χρώση (Α) με Cdc2 και αντισώματα Cdc25C και (Β) του γ-τουμπουλίνης (Green) και ϋΑΡΙ (κυανό) σε έλεγχο του οχήματος (αριστερά) και θεραπεία LBH589 (δεξιά) σε LNCaP. (C-D) ΜΕΚ αναστολέα εξασθενημένα LBH589 που προκαλείται προμεταφασικά σύλληψης σε LNCaP. Τα κύτταρα προ-επεξεργασία 30 με UO126 για 30 λεπτά και διαδοχικά κατεργάζεται με LBH589 για 24 ώρες. (Γ) Οι κύκλοι των κυττάρων αναλύθηκαν με ΡΙ-χρώση και κυτταρομετρία ροής. (D) Τα κύτταρα μετάφασης μετρήθηκαν με χρώση ϋΑΡΙ παρουσιάζονται ως συμπύκνωμα χρωματίνης.

Η

Για να διερευνηθεί η εμπλοκή της ενεργοποίησης ERK, τα κύτταρα LNCaP υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον αναστολέα ΜΕΚ, U0126, να αναστέλλουν τη δράση της ERK στο παρουσία LBH589. Η LBH589 μεσολάβηση G2 /M σύλληψης εξασθένισε με αναστολή της ERK σε κύτταρα κατεργασμένα με UO126 (Σχήμα 3C). Επιπλέον, η αναστολή της ERK μειωμένη προμεταφασικά κύτταρα LBH589 διαμεσολαβούμενη από 24% έως 13% (Σχήμα 3Δ), υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση ERK έπαιξε σημαντικό ρόλο στην LBH589 μεσολάβηση προμεταφασικά σύλληψης σε κύτταρα LNCaP.

LBH589 ρυθμισμένα προς τα κάτω HDAC6 και υπέστη

ενεργοποίηση της ERK

ελέγχθηκαν Τα αποτελέσματα της LBH589 σε HDAC1, HDAC3 και HDAC6. LBH589 ρυθμισμένα προς τα κάτω HDAC6 σε LNCaP, αλλά όχι σε κύτταρα PC-3 (Σχήμα 4Α). Επιπλέον, η LBH589 μεσολάβηση κάτω ρύθμιση HDAC6 συσχετίζεται με την ενεργοποίηση ERK στη δόση-εξαρτώμενο τρόπο, αλλά βρέθηκαν μόνο σε κύτταρα LNCaP (Σχήμα 4Β). Προκειμένου να προσδιορίσει ποια HDAC ήταν υπεύθυνο για την ενεργοποίηση της ERK, οι τρεις πρωτεΐνες γκρέμισε με siRNA για να εξετάσει την κατάσταση φωσφορυλίωσης ERK σε κύτταρα 293Τ, εφόσον τα κύτταρα 293Τ είχαν υψηλή αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης και θεραπεία LBH589 επίσης ως αποτέλεσμα προμεταφασικά σύλληψη και την ενεργοποίηση ERK των 293Τ κύτταρα (σχήματα S1, S2, S3). Νοκ-κάτω της HDAC6, αλλά δεν HDAC1 ή HDAC3, από siRNA φωσφορυλίωση σημαντικά προκαλούμενη ERK σε κύτταρα 293Τ (Σχήμα 4C).

(Α) Διαλογή των HDAC που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση της ERK. Οι ανοσο-blottings των κυτταρικών λυμάτων αγωγή LBH589 διεξήχθησαν με υποδεικνυόμενα αντισώματα. (Β) LBH589 προκάλεσε την προς τα κάτω ρύθμιση του HDAC6, η οποία συσχετίζεται με την ενεργοποίηση ERK σε LNCaP αλλά όχι σε PC-3. (C) Νοκ ντάουν της HDAC6 αυξημένης δραστηριότητας ΕΚΚ. 293Τ επιμολύνθηκε με siRNA της HDAC1, 3, 6, ή μη-στόχευσης για 72 ώρες. Τα λύματα αναλύθηκαν με ανοσοαποτύπωση. (D) δραστηριότητα ΕΚΚ συμμετείχε σε LBH589 μεσολάβηση HDAC6 κάτω ρύθμιση. Κυτταρολύματα από κύτταρα κατεργασμένα με LBH589 ή σε συνδυασμό με UO126 προ-κατεργασία ανοσο-κηλιδώθηκαν.

Η

Τα κύτταρα LNCaP μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με LBH589 και του αναστολέα ΜΕΚ, U0126. Η αναστολή της ενεργοποίησης ERK LBH589 επαγόμενη αποκατασταθεί επίπεδα πρωτεΐνης HDAC6 (Εικόνα 4D). Επιπλέον, ERK υπερεκφράστηκε σε κύτταρα 293Τ, τα οποία είχαν ως αποτέλεσμα την προς τα κάτω ρύθμιση των επιπέδων της πρωτεΐνης HDAC6 σε σύγκριση με μονοθεραπεία EGFP-φορέα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτές έδειξαν ότι η αναστολή της δραστηριότητας HDAC6 με LBH589 επαγόμενη ενεργοποίηση ERK, η οποία στη συνέχεια οδήγησε στην προς τα κάτω ρύθμιση των επιπέδων της πρωτεΐνης HDAC6. Μια αμοιβαία ρύθμιση θα μπορούσε, επομένως, να υπάρχουν μεταξύ HDAC6 και του μονοπατιού σηματοδότησης ERK.

προκαλείται από LBH589 ενεργοποίηση της ERK μέσω της οδού ΡΡ1 /c-Raf

Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι HDACi μπορεί να αυξήσει τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS και ενεργοποιούν το μονοπάτι σηματοδότησης Ras-Raf [21]. Τα επίπεδα ROS των LNCaP και PC-3 κύτταρα υπό θεραπεία LBH589 στη συνέχεια διερευνώνται. θεραπεία LBH589 επαγόμενη προμεταφασικά σύλληψης, αλλά δεν αύξησε σημαντικά ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS σε LNCaP, αλλά επάγεται ένα ορισμένο επίπεδο σε PC-3 κύτταρα (Σχήμα 5Α). θεραπεία LBH589 επίσης μείωσε τον σερίνη 259 φωσφορυλίωση (ανασταλτικό σήμα) και αύξησε το (σήμα ενεργοποίησης) σερίνη 338 φωσφορυλίωση του c-Raf, η οποία συσχετίζεται με την ενεργοποίηση ERK σε LNCaP, αλλά όχι σε κύτταρα PC-3 (Εικόνα 5Β). Αυτές οι προτάσεις ότι η ενεργοποίηση ERK LBH589 επαγόμενη μπορεί να προκαλούνται μέσω της ενεργοποίησης c-Raf.

(Α) ανάλυση της παραγωγής ROS. Τα αναφερόμενα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 75 ηΜ LBH589 για 24 ώρες. ROS μετρήθηκε όπως περιγράφεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι. (Β) Το υπόδειγμα της c-Raf μονοπάτι για θεραπεία LBH589 σηματοδότησης. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LBH589 για 24 ώρες και τα προϊόντα λύσης ήταν ανοσο-κηλιδώθηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. α-κατενίνης ήταν ένας έλεγχος φόρτωσης.

Η

LBH589 ενεργοποιηθεί αλληλεπίδραση ΡΡ1 με 14-3-3ζ και HDAC6

Η υπερέκφραση του PP1α, αλλά δεν ΡΡ2Α, ενίσχυσε την αποφωσφορυλίωση γ -Raf Ser259 και Ser338 φωσφορυλίωση, και στη συνέχεια περαιτέρω ενεργοποιημένα κατάντη ERK φωσφορυλίωσης υπό θεραπεία LBH589 σε κύτταρα 293Τ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι LBH589 μπορεί να προκαλέσει PP1α να ενεργοποιήσετε την c-Raf από αποφωσφορυλίωση Ser259 και στη συνέχεια την ενεργοποίηση ERK. Επειδή και οι δύο φωσφορικά του Cdc25C-Ser216 και c-Raf-Ser259 ήταν υποστρώματα για ΡΡ1, εξετάστηκε περαιτέρω η επίδραση της LBH589 στην φωσφορυλίωση Ser216 της Cdc25C. θεραπεία LBH589 μείωσε την φωσφορυλίωση Ser216 του Cdc25C σε μια δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο σε κύτταρα LNCaP (Σχήμα 6Α).

(Α) που επάγεται LBH589 Cdc25C-S216 αποφωσφορυλίωση σε μια δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. LNCaP εκτέθηκε σε 75 ηΜ LBH589 για διάφορους χρόνους ή σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις LBH589 για 24 ώρες. Η φωσφορυλίωση του Cdc25C-S216 διεξήχθη με άνοσο-κηλίδωση με Pi-Cdc25C-S216 αντίσωμα. (Β-Γ) θεραπεία LBH589 ενεργοποιημένο το αλληλεπιδρά συνεργάτη PP1α. Οι ανοσο-καταβυθίσεις διεξήχθησαν με αντι-HDAC6 ή αντι-14-3-3ζ. Τα καταβυθισθέντα δείγματα αναλύθηκαν με άνοσο-κηλίδωση χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον PP1α, 14-3-3ζ, Lys-Ac (Pan-ακετυλιωμένη λυσίνη). IgG ήταν ένας μη ειδικός έλεγχος pull-down.

Η

14-3-3 ήταν μια πρωτεΐνη συνοδείας για τη διατήρηση της κατάστασης φωσφορυλίωσης των S216 της Cdc25C και S259 του c-Raf με την προστασία τους από την αποφωσφορυλίωση με ΡΡ1 [ ,,,0],10,22]. Η αλληλεπίδραση μεταξύ 14-3-3, PP1α και HDAC6 ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας 14-3-3ζ, PP1α και HDAC6 αντισώματα στην ανάλυση συν-ανοσο-καταβύθιση. θεραπεία LBH589 αυξημένη 14-3-3ζ ακετυλίωση και την αλληλεπίδρασή της με PP1α (Σχήμα 6Β). Σε αντίθεση, HDAC6 μειώθηκε η αλληλεπίδρασή της με PP1α μετά τη θεραπεία LBH589 (Σχήμα 6C). Αυτές έδειξαν ότι HDAC6 μπορεί να ευθύνονται για 14-3-3ζ αποακετυλίωση για την προστασία των πρωτεϊνών των πελατών της c-Raf και Cdc25C από αποφωσφορυλίωση από PP1α.

Συζήτηση

Μια προηγούμενη μελέτη αποκαλύπτει ότι τα αίτια της θεραπείας LBH589 G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου μέσω αποικοδόμησης των κινασών Aurora σε νεφροκυτταρικό καρκίνωμα (RCC) [6]. Ομοίως, η παρούσα μελέτη διευκρινίζει περαιτέρω ότι LBH589 προκαλεί μια καθυστερημένη σύλληψη G2 φάση μέσω του κάτω ρύθμιση των κινασών Aurora σε καρκινικά κύτταρα PC-3 προστάτη με σχετική ανθεκτικότητα στη θεραπεία LBH589. HDACIs ενεργοποιούν ένα σημείο ελέγχου G2 σε φυσιολογικά κύτταρα που είναι συνήθως ελαττωματικά στα καρκινικά κύτταρα, τα οποία παρέχει μια εξήγηση γιατί τα φυσιολογικά κύτταρα είναι συνήθως πιο ανθεκτική στη θεραπεία HDACi [9]. Οι υποκείμενοι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην LBH589 σύλληψης διαμεσολαβείται φάση G2 μεταξύ φυσιολογικών κυττάρων και κυττάρων καρκίνου προστάτη μπορεί να είναι διαφορετική. Ωστόσο, τα αποτελέσματα εδώ σημαίνει ότι η LBH589 που προκαλείται G2 σύλληψης μπορεί να είναι ένας φαινότυπος των καρκινικών κυττάρων που είναι πιο ανεκτικοί σε θεραπεία LBH589.

Σε αντίθεση με LBH589 μεσολάβηση G2 σύλληψη φάση του PC 3-κύτταρα, επάγει LBH589 προμεταφασικά σύλληψη μετά την έντονη απόπτωση των κυττάρων LNCaP. Αν και οι γενετικό υπόβαθρο των κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη είναι διαφορετικά, η θεραπεία LBH589 επάγει την ενεργοποίηση της ERK και HDAC6 κάτω ρύθμιση στο 22Rv1 και DU 145 προστάτη κυτταρικές σειρές εκτός από τα κύτταρα LNCaP (Σχήμα S4). Ωστόσο, η εξέχουσα προμεταφασικά σύλληψη συμβαίνει μόνο σε κύτταρα του προστάτη με χαμηλά επίπεδα κατά την έναρξη της φωσφορυλίωσης της ERK, η οποία μπορεί να προκληθεί με βιώσιμο τρόπο από LBH589. LBH589 επάγει παροδικά ενεργοποίηση ERK μετά από μία ώρα της θεραπείας, η οποία αποβάλλεται γρήγορα μέσα σε 6 ώρες μετά τη θεραπεία LBH589 σε PC-3 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η αναστολή της δραστηριότητας HDAC6 με LBH589 επάγει μόνο παροδική ενεργοποίηση ERK και όχι HDAC6 αλλαγή επίπεδο πρωτεΐνης σημειώνεται σε PC-3 κύτταρα. Αυτό το φαινόμενο είναι παρόμοιο με παροδική ενεργοποίηση ERK που επάγεται από μιτογόνα, όπως EGF σε κύτταρα PC-3. Αυτή η μελέτη δείχνει ότι η αναστολή της HDAC6 με LBH589 απευθείας επάνω ρυθμίζει ενεργοποίηση ERK μέσω της οδού c-Raf /ΡΡ1, η οποία είναι παρόμοια με την μιτογόνο διέγερση, αλλά με ένα εντελώς αντίθετο βιολογικό αποτέλεσμα της διακοπή του κυτταρικού κύκλου, αντί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων.

ενεργοποίηση ERK, η οποία ανταποκρίνεται σε μία ποικιλία εξωκυτταρικών ερεθισμάτων όπως μιτογόνα ή καταπονήσεις, οδηγεί σε δραματικά διαφορετικές βιολογικές συνέπειες που συμπεριλαμβάνουν τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και κυτταρικό θάνατο [23-25]. Σταθερή ενεργοποίηση ERK μπορεί να επάγει κυτταρικό θάνατο, όταν τα κύτταρα ήταν υπό πίεση [26]. LBH589 προκαλεί παρατεταμένη ενεργοποίηση ERK μέσω μιας δωρεάν εμπρός ρύθμιση μεταξύ HDAC6 και ERK στα καρκινικά κύτταρα, τα οποία όχι μόνο προκαλεί προμεταφασικά σύλληψη, αλλά προκαλεί επίσης απόπτωση. Δεν υπάρχει καμία ανιχνεύσιμη αλλαγή της έκφρασης του HDAC6 mRNA σε κύτταρα LNCaP μετά τη θεραπεία LBH589 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ο αναστολέας πρωτεασώματος αποκαθιστά τα επίπεδα πρωτεΐνης HDAC6 μετά τη θεραπεία LBH589, γεγονός που υποδηλώνει ότι η εξάντληση των πρωτεϊνών HDAC6 μπορεί να εξαρτάται από πρωτεάσωμα μεσολάβηση οδός αποδόμησης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, γιατί LBH589 επιλεκτικά τα κάτω ρύθμιση πρωτεΐνες HDAC6 και κινασών Aurora Α και Β σε ορισμένες ειδικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου παραμένει ασαφής.

HDAC6 ανήκει στον υπότυπο κατηγορίας ΙΙα των οικογενειών HDAC. Είναι λεωφορεία μεταξύ του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος να επιτευχθεί βιολογικές λειτουργίες του. HDAC6 είναι η κύρια αποακετυλάσης που είναι υπεύθυνο για απακετυλίωση των α-τουμπουλίνης και HSP90 να διαμορφώνει μικροτουμπουλίνης εξαρτώμενη μεταφορά, στρατολογούν mis-αναδιπλωμένες πρωτεΐνες, και μεταφορά σε aggresomes για αποδόμηση [27-29]. Εκτός από τη συμμετοχή σε πολλές φυσιολογικές κυτταρικές λειτουργίες, HDAC6 μπορεί να απαιτούνται για την αποτελεσματική ογκογόνο μετασχηματισμό και μπορεί να εμπλέκεται στον καταρράκτη του παράγοντα β1 ανάπτυξης μετασχηματισμού (ΤΟΡ-β1) επαγόμενη επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση [30,31]. Αυτά υποδεικνύουν τον σημαντικό ρόλο των HDAC6 σε ογκογόνων διαδικασιών.

Έχει αναφερθεί ότι η οξεία μυελοειδή κύτταρα λευχαιμίας λείπει σε HDAC6 είναι ιδιαίτερα ανθεκτικά στην υδροξαμική ομάδα HDACIs [32]. Έτσι, HDAC6 μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα κομβικό θεραπευτικός στόχος για HDACIs στη θεραπεία του καρκίνου. Δεδομένου LBH589 είναι ένας ισχυρός ομάδα υδροξαμική HDACi με ισχυρή ανασταλτική επίδραση επί HDAC6, LBH589 έχει το πλεονέκτημα κλινική εφαρμογή στη θεραπεία των καρκίνων με έκφραση HDAC6. Αν και η ενζυμική ενεργότητα του HDAC6 μπορεί να ανασταλεί με LBH589 τόσο LNCaP και PC-3 κύτταρα PCa, LBH589 εξαντλεί εκλεκτικά είτε HDAC6 ή κινασών Aurora σε LNCaP και PC-3 κύτταρα προστάτη με διακριτά βιολογικά αποτελέσματα, αντίστοιχα. Αυτή η μελέτη εγείρει το σημαντικό ερώτημα γιατί LBH589 μειώνει επιλεκτικά είτε HDAC6 ή Aurora κινασών μέσω ενός μονοπατιού υποβάθμιση πρωτεασώματος σε διαφορετικά κύτταρα του προστάτη. Η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών πίσω από αυτή την ασυμφωνία στη θεραπευτική αντιμετώπιση των LBH589 σε διαφορετικά κύτταρα του προστάτη μπορούν να παρέχουν περισσότερες πληροφορίες για την κλινική εφαρμογή της LBH589.

Τα αποτελέσματα εδώ αποδεικνύουν ότι LBH589 επάγει την ενεργοποίηση της ERK με την αναστολή της δραστηριότητας HDAC6 σε ορισμένα κύτταρα . ενεργοποίηση ERK ελέγχεται από το ανάντη μονοπάτι Ras /Raf /MEK [33]. Η αποφωσφορυλίωση του S259 του c-Raf από δύο φωσφατάσες, ΡΡ1 ή ΡΡ2Α, έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση c-Raf από 14-3-3 και επιτρέπει την εκ νέου ενεργοποίηση του c-Raf, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί δραστηριότητα ΕΚΚ [34]. HDAC1, 6, και 10 έχουν αναφερθεί για να σχηματίσει ένα σύμπλοκο με ΡΡ1, αντίστοιχα. HDACIs διαταράξουν επιλεκτικά το σύμπλεγμα HDAC-ΡΡ1 και να αυξήσει τη σύνδεση των ΡΡ1 και Akt, η οποία συμβάλλει στην αντι-νεοπλασματική δραστηριότητα των HDACi [35]. Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι LBH589 διαταράσσει την HDAC6 /PP1α συγκρότημα και προωθεί την αλληλεπίδραση μεταξύ PP1α και ακετυλιωμένο 14-3-3ζ. Όταν PP1α συνδέεται με 14-3-3ζ, PP1α εξακολουθεί να διατηρεί δραστηριότητα φωσφατάσης της [36]. Με LBH589 μεταγωγής που αλληλεπιδρούν εταίρους της, PP1α μπορεί να μεταβάλει συνάφεια ή την ειδικότητα του σε υποστρώματα. Και πάλι, ένα σημαντικό ζήτημα εγείρεται ως προς το αν οι HDACs εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου μεταβάλλοντας συγγένεια ή ειδικότητα της PP1α των υποστρωμάτων ».

Εκτός από την ενεργοποίηση της ERK, η αναστολή της HDAC6 από LBH589 προκαλεί επίσης Cdc25C υπερ- φωσφορυλίωση από την απομάκρυνση της ανασταλτικής φωσφορυλίωσης σερίνης 216 της Cdc25C. LBH589 επαγόμενη αποφωσφορυλίωση S216 του Cdc25C ρυθμίζεται επίσης από PP1α και 14-3-3ζ με τους ίδιους μηχανισμούς υπεύθυνες για S259 αποφωσφορυλίωση της c-Raf. Έτσι, HDAC6 συμμετέχει όχι μόνο στη ρύθμιση της c-Raf /ΡΡ1 σηματοδοτικό μονοπάτι /ERK, αλλά συντονίζει επίσης την ERK καταρράκτη σηματοδότησης σε Μ μετάβαση των κυττάρων φάση του κύκλου.

Αυτή η μελέτη προτείνει ένα μοντέλο για να εξηγήσει πώς LBH589 προκαλεί προμεταφασικά σύλληψη. Όταν HDAC6 δεσμεύεται με HDACi, όπως LBH589 στη μελέτη αυτή, μπορεί να προκαλέσει μία διαμορφωτική αλλαγή στην HDAC6, που οδηγεί στην διάσπαση του PP1α και την ενίσχυση της 14-3-3ζ ακετυλίωση. Ακετυλιωμένο 14-3-3ζ έχει υψηλή συγγένεια για σύνδεση με PP1α και ρυθμίζοντας τη συγγένεια του PP1α πρόσδεσης σε υποστρώματα της. Περαιτέρω, οι φωσφορικά του c-Raf-Ser259 και Ser216 Cdc25C-αποφωσφορυλιωθεί με PP1α και αυτές επάγουν σταθερά την ενεργοποίηση ERK. Διατήρηση ενεργοποίηση ERK μπορεί να αποσταθεροποιήσει πρωτεΐνες HDAC6 και υπερ-φωσφορυλιώνουν Cdc25C, που οδηγεί στην προμεταφασικά διακοπή του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων LNCaP (Σχήμα 7).

σύνδεση προς HDAC6 LBH589 θα μπορούσε να προκαλέσει διαμορφωτική αλλαγή στην HDAC6, που οδηγεί στην διάσπαση του PP1α και την ενίσχυση της 14-3-3ζ ακετυλίωση. Ακετυλιωμένο 14-3-3ζ αυξημένη αλληλεπιδρούν συγγένεια του με PP1α και παρενέβαινε στη συγγένεια δέσμευσης PP1α με το υπόστρωμα. PP1α συνέχεια αποφωσφορυλιώνεται S259 του c-Raf και S216 του Cdc25C, προκαλώντας την ενεργοποίηση ΕΚΚ. Συνεχής ενεργοποίηση ERK οφείλεται στην ενεργοποίηση του c-Raf πρωτεΐνες θα μπορούσαν να αποσταθεροποιήσουν HDAC6 και υπερ-φωσφορυλιώνουν CDC25C, που οδηγεί στην προμεταφασικά διακοπή του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων LNCaP.

Η

Εν κατακλείδι, LBH589 επάγει παρατεταμένη ενεργοποίηση ERK μέσω δωρεάν εμπρός ρύθμιση που αναστέλλει δραστικότητα ενζύμου HDAC6, ακολουθούμενη από την προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης πρωτεΐνης HDAC6. Τα ευρήματα αυτά απαντήσει στο ερώτημα για το πώς η ενεργοποίηση της ERK μπορεί να είναι υπεύθυνη και για τις δύο πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την αναστολή της ανάπτυξης φαινοτύπων. HDAC6 είναι ένα κεντρικό παράγοντα απαραίτητη για την αλληλεπίδραση μεταξύ Raf /ERK οδό σηματοδότησης και βιολογικά μετάβαση του κυτταρικού κύκλου Μ φάση, γεγονός που το καθιστά ιδανικό στόχο για HDACi LBH589 κάνει. Η μελέτη αυτή διαφωτίζει περαιτέρω την LBH589 μεσολάβηση αργά G2 και πρώιμη φάση Μ διακοπή του κυτταρικού κύκλου μέσω διακριτών μοριακών μηχανισμών σε PC-3 και LNCaP PCa κυττάρων με διαφορετικά θεραπευτικά αποτελέσματα. Ως εκ τούτου, οι λεπτομερείς μηχανισμοί που είναι υπεύθυνοι για LBH589 μεσολάβηση αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων του προστάτη κατέρρευσε για να παρέχει νέες ιδέες που μπορούν να καθοδηγήσουν το σχεδιασμό των πιο αποτελεσματικών στρατηγικών που θα βελτιστοποιήσουν HDACi αντικαρκινική θεραπεία για την κλινική μετάφραση.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

LBH589 παρέχεται από την Novartis Pharmaceuticals (East Hanover, NJ) διαλύονται σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO). Σουβεροϋλοχλωριδίου δισυδροξαμικό οξύ (SBHA) και σουβεροϋλανιλιδο υδροξαμικό οξύ (SAHA) ήταν από ATON Pharma (Tarrytown, ΝΥ). Ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ), RNase Α και ένα κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ) . UO126 και PD98059 αγοράστηκαν από την Calbiochem.

καλλιέργειας κυττάρων

LNCaP, PC-3, και 22Rv1 ευγενικά από τον Dr. Pei-Wen Χσιάο (Κέντρο Γεωργικής Έρευνας Βιοτεχνολογίας, Academia Sinica, Ταϊβάν ) [37]. DU 145 και 293Τ αγοράστηκαν από Bioresource Συλλογή και Ερευνητικό Κέντρο (BCRC, Ταϊβάν). γραμμές PC-3 και κυττάρων 293Τ διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco, ενώ LNCaP και 22Rv1 καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640. Η DU 145 διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο του Eagle. Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% ορό εμβρύου θερμο-απενεργοποιημένο μόσχου, 2 mM γλουταμίνη, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο, 50 U /ml πενικιλίνη, και 50 mg /ml στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 /ατμόσφαιρα αέρα.

προσδιορισμούς ΜΤΤ

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 3000 -5000 κύτταρα ανά φρεάτιο, ανάλογα με την κυτταρική γραμμή, σε αγωγή με φορέα (DMSO) ή διαφορετικές δόσεις του LBH589, SAHA, και SBHA χρησιμοποιώντας πέντε φρεάτια ανά αγωγή. Στις 24, 48 και 72 ώρες αγωγής, τα μέσα μετακινήθηκαν και 100 μΐ 1 mg /ml ΜΤΤ προστέθηκαν πριν από την επώαση στους 37 ° C.