Αφηρημένο

Ενδοβρογχική υπερήχων Καθοδηγούμενη διαβρογχική παρακέντηση (EBUS-TBNA) και Trans-οισοφαγική υπερήχων Σάρωση με λεπτή βελόνη (EUS-FNA) είναι σημαντικές, νέες τεχνικές για τη διάγνωση και σταδιοποίηση του μη-μικροκυτταρικού καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) που έχουν ενσωματωθεί στις κατευθυντήριες γραμμές σταδιοποίηση του καρκίνου του πνεύμονα. Για την καθοδήγηση και τη βελτιστοποίηση αποφάσεις θεραπείας, ειδικά για τους ασθενείς με ΜΜΚΠ στο στάδιο ΙΙΙ και IV,

EGFR

και

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης συχνά απαιτείται. Το ποσοστό αντιστοιχία της ανάλυσης μετάλλαξης μεταξύ αυτών κυτταρολογική αναρροφήσεις και ιστολογικά δείγματα που λαμβάνονται από χειρουργική σταδιοποίηση είναι άγνωστη. Ως εκ τούτου, μελετήσαμε την έκταση στην οποία θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί με αξιοπιστία αλληλόμορφο-ειδική ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR με ανιχνευτές υδρόλυσης επί EBUS και EUS αναρροφήσεις λεπτή βελόνα με σύγκριση των αποτελεσμάτων με ιστολογικές υλικό από τον ίδιο ασθενή. Αναλύσαμε μια σειρά 43 ασθενών με NSCLC για τους οποίους η κυτταρολογική και ιστολογική υλικό ήταν διαθέσιμο. Δείξαμε ότι αυτές οι τυποποιημένες μοριακές τεχνικές μπορούν να εφαρμοστούν με ακρίβεια σε λεπτή βελόνα αναρρόφησης κυτταρολογική από ασθενείς με NSCLC. Είναι σημαντικό ότι, δείχνουμε ότι όλες οι μεταλλάξεις ανιχνεύονται σε ιστολογική υλικό του πρωτογενούς όγκου ταυτοποιήθηκαν επίσης στα κυτταρολογικά δείγματα. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι το μοριακό προφίλ μπορεί να πραγματοποιηθεί με αξιοπιστία σε λεπτή βελόνα αναρρόφησης κυτταρολογική εξέταση των ασθενών με NSCLC

Παράθεση:. Van Eijk R, Licht J, Schrumpf Μ, Talebian Yazdi Μ, Ruano D, Forte GI, et al. (2011) Ταχεία

KRAS

,

EGFR

,

BRAF

και

PIK3CA

Μετάλλαξη Ανάλυση Καλών Needle αναρροφήσεις από μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα Χρήση αλληλο-ειδικό qPCR. PLoS ONE 6 (3): e17791. doi: 10.1371 /journal.pone.0017791

Επιμέλεια: Ralf Krahe, Πανεπιστήμιο του Τέξας Μ D. Anderson Cancer Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26 Οκτωβρίου, 2010? Αποδεκτές: 11 Φλεβάρη, 2011? Δημοσιεύθηκε: 8 Μαρτίου 2011

Copyright: © 2011 van Eijk et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου του Leiden. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο στον δυτικό κόσμο [1]. Για κλινικούς και θεραπευτικούς σκοπούς, ο καρκίνος του πνεύμονα είναι παραδοσιακά υποδιαιρείται σε μικρό κύτταρο (SCLC) και μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Λαμβάνοντας υπόψη ότι η SCLC αντιμετωπίζεται με χημειοθεραπεία ή /και ακτινοθεραπεία, NSCLC είναι κατά κύριο λόγο αντιμετωπίζεται μέσω εκτομή? Ωστόσο, μόνο το 30% των ασθενών με NSCLC έχουν ένα χειρουργικά αφαιρέσιμη ασθένεια (στάδιο I /II) κατά τη στιγμή της παρουσίασης [2]. Αυτό υπογραμμίζει τη σημασία της ακρίβειας, προεγχειρητική σταδιοποίηση του μεσοθωρακίου στην πρόληψη περιττών εκτομές. Προεγχειρητική σταδιοποίηση μπορεί να πραγματοποιηθεί μέσω του διαβρογχική (EBUS-TBNA) ή διοισοφάγειο (EUS-FNA) αναρρόφηση των λεμφαδένων του μεσοθωρακίου. Αυτές οι διαδικασίες είναι κυτταρολογική λιγότερο επεμβατική από ρουτίνα mediastinoscopy ακολουθούμενη από βιοψία των λεμφαδένων, αλλά παρόμοια υψηλή εξειδίκευση και ευαισθησία [3] – [9] επιτυγχάνονται. Endosonography έχει ενσωματωθεί στις κατευθυντήριες γραμμές για τον καρκίνο του πνεύμονα στάσης ως εναλλακτική λύση για την χειρουργική σταδιοποίηση του μεσοθωρακίου [10], [11].

Σε πολλές περιπτώσεις, η αυξημένη χρήση των εν λόγω ελάχιστα επεμβατικές τεχνικές είναι επαρκής για τη διάγνωση και οργανώσει τον ασθενή σωστά. Αν και η ποσότητα κυτταρικού υλικού που λαμβάνονται από αυτές τις διαδικασίες είναι σχετικά μικρή, οι πληροφορίες που ζητούνται από τους κλινικούς γιατρούς είναι ταχέως αναπτυσσόμενη, π.χ., για NSCLC, ανοσοϊστοχημεία και η μοριακή παθολογία έχουν γίνει μέρος της βασικής φροντίδας [12].

Εκτός από αυτή την αλλαγή στις διαδικασίες ανασυγκρότησης, η ταχεία ανάπτυξη των νέων ιατρικών θεραπειών για ασθενείς με ΜΜΚΠ έχει λάβει χώρα. Ένα υποσύνολο των καρκίνων NSCLC μπορεί φιλοξενούν μια ενεργοποίηση μετάλλαξη στην περιοχή της κινάσης του EGFR [13]. Όγκους με αυτές τις μεταλλάξεις είναι συχνά ευαίσθητα σε αναστολείς της τυροσινικής κινάσης (TKIs). Από την άλλη πλευρά, μεταλλάξεις ενεργοποίησης σε

KRAS

συνδέονται με αντίσταση στην TKIs. Αν και οι περισσότεροι δημοσιεύματα αναφέρουν ότι αυτές οι μεταλλάξεις είναι αμοιβαία αποκλειόμενα [14] – [19], τα στοιχεία δείχνουν [20] ότι ένας όγκος μπορεί ταυτόχρονα να φιλοξενούν μια ενεργοποίησης

EGFR

μετάλλαξη και οι μεταλλάξεις προς τα κάτω στην οδό στο

KRAS

γονίδιο, το οποίο σημαίνει ότι οι ανάντη αναστολή του EGFR δεν θα έχει κανένα θεραπευτικό αποτέλεσμα σε αυτές τις περιπτώσεις. Επίσης, μεταλλάξεις στο

BRAF

και

PIK3CA

αναφέρονται στον NSCLC. Ωστόσο, απαιτείται περαιτέρω έρευνα για να προσδιοριστεί ο βαθμός στον οποίο αυτές οι μεταλλάξεις μπορεί να έχουν συνέπειες για τη θεραπεία [21], [22].

Λόγω αυτών των εξελίξεων και την επιθυμία των ασθενών και των ιατρών για να ελαχιστοποιηθεί η καθυστέρηση της θεραπείας , είναι ταχεία και ευαίσθητη μοριακές τεχνικές που απαιτούνται. Κατά προτίμηση, οι τεχνικές αυτές θα πρέπει να εφαρμόζονται σε φορμόλη σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) κυτταρολογικά δείγματα [23] – [25], επειδή τα δείγματα αναρρόφησης EBUS-TBNA και EUS-FNA είναι συχνά το πρώτο υλικό που αποκτάται από ασθενείς με NSCLC. Αλληλόμορφων ειδικών ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qPCR) με ανιχνευτές υδρόλυσης είναι ένα αξιόπιστο και ευαίσθητη τεχνική που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για το σκοπό αυτό. Ανίχνευση μεταλλάξεων στο

EGFR

,

KRAS

,

BRAF

και

PIK3CA

με ανιχνευτές υδρόλυσης έχει περιγραφεί προηγουμένως σε ασθενείς με ΜΜΚΠ [23] – [26 ]. Η ευαισθησία των δοκιμασιών ξεπερνά επίσης το σύνολο πρόταση ευαισθησία 1% για το

KRAS

δοκιμές μετάλλαξης [27].

Η πλειοψηφία των

EGFR

μεταλλάξεις είναι p.L858R, η hotspot μετάλλαξη στο εξόνιο 21 και διαγραφές στο εξόνιο 19, τα οποία αναφέρεται ότι περιλαμβάνουν μέχρι 36% του συνόλου των μεταλλάξεων ενεργοποιώντας [15], [28].

KRAS

μεταλλάσσεται σε 10% -30% των καρκινωμάτων του πνεύμονα και πάνω από το 95% του συνόλου των ενεργοποίηση μεταλλάξεων στο

KRAS

βρίσκονται στο εξόνιο 1 (κωδικόνια 12 και 13) [28], [ ,,,0],29]. Η

BRAF

μετάλλαξη p.V600E hotspot αναφέρεται στο 3% του NSCLC και αλλάζει τα κατάλοιπα σημαντικό BRAF φωσφορυλίωση μεσολαβεί η ΑΚΤ, γεγονός που υποδηλώνει ότι η διάσπαση της ΑΚΤ που προκαλείται από την αναστολή BRAF παίζει ρόλο στην κακοήθη εξαλλαγή [28] , [30]. Τρεις μεταλλάξεις hotspot σε

PIK3CA

μπορεί να είναι μια άλλη αιτία της υπερ-ενεργοποίηση του ΡΙ3Κ-ΑΚΤ οδού, το οποίο προωθεί τον κακοήθη μετασχηματισμό των επιθηλιακών κυττάρων του ανθρώπου αεραγωγών και έχει αναφερθεί σε περίπου 4% των καρκινωμάτων του πνεύμονα [28 ], [31].

στην παρούσα μελέτη, συγκρίναμε αναλύσεις qPCR αλληλόμορφο-ειδικό για την πιο συχνή ενεργοποίηση μεταλλάξεων στο

EGFR

,

KRAS

,

BRAF

και

PIK3CA

σε όγκο θετική λεπτή βελόνα κυτταρολογική αναρροφήσεις κατά ιστολογική υλικό των πρωτογενών όγκων.

με αυτή την προσέγγιση, έχουμε ως στόχο να καθορίσει το βαθμό στον οποίο αλληλόμορφο-ειδική qPCR με ανιχνευτές υδρόλυση μπορεί να πραγματοποιηθεί σε κυτταρολογικές υλικό αναρρόφηση με τη σύγκριση της κατάστασης μετάλλαξης και στη συνέχεια παρατηρώντας το ποσοστό αντιστοιχίας μεταξύ του κυτταρολογική και ιστολογική υλικό και μεταξύ πρωτογενών όγκων και μεταστάσεων.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Ειδικές ανάγκη για την έγκριση της επιτροπής δεοντολογίας δεν ήταν αναγκαία για τη μελέτη αυτή. Όλα τα δείγματα αντιμετωπίζονται σύμφωνα με τις ιατρικές ηθικές κατευθυντήριες γραμμές περιγράφονται στον Κώδικα Ορθή Δευτεροβάθμια χρήση ανθρώπινων ιστών ιδρύθηκε από την ολλανδική Ομοσπονδία Ιατρικών Επιστημών (www.federa.org, πρόσβαση 27η Οκτωβρίου 2010). Κατά συνέπεια σε αυτές τις κατευθυντήριες γραμμές Όλα τα ανθρώπινα υλικά που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη έχει ανώνυμα από το κλινικά δεδομένα δεν χρησιμοποιήθηκαν. Επειδή άδεια της διαδικασίας αυτής ανωνυμίας μεμονωμένων ασθενών δεν είναι απαραίτητη.

Η επιλογή δειγμάτων

Υλικό από 43 ασθενείς με NSCLC για την οποία και οι δύο ήταν διαθέσιμα επιλέχθηκαν όγκο θετική κυτταρολογική και ιστολογική υλικό από το Τμήμα Παθολογίας του Ιατρικού Κέντρου του Πανεπιστημίου του Leiden (ΤΕΔΚ) και προσδιορίζονται μέσω μιας αναζήτησης βάση δεδομένων PALGA? μη-γυναικολογική κυτταρολογικά δείγματα μεταξύ του 2005 και του 2009 ερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας την αναζήτηση-strings «πνεύμονα, κακοήθη κύτταρα και μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα» και «μεσοθωράκιο, κακοήθη κύτταρα και μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα». Από τις 447 μοναδικές κυτταρολογικά δείγματα, εμείς επιλεγμένες περιπτώσεις για τις οποίες όγκων θετικών ιστολογική υλικό του πρωτογενούς όγκου ήταν επίσης διαθέσιμο (συμπληρωματικός Πίνακας S1). Από τους 43 ασθενείς, 33 ασθενείς είχαν υποτύπου: 14 καρκινώματα πλακωδών κυττάρων, 15 αδενοκαρκινώματα, 3 αδενοχοληδωτό καρκινώματα και 1 καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου. Οι υπόλοιποι 10 ασθενείς είχαν ταξινομηθεί NSCLC μόνο. ​​

DNA από 42 δείγματα FFPE ελέγχου ελήφθη από το τμήμα Μοριακής Διαγνωστικής (MD) του Τμήματος Παθολογίας στην ΤΕΔΚ. Για σκοπούς επαλήθευσης, μια σειρά δειγμάτων 10 DNA, εκ των οποίων 9 είχαν αποδεδειγμένη

EGFR

εξόνιο 19 διαγραφή της αλληλουχίας του DNA, που παρέχονται από τον Ολλανδικό Ινστιτούτο Καρκίνου -. Antoni van Leeuwenhoek Νοσοκομείο

απομόνωση DNA

Πριν από την απομόνωση του DNA, τα καρκινικά κύτταρα εμπλουτίστηκαν για να ληφθούν ποσοστά «.

Η

Το συνολικό ποσοστό κλήσεων στις 13 δοκιμασίες, μετά τη συγχώνευση, ανέρχεται σε 95% (58 απροσδιόριστο αποτελέσματα από του 1118 δοκιμές). Το ποσοστό πρόσκληση για ιστολογική υλικό είναι σημαντικά υψηλότερη σε 99% (8 απροσδιόριστο από 559) από ό, τι για κυτταρολογική υλικού σε 91% (48 από 559). Εντός του κυτταρολογικού υλικού, το ποσοστό κλήσεων για πρωτοπαθείς όγκους είναι χαμηλότερο (84%) από ό, τι για τις μεταστάσεις (96%). Σημειώστε ότι οι παρατηρήσεις αυτές παραμένουν εάν ο ασθενής με τα χαμηλότερα αποτελέσματα ποιότητας (δείγμα 21) αφαιρείται. Εντός του ιστολογικού υλικού μπορεί να παρατηρηθεί η ίδια διαφορά στο ποσοστό κλήσεων, αλλά σε πολύ μικρότερο βαθμό (98% για τις πρωτογενείς όγκους έναντι 99% για τις μεταστάσεις). Κατά τη σύγκριση των ποσοστών κλήση ανά δοκιμασία, παρατηρήσαμε ότι οι τρεις αναλύσεις για το

PIK3CA

γονίδιο που εκτελούνται λιγότερο (μεταξύ 88 και 91%) από ό, τι τα άλλα 10 δοκιμασίες (μεταξύ 94 και 99%).

Όπως μπορεί να παρατηρηθεί, όταν κυτταρολογική υλικό ελήφθη από πρωτογενείς όγκους, τα αποτελέσματα μετάλλαξης για ιστολογία και κυτταρολογίας συμφωνούσαν σε όλες τις περιπτώσεις όπου προσδιορίστηκαν αμφότερα τα αποτελέσματα. Όταν κυτταρολογική υλικό ελήφθη από μετάσταση, σε έναν ασθενή (NR 40) με ένα καρκίνωμα αδενοκαρκίνωμα /βρογχοκυψελιδικό κύτταρο (BAC), ένα KRAS c.34G & gt? Μια μετάλλαξη ταυτοποιήθηκε στην μεσοθωρακίου λεμφαδένων που δεν ανιχνεύθηκε στον πρωτογενή όγκο. Αυτό θα μπορούσε να εξηγηθεί από την κοινώς παρατηρείται γενετική απόκλιση της μετάστασης από πρωτογενούς όγκου της. Στην περίπτωση αυτή το χρονικό διάστημα είναι 18 έτη, μεταξύ του πρωτογενούς όγκου και την μετάσταση. Συνολικά, το ποσοστό ασυμφωνία είναι μόνο 0,20% (1 δοκιμασία από 503 όπου προσδιορίζεται τόσο ιστολογικά και κυτταρολογικά αποτελέσματα).

ποσοστό του όγκου των κυττάρων και του DNA ποιότητας

Από βιοψίες και κυτταρολογική εξέταση, μόνο μικρές εστίες όγκου μπορεί να μικροτομή. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα χαμηλή απόδοση του DNA που, σε περίπτωση μονιμοποίηση φορμαλίνης, είναι επίσης μερικώς υποβαθμισμένη. Για τη μελέτη της ποιότητας του DNA, συγκρίναμε την απόδοση του DNA με την απόδοση της δοκιμασίας. Παρατηρήσαμε ότι το μέσο ποσό του DNA που απομονώθηκε (295 ng) ήταν χαμηλότερη στην ομάδα (n = 15), όπου δύο ή περισσότερες αναλύσεις απέτυχαν [σε σύγκριση με την ομάδα ανελλιπώς δοκιμασίες (n = 102, 2973 ng)]. Παρ ‘όλα αυτά, στην τελευταία ομάδα, το 44% των δειγμάτων (n = 45) είχαν επίσης μια ποσότητα DNA από κατώτερο από 295 ng. Αυτό δείχνει ότι οι αξίες Cq είναι ένας καλύτερος δείκτης της ποιότητας και της απόδοσης από μετρήσεις της συγκέντρωσης του DNA DNA.

αλληλόμορφων-ειδικών qPCR με ανιχνευτές υδρόλυσης έχει αναφερθεί να ξεπεράσει το επίπεδο ευαισθησίας 1% [27]. Ωστόσο, λαμβάνοντας υπόψη ότι η αποτελεσματικότητα qPCR εξαρτάται επίσης από τον κατακερματισμό του DNA, το DNA που απομονώθηκε από τα δείγματα FFPE θα μπορούσαν με ακρίβεια να αναλυθεί σε ένα επίπεδο ευαισθησίας του 10% [26]. Προσδιορίσαμε το όριο ανίχνευσης σε σειριακές αραιώσεις του DNA από δύο όγκους που μεταφέρουν ένα

KRAS

c.34G & gt? Τ ή ένα c.35G & gt? Μία μετάλλαξη. Αυτό έδειξε ότι η ελάχιστη συμβολή του DNA πρέπει να είναι τουλάχιστον 32 pg, το ισοδύναμο των 4-6 κυττάρων υψηλού μοριακού DNA, για να δώσει τιμές Cq & lt?. 35 (Σχήμα 3)

Η κορυφή του πίνακα δείχνει το μεταλλαγμένο σήμα (FAM) για μια σειρά διαφορετικών ποσοτήτων DNA εισόδου σε pg φέρουν το c.34G & gt? T KRAS μετάλλαξη. Όχι «μεταλλαγμένο» σήμα παρατηρείται σε DNA άγριου τύπου (πράσινη γραμμή) και τον έλεγχο των υδάτων (γκρι γραμμή). Στον πίνακα άγριου τύπου (VIC) όλα δείχνουν DNA του σήματος άγριου τύπου, ενώ ο έλεγχος του νερού είναι αρνητική (γκρίζα γραμμή). Οι εικόνες που λαμβάνονται από την έκδοση λογισμικού LC480 1.5.0. Ο γ-άξονας δείχνει τον σχετικό φθορισμό για το FAM (465-510 nm) και VIC (533-580nm) ανιχνευτές, x-άξονας δείχνει τους κύκλους PCR.

Η

Επιπλέον, μπορούμε να επικυρώσει τις δοκιμασίες σε μια σειρά DNA που απομονώθηκαν από μικροτομή δείγματα FFPE με γνωστά

KRAS

,

PIK3CA

,

BRAF

ή παραλλαγές EFGR όπως καθορίζεται από αλληλουχίας Sanger. Βρήκαμε μια συσχέτιση 100% με τις δοκιμασίες ανιχνευτή υδρόλυσης.

επικυρωθεί η δοκιμασία για

EGFR

εξόνιο 19 σε μια σειρά από 10 δείγματα με πιθανές αλληλουχία επαληθεύεται εξόνιο 19 διαγραφές και ένα ποσοστό του όγκου του περισσότερο από 50%. Τα δείγματα ελέγχθηκαν χωρίς προηγούμενη γνώση της κατάστασης μετάλλαξης. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης υδρόλυση συγκρίθηκαν με τα αποτελέσματα αλληλουχία DNA και όλων των εννέα δείγματα που περιέχουν ένα εξόνιο 19 απαλοιφής αναγνωριστεί σωστά και να διακρίνονται από το δείγμα άγριου τύπου (Σχήμα 2β). Σε μία περίπτωση, υπήρχε ένα 18-bp εισαγωγή στο εξώνιο 19. Επειδή αυτό έπεσε έξω από την περιοχή ανίχνευσης των ανιχνευτών, η μετάλλαξη δεν ανιχνεύθηκε από την δοκιμασία διαγραφή (SampleID 1012 στον συμπληρωματικό πίνακα S3). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι όλες οι μεταλλάξεις hotspot και

EGFR

εξόνιο 19 διαγραφές μπορεί να ανιχνευθεί με τη χρήση των ανιχνευτών υδρόλυσης.

Η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα

Οι μεταλλάξεις στο

KRAS

και

PIK3CA

συμπλέγματος σε hotspots. Για

KRAS

, οι επτά δοκιμασίες σε υβριδισμό με κωδικόνια 12 και 13 (νουκλεοτίδια c.34G, c.35G και c.38G), ενώ για

PIK3CA

δύο δοκιμασίες ανιχνεύεται εξόνιο 9 αλλαγές (γ .1624G & gt? Α και c.1633G & gt? Α). Καθώς οι ανιχνευτές δυνητικά υβριδοποιήθηκαν στην ίδια περιοχή, διασταυρούμενη αντιδραστικότητα μεταξύ των διαφόρων

KRAS

ή

PIK3CA

δοκιμασίες μπορεί να παρατηρηθεί ως αποτέλεσμα της αυξημένης αναγνώσεις φθορισμού από ατελώς συμφωνημένα ανιχνευτές ή εκκινητές [26 ]. Επιπλέον, διασταυρούμενη αντιδραστικότητα θα μπορούσαν να προκύψουν από (σπάνια) αντικαταστάσεις ζευγών βάσεων που δεν καλύπτονται από τις χρησιμοποιήθηκαν δοκιμασίες.

Η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα μελετήθηκε σε μια σειρά από 42 δείγματα MD μεταφέρουν ένα

KRAS

μετάλλαξη στη θέση 34, 35 ή 38. Ένα σύνολο 294 δοκιμασίες (42 × 7) διεξήχθησαν. Η σωστή κατάσταση μετάλλαξη εντοπίστηκε όταν ένα R

m /R

αναλογία βάρους cut-off & gt? Χρησιμοποιήθηκε 0,7? Ωστόσο, σε 68 δοκιμασίες, παρατηρήθηκε ένα σήμα διασταυρούμενη αντιδραστικότητα. Πέντε σήματα διασταυρούμενη αντιδραστικότητα είχε R

m /R

κβ & gt? 0.7, αλλά σε αυτές τις περιπτώσεις, η δοκιμασία για την πραγματική μετάλλαξη είχαν R

m /R

κβ & gt? 1,0. Η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα παρατηρήθηκε μόνο για τους ανιχνευτές που καλύπτουν την ίδια θέση ζεύγους βάσεων (στη θέση 34 ή 35). Η διασταυρούμενη αντιδραστικότητα μεταξύ σημάτων από το ζεύγος βάσεων 34 ή 35 και η θέση 38 δεν παρατηρήθηκε (συμπληρωματικός Πίνακας S4). Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι δεν παρατηρήθηκαν διασταυρούμενη αντιδραστικότητα επιπτώσεις για τα δύο διαφορετικά

PIK3CA

ανιχνευτές.

Η κλινική πρακτική

Οι περιγραφόμενες μέθοδοι μπορούν να εφαρμοστούν στην κλινική πράξη. Τα αποτελέσματα μοριακή διαγνωστική δοκιμή μπορεί να παραχθεί σε σύντομο χρονικό διάστημα. Στην καθημερινή πρακτική, η κυτταρολογική EBUS-TBNA ή υλικό αναρρόφησης EUS-FNA είναι μορφολογικά δακτυλογραφημένα από παθολόγους. Στη συνέχεια, τα δείγματα συγκεντρωμένα για μικροδιατομής σε εβδομαδιαία βάση. Μικροανατομίας είναι απαραίτητη για να ληφθεί ποσοστά των κυττάρων των όγκων για να ανιχνευθεί η EGFR εξόνιο 19 διαγραφή, και να επιτρέψει σε άλλες αναλύσεις με χαμηλότερη ευαισθησία από την περιγραφόμενη μέθοδο, π.χ. Sanger αλληλούχισης. Μετά την απομόνωση του DNA, οι ανιχνεύσεις ανιχνευτή υδρόλυσης εκτελείται σε αραιώσεις του DNA. Στο τέλος της δεύτερης ημέρας, τα αποτελέσματα qPCR αναλύονται σε ένα εργαλείο ανάλυσης Microsoft Excel-based in-house-αναπτύχθηκε για να ερμηνεύσει τα αποτελέσματα, π.χ., να καθορίσει την κατάσταση της μετάλλαξης του κάθε ανιχνευτή και να ερμηνεύσει την επίδραση του διασταυρούμενη αντιδραστικότητα. Τα αποτελέσματα στη συνέχεια υποβάλλονται στην κλινική. Ένας περιορισμός της ανάλυσης hotspot είναι, εξ ορισμού, ότι μόνο οι μεταλλάξεις hotspot εντοπιστεί, ενώ αλληλουχίας Sanger μπορεί να εντοπίσει όλες τις μεταλλάξεις στο PCR αμπλικόνιο. Σε ορισμένες περιπτώσεις, στις οποίες η ανάλυση μετάλλαξη δεν πληροί τις ρυθμίσεις ποιότητας, αλληλούχιση Sanger θα εκτελεστεί. Για αλληλουχίας Sanger, επιπλέον αντιδράσεις PCR, καθαρισμοί προϊόν της αντίδρασης και η ηλεκτροφόρηση πρέπει να εκτελείται, η οποία θα απαιτήσει δύο επιπλέον ημέρες στον αγωγό ανάλυση.

Συμπέρασμα

Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η σωματική ανάλυση μετάλλαξης hotspot για

KRAS

,

PIK3CA

,

BRAF

και

EGFR

της παρακεντήσεις των λεμφαδένων του μεσοθωρακίου σε ασθενείς με NSCLC είναι ακριβείς και αξιόπιστες. Σωματικών ανάλυση μετάλλαξης hotspot για

KRAS

,

PIK3CA

,

BRAF

και

EGFR

μπορεί αξιόπιστα να πραγματοποιηθεί με χρήση αλληλόμορφο-ειδική qPCR με ανιχνευτές υδρόλυσης? τα αποτελέσματα μετάλλαξη από κυτταρολογικά δείγματα και οι πρωτογενείς όγκοι είναι εξαιρετικά συμφωνούν.

Σωματικά ανάλυση μετάλλαξης σε NSCLC για μοριακή σταδιοποίηση και την καθοδήγηση των αποφάσεων της θεραπείας μπορεί να εκτελεστεί σε EBUS και EUS αναρροφήσεις λεπτή βελόνα, διαδικασίες που είναι λιγότερο επεμβατική για τον ασθενή από την καθιερωμένη mediastinoscopy.

τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η μοριακή γενετική ανάλυση των NSCLC θα πρέπει να ενσωματωθούν με τις τυποποιημένες διαδικασίες EBUS και EUS. Αυτή η συνδυασμένη προσέγγιση θα έχει ως αποτέλεσμα την ακριβή διάγνωση και σταδιοποίηση των ασθενών και θα βοηθήσει επίσης να καθοδηγήσει τις βέλτιστες αποφάσεις θεραπείας, ειδικά στο στάδιο ΙΙΙ και IV NSCLC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1. . Επισκόπηση

Γενική

doi: 10.1371 /journal.pone.0017791.s001

(XLS)

Πίνακας S2. .

Primer ακολουθίες

doi: 10.1371 /journal.pone.0017791.s002

(XLS)

Πίνακα S3.

EGFR εξόνιο 19 το πείραμα επικύρωσης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0017791.s003

(XLS)

Πίνακας S4.

διασταυρούμενη αντιδραστικότητα σε δοκιμασίες KRAS

doi:. 10.1371 /journal.pone.0017791.s004

(XLS)

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε τους τεχνικούς σε μοριακό Diagnostics ομάδα στο Τμήμα LUMC Παθολογίας για τη δοκιμή των πρωτοκόλλων σε διάφορες βιολογικές ρυθμίσεις και την αντιμετώπιση των διαφόρων πτυχών της μελέτης.