Αφηρημένο

Ιστορικό

Πρόσφατα , μία νέα παραλλαγή του ER-α, ER-α36 ταυτοποιήθηκε και κλωνοποιήθηκε. ER-α36 στερείται ενδογενή δραστηριότητα μεταγραφή και κυρίως μεσολαβεί μη γονιδιωματικών σηματοδότηση των οιστρογόνων. Εδώ, μελετήσαμε το ρόλο των μη γονιδιωματικών οιστρογόνου μονοπατιών σηματοδότησης που μεσολαβούνται από ER-α36 στη ταμοξιφένη αντίσταση και αγωνιστή δράση.

Μεθοδολογία

Ο κυτταρικός εντοπισμός του ER-α36 εξετάστηκε με ανοσοφθορισμό σε MCF- 7 κύτταρα και κύτταρα Hec1A. MCF-7 καρκίνου του μαστού, κύτταρα MCF-7 που εκφράζουν ανασυνδυασμένο ER-α36 (MCF-7 /ER36), Hec1A καρκίνο του ενδομητρίου κύτταρα και κύτταρα Hec1A με siRNA knockdown του ER-α36 (Hec1A /RNAiER36) υποβλήθηκαν σε αγωγή με 17β-estradial ( Ε2) και ταμοξιφένη (ΤΑΜ) απουσία και παρουσία του αναστολέα κινάσης U0126 και Ι Υ294002. Εξετάσαμε φωσφορυλίωση μορίων σηματοδότησης και την έκφραση του c-myc με ανοσοστύπωση, και η ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων με τη δοκιμασία ΜΤΤ.

Συμπεράσματα

παραλλαγή ER ER-α36 ενισχύει δραστικότητα αγωνιστή ΤΑΜ μέσω της ενεργοποίησης του μεμβράνη ξεκίνησε μονοπάτια στον καρκίνο του ενδομητρίου σηματοδότησης, και ότι ER-α36 εμπλέκεται σε

de novo

και επίκτητη αντοχή TAM στον καρκίνο του μαστού

Παράθεση:. Lin SL, Yan LY, Zhang XT, Yuan J, Λι Μ, Qiao J, et al. (2010) ER-α36, μία παραλλαγή του ER-α, προωθεί Tamoxifen αγωνιστή σε δράση καρκίνο του ενδομητρίου κύτταρα μέσω της ΜΑΡΚ /ΕΚΚ και ΡΙ3Κ /Akt Pathways. PLoS ONE 5 (2): e9013. doi: 10.1371 /journal.pone.0009013

Επιμέλεια: Syed A. Αζίζ, Health Canada, Καναδάς

Ελήφθη: 11 Δεκεμβρίου, 2009? Αποδεκτές: 13 του Ιανουαρίου του 2010? Δημοσιεύθηκε: 2 Φεβρουαρίου 2010

Copyright: © 2010 Lin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό πρόγραμμα βασικής έρευνας της Κίνας (2006CB504004, 2006CB944005). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Tamoxifen είναι ένας εκλεκτικός ρυθμιστής υποδοχέα οιστρογόνου (SERM) με μικτή αγωνιστή /ανταγωνιστή δραστηριότητες που έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως ως μια αποτελεσματική θεραπεία όλων των σταδίων της υποδοχέα οιστρογόνου (ER) του καρκίνου του μαστού -θετικό [1]. Tamoxifen καταστέλλει την επανεμφάνιση του καρκίνου του μαστού και μειώνει τη συχνότητα εμφάνισης του ετερόπλευρου καρκίνου του μαστού κατά 49% [2]. Tamoxifen έχει επίσης χρησιμοποιηθεί ως χημειοπροληπτικός παράγοντας σε γυναίκες που έχουν υψηλό κίνδυνο για καρκίνο του μαστού [3]. Πιστεύεται ότι η ταμοξιφένη δρα ως ανταγωνιστής με ανταγωνισμό με οιστρογόνα για τον τομέα των ER δέσμευσης συνδέτη, αναστέλλοντας έτσι ER μεσολάβηση μιτογόνος οιστρογόνα σηματοδότηση [4]. Ωστόσο, το μεγαλύτερο εμπόδιο για την ταμοξιφαίνη χρήση είναι η ταμοξιφαίνη αντίσταση, η οποία εμφανίζεται

de novo

ή μπορεί να αποκτηθεί μετά τη χρήση του [5]. Επιπλέον, η ταμοξιφένη χρήση αυξάνει τη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του ενδομητρίου σε μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες με μακροχρόνια θεραπεία [6]. Οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν τόσο

de novo

και απέκτησε ταμοξιφαίνη αντίσταση και δράση αγωνιστή της σε ενδομήτριου ιστού είναι ελάχιστα κατανοητή.

ER ανήκει στην οικογένεια στεροειδών ορμονών του υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων. Είναι κατά κύριο θεωρείται ότι ER δρα ως παράγοντας μεταγραφής που εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα του κυττάρου [7]. Ωστόσο, συσσωρεύοντας απόδειξη έχει αποδείξει ότι ER υπάρχει επίσης και από την πλασματική μεμβράνη και συμμετέχει στην ταχεία σηματοδότηση των οιστρογόνων. Έχει αναφερθεί ότι ER τροποποιείται με μετα-μεταφραστική παλμιτοϋλίωσης στο πεδίο σύνδεσης συνδετήρα που μπορεί να συμβάλλουν στην εντόπιση μεμβράνη του [8]. Σύνδεσμος ER και caveolin-1 επίσης φάνηκε να διευκολυνθεί ER εντοπισμό στην μεμβράνη του πλάσματος [9]. Η caveolin-1 είναι μία δομική πρωτεΐνη του μικροσπηλαίων και χρησιμεύει ως πρωτεΐνη ικρίωμα να προσλάβει μόρια όπως υποδοχείς αυξητικού παράγοντα, G πρωτεΐνες, Src κινάσες τυροσίνης της οικογενείας και την ΡΙ3Κ [10] σηματοδότησης. Θεωρήθηκε ότι τα οιστρογόνα μπορούν ταχέως ενεργοποιούν διαφορετικές οδούς σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου του ΜΑΡΚ /ΕΚΚ, φωσφολιπάση C, ΡΙ3Κ /Akt και G οδούς υποδοχέα ενεργοποιημένης πρωτεΐνης-συζευγμένο στο μικροσπηλαίων [11].

Πρόσφατα, ταυτοποιήσαμε και κλωνοποιήθηκε μια νέα παραλλαγή του ER-α με μοριακό βάρος 36 kDa που ονομάστηκε ως ER-α36 [12]. Η αρχική 66 kDa ER-α ονομάστηκε ER-α66 [13]. ER-α36 μεταγραφή ξεκινά από έναν υποκινητή που βρίσκεται στο πρώτο ιντρόνιο του γονιδίου ER-α66 και δημιουργείται από δύο εναλλακτικών γεγονότων ματίσματος. ER-α36 έτσι πρωτεΐνης στερείται εξαρτώμενη από συνδετήρα και ανεξάρτητη από τομέα διενεργοποίησης (AF-1 και AF-2), αλλά διατηρεί πεδίο σύνδεσης DNA- και τον τομέα διμερισμού μερική και πεδία σύνδεσης συνδετήρα [12]. ER-α36 διαθέτει ένα μοναδικό τομέα 27 αμινοξέων στο Ο-τερματικό το οποίο αντικαθιστά τα τελευταία 138 αμινοξέα που κωδικοποιούνται από τα εξόνια 7 και 8 του γονιδίου ER-α66. προηγούμενη αναφορά μας έδειξαν ότι 17β-οιστραδιόλη και SERMs όπως η ταμοξιφένη μπορεί να επάγει ενεργοποίηση του μονοπατιού /ERK ΜΑΡΚ και διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω της μεμβράνης σχετιζόμενη ER-α36 [14]. έτσι Υποθέσαμε ότι ER-α36 μπορεί να σχετίζεται με την δραστικότητα αγωνιστή της ταμοξιφαίνης. Στην παρούσα έκθεση, μελετήθηκε η λειτουργία ER-α36 σε ΕΚ-θετικό MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού και Hec1A καρκίνου του ενδομητρίου κύτταρα και διερευνήθηκε η συμβολή της ΜΑΡΚ /ΕΚΚ και ΡΙ3Κ /Akt οδών που προκαλείται από ER-α36 στον αγωνιστή δράση της ταμοξιφαίνης στον καρκίνο του ενδομητρίου.

Αποτελέσματα

ER-α36 εκφράζεται στην πλασματική μεμβράνη σε MCF-7 και Hec1A κύτταρα

ER-α36 είναι μια νέα παραλλαγή του ER-α66 δημιουργούνται με εναλλακτική χρήση προωθητή και εναλλακτικό μάτισμα [12]. Για να εξεταστεί η έκφραση ER-α36 σε MCF-7 κύτταρα και τα κύτταρα Hec1A, ανάλυση Western blotting πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ειδικό αντίσωμα ER-Α36 έναντι των μοναδικών 20 αμινοξέα στο Ο-τερματικό της ER-α36. ER-α36 εκφράζεται σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 1Α, αριστερά). Ωστόσο, η ανάλυση στυπώματος Western απέτυχαν να ανιχνεύσουν έκφραση ER-α66 σε κύτταρα Hec1A (Εικ. 1Α, δεξιά), σύμφωνα με αυτήν την Hec1A είναι μια καρκινική κυτταρική σειρά ER-αρνητική [15]. Για να εξεταστεί η κυτταρική εντόπιση του ER-α36, δοκιμασία ανοσοφθορισμού εκτελέστηκε. Σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, χρώση ανοσοφθορισμού αποκάλυψε μια έντονη πρότυπο κατανομής μεμβράνης πλάσματος (Σχ. 1Β). ΜΙΚΡΟΣΠΗΛΑΙΑ Οι εγκολεασμένο μικροδομές επί της μεμβράνης του πλάσματος στην οποία caveolin-1 χρησιμεύει ως πρωτεΐνη ικρίωμα για να σχηματιστεί το σύμπλοκο σηματοδότησης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1C, caveolin-1 εκφράζεται κυρίως στην επιφάνεια του κυττάρου (κόκκινο). Συγχωνευθείσας εικόνες της ER-α36 και caveolin-1 έδειξε ουσιαστική σήματα συν-εντοπισμού (κίτρινο) στην μεμβράνη του πλάσματος.

Α, Η έκφραση της ER-α36 και πρωτεΐνη ER-α66 στο MCF-7 και Hec1A κύτταρα . Εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάζονται από MCF-7 και Hec1A κύτταρα και χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση στυπώματος Western. Β, Ο εντοπισμός του ER-α36 σε MCF-7 και Hec1A κύτταρα. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε καλυπτρίδες στερεώθηκαν και χρωματίστηκαν ανοσοφθορισμό με ένα ειδικό αντίσωμα αντι-ER-α36 (πράσινο). Τα κύτταρα αντίθετα με Hoechst 33258 (μπλε). C, Η συν-εντοπισμό των ER-α36 και caveolin-1 επί της μεμβράνης των κυττάρων Hec1A πλάσματος. Πράσινο: ER-α36? Κόκκινο: caveolin-1? μπλε: πυρηνική? σήματα κίτρινο, συν-εντοπισμού. Μπαρ, 10 μικρόμετρα. Α, ανάλυση χρονική πορεία της έκφρασης ER-α36 στα κύτταρα Hec1A. κύτταρα Hec1A υποβλήθηκαν σε αγωγή με 2 μΜ Tam για υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκαν με επίπεδο έκφρασης β-ακτίνης, και κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± SEM (n = 3). *, P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα

Η

Στη συνέχεια, αναλύσαμε συνδέτη που προκαλείται από την έκφραση ER-α36.. κυτταρικές γραμμές Hec1A υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ταμοξιφαίνη για διαφορετικά χρονικά σημεία και ER-α36 έκφραση αξιολογήθηκε με ανάλυση Western blotting, αποκαλύπτοντας ότι ER-α36 εκφράσεως είναι αυξημένο σε ταμοξιφαίνη επεξεργασμένα κύτταρα (Εικ. 1ϋ).

ER-α36 μεσολαβεί οιστρογόνα και Tamoxifen- εξαναγκασμένη ΕΚΚ ενεργοποίησης

για να διερευνήσουν τον μηχανισμό που διέπουν τη δράση αγωνιστή της ταμοξιφαίνης στον καρκίνο του ενδομητρίου κύτταρα, αποφασίσαμε να εξετάσουμε τη λειτουργία του ER-A36 στην ταμοξιφένη επεξεργασμένα κύτταρα Hec1A. Εξετάσαμε πρώτα τα επίπεδα φωσφορυλίωσης ΜΑΡΚ /ΕΚΚ, μια κινάση σερίνης-θρεονίνης εμπλέκονται σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό [16]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α και το Σχ. 2Β, Ε2 ή ταμοξιφένη θεραπείες οδηγούν σε ταχεία φωσφορυλίωση των ERK1 /2. Επανα-ανίχνευση της μεμβράνης με ένα συνολικό αντίσωμα ERK1 /2 έδειξε ότι η συνολική περιεκτικότητα σε ERK1 /2 δεν άλλαξε, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αυξημένη φωσφορυλίωση ERK1 /2 δεν προκλήθηκε από την αυξημένη έκφραση ERK1 /2.

Α και Β, κύτταρα Hec1A υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ηΜ Ε2 ή 2 μΜ Tam για τα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Επίπεδα /2 φωσφορυλίωση ERK1 μετρήθηκαν σε εκχυλίσματα πρωτεΐνης με ανάλυση Western blot. Σύνολο ERK1 /2 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± SEM (n = 3). *, Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Γ και Δ, ER-α36 έκφραση σε Hec1A /V και κύτταρα Hec1A /RNAi. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± SEM (n = 3). *, P & lt? 0,05 σε σύγκριση με το /V κύτταρα Hec1A. Ε, Hec1A /V και κύτταρα Hec1A /RNAi σε επεξεργασία με 10 ηΜ Ε2 ή 2 μΜ Tam αναλύθηκαν για τα επίπεδα του /2 φωσφορυλίωση ERK1 με κηλίδα Western. Σύνολο ERK1 /2 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης, και κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± SEM (n = 3). *, Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (-) έναντι θεραπείες. F, Κυτταρολύματα από Hec1A κύτταρα επεξεργασμένα με DMSO (διαδρομές 1, 2 και 3), 10 ηΜ Ε2 (διαδρομές 2 και 5), 2 μΜ Tam (λωρίδες 3 και 6) ή προκατεργάστηκαν με 10 μΜ U0126 (λωρίδες 4, 5 και 6 ) για 30 λεπτά αναλύθηκαν με ανάλυση Western blot.

η

για να δοκιμαστεί η συμμετοχή των ER-α36 στις δραστηριότητες της Ε2 και ταμοξιφαίνης παρατηρούνται σε κύτταρα Hec1A που στερούνται έκφρασης ER-α66, αποφασίσαμε να χτυπήσει κάτω ER-α36 έκφραση με την προσέγγιση siRNA. Έχουμε καθιερώσει σταθερές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν φορέα έκφρασης shRNA έναντι ER-α36 (κύτταρα Hec1A /RNAi) και εξετάστηκαν ER-α36 έκφραση (Σχ. 2C και 2D). Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Ε, Ε2 και ταμοξιφένη απέτυχε να διεγείρει τη φωσφορυλίωση της ERK1 /2 σε κύτταρα Hec1A με ER-A36 έριξε κάτω, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ER-A36 είναι ο υποδοχέας που μεσολαβεί τις δραστηριότητες των οιστρογόνων και της ταμοξιφαίνης.

Εξωκυττάρια ρυθμίζονται κινάσης κινάσης (ΜΕΚ) δρα ανοδικά της ERK1 /2 και θα μπορούσε να φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν ERK1 /2 [17]. Η ΜΕΚ ειδικό U0126 αναστολέα ανέστειλε αποτελεσματικά το 2 ενεργοποίηση ERK1 /διεγείρεται από Ε2 και tamoxifen (Σχ. 2F).

Διαπιστώσαμε επίσης σταθερές κυτταρικές σειρές από ER-θετικά καρκινικά κύτταρα MCF-7 μαστού που ιδιοσυστατικά εκφράζουν ανασυνδυασμένα ER -α36 (MCF-7 /ER36 κύτταρα) (Εικ. 3Α). Στον έλεγχο MCF-7 κύτταρα επιμολυσμένα με τον κενό φορέα, θεραπεία Ε2 επαγόμενη φωσφορυλίωση του ERK1 /2 (Σχ. 3Β), η οποία θα μπορούσε να καταργηθεί με tamoxifen (Σχ. 3C). Ωστόσο, η ταμοξιφένη επαγόμενη φωσφορυλίωση του ERK1 /2 σε MCF-7 /ER36 κύτταρα (Σχ. 3D). ΜΕΚ ειδικός αναστολέας U0126 ανέστειλε αποτελεσματικά το 2 ενεργοποίηση ERK1 /διεγείρεται από Ε2 και tamoxifen (Σχ. 3Ε). Συνεπώς, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ER-α36 μεσολαβεί στην οδό /ERK Ras /ΜΕΚ επάγεται τόσο από το οιστρογόνο και tamoxifen και πρότεινε ότι ER-Α36 μπορεί να εμπλέκεται σε ταμοξιφένη αντίσταση και ακόμη και την προώθηση της δράσης συναγωνιστή της ταμοξιφαίνης.

A , ανάλυση Western blot της έκφρασης ER-α36 σε 7 MCF-/ER36 κύτταρα MCF-7 /V και. Τα επίπεδα της έκφρασης κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα β-ακτίνης, και κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± SEM (n = 3). *, P & lt? 0,05 σε σύγκριση με 7 MCF-A /V κύτταρα. Β και C, MCF-7 /V κύτταρα κατεργασμένα μόνο με 10 ηΜ Ε2 ή με 2 μΜ Tam μαζί για τα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Εκχυλίσματα πρωτεΐνης αναλύθηκαν με ανάλυση κηλίδος Western. Σύνολο ERK1 /2 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± SEM (n = 3). *, Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. D, MCF-7 /ER36 κύτταρα που κατεργάζονται με 2 μΜ Tam για διαφορετικά χρονικά σημεία αναλύθηκαν για /2 φωσφορυλίωση ERK1 με κηλίδα Western. Τα επίπεδα της έκφρασης κανονικοποιήθηκαν σε επίπεδα της ολικής ERK1 /2, και κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± SEM (n = 3) *, Ρ & lt?. 0.05 σε σύγκριση προς τα μη κατεργασμένα κύτταρα. Ε, Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν από 7-MCF /ER36 κύτταρα επεξεργασμένα με DMSO (διαδρομές 1, 2 και 3), 10 ηΜ Ε2 (διαδρομές 2 και 5), 2 μΜ του Tam (λωρίδες 3 και 6) ή προκατεργάστηκαν με 10 μΜ U0126 (λωρίδες 4, 5 και 6) για 30 λεπτά και ανοσοστυπώθηκαν με αντισώματα έναντι pERK1 /2 ή ολική ERK1 /2.

Η

ER-α36 Μεσολαβεί οιστρογόνα και Tamoxifen Διεγειρόμενη ΡΙ3Κ /Akt Ενεργοποίηση

είναι γνωστό ότι η κινάση σερίνης /θρεονίνης Akt, ή πρωτεϊνική κινάση Β, παίζει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την επιβίωση με αναστολή της απόπτωσης [18]. Δοκιμάσαμε εάν Ε2 και θεραπείας με ταμοξιφαίνη προκαλεί επίσης ενεργοποίηση του μονοπατιού Akt σε κύτταρα Hec1A. Θεραπεία της Ε2 και tamoxifen οδήγησε σε ταχεία φωσφορυλίωση της Akt (Σχ. 4Α και 4Β), ενώ και οι δύο Ε2 και ταμοξιφένη απέτυχε να επάγει την φωσφορυλίωση της Akt σε κύτταρα Hec1A /RNAi (Εικ. 4C). Tamoxifen επάγεται επίσης Akt φωσφορυλίωση σε κύτταρα MCF-7 ότι οι εξαιρετικά εκφράζουν ανασυνδυασμένα ER-α36 (Εικ. 4Ε). Προεπεξεργασία με τον αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002 ακύρωσε την φωσφορυλίωση της Akt διεγείρεται από Ε2 ή tamoxifen σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 4D και 4F), υποδεικνύοντας ότι ER-α36 μεσολαβεί επαγόμενη ταμοξιφένη Akt φωσφορυλίωση μέσω της οδού ΡΙ3Κ σε αυτά τα κύτταρα. Έτσι, τα δεδομένα μας πρότειναν ότι ER-α36 μεσολάβηση activaton της ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι μπορεί επίσης να εμπλέκεται στην αντίσταση και αγωνιστή δράση του tamoxifen.

κύτταρα Hec1A υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ηΜ Ε2 (Α) ή 2 μΜ Tam (Β) για τα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία και τα λύματα ανοσοστυπώθηκαν με αντίσωμα έναντι φωσφορυλιωμένης Akt. Επίπεδα φωσφορυλίωσης κανονικοποιήθηκαν με τη συνολική Akt πρωτεΐνη, και κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± SEM (n = 3). *, Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. C, ανάλυση στυπώματος Western της φωσφορυλίωσης Akt σε Hec1A /V και κύτταρα Hec1A /RNAi ER36 επεξεργασία με 10 ηΜ Ε2 ή 2 μΜ Tam για 10 λεπτά. Επίπεδα φωσφορυλίωσης κανονικοποιήθηκαν με τη συνολική Akt πρωτεΐνη, και κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± SEM (n = 3). *, Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. #, Η P & lt? 0,05 σε σύγκριση με Ε2- ή Tam επεξεργασμένο Hec1A /V κύτταρα. D, τα κύτταρα Hec1A προκατεργάστηκαν με 50 μΜ αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002 (LY, διαδρομές 4, 5 και 6) για 2 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 ηΜ Ε2 (διαδρομές 2 και 5) ή 2 μΜ Tam (λωρίδες 3 και 6) για 10 λεπτά . Ε, ανάλυση Western blot της φωσφορυλίωσης Akt σε 7-MCF /ER36 κύτταρα που κατεργάζονται με 2 μΜ Tam για τα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Έκφραση κανονικοποιήθηκε σε ολική Akt, και κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± SEM (n = 3) *, Ρ & lt?. 0.05 σε σύγκριση προς τα μη κατεργασμένα κύτταρα. F, Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν από 7 MCF-/ER36 κύτταρα που υπέστησαν αγωγή με DMSO (διαδρομές 1 και 2), 2 μΜ του Tam (διαδρομές 2 και 4) ή σε προεπεξεργασία με 50 μΜ αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002 (LY, διαδρομές 3 και 4) για 2 h, και ανοσοαποτύπωση με αντισώματα έναντι φωσφορυλιωμένης Akt ή ολική Akt.

Η

ER-α36 εμπλέκεται στη ρύθμιση του c-myc έκφρασης της πρωτεΐνης σε Hec1A κύτταρα

πρωτοογκογονιδίου c-Myc έχει βαθιές μιτογονικά αποτελέσματα στα καρκινικά κύτταρα μέσω της ικανότητάς της να προάγει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [19]. Αντινόημα ολιγονουκλεοτίδια με c-Myc μπορεί να αναστείλει κύτταρα καρκίνου του μαστού πολλαπλασιασμό [20]. Tamoxifen αναστέλλει οιστρογόνο επαγόμενη έκφραση c-Myc σε ER-α66-θετικά κύτταρα καρκίνου του μαστού. Ωστόσο, ο-Μγο παίζει σημαντικό ρόλο στην ταμοξιφαίνη δράση αγωνιστή [21]. Μετρήσαμε τα επίπεδα έκφρασης του c-myc σε κύτταρα Hec1A αγωγή με Ε2 ή ταμοξιφένη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, κατεργασία με Ε2 ή επαγόμενη ταμοξιφένη έκφραση c-Myc in /V κύτταρα Hec1A αλλά όχι σε /RNAi κύτταρα ER-α36 Hec1A, η οποία θα μπορούσε να καταργηθεί στην πράξη από την U0126 αναστολέα ΜΕΚ (Εικ. 5Β) και αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002 (Σχ. 5C).

Α, ανάλυση κηλίδος Western της έκφρασης c-Myc σε Hec1A /V και κύτταρα Hec1A /RNAi σε επεξεργασία με 10 ηΜ Ε2 ή 2 μΜ Tam για 12 ώρες. Τα επίπεδα της έκφρασης κανονικοποιήθηκαν στα επίπεδα του β-ακτίνης, και κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± SEM (n = 3). *, Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (-) έναντι θεραπείες. #, Η P & lt? 0,05 σε σύγκριση με Tam επεξεργασμένο Hec1A /V κύτταρα. Β και C, Hec1A κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 12 ώρες με 10 ηΜ Ε2 ή 2 μΜ Tam ή μαζί με 10 μΜ του αναστολέα ΜΕΚ U0126 ή 50 μΜ αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002. Τα επίπεδα της έκφρασης c-Myc ομαλοποιήθηκαν στα επίπεδα του β-ακτίνης, και κάθε ράβδος αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± SEM (n = 3). *, Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (-) έναντι θεραπείες. #, Η P & lt?. 0.05 σε σύγκριση με Ε2- και Tam επεξεργασμένο Hec1A /V κύτταρα

Η

ER-α36 Μεσολαβεί Tamoxifen-διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα Hec1A

Για να μελετήσει περαιτέρω το ρόλο του ER-α36 στη ταμοξιφένη δραστικότητα αγωνιστή σε ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα, Hec1A /V και κύτταρα Hec1A /RNAi υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ταμοξιφένη και prolifaration τους μετρήθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ. δοκιμασίας ΜΤΤ έδειξε ότι η ταμοξιφαίνη τόνωσε την ανάπτυξη της /V κυττάρων Hec1A. Ωστόσο, η ταμοξιφένη ήταν ικανή να αναστείλει την ανάπτυξη των κυττάρων Hec1A /RNAi με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 6Α). Ο πολλαπλασιασμός κυττάρων που προκαλείται από tamoxifen ανεστάλη από τον αναστολέα ΜΕΚ U0126 και ΡΙ3Κ αναστολέα LY294002 (Εικ. 6Β), υποδηλώνοντας ότι τόσο η ΜΑΡΚ /ΕΚΚ και ΡΙ3Κ /Akt οδοί που εμπλέκονται στην Ε2 και tamoxifen διεγείρεται ανάπτυξη κυττάρου σε ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα.

Α, κύτταρα Hec1A επιμολυσμένα με τον κενό φορέα έκφρασης (Hec1A /V) ή κυτταρικές σειρές Hec1A στην οποία ERα36 είχαν σταθερώς χτυπηθεί κάτω από την έκφραση shRNA (Hec1A /RNAi) τοποθετήθηκαν πλάκες 96-φρεατίων (3 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις Tam σε μέσο που περιέχει 2,5% δεξτράνη απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα FBS για 72 ώρες. ΜΤΤ δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται στο

υλικά και μεθόδους

. Αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο και η μέση τιμή ± SEM δεικνύονται. *, P & lt? 0,05 σε σύγκριση με Tam επεξεργασμένο Hec1A /V κύτταρα αντίστοιχα. Β, κύτταρα Hec1A υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ηΜ Ε2 ή 2 μΜ Tam μαζί με 10 μΜ του αναστολέα U0126 ΜΕΚ ή 50 μΜ ΡΙ3Κ αναστολέα LY294002, αντίστοιχα, για 72 ώρες, και αναλύθηκαν με ανάλυση ΜΤΤ. Αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο και η μέση τιμή ± SEM δεικνύονται. *, Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. C, κενός φορέας έκφρασης επιμολυσμένα κύτταρα (MCF-7 /V) 7 MCF-ή MCF-7 κύτταρα επιμολυσμένα με (7 MCF-/ER36 κύτταρα) ERα36 φορέα έκφρασης τοποθετήθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκες (5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις της ταμοξιφαίνης σε μέσο που περιέχει 10% FBS για 72 ώρες. δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη. Αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο και η μέση τιμή ± SEM δεικνύονται. *, P & lt? 0,05 σε σύγκριση με Tam επεξεργασμένο 7 MCF-/ER36 κύτταρα αντίστοιχα. D, MCF-7 /V και MCF 7-/ER36 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 2 μΜ Tam μαζί με 10 μΜ U0126 ή 50 μΜ αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002, αντίστοιχα, για 72 ώρες και αναλύθηκαν με ανάλυση ΜΤΤ. Αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο και η μέση τιμή ± SEM δεικνύονται. *, Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο 7 MCF-/V κύτταρα

Η

Παρατηρήσαμε ότι η ταμοξιφένη πολλαπλασιασμός αναστέλλεται ισχυρά κυττάρων στις 7 MCF-/V κύτταρα, σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές ότι η ταμοξιφένη λειτουργεί ως ένας. ισχυρός ανταγωνιστής σε ΕΚ-θετικό καρκίνο του μαστού MCF-7 κυττάρων [22]. Ωστόσο, MCF-7 /ER36 κύτταρα που εκφράζουν ιδιοσυστατικά υψηλά επίπεδα ανασυνδυασμένης ER-α36 επέδειξε έλλειψη ευαισθησίας προς ταμοξιφαίνη θεραπεία (Εικ. 6C). Η ΜΕΚ αναστολέα U0126 και αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002 Επιπλέον ανέστειλε την ανάπτυξη και των δύο κυτταρικών σειρών (Σχ. 6D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι και πάλι υψηλό επίπεδο έκφρασης ER-α36 μπορεί συνεισφέρουν αντοχή σε tamoxifen.

Συζήτηση

Tamoxifen είναι ένα SERM που έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για την θεραπεία του προχωρημένου ER-θετικό καρκίνο του μαστού και να την πρόληψη του καρκίνου του μαστού σε υψηλού κινδύνου προ- και μετα-εμμηνοπαυσιακές γυναίκες ως χημειοπροληπτικός παράγοντας [23], [24]. Ωστόσο, η ταμοξιφένη έχει επίσης μερική οιστρογονική δραστικότητα στη μήτρα που μπορεί να οδηγήσει σε υπερπλασία του ενδομητρίου [25]. Μακροχρόνια ταμοξιφένη χρήση συνδέεται με αυξημένη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του ενδομητρίου [26]. Εδώ ανέφερε ότι ένα νέο παραλλαγή της ER-α, ER-α36, ότι εκφράζεται έντονα επί της μεμβράνης του Hec1A καρκίνου του ενδομητρίου κύτταρα του πλάσματος και στα ενδομητρίου δείγματα καρκίνου από ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με ταμοξιφαίνη για τουλάχιστον τρία χρόνια. Τόσο Ε2 και ταμοξιφαίνη που προκαλείται από τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων των κυττάρων Hec1A πιθανώς μέσω των οδών μη γενωμική σηματοδότηση μέσω ER-α36.

Μια σειρά από υποθέσεις έχουν προταθεί για να εξηγήσουν δράση αγωνιστή της ταμοξιφαίνης στην ενδομητρίου καρκινογένεση. Έχει προταθεί ότι οι μεταβολίτες αντιδραστικού της ταμοξιφαίνης μορφής DNA-προσαγωγών και παράγουν μεταλλάξεις στη ενδομήτριου ιστού [27]. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι η AF1 περιοχή της ER-α66, καθώς και σε κύτταρα και προαγωγού-ειδική πρόσληψη συνενεργοποιητή εμπλέκονται στην ταμοξιφαίνη δράση αγωνιστή [28], [29]. Ο ρόλος της ταμοξιφαίνης σε ενδομητρίου καρκινογένεση μπορεί να χρησιμοποιούν διακριτές γονιδιωματική δραστηριότητα [30]. Πρόσφατα, συσσωρεύοντας στοιχεία έδειχναν ότι τα μονοπάτια σηματοδότησης μεμβράνη ξεκίνησε προσδίδουν ταμοξιφαίνη αντίσταση και δράση αγωνιστή μέσα από διαφορετικές καταρράκτες κινάσης και διακριτή δεύτεροι αγγελιοφόροι [15].

Η οικογένεια ΜΑΡΚ αποτελείται από ERK, JNK και P38. ERK παίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό. JNK και ρ38 εμπλέκονται στην διαφοροποίηση των κυττάρων και την απόπτωση που επάγεται από ερεθίσματα όπως στρες υπεριώδες φως [31], γ ακτινοβολία [32], [33], το DNA-επιζήμια και chemopreventive φάρμακα [34]. Πολλοί ογκογόνο μόρια σηματοδότησης ενεργοποιήσετε την ΜΑΡΚ /ΕΚΚ μονοπατιού [35]. έκφραση ERK συνήθως αυξάνεται και η δράση της είναι επάνω ρυθμισμένη σε ιστούς καρκίνου του μαστού σε σύγκριση με τις γειτονικές τους φυσιολογικούς ιστούς [36]. Επιπλέον, η ταμοξιφένη αντίσταση

in vivo

κατά κύριο λόγο διαμεσολαβείται από μη γονιδιωματικών μηχανισμών. Genomic δράση οιστρογόνων φαίνεται λιγότερο δραστική [37], [38]. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι ER-α36 μεσολαβεί τόσο Ε2- και ταμοξιφένη επαγόμενη ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ /ΕΚΚ μονοπάτι και ER-α36 υπερέκφραση ταμοξιφαίνη κύτταρα ευαίσθητα MCF-7 μειωμένη ευαισθησία σε ταμοξιφαίνη. Επιπλέον, ER-α36 μεσολαβεί ταμοξιφένη επαγόμενη ενεργοποίηση του μονοπατιού ΜΑΡΚ /ΕΚΚ και συμβάλλει επίσης στην αγωνιστή δράση του ταμοξιφαίνη από την Hec1A καρκίνο του ενδομητρίου κύτταρα. Ενδομητρίου καρκινικούς ιστούς που εκφράζουν υψηλά ER-α36 εμφανίζεται επίσης υψηλά επίπεδα της φωσφορυλίωσης ERK.

Ο ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι παίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική ανάπτυξη και την επιβίωση [39]. Akt ενεργοποιείται από πολλούς μονοπάτια σηματοδότησης, όπως η υπερέκφραση των υποδοχέων αυξητικού παράγοντα, [40]. Εισαγωγή ενός συστατικώς δραστικής Akt σε κύτταρα MCF-7 θα μπορούσε να επάγει την ταμοξιφαίνη αντίσταση, προστατεύοντας τα κύτταρα από την ταμοξιφαίνη επαγόμενη απόπτωση [41]. Επιπλέον, η Akt δραστηριότητα dramaticaly αυξάνεται σε tamoxifen- ανθεκτικά κύτταρα MCF7 [18]. Σε ασθενείς φωσφορυλιωμένο Akt-θετικό, ενδοκρινική θεραπεία έχει χειρότερες αποτελεσματικότητα συγκριτικά με τους ασθενείς φωσφορυλιωμένο Akt-αρνητικά [42]. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ER-α36 μεσολάβηση ταμοξιφένη διεγείρεται ενεργοποίηση της Akt σε κύτταρα με υψηλά επίπεδα έκφρασης ER-α36 υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ /Akt μονοπατιού που διαμεσολαβείται από ER-α36 συνεισφέρει στην αντοχή και αγωνιστή δράση του tamoxifen .

Η πρωτεΐνη c-Myc είναι ένας παράγοντας πυρηνικής μεταγραφής που παίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική ανάπτυξη [43]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η ΜΑΡΚ /ΕΚΚ και οδούς ΡΙ3Κ /Akt ρυθμίζουν την έκφραση c-Myc πρωτείνης [44], [45], [46]. Βρήκαμε δύο Ε2 και tamoxifen επαγόμενη έκφραση c-Myc μέσω ER-α36-διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της ERK και Akt. Η επώαση των κυττάρων με Hec1A αναστολέα ΜΕΚ U0126 και αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002 μπλοκάρει Ε2- και tamoxifen- επαγόμενη έκφραση c-Myc. Ως εκ τούτου, η ταμοξιφένη ασκεί τη δράση συναγωνιστή μέσω μη γονιδιωματικών μονοπάτι ER-α36 μεσολάβηση.

Συνοπτικά, αναφέρουμε εδώ ότι ER-α36 εκφράζεται επί της μεμβράνης πλάσματος και στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων του ενδομητρίου καρκινώματος. Δείξαμε επίσης ότι και οι δύο Ε2 και ταμοξιφέν προωθείται πολλαπλασιασμού του ενδομήτριου καρκινικών κυττάρων μέσω ER-α36-διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ /ΕΚΚ και ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτια και ER-α36 υπερέκφραση οδήγησε σε ταμοξιφένη αντίσταση σε κύτταρα MCF-7. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν σημαντικές νέες πληροφορίες για την περαιτέρω κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν τη δράση αγωνιστή της ταμοξιφαίνης.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά και αντιδραστήρια

Όλα τα χημικά και τα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Sigma αναφέρεται εκτός εάν άλλως. Πολυκλωνικά αντι-ERK1 /2 αντίσωμα, πολυκλωνικά αντι-φωσφο-ERK1 /2 αντίσωμα (Thr

202 /Tyr

204), πολυκλωνικά αντι-caveolin-1 -TRITC αντίσωμα, μονοκλωνικό αντι-ο-Μγο αντίσωμα, πολύκλωνα αντι-Akt αντίσωμα, μονοκλωνικό αντι-ER-α66 (D-12) αντίσωμα και μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Πολυκλωνικά αντι-φωσφο-Ακί (Ser

473) αντίσωμα λήφθηκε από Signalway Antibody (Pearland, ΤΧ). Το ειδικό αντίσωμα ER-α36 έναντι των 20 μοναδικά αμινοξέα στο C-τερματικό της ER-α36, πλασμίδιο έκφρασης ER-α36, φορέα έκφρασης ER-α36 shRNA και τον κενό φορέα έκφρασης έχουν περιγραφεί πριν από τις [12], [14]. U0126 αγοράστηκε από την Calbiochem (La Jolla, CA).

Κυτταροκαλλιέργεια και κυτταρικές γραμμές

MCF-7 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού ελήφθησαν από την ATCC (Manassas, VA), και την ανθρώπινη Hec1A ενδομητρίου καρκινικά κύτταρα ελήφθησαν από το Δρ Λι-Hui Wei (Νοσοκομείο του Πεκίνου Πανεπιστήμιο του Λαού, στο Πεκίνο). Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2 σε κατάλληλο μέσο καλλιέργειας. Για τη δημιουργία των κυττάρων MCF-7 που εκφράζουν ανασυνδυασμένο ER-α36, τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα ανά 60 mm δίσκο και μορφομετατρέπονται 24 ώρες αργότερα με ένα φορέα έκφρασης που κινείται από τον cytomagalovirus (CMV) σε ο φορέας έκφρασης θηλαστικών pCB6 + όπως περιγράφεται αλλού [14], με τη χρήση της Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ο φορέας έκφρασης περιέχει τον πλήρους μήκους cDNA ER-α36. Ο κενός φορέας έκφρασης επίσης διαμολύνθηκε σε κύτταρα για να χρησιμεύσει ως έλεγχος. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα επανα-επιστρώθηκαν και επιλέγονται με 500 μg /ml του G418 για δύο εβδομάδες. Το μέσο αλλάχθηκε κάθε τρεις ημέρες έως ότου εμφανίστηκαν αποικίες. Οι κλώνοι επεκτάθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Οι κλώνοι με υψηλή έκφραση ER-α36 ήταν ένα μίγμα από περισσότερα από είκοσι κλώνους και ονομάζεται MCF-7 /ER-α36. Μία κυτταρική γραμμή με ομαδοποιήθηκαν κλώνους επιμολυσμένα με τον κενό φορέα έκφρασης ονομάστηκε MCF-7 /V και χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

Διαπιστώσαμε επίσης κυτταρικές σειρές από κύτταρα Hec1A επιμολυσμένα με ένα φορέα έκφρασης shRNA ER-α36 (Hec1A /RNAi) και ο κενός φορέας έκφρασης (Hec1A /V). Εν συντομία, ER-α36 shRNA φορέα έκφρασης pRNAT-U6.1 /Neo πλασμίδιο που περιέχει το shRNA έναντι ER-Α36 (GenScript Corp. ΤΧ) και τον κενό φορέα έκφρασης επιμολύνθηκαν σε κύτταρα Hec1A με Lipofectamine 2000 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα επανα-επιστρώθηκαν και επιλεγμένα με G418 (600 μg /ml) για δύο εβδομάδες. Οι κλώνοι επεκτάθηκαν για περαιτέρω ανάλυση.

ανοσοφθορισμού και συνεστιακό μικροσκόπιο

Ο κυτταρικός εντοπισμός της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με έμμεσο ανοσοφθορισμό. Hec1A ή MCF-7 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε αποστειρωμένο γυάλινες καλυπτρίδες στερεώθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS για 10 λεπτά. Αφού κατέστησαν διαπερατά με 0,4% Triton Χ-100 σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά, τα κύτταρα αποκλείστηκε σε 4% BSA-PBS συμπληρωμένο για 1 ώρα και επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C με αντι-ER-α36-ειδικό αντίσωμα. Μετά από τρεις πλύσεις σε PBS, τα κύτταρα σημάνθηκαν με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με FITC. Η χρωστική Hoechst 33258 DNA χρησιμοποιήθηκε για την πυρηνική χρώση.

Για διπλή χρώση του ER-α36 και caveolin-1, μετά από χρώση ER-α36 και πλύνετε σε PBS, τα κύτταρα αποκλείστηκε σε 4% BSA-PBS συμπληρωμένο για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από επώαση με αντι-caveolin-1-TRITC αντίσωμα όλη τη νύκτα, τα κύτταρα περαιτέρω πλύθηκαν σε PBS και χρωματίστηκαν με Hoechst 33258. Μικροσκοπικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός συνεστιακής λέιζερ σάρωσης μικροσκόπιο (Zeiss LSM 510 META, Germany).

Ημι-ποσοτική RT-PCR

Ολικό RNA εξήχθη με αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ολικό RNA (1.6 μ§) χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή του πρώτου κλώνου cDNA με αντίστροφη μεταγραφάση (Takara, Dalian, P.R.China). Οι ακόλουθες ομάδες εναρκτήρα σχεδιάστηκαν για την ενίσχυση του ανθρώπινου ER-α36 (BX640939, 1145-1434 bp): προς τα εμπρός, 5′-CAAGTGGTTTCCTCGTGTCTAAAGC-3 ‘και αντίστροφος, 5′-TGTTGAGTGTTGGTTGC CAGG-3′? GAPDH mRNA Ανθρώπινα ενισχύθηκε από τον πρόσθιο εκκινητή 5’-ACGGATTTGG TCGTATTGGG-3 ‘και τον ανάστροφο εκκινητή 5′-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3’.

ΜΤΤ Δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αναλύθηκε με τη χρήση του 3 – (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) 2,5- βρωμιούχο διφαινυλτετραζόλιο (ΜΤΤ) [47]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε μια τελική συγκέντρωση 5 × 10

3 7 MCF-/ER36 κύτταρα /φρεάτιο για MCF-7 /V και ή 3 × 10

3 /φρεάτιο για Hec1A /V και Hec1A /RNAi κύτταρα. MCF-7 /V και MCF-7 /ER36 κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FCS με τις υποδεικνυόμενες θεραπευτικές αγωγές. κύτταρα Hec1A /V και Hec1A /RNAi επωάστηκαν σε μέσο ελεύθερο ερυθρού φαινόλης που περιέχει 2.5% δεξτράνη απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα FCS (Biochrom AG, Βερολίνο, Γερμανία) με τα υποδεικνυόμενα θεραπείες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με ΜΤΤ (0,5 mg /ml) για 4 ώρες στους 37 ° C. Μετά την απομάκρυνση του μέσου που περιέχει το αντιδραστήριο ΜΤΤ, 150 μΐ DMSO προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Οι πλάκες διαβάστηκαν σε μήκος κύματος 490 nm χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών (Bioteck Powerwave ™, USA).

Western Blotting Ανάλυση

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε φαινόλη-κόκκινο-ελεύθερο μέσο με 2,5% δεξτράνη charcoal- απογυμνωμένο FCS για 48-72 ώρες και στη συνέχεια άλλαξαν σε μέσο χωρίς ορό 12 ώρες πριν από τη διέγερση από τους παράγοντες που αναφέρονται. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε παγωμένο PBS, και τα κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA με το κοκτέιλ αναστολέα πρωτεϊνάσης από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). Τα κυτταρολύματα υπέστησαν ζέση με ρυθμιστικό φόρτωσης πηκτής για 5 λεπτά στους 100 ° C, διαχωρίστηκαν σε 10% SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF, διερευνήθηκε με τα κατάλληλα αντισώματα και οπτικοποιούνται με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια αντιδραστήρια ανίχνευσης (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ).

Στατιστική ανάλυση

η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ζευγαρωμένων δειγμάτων

t-test

, ή ANOVA ακολουθούμενη από τη δοκιμή Student-Newman-Keuls για να προσδιοριστεί διαφορές στα μέσα.

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Ευχαριστίες

Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Δρ Λι-Hui Wei για την ευγενική παροχή των κυττάρων Hec1A.. Μπορούμε επίσης να ευχαριστήσω τον Δρ Yong-Feng Shang στο Πανεπιστήμιο του Πεκίνου και ο Δρ Heide Schatten στο Πανεπιστήμιο του Μισούρι για την προσεκτική ανάγνωση του χειρογράφου και προσεγμένες προτάσεις.