Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο προσδιορισμός ενός διαγνωστικού δείκτη με βάση το αίμα είναι ένας στόχος σε πολλούς τομείς της ιατρικής, συμπεριλαμβανομένης της έγκαιρης διάγνωσης του καρκίνου του προστάτη. Περιγράφουμε τη χρήση της κατά μέσο όρο διαφορικής εμφάνισης ως έναν αποτελεσματικό μηχανισμό για βιοδείκτη ανακάλυψη το RNA πλήρες αίμα. Η διαδικασία της μέσης τιμής μειώνει το πρόβλημα της κλινικής ετερογένειας ενώ ελαχιστοποιείται ταυτόχρονα χειρισμό του δείγματος.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

RNA απομονώθηκε από το αίμα των ασθενών με καρκίνο του προστάτη και υγιείς μάρτυρες. Τα δείγματα συνενώθηκαν και υποβλήθηκαν προς τη μέση διαδικασία διαφορικής εμφανίσεως. Οι μεταγραφές παρούσα σε διάφορα επίπεδα μεταξύ ασθενών και μαρτύρων καθαρίστηκαν και αλληλουχήθηκαν για ταυτοποίηση. επίπεδα μεταγραφής στο αίμα των ασθενών με καρκίνο του προστάτη και οι έλεγχοι ελέγχθηκε από ποσοτική RT-PCR. Μέσα συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας ένα t-test και μια καμπύλη δέκτη-λειτουργίας παρήχθη. Το δαχτυλίδι πρωτεΐνη δακτύλου 19Α (RNF19A) μεταγραφή ταυτοποιήθηκε ως έχουν υψηλότερα επίπεδα σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με υγιείς άνδρες μέσω της κατά μέσο όρο διαδικασία διαφορικής εμφανίσεως. Ποσοτική ανάλυση RT-PCR επιβεβαίωσε μια περισσότερο από 2-φορές υψηλότερο επίπεδο των επιπέδων RNF19A mRNA στο αίμα ασθενών με καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες (ρ = 0,0066). Η ακρίβεια των διακρίνει τους ασθενείς με καρκίνο από υγιείς άνδρες που χρησιμοποιούν τα επίπεδα RNF19A mRNA στο αίμα, όπως καθορίζεται από την περιοχή κάτω από την καμπύλη φορέα υποδοχής ήταν 0,727.

Συμπεράσματα /Σημασία

στον μέσο όρο απόκλιση οθόνη προσφέρει μια απλουστευμένη προσέγγιση για την διεξοδική εξέταση των υγρών του σώματος, όπως το αίμα, να εντοπίσει βιοδείκτες σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη. Επιπλέον, αυτή η απόδειξη της ιδέας μελέτη δικαιολογεί περαιτέρω ανάλυση των RNF19A ως κλινικά σημαντικό βιοδείκτη για την ανίχνευση του καρκίνου του προστάτη

Παράθεση:. Bai VU, Hwang O, Θεία GW, Μπαράκ ER, Menon Μ, Reddy GP- V, et al. (2012) κατά μέσο όρο διαφορική έκφραση για την ανακάλυψη βιοδεικτών στο αίμα ασθενών με καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 7 (4): e34875. doi: 10.1371 /journal.pone.0034875

Επιμέλεια: Rakesh Κ Srivastava, Το Πανεπιστήμιο του Κάνσας Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12 Οκτωβρίου, 2011? Αποδεκτές: 10 Μάρτη 2012? Δημοσιεύθηκε: 6 του Απρίλη, 2012

Copyright: © 2012 Bai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το Ουρολογικό Ινστιτούτο Vattikuti. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Αν και μεταστατικό καρκίνο του προστάτη παραμένει μια ανίατη ασθένεια [1], η παρέμβαση όταν η ασθένεια εξακολουθεί να είναι εντοπισμένη, και συνήθως ασυμπτωματική, είναι συχνά θεραπευτική [2], [3], [4]. Δεδομένου ότι η πρώιμη παρέμβαση είναι γνωστό ότι μειώνει τη θνησιμότητα σε άνδρες με καρκίνο του προστάτη [5], η έγκαιρη ανίχνευση κρατά την υπόσχεση για τη μείωση του καρκίνου ειδικά ποσοστά θνησιμότητας του προστάτη, αλλά η αποτελεσματικότητά της δεν έχει ακόμη καθοριστεί. Προστατικό ειδικό αντιγόνο (PSA) είναι η μόνη βιοδείκτης συνήθως σε χρήση για το σκοπό αυτό, αλλά έχει περιορισμούς με ατελή εξειδίκευση και ευαισθησία. Μια κανονική PSA δεν αποκλείει την παρουσία του δυνητικά θανατηφόρα καρκίνου του προστάτη [6] ενώ καλοήθης νόσος του προστάτη μπορεί να προκαλέσει αυξήσεις του PSA που μπορεί να απαιτούν βιοψία του προστάτη για τη διάγνωση. Οι περιορισμοί της εξέτασης PSA στη μείωση της θνησιμότητας του καρκίνου του προστάτη-φάνηκαν ξεκάθαρα όταν δύο μεγάλες τυχαιοποιημένες ελεγχόμενες μελέτες που δημοσιεύτηκαν αντικρουόμενα αποτελέσματα [7], [8]. Ακόμη και αν ερμηνευθεί σε ένα ευνοϊκό φως, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το όφελος επιβίωσης από τον έλεγχο του PSA ήταν μικρή, με 50 άνδρες που χρειάζονται να υποβληθούν σε προστατεκτομή για να σώσει μια ζωή [7]. Αυτό το αποτέλεσμα καταδεικνύει επίσης το πρόβλημα του υπερδιάγνωσης καρκίνου του προστάτη, όταν πολλοί άνδρες διαγνώστηκαν με βραδείας εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη που δεν θα επηρεάσουν τη θνησιμότητα τους, ακόμη και αν αφεθεί χωρίς θεραπεία. Ωστόσο, το γεγονός ότι ο καρκίνος του προστάτη παραμένει η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με τους άνδρες [9] είναι μια υπενθύμιση της σημασίας της ανίχνευσης δυνητικά θανατηφόρο καρκίνο του προστάτη όταν είναι ακόμα ιάσιμη. Έτσι, η αναγνώριση των πρόσθετων βιοδείκτες για να βελτιώσει την απόδοση του PSA παραμένει ένας σημαντικός στόχος στον καρκίνο του προστάτη έγκαιρη ανίχνευση, ειδικά στην ανίχνευση της επιθετικής νόσου.

Περιγράφουμε εδώ τη χρησιμότητα ενός κατά μέσο όρο διαφορικής έκφρασης (ADE ) προσέγγιση για τον εντοπισμό βιοδεικτών σε δείγματα αίματος των ανδρών με καρκίνο του προστάτη. Διαφορική μεθοδολογία οθόνη δεν απαιτεί προηγούμενη γνώση του RNA μεταγραφές. Διαφορική οθόνη προσφέρει έτσι μια «ανοικτή» σύστημα, στο οποίο μπορούν να εντοπιστούν και οι δύο γνωστές και άγνωστες μεταγραφές RNA που σχετίζεται με μία κατάσταση ασθένειας, γεγονός που το διαχωρίζει από την τεχνολογία μικροσυστοιχιών [10], [11]. Διαφορική οθόνη απαιτεί μικρές ποσότητες από την έναρξη της RNA (μόλις 20 ng ολικού RNA), και προσφέρει μια απαράμιλλη δυνατότητα για ταχεία ταυτοποίηση των μεταγραφών RNA παρόντος σε διαφορετικά επίπεδα σε δοκιμασία έναντι δειγμάτων αναφοράς? είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική στον εντοπισμό χαμηλή μεταγραφές αφθονία [11] που δεν μπορεί να ανιχνευθεί με τεχνολογίες εξέταση μικροδέσμης υβριδισμού που βασίζεται. Διαφορική οθόνη προσφέρει επίσης μια εξαιρετική ευκαιρία για να ανακρίνουν ολόκληρο το μεταγραφικό. Με βάση θεωρητικούς υπολογισμούς, τα 240 ζεύγη αυθαίρετη και άγκυρα εκκινητών αναμένεται να ενισχύσει -96% του εξέφρασε μεταγραφές RNA [12]. αλληλουχίας μεταγραφικό επόμενης γενιάς (π.χ., RNA-επόμενα) μοιράζεται μερικές από αυτές τις δυνάμεις (ανάλυση ολόκληρο το μεταγραφικό, εκ των προτέρων γνώση της ακολουθίας μεταγραφής δεν απαιτείται, μικρές ποσότητες ξεκινώντας απαιτείται RNA), ενώ προσφέρει επίσης τη δυνατότητα να διακρίνει αλληλομόρφων και συναρμολόγησης παραλλαγές που δεν είναι εύκολα αξιολογούνται με διαφορική εμφάνιση [13]. Ωστόσο, τα δεδομένα αλληλουχίας RNA-επόμενα θα παραποιήσει προς υψηλή μεταγραφές αφθονία και η τεχνολογία παραμένει μέχρι και 100 φορές πιο ακριβά από ό, τι διαφορικό οθόνη [13].

ADE διατηρεί τα πλεονεκτήματα της τεχνικής διαφορικής οθόνη, διευκολύνοντας παράλληλα την ανάλυση ετερογενών δειγμάτων. Η συγκέντρωση των ετερογενών δειγμάτων προσδιορίζει αποτελεσματικά μεταγραφές που εκφράζονται διαφορικά σε ένα υψηλό ποσοστό των δειγμάτων που περιλαμβάνουν δύο ομάδες [10]. Επιδιώξαμε να βελτιώσει περαιτέρω ADE μεθοδολογία με την επιτάχυνση του καρκίνου του προστάτη ανακάλυψη βιοδεικτών σε κλινικά σχετικών δειγμάτων. Παρά το γεγονός ότι ο χρυσός κανόνας της διάγνωσης του καρκίνου του προστάτη είναι η βιοψία του προστάτη, αυτή η διαδικασία είναι επώδυνη, επεμβατική και υπόκειται σε πιθανές επιπλοκές αιμορραγίας και λοίμωξης. Ως εκ τούτου, βιοδείκτες που μπορούν να προσδιοριστούν σε δείγματα όπως αίμα είναι επιθυμητές. Δεδομένου ότι δεν είναι όλοι οι βιοδείκτες που σχετίζονται με όγκους θα είναι ανιχνεύσιμη στο αίμα, την έναρξη της διαδικασίας ανακάλυψης στον ιστό του όγκου θα απαιτήσει αργότερα την επιπλέον δαπάνη χρόνου και πόρων για την επικύρωση σε δείγματα αίματος. Επιπλέον, βιοδείκτες με βάση το αίμα που αντιπροσωπεύουν μια απόκριση του ξενιστή σε όγκο δεν θα αναγνωρίζονται εάν βιοδεικτών ανακάλυψη ξεκίνησε σε δείγματα όγκων. Ειδική μέσων συλλογής αίματος επιτρέπει την αποτελεσματική ανάκτηση της μη διασπασμένης RNA από ολικό αίμα, ακόμη και μετά από παρατεταμένη επώαση σε θερμοκρασία δωματίου, καθιστώντας αυτό μια πρακτική επιλογή για κλινική εφαρμογή. έτσι αποφασίσαμε να ξεκινήσει η διαδικασία ανακάλυψης βιοδεικτών χρησιμοποιώντας δείγματα ολικού αίματος.

Αν και ADE έχει τυπικά χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση μεταγραφές που εκφράζονται διαφορικά στον ιστό (ως εκ τούτου, η ορολογία «κατά μέσο όρο διαφορική έκφραση»), προσαρμόσαμε αυτό τεχνική για τον εντοπισμό μεταγραφές RNA που υπάρχουν σε διαφορετικά επίπεδα στο RNA ολικό αίμα από δύο ομάδες των ασθενών. Αυτές οι μεταγραφές δεν είναι κατ ‘ανάγκη εκφράζονται διαφορικά σε κύτταρα που είναι παρόντα στο αίμα, ή ακόμη και σε όγκο συγκριτικά με φυσιολογικό ιστό, αλλά η παρουσία τους στο αίμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να διαφοροποιήσει μεταξύ αυτών των δύο ομάδων. Σε αυτή τη μελέτη, περιγράφουμε την χρήση του ADE να προσδιορίσει ένα μεταγράφημα RNA, (ID Gene: 25897) RNF19A, ότι είναι παρούσα σε υψηλότερα επίπεδα στο αίμα των ασθενών με καρκίνο του προστάτη από ό, τι στους υγιείς μάρτυρες. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν απόδειξη της αρχής που κατά μέσο όρο διαφορική έκφραση (ADE) μεθοδολογία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανακάλυψη σημειωτών RNA σε σωματικά υγρά των ανδρών με καρκίνο του προστάτη και να υποστηρίξει την μελέτη του RNF19A ως δυνητικού βιοδείκτης του καρκίνου του προστάτη.

Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλες οι έρευνες που αφορούν τα ανθρώπινα συμμετέχοντες εγκρίθηκε από την (HFHS) Διατροφή κριτική Θεσμικών Henry Ford Health System. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε για όλους τους συμμετέχοντες και όλους κλινική έρευνα διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι.

Ασθενείς και Συλλογής Αίματος

ασθενών με καρκίνο του προστάτη εντοπίστηκαν μέσω του Τμήματος ουρολογίας στο Henry Ford συστήματος Υγείας (HFHS). Υγιείς μάρτυρες είχαν προσληφθεί από το γενικό πληθυσμό και κλινικές HFHS Internal Medicine. Ολικού αίματος (2,5 ml) συλλέχθηκε σε σωλήνες PAXgene RNA Blood (Qiagen, Valencia, CA), επιτρέποντας τη μεταφορά σε θερμοκρασία δωματίου χωρίς υποβάθμιση του RNA. Τα δείγματα καταψύχθηκαν στους -80 ° C μέχρι διεξήχθη εκχύλιση του RNA.

Απομόνωση RNA

Αίμα στα PAXgene Blood RNA σωλήνες φυγοκεντρήθηκε. Το σφαιρίδιο πλύθηκε με RNase-free νερό και επαναιωρήθηκαν σε αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA). RNA εκχυλίστηκε σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Το απομονωμένο RNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με RNase-free DNase (Invitrogen, Carlsbad, CA) και η συγκέντρωση του ολικού RNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα qubit Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA).

μεσοτιμημένη διαφορικής έκφρασης (ADE)

Ολικό RNA από το αίμα του 10 ασθενείς και 10 υγιείς άνδρες συγκεντρώθηκαν χωριστά, αντίστροφη μεταγραφή, και υποβλήθηκαν σε ADE όπως περιγράφεται από Bai et al [10]. Anchor και αυθαίρετες εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την PCR ήσαν H-T11A και Η-AP17 (GenHunter Corporation, Nashville, ΤΝ). Οι αντιδράσεις PCR διεξήχθησαν εις διπλούν. Τα προϊόντα PCR ηλεκτροφορήθηκαν και ζώνες ανιχνεύθηκαν με αυτοραδιογραφία. Συγκροτήματα που διέφεραν σε ένταση μεταξύ των ασθενών με καρκίνο του προστάτη και υγιείς άνδρες κόπηκαν από την πηκτή, η εκ νέου ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας την ίδια άγκυρα και αυθαίρετων εκκινητών H-T11A και Η-AP17, και απ ‘ευθείας η αλληλουχία του.

qRT-PCR

το RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας τυχαία εναύσματα εξαμερών και Transcriptor της αντίστροφης μεταγραφάσης (Roche Applied Science, Indianapolis, ΙΝ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μετά την ανάστροφη μεταγραφή, το RNA υποβλήθηκε σε qPCR σε ένα Applied Biosystems 7500 Fast PCR Πραγματικού χρόνου System (Applied Biosystems, Foster City, CA) χρησιμοποιώντας αλληλουχία-ειδικούς εκκινητές για RNF19A (Δοκιμασία Id: Hs00968447_m1) και 18S RNA (Δοκιμασία Id: Hs03928985_g1 ). Ο αριθμός κύκλου στην οποία η αντίδραση διέσχισε ένα φθορισμού κατωφλίου (C

Τ) προσδιορίστηκε για κάθε μεταγράφημα, και το επίπεδο της κάθε δοκιμής γονιδίου σε σχέση με 18S RNA (μεταγραφή αναφοράς) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση 2

-ΔC

t, όπου ΔΟ

t = C

Τ, τεστ – C

t, ref [14]

Στατιστικές Μέθοδοι

Μέσα συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας ένα t. -δοκιμή. Η ισότητα των διακυμάνσεων της ομάδας ελέγχθηκε, και η τιμή p Satterthwaite αναφέρθηκε για διανομές με άνισες διακυμάνσεις. Ο συντελεστής συσχέτισης Pearson χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει γραμμική συσχέτιση. Μια καμπύλη χειριστή του δέκτη (ROC) δημιουργήθηκε με γραφική παράσταση της ευαισθησίας έναντι του ποσοστό ψευδώς θετικών (1 – ειδικότητα) ως διάκριση της δοκιμής ήταν ποικίλη. Η περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) υπολογίστηκε. Όλες οι στατιστικές υπολογισμοί έγιναν σε SAS.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Δείγματα αίματος ελήφθησαν από υγιείς άνδρες μάρτυρες και οι άνδρες με εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη πριν από την οριστική θεραπεία. Μετά την εκχύλιση του RNA, 20 ng ολικού RNA από καθένα από τους ασθενείς καρκίνου του προστάτη 10 ή από κάθε ένα από τα 10 υγιείς άνδρες συνενώθηκαν για να σχηματίσουν δύο χωριστών ομάδων RNA (καρκίνου του προστάτη έναντι υγιών) τα οποία στη συνέχεια αναλύθηκαν με ADE όπως περιγράφεται από τον Bai et al [10]. PCR ενίσχυση χρησιμοποιώντας ένα σετ άγκυρα και αυθαίρετο εκκινητή εκτελέστηκε εις διπλούν και τα προϊόντα της αντίδρασης υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα (Εικ. 1).

Όπως φαίνεται στο Σχ. 1, ανάλυση ADE προσδιόρισε δύο μεταγραφές RNA ενισχύθηκε σε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα σε δείγματα αίματος από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη (Ca) από ότι σε εκείνες από υγιείς άνδρες (H). Η ανάλυση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων (Σχ. S1, συμπληρωματικά στοιχεία) αποκάλυψε ότι αυτές οι δύο μεταγραφές μοιράζονται μια κοινή αλληλουχία και ότι αυτή η αλληλουχία είχε 100% ομολογία με την αλληλουχία νουκλεοτιδίων στην πρωτεΐνη δαχτυλίδι δάχτυλο 19Α (RNF19A) μεταγραφή mRNA. RNF19A, που ονομάζεται επίσης Dorfin, είναι μια Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης είναι γνωστό ότι εκφράζονται σε παθολογικές τα εγκλείσματα βρίσκονται σε νόσο του Parkinson, αμυοτροφική πλευρική σκλήρυνση, και άνοια σώματος Lewy [15]. RNF19A ubiquitinates synphilin-1 και μεταλλαγμένων υπεροξειδική δισμουτάση 1 (SOD1), τα οποία εμπλέκονται στην παθογένεση αυτών των νευροεκφυλιστικών διαταραχών [16], [17]. RNF19A δεν έχει προηγουμένως συσχετιστεί με τον καρκίνο, η οποία υπογραμμίζει τη χρησιμότητα της διαφορικής εμφάνισης στον εντοπισμό νέων ενώσεων. Ωστόσο, τόσο RNF19A και τους στόχους της (SOD1 και synphilin-1) έχουν εμπλακεί στην επιβίωση των κυττάρων και οδούς κυτταρικού θανάτου [18], [19], [20]. SOD1 έχει ειδικά σχετίζεται με τον καρκίνο του προστάτη [21], [22] και μπορεί να εμπλέκεται στην κυτταρική απόκριση σε βλάβη του DNA μέσω του ρόλου της στην οδό οξειδωτικού στρες. Άλλα Ε3-ουβικιτίνης λιγάσες, όπως RNF6, αναφέρονται στη ρύθμιση της δραστηριότητας υποδοχέα ανδρογόνων σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη [23].

ανάλυση ADE προσδιόρισε δύο μεταγραφές RNA με επίπεδα σημαντικά υψηλότερα σε RNA ολικού αίματος από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη ( Ca) από ότι σε υγιείς άνδρες (H). Νουκλεοτιδίων ανάλυση αλληλουχίας αποκάλυψε ότι αυτές οι δύο μεταγραφές μοιράζονται μια κοινή αλληλουχία. Αυτή η αλληλουχία είχε 100% ομολογία με την αλληλουχία νουκλεοτιδίων στην Ε3-ουβικιτίνης λιγάση παράμεσου Protein 19α (RNF19A) μεταγραφή και βρίσκεται στην 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (UTR).

Η

Μετά την ταυτοποίηση των η μεταγραφή RNF19A ως δυνητικό βιοδείκτη διακρίνει το αίμα των ασθενών με καρκίνο του προστάτη από το αίμα υγιών ελέγχων, qRT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί το επίπεδο της μεταγραφής, σε σχέση με εκείνη του 18S RNA, σε δείγματα ολικού RNA αίματος από μεμονωμένους ασθενείς. Σχετικά επίπεδα RNF19A μετρήθηκαν σε 33 ασθενείς με καρκίνο του προστάτη και 19 υγιείς άνδρες μάρτυρες. Αυτές οι ομάδες ήταν ανεξάρτητες από τις ομάδες ασθενών που χρησιμοποιούνται για τη διαδικασία ανακάλυψης ADE. Τα δείγματα ελέγχου (διάμεση ηλικία 40 ετών, εύρος 31-50 έτη) ελήφθησαν από τον γενικό πληθυσμό, και ως εκ τούτου, δεν ήταν της ίδιας ηλικίας σε περιπτώσεις καρκίνου του προστάτη. Τα βασικά κλινικά δεδομένα για την ομάδα του καρκίνου του προστάτη παρουσιάζεται στον Πίνακα 1. Όλες οι περιπτώσεις καρκίνου του προστάτη είχαν συμβατική αδενοκαρκίνωμα σε παθολογική εξέταση και καμία δεν ήταν τεκμηριωμένες να έχουν κομβική διαφυγή ή μακρινό μεταστατική νόσο. Τα σχετικά επίπεδα RNF19A όπως μετράται με qRT-PCR που φαίνεται στο Σχ. 2 (για τη σύγκριση των πρώτων C

δεδομένων T, ανατρέξτε συμπληρωματικά στοιχεία, Πίνακας S1). Η μέση σχετική στάθμη της RNF19A ήταν 4,79 ± 0,91 (SE) σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με 1,96 ± 0,39 (SE) στους υγιείς μάρτυρες. Αυτή η διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων ήταν στατιστικά σημαντική (p = 0,0066). Μια παρόμοια στατιστικά σημαντική διαφορά στα επίπεδα RNF19A μεταξύ των ασθενών με καρκίνο του προστάτη και των υγιών μαρτύρων ελήφθη όταν τα επίπεδα αξιολογήθηκαν με χρήση ημι-ποσοτική RT-PCR (Σχ. S2, συμπληρωματικά στοιχεία).

Η

Ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε δείγματα ολικού RNA αίματος από ασθενείς με εντοπισμένο καρκίνο του προστάτη (n = 33), καθώς και υγιείς άνδρες μάρτυρες (n = 19). Επίπεδα RNF19A μεταγραφή ομαλοποιήθηκαν με 18S RNA (γονίδιο αναφοράς). Τα κανονικοποιημένα αποτελέσματα παρουσιάζονται σε μορφή Θηκόγραμμα, με κουτιά που αντιπροσωπεύουν το 25

ου, 50

ου, και 75

ου τοις εκατό και μουστάκια που αντιπροσωπεύουν το 10

ου και 90

ου εκατοστημόρια του δεδομένα. Ακραίες τιμές εμφανίζονται επίσης. Η διαφορά μεταξύ των μέσων ήταν στατιστικά σημαντική (p = 0.0066).

Η

Μια καμπύλη δέκτη-λειτουργίας για RNF19A δημιουργήθηκε ως μια συνολική εκτίμηση της ευαισθησίας και ειδικότητας αυτού του βιοδείκτη αίματος για τη διάκριση των περιπτώσεων καρκίνου του προστάτη από τους ελέγχους (Σχ. 3). Η AUC για το μοντέλο ήταν 0,7273, όπου ένας AUC του 1 αντιστοιχεί σε ένα διαγνωστικό τεστ με τέλεια (100%) ειδικότητα και ευαισθησία. Ως σημείο αναφοράς, η AUC για την PSA έχει εκτιμηθεί σε 0,640 έως 0,678, ενώ η AUC για ένα δημοφιλές νομογράφημα που λαμβάνει υπόψη άλλους παράγοντες κινδύνου του καρκίνου του προστάτη, εκτός από το επίπεδο του PSA έχει εκτιμηθεί σε 0.691 [24], [ ,,,0],25], [26].

μια καμπύλη δέκτη-λειτουργίας (ROC) δημιουργήθηκε ως μια προκαταρκτική εκτίμηση της ακρίβειας των σχετικών επιπέδων της RNF19A στην ταξινόμηση των ασθενών με καρκίνο ή υγιείς μάρτυρες στην ομάδα των ασθενών μας. Η αλήθεια θετικό ποσοστό (ευαισθησία) σχεδιάστηκε έναντι του ψευδώς θετικό ποσοστό (1-ειδικότητα). Η περιοχή κάτω από την καμπύλη υπολογίστηκε ως 0,7273.

Η

Αν και το εύρημα αυτό είναι ενθαρρυντικό, θα πρέπει να σημειωθεί ότι η χρήση του PSA για τη διαφοροποίηση των ασθενών με καρκίνο του προστάτη από τους ελέγχους σε ομάδες μας μπορεί να έχει επίσης ως αποτέλεσμα μια βελτιωμένη AUC δεδομένης της σχετικά νεαρότερη ηλικία υγιών ομάδα μας. Με μέση ηλικία των 40, η αναμενόμενη PSA σε υγιή ομάδα μας θα ήταν λιγότερο από 1,0 ng /mL, σημαντικά χαμηλότερο από τη μέση τιμή του PSA του 6,4 ng /mL δει σε ομάδα καρκίνου του προστάτη μας. Ωστόσο, τα επίπεδα RNF19A δεν συσχετίζονται με την ηλικία (συντελεστής Pearson 0.09), γεγονός που καθιστά απίθανο ότι τα ευρήματά μας είναι απλά οφείλεται σε μια ηλικία που σχετίζονται αποτέλεσμα. Σαφώς, περαιτέρω επικύρωση πρέπει να πραγματοποιείται σε πληθυσμούς που μοιάζουν περισσότερο με το πραγματικό περιβάλλον των ασθενών που παραπέμπονται για βιοψία του προστάτη. Επιπλέον, απομένει να καθοριστεί αν RNF19A ή άλλα τέτοια βιοδείκτες θα προσθέσει επιπλέον αξία σε κλινικά καθιερωμένες μεθόδους για να δημιουργήσει τον κίνδυνο καρκίνου του προστάτη, όπως PSA, την ηλικία, τη φυλή και το οικογενειακό ιστορικό. Αυτή η μελέτη δεν είχε σχεδιαστεί για να αντιμετωπίσει το κρίσιμο ζήτημα της αυξημένης ανίχνευση του καρκίνου του δυνητικά θανατηφόρα, αποφεύγοντας παράλληλα την υπερδιάγνωσης του καρκίνου νωχελικός. Περαιτέρω προσπάθειες για την ανακάλυψη βιοδεικτών για τον εντοπισμό αυτά τα θανατηφόρα υποτύπους αποτελούν βασικό στόχο για το μέλλον.

Εν κατακλείδι, εμείς περιγράφουμε εδώ τη χρήση του κατά μέσο όρο διαφορικής έκφρασης για τον εντοπισμό RNF19A ως μεταγραφή RNA που είναι παρόν σε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα στο αίμα των ασθενών με καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες. Στο δείγμα μας των ασθενών, αυτή η μεταγραφή ήταν σε θέση να διακρίνουν τους ασθενείς με καρκίνο του προστάτη από τους ελέγχους με την AUC της καμπύλης δέκτη-λειτουργίας των 0,7273. Τα αποτελέσματα που συζητούνται εδώ την απόδειξη του κύκλου αρχή ότι η μεθοδολογία ADE μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανακάλυψη των δεικτών RNA στο αίμα των ανδρών με καρκίνο του προστάτη και δικαιολογούν την περαιτέρω ανάλυση των RNF19A ως κλινικά σημαντικό βιοδείκτη για τον καρκίνο του προστάτη η έγκαιρη διάγνωση.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

χρωματογραφήματα των ADE-προσδιορίζονται μεταγραφές. Δείγματα από υγιείς ελέγχους και τους ασθενείς με καρκίνο του προστάτη υποβλήθηκαν σε ανάλυση κατά μέσο όρο διαφορική έκφραση. Μεταγραφών (Α και Β), που υπάρχει σε διάφορα επίπεδα σε υγιείς μάρτυρες σε σύγκριση με ασθενείς με καρκίνο του προστάτη, υποβλήθηκαν σε ανάλυση αλληλουχίας. Τα χρωματογραφήματα από τις αντιδράσεις αλληλούχισης τόσο για μεταγραφής Α και Β, τα οποία υποδεικνύουν ένα πανομοιότυπο κοινή αλληλουχία. Δεδομένης της ανάλυση της γέλης διαφορικής εμφάνισης, η διαφορά στο μήκος μεταξύ των δύο ζωνών (Α και Β) δεν είναι περισσότερο από αρκετά νουκλεοτίδια. Μια διαφορετική θέση ανόπτησης είτε για την τυχαία αστάρι ή το αστάρι polyA μπορεί να εξηγήσει αυτό το αποτέλεσμα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0034875.s001

(PPT)

Εικόνα S2. ανάλυση

RT-PCR του RNF19A στο αίμα από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη και υγιείς άνδρες. Επίπεδα RNF19 αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ημι-ποσοτική RT-PCR. RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας τυχαία εξαμερή ή ολιγο (dT) εκκινητή και Transcriptor της αντίστροφης μεταγραφάσης (Roche Applied Science) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ενίσχυση του cDNA έγινε χρησιμοποιώντας αλληλουχία-ειδικούς εκκινητές του RNF19A και GAPDH γονίδια. Τα προϊόντα PCR έτρεξαν σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 2%. Η ποσοτικοποίηση των ζωνών του cDNA στο πήκτωμα διεξήχθη με ψηφιακή ανάλυση ένταση της ζώνης με τη χρήση ενός ακόμη βίντεο σύστημα Eagle Eye II με το λογισμικό που παρέχεται από την Stratagene (La Jolla, CA). επίπεδα μεταγραφής RNF19A ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη σε σύγκριση με τους μάρτυρες

doi:. 10.1371 /journal.pone.0034875.s002

(PPT)

Πίνακα S1.

Πρώτες C

Τα δεδομένα Τ που παρουσιάζονται για τις ομάδες επικύρωση των ασθενών με καρκίνο του προστάτη (PRCA PTS) και υγιείς μάρτυρες. Η μέση C

αξίες T ήταν χαμηλότερες σε PRCA πόντους σε σύγκριση με τους ελέγχους (28.25 έναντι 29.50, p = 0.02). Η μέση C

αξίες T για το γονίδιο αναφοράς 18S δεν ήταν στατιστικά σημαντικά μεταξύ ασθενών και μαρτύρων (16,62 έναντι 16,67, p = 0.89). Μέσα συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας ένα t-test

doi:. 10.1371 /journal.pone.0034875.s003

(DOC)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελαν να ευχαριστήσω τους ασθενείς και τις οικογένειές τους που έκαναν δυνατή αυτή τη δουλειά.