Αφηρημένο

Σε αυτή τη μελέτη ένα microRNA (miRNA) υπογραφή εντοπίστηκε σε γεμσιταβίνη ανθεκτικό παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) μοντέλο κυτταρική σειρά (BxPC3-GZR) και η υπογραφή αυτή εξετάστηκε περαιτέρω σε προχωρημένες PDAC δείγματα όγκων από τη βάση δεδομένων Cancer Genome Atlas (TCGA). BxPC3-GZR έδειξε μεσεγχυματικά φαινότυπο, εξέφρασαν υψηλά επίπεδα CD44 και έδειξε μια εξαιρετικά σημαντική απορρύθμιση των 17 miRNAs. Βασισμένο σε σχέση με τον καρκίνο, μια υπογραφή επτά-miRNA (miR-100, miR-125b, miR-155, miR-21, miR-205, miR-27b και miR-455-3p) επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτες. Μια ισχυρή συσχέτιση παρατηρήθηκε για έξι από τα επτά miRNAs σε 43 προηγμένες δείγματα όγκου σε σύγκριση με φυσιολογικό πάγκρεας ιστό. Για να εκτιμηθεί η λειτουργική συνάφεια που αρχικά επικεντρώθηκε στην miRNA-125β, η οποία είναι υπερ-εκφράζεται τόσο στο μοντέλο BxPC3-GZR και προηγμένες δείγματα όγκων PDAC. Εξόντωση miRNA-125b σε BxPC3-GZR και τα κύτταρα Panc-1 προκάλεσε μια μερική αντιστροφή του φαινοτύπου μεσεγχυματικών και ενισχυμένη απόκριση σε gemcitabine. Επιπλέον, RNA-επόμενα δεδομένα από κάθε ένα από 40 προηγμένα δείγματα όγκων PDAC από τη βάση δεδομένων TCGA δείχνουν μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των miRNA-125b και πέντε από τις έξι πιθανών γονιδίων στόχων (

BAP1

,

BBC3

,

NEU1

,

BCL2

,

STARD13

). Μέχρι στιγμής, δύο από αυτά τα γονίδια στόχους,

BBC3

και

NEU1

, που είναι ογκοκατασταλτικά γονίδια, αλλά δεν έχει ακόμη μελετηθεί σε PDAC, φαίνεται να είναι λειτουργική στόχους του miR-125b αφού knockdown του miR125b προκαλούνται ρύθμιση τους επάνω. Αυτά τα miRNAs και μοριακοί στόχοι τους μπορούν να χρησιμεύσουν ως στόχοι για την ενίσχυση της ευαισθησίας σε χημειοθεραπεία και τη μείωση μεταστατική εξάπλωση

Παράθεση:. Bera Α, VenkataSubbaRao Κ, Manoharan MS, Λόφος P, Freeman JW (2014) Ένα miRNA Υπογραφή χημειοθεραπεία μεσεγχυματικά Φαινότυπος Αναγνωρίζει νέων μοριακών στόχων συνδεδεμένων με προχωρημένο καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 9 (9): e106343. doi: 10.1371 /journal.pone.0106343

Επιμέλεια: Shrikant Anant, Πανεπιστήμιο του Κάνσας Ιατρική Σχολή, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 Απριλίου, 2014? Αποδεκτές: 6 Ιουλίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 3 Σεπ 2014

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Χρησιμοποιήσαμε τα στοιχεία για την ανάλυσή μας αποτελούν το κοινό αποθετήριο – ο καρκίνος Genome Atlas (TCGA) Δεδομένα Portal https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/. Αυτό παρέχει μια πλατφόρμα για τους ερευνητές να αναζητήσετε, να κατεβάσετε και να αναλύσει σύνολα δεδομένων που δημιουργούνται από TCGA. Περιέχει κλινικές πληροφορίες, γονιδιακά δεδομένα χαρακτηρισμό και ανάλυση αλληλουχίας υψηλό επίπεδο των γονιδιωμάτων του όγκου

Χρηματοδότηση:. Η χρηματοδότηση που προβλέπεται από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας-RO1CA069122 να JWF, Υποθέσεων Βετεράνων Merit Award 1I01BX000927 να JWF και William και Eula Owens Ίδρυμα Ιατρικής Έρευνας στο JWF. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

PDAC συνεχίζει να έχει τη χειρότερη πρόγνωση του οποιουδήποτε στερεού όγκου. Το 2013, εκτιμάται ότι περισσότερα από 45.000 νέα περιστατικά θα διαγνωστούν στις Ηνωμένες Πολιτείες με τη θνησιμότητα σε συχνότητα αναλογία σχεδόν ίση με το ένα [1]. Η γεμσιταβίνη είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη χημειοθεραπεία για τον καρκίνο του παγκρέατος, αλλά είναι σημαντικά μεταβολίζεται στο πλάσμα και ως εκ τούτου απαιτεί υψηλές δόσεις που οδηγούν σε τοξικότητα [2]. Πολλοί PDAC είναι αρχικά ανθεκτικό σε γεμσιταβίνη και να ανταποκρίνεται αυτοί γενικά αναπτύσσουν αντίσταση κατά την πορεία της θεραπείας [3].

Απομένει να καθοριστεί αν η χημειοθεραπεία φαινότυπος προκαλείται ως αποτέλεσμα της θεραπείας ή εάν υπάρχει ένας υποπληθυσμός των καρκινικών κυττάρων εντός του όγκου που είναι εκ φύσεως πιο ανθεκτικοί στη θεραπεία. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι οι περισσότεροι συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένων PDAC κατέχουν μια ξεχωριστή υποπληθυσμό καρκινικών βλαστοκυττάρων (ΚΕΠ). Τα στοιχεία δείχνουν επίσης ότι η ΚΕΠ είναι εγγενώς πιο ανθεκτικά στην χημειοθεραπεία και να αξιοποιήσει το δυναμικό αυτο-ανανέωσή τους για την αναγέννηση νέων όγκων ανάπτυξη [4]. Μια προηγούμενη μελέτη συνδέει ΚΕΠ με επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) [5].

EMT αντιπροσωπεύει ένα πρόγραμμα trans-διαφοροποίηση που απαιτείται για τη μορφογένεση των ιστών κατά τη διάρκεια διαφορετικών κυτταρικών αναπτυξιακή εξέλιξη [6]. Η διαδικασία EMT μπορεί να ρυθμίζεται από μία ποικιλία κυτοκινών και αυξητικών παραγόντων, όπως ΤΟΡ-β, των οποίων οι δραστηριότητες απορυθμισμένη κατά την διάρκεια της προόδου του όγκου [7]. EMT επαγωγή στα καρκινικά κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα την απόκτηση επεμβατική και μεταστατικές ιδιότητες. Μελέτες δείχνουν επίσης ότι EMT συμβάλλει επίσης στη χημειοαντίσταση και ότι τα κύτταρα αυτά έχουν δείκτες CSC [8]. Η ανάπτυξη των χημειοαντίσταση σε καρκινικά κύτταρα σε αντικαρκινικά φάρμακα συμπεριλαμβανομένων των gemcitabine μπορεί να ρυθμιστεί ή να συμβάλει στην από μικρο-RNAs (miRNAs). miRNAs είναι μικρά μη-κωδικοποίησης των μορίων RNA (22 νουκλεοτίδια), οι οποίες παίζουν κρίσιμους ρόλους στην μεταγραφική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Η ανάπτυξη του χημειοαντίσταση μέσω της αύξησης του αριθμού των ΚΕΠ έχει αποδοθεί σε μεταβολές στο επίπεδο των miRNAs στην παγκρέατος και άλλων στερεών όγκων [9].

Πρόσφατα ευρήματα δείχνουν μια σχέση μεταξύ miRNAs, EMT φαινότυπο, ΚΕΠ και χημειοαντίσταση [10], [11]. Μελέτες δείχνουν επίσης ότι miRNAs παίζουν ρόλο στη ρύθμιση της διαδικασίας ΕΜΤ [3], [11]. Για παράδειγμα, έχουν miRNAs δειχθεί να οδηγεί ΕΜΤ ρυθμίζοντας καντερίνη 1 και επιπρόσθετα μόρια που συνδέονται ΕΜΤ [12]. MiR-200A, miR-200b και miR-200c ήταν κάτω ρυθμίζονται σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα γεμσιταβίνης ανθεκτικά [13]. Μελέτες δείχνουν επίσης ότι η εκ νέου έκφραση της οικογένειας miR-200 των miRNAs μέχρι ρυθμιζόμενης cadherin 1 και κάτω ρυθμίζονται ZEB1 και βιμεντίνης [14]. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα με φαινότυπο EMT και ότι ήταν ανθεκτικά σε gemcitabine έδειξαν κάτω ρύθμιση ας-7 μέλη [5], [15], [16]. In vitro μελέτες δείχνουν PDAC δεσμό μεταξύ EMT, διεισδυτικότητα και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία και άλλες μελέτες υποστηρίζουν την ιδέα ότι miRNAs παίζουν ρόλο σε αυτές τις διαδικασίες με τη ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου [3], [11].

Σε αυτό μελέτη επιδιώξαμε να εντοπίσει μια υπογραφή miRNA για τα κύτταρα PDAC που κατέχουν στη χημειοθεραπεία και ένα φαινότυπο μεσεγχυματικά (παρουσία αντισωμάτων CRMP). Επειδή οι ασθενείς με προχωρημένο PDAC τείνουν να δείχνουν ελάχιστη ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία που καθορίζεται περαιτέρω αν αυτή η υπογραφή miRNA μπορεί να αντανακλάται σε ιστούς όγκων τους. Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι η θεραπεία γεμσιταβίνης επάγει έναν πληθυσμό κυττάρων με παρουσία αντισωμάτων CRMP in vitro και ότι μια υπογραφή miRNA που επιλέγεται για αυτή την παρουσία αντισωμάτων CRMP μοιράζεται με όγκους δείγματα από προχωρημένη PDAC. Επιπλέον, αυτή η μελέτη ήταν σε θέση να αποδείξει αρχικά μια λειτουργική συνάφεια το ένα πάνω εκφράζεται miRNA (miR-125b) από αυτή την υπογραφή και των πιθανών γονιδίων στόχων ογκοκατασταλτικά. Η μελέτη αυτή παρέχει τη βάση για περαιτέρω τεμαχίζοντας τους ρόλους των miRNAs στην παρουσία αντισωμάτων CRMP. Αυτά τα miRNAs και μοριακούς στόχους τους μπορεί να είναι η παροχή νέων θεραπευτικών στρατηγικών για την εξάλειψη ενός πληθυσμού των κυττάρων του όγκου που είναι γενικά ανθεκτικά στην gemcitabine και πιθανώς άλλες χημειοθεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

η γεμσιταβίνη αγοράστηκαν από LKT Laboratories, Inc (St. Paul, ΜΝ) διαλύθηκε σε στείρο διάλυμα PBS. Αντίστροφη αντιδραστήρια μεταγραφή και TaqMan πραγματικού χρόνου PCR master-mix αγοράστηκαν από την Applied Biosystems /Life Technologies (πόλη Foster, CA). Όλα τα άλλα χημικά ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ).

Οι κυτταρικές σειρές

Η ανθρώπινη παγκρεατική κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος BxPC3, Capan-2, AsPC-1 και Panc-1 αγοράστηκαν από την ATCC και τους καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ μέσο (εκτός BxPC3) με 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) σε υγροποιημένο επωαστή που περιέχει 5% CO

2 στους 37 ° C. BxPC3 καλλιεργήθηκε σε RPMI μέσο με 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και 10% FBS. Αυτή η κυτταρική γραμμή PDAC BxPC3 παροδικά εκτεθεί για τέσσερις ώρες κάθε επτά ημέρες με αυξανόμενες συγκεντρώσεις (50 ng έως 1.5 μg /ml) της γεμσιταβίνης για μια περίοδο έξι εβδομάδων. Η προκύπτουσα γεμσιταμπίνη ανθεκτική κυτταρική γραμμή που αναφέρεται ως BxPC3-GZR. Για τη συντήρηση, τα κύτταρα BxPC3-GZR επεκτάθηκαν σε μέσο καλλιέργειας και καταψύχθηκε σε κλάσματα. Για τα πειράματα τα κύτταρα BxPC3-GZR αποψύχθηκαν και αφέθηκαν να επεκταθούν σε καλλιέργεια για δύο ημέρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με γεμκιταβίνη (1,5 μg /ml) για τέσσερις ώρες. Γεμσιταμπίνη αφαιρέθηκε και τα κύτταρα BxPC3-GZR συλλέχθηκαν την επόμενη ημέρα για πειράματα, συμπεριλαμβανομένου του ελέγχου της ποιότητας γουέστερν κηλίδες για να δείξει ότι η αποκτηθείσα φαινότυπος EMT διατηρήθηκε.

κηλίδες Western αναλύσεις και χρώση ανοσοφθορισμού

Western blot ανάλυση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: Ε-καδερίνης και Neu1 από την Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA)? CD44, βήτα-ακτίνη και PUMA (

BBC3

) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ), βιμεντίνη από την Life Technologies (Carlsbad, CA). Χρένου συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα αγοράστηκαν από την Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). Για ανοσοφθορισμού (IF) χρώση, τα κύτταρα αναπτύσσονται σε στρογγυλό κάλυμμα γλιστρά σε μια 24 φρεατίων πλάκα. Στερέωση και ανοσοχρώση που ακολουθείται από τη λήψη εικόνων διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18].

Matrigel εισβολής κυττάρων Δοκιμασίες

Η επεμβατική συμπεριφορά των κυττάρων αναλύθηκε με δοκιμασίες εισβολή Matrigel, όπως περιγράφεται προηγουμένως [17], [18].

Το προφίλ έκφρασης των miRNAs

Το συνολικό RNA συμπεριλαμβανομένων των μικρών μη-κωδικοποίησης miRNA απομονώθηκε από BxPC3 και BxPC3-GZR χρησιμοποιώντας κιτ mirNeasy (Qiagen) ανά διαδικασίες του κατασκευαστή. ανάλυση Έκφραση miRNA στις δύο BxPC3 ελέγχου και τα κύτταρα BxPC3-GZR διεξήχθησαν με LC Sciences (Houston, ΤΧ) χρησιμοποιώντας ένα ιδιόκτητο μParaflo μικρορευστονικής τεχνολογία βιοτσίπ. Σημαντικές αλλαγές στην έκφραση miRNA αναλύθηκαν με t-test, όπως προβλέπεται με LC Sciences (Houston, ΤΧ). Μόνο τα πιο υψηλά σημαντικές αλλαγές τόσο πάνω και κάτω από εκφράζονται miRNAs θεωρήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση (Πίνακας 1).

Η

ανάστροφη μεταγραφή και ποσοτική PCR

ανιχνεύσεις TaqMan γονιδιακής έκφρασης TaqMan ( Life Technologies, Carlsbad, CA) χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων έκφρασης των δύο mRNA και ωριμάζουν miRNA. Ολικό RNA που εξάγεται με mirVana (Life Technologies, Carlsbad, CA) κιτ απομόνωσης RNA και ακολούθησε αντίστροφη μεταγραφή σε ένα μίγμα αντίδρασης που περιέχει τυχαία εξαμερών εκκινητών (για mRNA RT-PCR) και miR-ειδικούς εκκινητές stem-loop RT (για miRNA ΚΤ- PCR). Ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν με αντιδράσεις που περιέχουν ενισχυμένο cDNA και TaqMan εκκινητές στην Universal Master Mix χωρίς AmpErase UNG (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Όλα τα δεδομένα και τα δεδομένα mRNA miRNA εκφράζεται σε σχέση με 18S και U6 αντίστοιχα από TaqMan PCR πραγματοποιήθηκαν στα ίδια δείγματα, εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Διπλώστε έκφραση υπολογίστηκε από το τριπλούν των C

αξίες Τ μετά την

-ΔΔC

μέθοδο Τ.

Σταθερή γενιάς 2 κυτταρική γραμμή για miR-125b νοκ ντάουν

Η γεμσιταβίνη ανθεκτικά κύτταρα BxPC3-GZR και Panc-1 χρησιμοποιήθηκαν στο miR-125b γκρεμίζω μελέτη. Σύστημα Bioscience του (SBI, Mountain View, CA) miRZipTM miRNAs αντι-νόημα εκφράζονται σταθερά RNAi φουρκέτες που αναστέλλουν τη δράση miRNA. Η miRZip Τα siRNAs παράγουν λίγα λόγια, μονόκλωνο αντι-miRNAs που δεσμεύονται ανταγωνιστικά ενδογενή στόχο miRNA τους και αναστέλλουν τη λειτουργία του. Οι miRZip RNAs μικρή φουρκέτα κλωνοποιηθούν σε φορέα έκφρασης pGreenPuroTM shRNA SBI, μια βελτιωμένη τρίτης γενιάς HIV-based έκφραση lenti-φορέα. Η λεντοϊού φορέας περιέχει τα γενετικά στοιχεία υπεύθυνα για τη συσκευασία, μεταγωγή, και σταθερή ενσωμάτωση του ιικού κατασκευάσματος στο γονιδιωματικό DNA, επάγοντας έκφραση της αλληλουχίας τελεστή αντι-miRNA. Για την παραγωγή ενός υψηλού τίτλου των ιικών σωματιδίων, χρησιμοποιήσαμε την Kit ViraPowerTM λεντοϊών Support (Invitrogen, Carlsbad, CA) με την χρησιμοποίηση LipofectamineTM 2000 (Invitrogen) για τη επιμόλυνση των φορέων miRzip σε κύτταρα ΗΕΚ-293Τ. Επειδή τα μολυσμένα κύτταρα σταθερώς εκφράζουν GFP και πουρομυκίνη, καθώς και την αντι-miRNA κλωνοποιήθηκε στον φορέα miRZipTM, χρησιμοποιήσαμε πουρομυκίνη για να επιλεγούν τα μολυσμένα κύτταρα που φέρουν το miRzip. Μετά από έλεγχο που απομονώνονται BxPC3-GZRΔmiR-125b ή Panc-1ΔmiR-125β κύτταρα. Σε παρόμοιο τρόπο με τον οποίο παράγεται επίσης τον έλεγχο Zip των δύο κυτταρικών σειρών με τον φορέα miRZipTM. Για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας του φαρμάκου, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις γεμσιταβίνης για 96 ώρες και προσδιορισμούς ΜΤΤ διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19].

miRNA και μεταγραφικό προφίλ των δεδομένων όγκου από το Cancer Genome Atlas (TCGA)

miRNA:

Επίπεδο 3.1.1.0 miRNA δεδομένα ακολουθίας από την πύλη δεδομένων TCGA είχε κατεβάσει για 43 δείγματα όγκων με ένα φυσιολογικό ιστό. Μια μήτρα δεδομένων παρασκευάσθηκε συνδυάζοντας τις πρώτες μετρήσεις ανάγνωσης του 1046 miRNAs από 44 [43 όγκων και 1 κανονικό] δείγματα. Με βάση την υπόθεση ότι τα δεδομένα ακολουθία miRNA ακολουθούν μια αρνητική διωνυμική κατανομή [20], [21] οι μετρήσεις ανάγνωσης ήταν μεγέθους παράγοντα ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας DESeq έκδοση 1.10.1 [22] συσκευασία R έκδοση 2.15.3. Κανονικοποιημένα δεδομένα καταμέτρηση ανάγνωσης χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της αλλαγής log2 φορές μεταξύ του όγκου και των κανονικών δειγμάτων

μεταγραφικό:.

Επίπεδο 3.1.1.0 δεδομένα αλληλουχίας RNA από την πύλη δεδομένων TCGA είχε κατεβάσει για 40 δείγματα όγκων με ένα φυσιολογικό ιστό ως έλεγχος. Χρησιμοποιήσαμε το λογισμικό RSEM για τον καθορισμό ποσότητας των μεταγραφών από τα δεδομένα RNA-Seq. RSEM ανώτερο τεταρτημόριο ομαλοποιημένη μετράει ανάγνωσης δεδομένων από 41 (40 όγκους και 1 κανονικό) δείγματα ιστού χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της αλλαγής log2 φορές μεταξύ του όγκου και φυσιολογικά δείγματα.

Η στατιστική ανάλυση

αταίριαστο t- του μαθητή δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση ατομικών μέσων ομάδα. Μια τιμή ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική. Όλες οι τιμές στα σχήματα και κείμενο εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD

Αποτελέσματα

Δημιουργία ενός καρκίνου του παγκρέατος παρουσία αντισωμάτων CRMP μοντέλο κυτταρική σειρά

Η PDAC κυτταρική σειρά BxPC3 ήταν παροδικά εκτεθεί σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις της γεμσιταβίνης για μια περίοδο έξι εβδομάδων. Τα ανθεκτικά προκύπτουν gemcitabine κύτταρα BxPC3-GZR συγκρίθηκαν με τα πατρικά κύτταρα BxPC3 για διαφορές στη μορφολογία, η απόκριση στη γεμσιταβίνη, η έκφραση της μεσεγχυματικών, επιθηλιακά δείκτες και CD44. Συγκρίσεις για τη μορφολογία δείχνουν ότι τα γονικά κύτταρα BxPC3 μεγάλωσε σε ερμητικά συσκευασμένα περιοχές και έδειξε μια επίπεδη και στρογγυλή εμφάνιση, χαρακτηριστική ενός επιθηλιακού όπως μορφολογία? λαμβάνοντας υπόψη ότι τα κύτταρα BxPC3-GZR μεγάλωσε ως χαλαρά που σχετίζονται με τα κύτταρα με ένα άξονα που μοιάζει με χαρακτηριστική μορφολογία του φαινοτύπου μεσεγχυματικών (Εικ. 1Α). Η ευαισθησία στην αγωγή με γεμσιταβίνη συγκρίθηκε μεταξύ BxPC3-GZR και γονικά κύτταρα BxPC3. κύτταρα BxPC3-GZR έδειξε μεγαλύτερο από μια διπλή μείωση στην απόκριση σε γεμσιταβίνη συγκριτικά με γονικά κύτταρα του BxPC3 (Εικ. 1 C). Για να καθοριστεί εάν τα κύτταρα BxPC3-GZR επίσης διασχίζουν ανθεκτικά σε άλλο χημειοθεραπευτική ένωση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με πακλιταξέλη και προσδιορισμούς ΜΤΤ Διεξήχθησαν. Ενώ τα κύτταρα BxPC3-GZR έδειξε περισσότερο από μια διπλή μείωση στην ευαισθησία σε γεμσιταβίνη, αυτά τα κύτταρα έδειξαν μόνο ένα μέτριο μείωση της ευαισθησίας στην πακλιταξέλη (Εικ. S1). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι διαφορετικές οδούς σηματοδότησης μπορεί να είναι υπεύθυνη για την αντίσταση ενάντια διαφορετικά φάρμακα. Επελέγησαν Μια πρόσφατη μελέτη με πλευρά πληθυσμό κυττάρων PDAC με ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου και ότι για την αντίσταση στην gemcitabine δεν ήταν ανθεκτικά σε 5-FU [23]. Η ανάλυση στυπώματος Western των κυττάρων που συλλέγονται σε κάθε εβδομάδα κατά τη διάρκεια των έξι εβδομάδων από την αύξηση της θεραπείας gemcitabine αποκάλυψε ότι το επίπεδο των επιθηλιακών δείκτη Ε-καδερίνης μειώθηκε σταδιακά με ταυτόχρονη αύξηση των επιπέδων των μεσεγχυματικών βιμεντίνη δείκτη και τον CD44 δείκτη βλαστικών κυττάρων (Εικ. 1Β) .

Α. Μορφολογικές διαφορές μεταξύ των γονικών BxPC3 και χημειοαντίσταση μεσεγχυματικά κύτταρα BxPC3-GZR. Β Western blot που δείχνει ότι τα κύτταρα BxPC3-GZR διαθέτουν ένα φαινότυπο EMT, η οποία αποδεικνύεται από την αυξημένη έκφραση της βιμεντίνης και μείωση της E-cadherin και να εκφράσουν τον δείκτη βλαστικών κυττάρων CD44. Γ ΜΤΤ δοκιμασία συγκρίνοντας την ανάπτυξη του πατρικού BxPC3 και BxPC3-GZR στις 96 ώρες μετά τη θεραπεία με διαφορετικές συγκεντρώσεις γεμσιταβίνης. Δ Western Blot συγκρίνοντας την έκφραση του CD44, Ε-cadherin, Zeb-1 και βιμεντίνης μετά από τέσσερα περάσματα της BxPC3 και BxPC3-GZR. Ε και ΣΤ ανοσοφθορισμού εικόνες ομοεστιακό μικροσκόπιο δείχνουν την διαφορική έκφραση του CD44 και βιμεντίνης στα κύτταρα BxPC3 και BxPC3-GZR.

Η

Το πιο σημαντικό, έχουμε επίσης παρακολουθούνται και συγκρίνονται τα επίπεδα έκφρασης ίδιες πρωτεΐνες της BxPC3 και τα κύτταρα BxPC3-GZR που όπου επεκτάθηκε και πέρασε για διαδοχικές γενιές στον πολιτισμό. Η σταθερότητα του φαινοτύπου BxPC3-GZR επιβεβαιώθηκε σε βραχυπρόθεσμες καλλιέργειες με κύτταρα BxPC3-GZR δείχνει ένα χαμηλότερο επίπεδο Ε-καδερίνης, μέχρι ρύθμιση της έκφρασης βιμεντίνη και αυξημένη έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων CD44 (Σχ. 1D). Σε συμφωνία με τα δεδομένα κηλίδος Western, ανάλυση ανοσοφθορισμού έδειξε μια πολύ ισχυρότερη χρώση τόσο CD44 και βιμεντίνης σε κύτταρα BxPC3-GZR σε σύγκριση με το γονικό BxPC3 ομολόγου (Σχ. 1Ε, F).

Προσδιορισμός μιας υπογραφής miRNA που συνδέονται με την παρουσία αντισωμάτων CRMP σε PDAC

Οι μελέτες δείχνουν ότι διάφορα miRNAs όπως miR-100, miR-21, ας-7, ΜΙΚ 34α και miR – 200c παίζουν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση ογκογένεση και χημειοαντίσταση σε διάφορους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του παγκρέατος καρκίνος [24] – [26]. Μελέτες έδειξαν επίσης ένα ρόλο για miRNAs σε ανάπτυξη φαρμακευτικής αντοχής σε μια ποικιλία κακοηθειών [11]. Το επίπεδο έκφρασης των miRNA συγκρίθηκε σε κύτταρα BxPC3 και BxPC3-GZR από μParaflo miRNA μικοτσίπ προφίλ. Μετά τον υπολογισμό και την εξάλειψη των μη σημαντικών miRNAs (από την άποψη της έκφρασης), μια ιδιαίτερα σημαντική προφίλ miRNA διαπιστώθηκε ότι διακρίνονται κύτταρα BxPC3-GZR από γονικά κύτταρα BxPC3 (Εικ. 2,

Πίνακας 1

). Αυτό το προφίλ έδειξε πιο σημαντική εννέα miRNAs που μέχρι ρυθμίζονται σε κύτταρα BxPC3-GZR σε σύγκριση με BxPC3 (miR-125b, miR-155, miR-100, miR-4324, miR-21, miR-15b, miR-25, ΜΙΚ 424 *, miR-99b) και οκτώ που προβλέπονται ρυθμίζεται (miR-1246, miR-205, miR-4443, miR-30D, miR-27b, miR-4485, miR-378 *, miR-455-3p).

Α. χάρτης θερμότητας ανάλυση των δεδομένων από τις δοκιμασίες μικροσυστοιχιών miRNA σύγκριση γονικών κυττάρων BxPC3 και ανθεκτικοί στα φάρμακα κυττάρων BxPC3-GZR. Μόνο miRNAs επιλέχθηκαν η οποία είχε σημαντικά πάνω ή κάτω από εκφράζεται σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα (αλλαγές υψηλής φορές βασίζονται σε αξίες log2 και πολύ χαμηλές τιμές ρ) πάρθηκαν για περαιτέρω επικύρωση. Οι στατιστικές τιμές που εκπροσωπούνται στο

Πίνακας 1

. Β Επικύρωση των miRNA δεδομένων μικροσυστοιχιών έγινε για οκτώ διαφορικά εκφρασμένων miRNAs χρησιμοποιώντας δοκιμασία TaqMan qPCR. Σε κάθε κυτταρική γραμμή, το επίπεδο έκφρασης του υποδεικνύεται miRNA συγκρίθηκε μεταξύ γονικά κύτταρα BxPC3 και τα κύτταρα BxPC3-GZR. RNU43 ή U6 χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος miRNA. Γ TCGA ανάλυση των δεδομένων δείχνει ότι 6 από τα 7 miRNAs επικυρώνονται για να απελευθερωθεί στα κύτταρα BxPC3-GZR έδειξε επίσης διαφορική έκφραση σε δείγματα όγκων από ασθενείς με προχωρημένο PDAC. δείγματα όγκων από 43 ασθενείς με προχωρημένο PDAC αναλύθηκαν για την έκφραση των miRNAs σε σύγκριση με το φυσιολογικό πάγκρεας ιστό.

Η

Με βάση την συνάφεια με τον καρκίνο και χημειοαντίσταση, επιλέχθηκαν επτά από αυτά τα miRNAs για περαιτέρω μελέτη. Real Time-PCR δοκιμασίες χρησιμοποιώντας TaqMan έγιναν για την επικύρωση πάνω ή κάτω από-εκφράζεται miRNAs προσδιορίζονται από συστοιχίες miRNA (Σχ. 2Β). Τέλος, εντοπίστηκαν τέσσερις από τις υπερ-εκφράζεται miRNAs (miR-125b, miR-155, miR-100, miR-21) και τρεις εκφράζονται miRNAs (miR-27b, mir-205 και miR-455-3p) από miRNA μικροσυστοιχίες επικυρώθηκαν από την Real-Time PCR (Εικ. 2Β).

Η υπογραφή miRNA από το μοντέλο κυτταρική γραμμή παρουσία αντισωμάτων CRMP επίσης ανιχνευθεί σε κλινικά δείγματα από ασθενείς με προχωρημένο PDAC

Για τη δημιουργία του δυναμικού συνάφεια του επικυρωμένη παρουσία αντισωμάτων CRMP miRNA υπογραφή με miRNAs βρίσκονται σε προχωρημένο PDAC, ολόκληρη αναλύσεις μεταγραφικό (miRNA και mRNA-επόμενα, τα επίπεδα έκφρασης) πραγματοποιήθηκαν με τις PDAC δείγμα ασθενούς δεδομένα από τα σύνολα δεδομένων TCGA. Στην βάση δεδομένων TCGA Υπάρχουν συνολικά δείγματα ασθενών 43 PDAC περιέχουν επιπέδου έκφρασης miRNAs με ένα κανονικό πάγκρεας ιστό. Σαράντα από δείγματα όγκων αυτών των ασθενών είχαν δεδομένα για τα δύο mRNA και επίπεδα έκφρασης miRNA. Μια σύγκριση της πάνω και κάτω από εκφράζονται miRNAs στο TCGA με εκείνες συστοιχία μας miRNA παρουσιάζεται στο

Πίνακας 2

. Όπως φαίνεται στο

πίνακα 2

, από τα δεκαεπτά miRNAs που περιλαμβάνει τα miRNAs έκτροπα απελευθερωθεί στην BxPC3-GZR (9 υπερεκφράζεται και 8 κάτω εξέφρασαν) δεδομένα miRNA για 14 από αυτά ήταν διαθέσιμα στο TCGA αναλύσεις και για τα επτά των επικυρωμένων miRNAs. Μια περαιτέρω σύγκριση έγινε για την υπογραφή έξι-miRNA επικυρωθεί από τα στοιχεία του πίνακα και για τα οποία υπήρχαν ταιριάζουν δεδομένων για προχωρημένους PDAC δείγματα. Η ανάλυση αυτών των δεδομένων φαίνεται στο Σχήμα 2C. Είναι ενδιαφέρον ότι υπήρχε σημαντική συσχέτιση με την κοινή επίπεδα έκφρασης των miRNAs σε προχωρημένο δείγματα όγκων PDAC με την επικυρωμένη υπογραφή παρουσία αντισωμάτων CRMP miRNA για πέντε από τα έξι miRNAs (Σχ. 2C,

Πίνακας 2

). Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι οι miR-125b δεδομένα για τα δείγματα όγκου δίνεται τόσο ως miR-125b-1 και miR-125b-2 ισομορφές, ενώ σε κυτταρικές σειρές που προσδιορίζεται μόνο miR-125b-1 ισομορφή (που ορίζεται ως ΜΙΚ 125β). Είναι ενδιαφέρον ότι, οι πρόδρομοι του miR-125b-1 και miR-125b-2 ισομορφές ήταν γνωστό ότι προέρχονται ανεξάρτητα από διαφορετικούς γενετικούς τόπους χρωμοσωμική αν και ώριμες αλληλουχίες και οι στόχοι τους είναι ίδιες [27]. Οι πιο αξιοσημείωτες miRNAs πάνω εκφράζεται σε δύο BxPC3-GZR και κλινικά δείγματα ήταν miR-100, miR-21, miR-125b-1, miR-125b-2, ενώ miR-205, miR-27b και miR455 ήταν κάτω από-εκφράζεται.

miR-125b παίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση της παρουσία αντισωμάτων CRMP σε PDAC

οι αρχικές μελέτες που έγιναν για να διαπιστωθεί αν τα miRNAs που προσδιορίζονται στα κύτταρα BxPC3-GZR και ότι ήταν κοινή σε κλινικά δείγματα έπαιξε ένα ρόλο στην παρουσία αντισωμάτων CRMP. Το miR-125b, που ήταν συνήθως υπερεκφράζεται στα δύο προηγμένες PDAC κλινικά δείγματα και σε κύτταρα BxPC3-GZR (Εικ. 2) επιλέχθηκε για αυτές τις αναλύσεις. Για περαιτέρω μελέτες, τρεις κυτταρικές γραμμές PDAC (AsPC-1, Capan-2, Panc-1) εκτός από BxPC3 εξετάστηκαν για επίπεδα έκφρασης των δεικτών EMT μαζί με miR-125b και miR-30d (Εικ. 3 Α, Β) . MiR-30D χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση της διαφορικής έκφρασης των miRNA αφού έδειξαν επίπεδο έκφρασης ίση και στις δύο γονικών (BxPC3) και ανθεκτικά κύτταρα με ανάλυση qPCR. Σε αυτές τις κυτταρικές σειρές η επιθηλιακή δείκτη Ε-καδερίνης είναι αντιστρόφως ανάλογη προς την έκφραση του miR-125b? ότι, ο μεσεγχυματικά βιμεντίνη δείκτης και ο δείκτης CD44 βλαστικών κυττάρων αναλογικά που σχετίζονται με την έκφραση του miR-125β (Εικ. 3Α, Β). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν περαιτέρω ότι ο φαινότυπος EMT μπορεί να ρυθμίζεται εν μέρει από την συστατική έκφραση του miR-125b σε Capan-2 και BxPC3 κύτταρα δείχνουν επιθηλιακά σαν φαινότυπο και εκφράζουν χαμηλά επίπεδα του miR-125b? Ωστόσο, AsPC-1 και Panc-1 κύτταρα είναι μεσεγχυματικά σαν και δείχνουν υψηλότερα επίπεδα miR-125β (Εικ. 3 Α, Β). Εκτός αυτού έχουμε παρακολουθούνται επίσης την έκφραση του miR-125b σε κύτταρα BxPC3 κατά την κατεργασία με gemcitabine. Τα δεδομένα δείχνουν ότι 72 ώρες επίδρασης γεμσιταβίνη επαγόμενη την έκφραση miR-125b σε κύτταρα BxPC3 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Σχ. 3C). Συνεπώς, αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι και οι δύο χημειοαντίσταση και μεσεγχυματικών φαινοτύπων ρυθμίζονται από τη διαφορική έκφραση του miR-125b.

A. Οι αναλύσεις στυπώματος Western που δείχνει τα επίπεδα έκφρασης των δεικτών ΕΜΤ σε κύτταρα PDAC στα οποία προσδιορίστηκε miR-125b έκφρασης. ανάλυση TaqMan Β qPCR που δείχνει την σχετική έκφραση του miRNAs (MIR-125b και miR-30d) σε διάφορες PDAC κύτταρα. MiR-30d χρησιμοποιείται σαν ένας έλεγχος. C. Επαγωγή του miR-125b έκφραση σε BxPC3 κατά την αγωγή της γεμσιταβίνης. Ποσοτική PCR (TaqMan) διεξήχθησαν μετά από 72 ώρες επώασης με το φάρμακο με σκοπό την παρακολούθηση του επιπέδου έκφρασης του miR-125b σε κύτταρα BxPC3. Τα δεδομένα δείχνουν ότι η έκφραση του miR-125b αυξάνεται κατά την επεξεργασία της γεμσιταβίνης με δοσοεξαρτώμενο τρόπο.

Η

Για να καθοριστεί αν miR-125b έκφραση σχετίζεται άμεσα με την παρουσία αντισωμάτων CRMP, έχουμε γκρέμισε την έκφραση του miR-125b με τη χρήση της τεχνολογίας Zip και σταθερές κυτταρικές σειρές που παράγονται και εξετάζονται για έκφραση του miR-125b και στα δύο BxPC-GZR-Zip-Ctrl και BxPC3-GZR-ΔmiR-125β κύτταρα (Σχ. 4Α). Η μορφολογία του miR-125b νοκ ντάουν κυττάρων εκτιμήθηκε επίσης και νοκ ντάουν του miR-125b αποκατέστησε την επιθηλιακά όπως μορφολογία (Εικ. 4Α). TaqMan qPCR δοκιμασία έδειξε μια κατά προσέγγιση το 80% νοκ ντάουν του miR-125b στα κύτταρα BxPC3-GZR (Εικ. 4Β). Knockdown αντι-miR125b αντιστραφεί δείκτες ΕΜΤ όπως φαίνεται από την αυξημένη έκφραση της επιθηλιακής δείκτη Ε-καδερίνης και της μειωμένης έκφρασης του βιμεντίνη μεσεγχυματικών δείκτη και μειώθηκε επίσης έκφραση CD44 (Σχ. 4C). Νοκ ντάουν του miR-125b μειωμένη κυτταρική μετανάστευση (Εικ. 4D, E) και εν μέρει ανέτρεψε την αντίσταση γεμσιταβίνη των κυττάρων BxPC3-GZR (Σχ. 4F).

Α. Καθιερώστε τα Lenti-ιικά σταθερά κύτταρα με βάση την έκφραση αντι-miR-125b σε BxPC3-GZR (Zip-ελέγχου και miR-125b knock-down). δοκιμασίες Β TaqMan qPCR δείχνει το νοκ ντάουν του miR-125b στα κύτταρα ctrl BxPC3-GZR-Zip σε σύγκριση με BxPC3-GZRΔmiR-125β κύτταρα. Γ Έκφραση των αντι-miR-125β (τεχνολογία Zip, SBI) μειώνει την έκφραση του EMT και βλαστική ικανότητα δείκτης παρακολουθείται από ποσοτικούς προσδιορισμούς Δυτική μπουλόνι. Πίνακες Δ και Ε δείχνουν την εξασθένηση της κυτταρικής μετανάστευσης με να χτυπήσει κάτω miR-125b έκφρασης. Εικόνες ελήφθησαν μετά χρώση κρυσταλλικού ιώδους των μετανάστευσαν κύτταρα και τα δεδομένα παρίστανται γραφικώς ως γραφική παράσταση (Bar = 50 μm). ΣΤ Knockdown του miR-125b αυξάνει την απόκριση σε γεμσιταβίνη. BxPC3-GZR-zip-Ctrl και BxPC3-GZRΔmiR-125β κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με γεμσιταβίνη σε διαφορετικές συγκεντρώσεις και οι προσδιορισμοί ΜΤΤ πραγματοποιήθηκαν μετά από 96 ώρες θεραπείας. Γ Knockdown του miR-125b στα κύτταρα Panc-1. Lenti-ιικά βάση σταθερή κύτταρα που δημιουργούνται για να αναστέλλουν miR-125b έκφρασης (τεχνολογία Zip,). δοκιμασίες TaqMan qPCR έγιναν για να μετρηθεί η έκφραση του miR-125b σε Zip-ελέγχου κύτταρα Panc-1 και γκρεμίζω κύτταρα (Panc-1 ΔmiR-125β). H. Παρεμποδίζουν miR-125b μειώνει την έκφραση CD44 και βιμεντίνης ενώ μέχρι που ρυθμίζουν την έκφραση Ε-καδερίνης. I. Knockdown του miR-125b αυξάνει την απόκριση των Panc-1 προς γεμσιταβίνη. προσδιορισμοί ΜΤΤ έγιναν μετά από 96 ώρες θεραπείας gemcitabine. Στατιστικές τιμές σημασία * p & lt? 0,05 και ** p & lt? 0,01 υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας Τ-τεστ μαθητή

Η

Για να επιβεβαιώσετε ότι αυτή η επίδραση του miR-125b νοκ ντάουν δεν ήταν μοναδική για τα κύτταρα BxPC3-GZR. , miR-125b επίσης χτυπηθεί κάτω σε κύτταρα Panc-1. Παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε σε miRNA-125β knockdowns για τα κύτταρα BxPC3-GZR, κηλίδα Western και τα δεδομένα δοκιμασίας ΜΤΤ έδειξαν ότι η εξουδετέρωση του miR-125b έκφραση σε Panc-1 κυττάρων εν μέρει ανέτρεψε την φαινότυπο μεσεγχυματικά (Σχ. 4G, H) και ενισχυμένη απάντηση γεμσιταβίνη (Εικ. 4I).

στόχων Gene του miR-125b

από miRNAs πράξη είτε κατασταλτική ή διάσπαση mRNAs στόχο τους, θα πραγματοποιηθεί ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης των πολλών γνωστών κατάντη στόχοι του miR -125b. Αρκετές μελέτες έδειξαν ότι οι στόχοι του mRNA του miR-125b είναι

BBC3

(PUMA),

ITCH

,

BAK1

,

BCL2

,

NEU1

,

PPP1CA

,

PPP2CA

[28] [29]?

STARD13

(DLC2) [30]?

AP1M1

,

STK11IP

,

PSMD8

,

TBC1D1

,

TDG

,

MKNK2

,

DGAT1

, BAP1,

GAB2

,

SGPL1

[28]. Αναλύσαμε τα δεδομένα κλινικής του όγκου για αυτά τα επίπεδα έκφρασης του mRNA ανωτέρω (Εικ. 5). RNA-seq από TCGA έδειξαν ότι οι εκφράσεις του μερικά από αυτά τα γονίδια (

BAP1

,

BBC3

ή PUMA,

BCL2

,

NEU1

,

STARD13

) συσχετίζονται αρνητικά με την έκφραση του miR-125b. Αναλύσαμε τόσο η γενική τάση έκφραση των στοχοθετημένων γονιδίων στο PDAC δείγματα από τη βάση δεδομένων TCGA (Εικ. 5Α), καθώς και το επίπεδο έκφρασης του στοχευμένου γονιδίου σε σχέση με την έκφραση του miRNA-125b εντός των ίδιων δειγμάτων του όγκου (Σχ . 5Β). Στη συνέχεια, έχουμε παρακολουθείται το επίπεδο έκφρασης της ρ53 επάνω ρυθμισμένη ρυθμιστής της απόπτωσης (PUMA). PUMA επίσης γνωστή ως Bcl-2-δεσμευτικό στοιχείο 3 (BBC3) είναι ένα προ-αποπτωτική πρωτεΐνη και μέλος της οικογένειας Bcl-2 πρωτεΐνη [31], [32]. PUMA εμπλέκεται τόσο ρ53-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από μονοπάτι απόπτωσης που επάγεται από μια ποικιλία σημάτων [33]. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν επίσης ότι

NEU1

Neu1 προϊόν salidase είναι σημαντική στη ρύθμιση της ιντεγκρίνης β4 μεσολάβηση σηματοδότηση, που οδηγούν στην καταστολή της μετάστασης του καρκίνου [34]. Ωστόσο, μια ξεχωριστή μελέτη δείχνει ότι Neu1 salidase ενισχύει την σηματοδότηση EGFR και ως εκ τούτου θα μπορούσε να είναι η προώθηση του όγκου [35]. Τα παρόντα ευρήματα, μαζί με το web-based στόχο miRNA δεδομένα σάρωσης δείχνουν ότι το miR-125b στοχεύει άμεσα τις 3’UTRs της PUMA (BBC3) και Neu1 (Εικ. 6. F, G). Προς υποστήριξη αυτού, οι εκφράσεις του mRNA για

BBC3

(PUMA) και

NEU1

ήταν αντιστρόφως ανάλογη με την έκφραση του miR-125β (Εικ. 6Α) σε κύτταρα BxPC3-GZR.

Α. mRNA στόχου προφίλ έκφρασης αναλύσεις για miR-125b. Αποφασισμένος την έκφραση των γνωστών miR-125b στόχους (

BBC3

(PUMA),

BCL2

,

STARD13

,

BAK1

,

BAP1

,

ITCH

και

NEU1

). B. Μια άμεση συνεργασία σχέση του mRNA στόχου και miR-125b επίπεδο έκφρασης μετρήθηκαν με τον ίδιο όγκο από παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα [PDAC] δείγμα ασθενούς. Πρώτο πάνελ εξηγεί τα διάφορα τεταρτημόρια που περιλαμβάνει ρύθμιση προς τα πάνω (+ πρόσημο Ve) ή προς τα κάτω ρύθμιση (- Ve σημάδι) των επιπέδων έκφρασης mRNA και miRNA. Άλλοι πίνακες που αντιπροσωπεύουν το επίπεδο έκφρασης των διαφορετικών mRNA (

BBC3, Neu1 και BAK1

) σε σύγκριση με την έκφραση του miR-125b με τον ίδιο όγκο.

Η

Α. PUMA (

BBC3

) και Neu1 είναι πιο εξέχοντες στόχους του mRNA του miR-125b. Οι αναλύσεις TaqMan qPCR πραγματοποιήθηκαν για την επικύρωση κλινικών δεδομένων. Τα αποτελέσματα qPCR που δείχνει το επίπεδο έκφρασης των διαφορετικών mRNA (

BBC3, Neu1 και BAK1

) τα οποία είναι άμεσο στόχο του miR-125b σύγκριση μεταξύ των γονικών κυττάρων BxPC3 και ανθεκτικά κύτταρα GZR. B. Σύγκριση των επιπέδων έκφρασης του mRNA της

BBC3, Neu1 και BAK1

στα κύτταρα BxPC3-GZR και σταθερή κύτταρα BxPC3-GZR εκφράζουν αντι-miR-125b. Γ κηλίδες Western ανάλυση για να παρακολουθεί το επίπεδο έκφρασης της PUMA και Neu1 στο BxPC3, BxPC3-GZR, και miR-125b νοκ ντάουν κύτταρα. Δ και Ε Παρεμποδίζουν miR-125b αποκαθιστά BBC3 και Neu-1 έκφραση σε κύτταρα Panc-1, qPCR (D) και στύπωμα Western (Ε). F, διατήρηση Γ Είδη και αντιστοίχιση της ακολουθίας σπόρων στην 3’UTR του

BBC3

και

NEU1

mRNAs με miR-125b ακολουθία ελέγχθηκαν με τη χρήση δωρεάν web-based λογισμικό Targetscan.

στη συνέχεια, συγκρίναμε την έκφραση των τριών διαφορετικών πιθανών miR-125b γονιδίων στόχων PUMA (

BBC3

) (πιο κάτω εκφράζονται γονιδίων σε δείγματα ασθενών),

NEU1

και

BAK1

(up-ρύθμιση του γονιδίου) mRNAs μεταξύ BxPC3 γονικών και των κυττάρων BxPC3-GZR (Εικ. 6Β).