Αφηρημένο

Ανθρώπινο ABCG2, μέλος της ΑΤΡ-δέσμευσης υπερ μεταφορέα κασέτας, παίζει καθοριστικό ρόλο στην αντίσταση σε πολλά φάρμακα και την προστασία καρκινικά βλαστικά κύτταρα. ABCG2-νοκ-άουτ δεν είχε εμφανή δυσμενή επίδραση επί της ανάπτυξης, της βιοχημείας, και της ζωής των ποντικών. Έτσι, ABCG2 είναι ένα ενδιαφέρον και πολλά υποσχόμενο στόχο για την ανάπτυξη παραγόντων χημειο-ευαισθητοποίηση των για την καλύτερη θεραπεία του φαρμάκου καρκίνων ανθεκτικών και για την εξάλειψη του καρκίνου βλαστικών κυττάρων. Προηγουμένως, αναφέραμε μία νέα δύο αναστολέα ABCG2 λειτουργία δράσης, PZ-39, που επάγει αποικοδόμηση ABCG2 εκτός από την αναστολή της δράσης της. Σε αυτό το χειρόγραφο, αναφέρουμε τις πρόσφατες προόδους μας στον εντοπισμό δύο διαφορετικές ομάδες αναστολέων ABCG2 με μία ανασταλτική μόνο λειτουργία ABCG2 (στατικό) και η άλλη προκαλεί αποικοδόμηση ABCG2 σε λυσόσωμα εκτός από την αναστολή της λειτουργίας του (δυναμική). Έτσι, ο αναστολέας που προκαλείται υποβάθμιση ABCG2 μπορεί να είναι πιο συχνές από ό, τι αναμενόταν και η περαιτέρω διερεύνηση των δυναμικών αναστολέων που προκαλούν υποβάθμιση ABCG2 μπορεί να παρέχει ένα πιο αποτελεσματικό τρόπο για την ευαισθητοποίηση ABCG2 μεσολάβηση MDR στη χημειοθεραπεία του καρκίνου.

Παράθεση : Peng Η, Qi J, Dong Ζ, Zhang JT (2010) Δυναμική

vs

Αναστολείς Στατική ABCG2 να ευαισθητοποιήσει τα ναρκωτικά ανθεκτικά κύτταρα του καρκίνου. PLoS ONE 5 (12): e15276. doi: 10.1371 /journal.pone.0015276

Επιμέλεια: Wenqing Xu, του Πανεπιστημίου της Ουάσινγκτον, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 Σεπτέμβρη του 2010? Αποδεκτές: 3 του Νοεμβρίου 2010? Δημοσιεύθηκε: 7, Δεκεμβρίου, 2010

Copyright: © 2010 Peng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί CA113384 και CA120221 (JTZ) και από μια επιχορήγηση Showalter Ίδρυμα (ZD). Jing Qi είναι ο αποδέκτης του Υπουργείου Άμυνας Breast Cancer Research Program μεταδιδακτορικής έρευνας. Hui Peng υποστηρίζεται προς το παρόν, εν μέρει, από NNSF της Κίνας επιχορήγησης Νο 30873083. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου.

Ανταγωνιστικά συμφέροντα : Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ABCG2 είναι μέλος της κασέτας ΑΤΡ-σύνδεσης (ABC) μεταφορέας υπερ και υπερέκφραση του ABCG2 έχει αποδειχθεί ότι αιτία. πολυφαρμακευτική αντίσταση (MDR) σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μοντέλου και να συσχετίζονται με κακή πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο δύο ενήλικα και της παιδικής λευχαιμίας και του μαστού (για επισκοπήσεις βλέπε [1], [2], [3]). Σε αντίθεση με άλλα μέλη του μεταφορέα υπεροικογένειας ABC όπως Ρ-γλυκοπρωτεΐνη (MDR1 /ABCB1), ABCG2 θεωρείται ως ένα δεύτερο μεταφορέα που αποτελείται από ένα νουκλεοτίδιο-πεδίο σύνδεσης (NBD) στο αμινο-άκρο και μία διαμεμβρανική περιοχή (MSD) σε καρβοξυτελικό άκρο. Έχει, ως εκ τούτου, έχουν σκεφτεί να υπάρχει και να λειτουργεί ως ένα ομο-διμερές. Ωστόσο, πρόσφατα στοιχεία έδειξαν ότι ABCG2 μπορεί να υπάρχει και να λειτουργεί ως ανώτερης τάξης των ολιγομερών που αποτελείται από 8-12 όμοιες υπομονάδες [4], [5] και οι θέσεις ολιγομερισμού είναι πιθανό βρίσκεται στο MSD [6].

κατά τη διαδικασία της με στόχο την ευαισθητοποίηση MDR διαμεσολαβείται από ABCG2, ένας αριθμός αναστολέων ABCG2 έχουν ανακαλυφθεί πρόσφατα [7], [8], [9], [10], [11], [12] εκτός από το προηγουμένως που προσδιορίστηκαν όπως Fumitremorgin C (FTC) (για μία επισκόπηση βλέπε [2]). Ένας από αυτούς τους αναστολείς ABCG2, PZ-39, ήταν πολύ αποτελεσματική και διακριτικό από τους άλλους όπως FTC με την ικανότητα να προκαλούν λυσόσωμα εξαρτώμενη αποδόμηση της πρωτεΐνης ABCG2 [7].

Για να προσδιοριστεί περαιτέρω, εάν προκαλείται από αναστολέα ABCG2 αποικοδόμησης είναι μοναδικό για PZ-39, εξετάσαμε άλλους αναστολείς ABCG2 που παράγεται κατά την αρχική μας διαλογής η οποία οδήγησε στην ταυτοποίηση του PZ-39. Βρήκαμε δύο τύποι αναστολέων ABCG2 με μία ανασταλτική δραστηριότητα ABCG2 μόνο (στατικό) και η άλλη την αναστολή της δραστικότητας ABCG2 καθώς και την επαγωγή αποικοδόμησης ABCG2 μέσω λυσόσωμα (δυναμική). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι ο αναστολέας που προκαλείται υποβάθμιση ABCG2 σε λυσοσώματα μπορεί να είναι πιο συχνές από ό, τι έχει ήδη προβλεφθεί και περαιτέρω διερεύνηση των δυναμικών αναστολέων που προκαλούν υποβάθμιση ABCG2 σε λυσοσώματα μπορεί να παρέχει ένα πιο αποτελεσματικό τρόπο για την ευαισθητοποίηση ABCG2 μεσολάβηση MDR στη χημειοθεραπεία του καρκίνου.

Αποτελέσματα

Δύο τύποι αναστολέων ABCG2

Προηγουμένως, ανέφερε ότι η ορθολογική εξέταση των εκπροσώπων των διαφόρων τύπων της ένωσης βιβλιοθήκης από Specs (www.specs.net) οδήγησε σε ταυτοποίηση ενός αναστολέα που δρα ABCG2 δύο-mode PZ-39 [7]. Κατά την αρχική διαλογή, αρκετές άλλες αναστολείς ABCG2, οι οποίες είναι δομικά διαφορετικές από PZ-39 και τα παράγωγά του (Εικ. 1), ταυτοποιήθηκαν επίσης και τη δραστηριότητα τους να αναστέλλουν ABCG2 μεσολάβηση εκροής φαρμάκου έχει επιβεβαιωθεί χρησιμοποιώντας κύτταρα ΗΕΚ293 με υπερ-έκφραση έκτοπου ABCG2 (ΗΕΚ293 /ABCG2) (Σχ. 2Α). Για να καθοριστεί εάν αυτοί οι αναστολείς κατέχουν επίσης τον ενεργό ιδιότητα δυο-mode, ελέγξαμε πρώτα την επίδραση αυτών των αναστολέων επί της έκφρασης ABCG2 χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, τρία από τα τέσσερα νέα αναστολέων (ΡΖ-8, 34, και 38) σε συνδυασμό με PZ-39 έκφραση ABCG2 αναστέλλουν ενώ PZ-16 δεν το κάνει. Μαζί με την προηγούμενη διαπίστωσή μας ότι FTC αναστέλλει μόνο δραστηριότητα ABCG2 [7], καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι υπάρχουν πιθανότατα δύο τύποι αναστολέων ABCG2 με μία ανασταλτική μόνο ABCG2 δραστηριότητα, ενώ η άλλη αναστέλλουν τόσο τη δραστηριότητα και την έκφραση της ABCG2.

Οι χημικές δομές που παρουσιάζονται για PZ-8, (12E)-N’-((5-(3,4-dihydro-4-oxo-3-phenylquinazolin-2-ylthio)furan-2-yl)methylene)-2-(4-ethylphenoxy)acetohydrazide; PZ-16, 2- (4- (4-νιτροφαινοξυ) φαινυλ) -2-oxoethyl2- (2- (4- χλωρο βενζαμιδο) ακεταμιδο) οξικό? PZ-34, (Ε) -2- (4-αιθοξυφαινυλο) -Ν ‘- (1- (4- (φουραν-2-καρβοξαμιδο) φαινυλ) αιθυλιδενο) κινολινο-4-καρβοϋδραζίδιο? PZ-38, (N-(2,5-dimethoxyphenyl)-2-({4-[4-(dimethylamino)benzylidene]-5-oxo-1-phenyl-4,5-dihydro-1H-imidazol-2-yl}sulfanyl)acetamide); και ΡΖ-39 (Ν- (4-χλωροφαινυλ) -2 – [(6 – {[4,6-δι (4- μορφολινυλ) -1,3,5- τριαζιν-2-υλ] αμινο} -1,3 βενζοθειαζολο-2-υλ) σουλφανυλ] ακεταμίδιο).

Η

Α, συσσώρευση μιτοξαντρόνη. κύτταρα /ABCG2 ΗΕΚ293 επωάστηκαν με μιτοξαντρόνη για 30 λεπτά σε παρουσία DMSO (λεπτή γραμμή) ή 10 μΜ ενώσεων ΡΖ (παχιά γραμμή) που ακολουθείται από ανάλυση FACS του επιπέδου μιτοξαντρόνης. Β, η έκφραση ABCG2. ΗΕΚ293 κύτταρα /ABCG2 επωάστηκαν με 3.3 μΜ ΡΖ ενώσεις ή DMSO ελέγχου για διάφορους χρόνους που ακολουθείται από συλλογή των κυττάρων και ανάλυση Western blot των ABCG2 ανιχνεύθηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα BXP-21.

Η

Η καταστολή της έκφρασης ABCG2 από τα γνωστά και τα υπάρχοντα αναστολείς ABCG2

τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι ο αναστολέας που προκαλείται από την καταστολή της έκφρασης ABCG2 μπορεί να είναι πιο συχνές από ό, τι αναμενόταν. Για να δοκιμαστεί περαιτέρω αυτή η πιθανότητα, μελετήθηκε η επίδραση δύο άλλα δημοσιευμένα αναστολείς ABCG2 (NSC-168201 και NSC-120668) [12] για την έκφραση ABCG2 χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, τόσο NSC-168201 και NSC-120668 καταστέλλουν αποτελεσματικά την έκφραση ABCG2. Ωστόσο, ο αναστολέας ABCG2 ελέγχου FTC δεν παρότι όλες οι τρεις αναστολείς ενισχύσει αποτελεσματικά συσσώρευση μιτοξαντρόνη σε ΗΕΚ293 /ABCG2 κυτταρικές σειρές (Σχ. 3Β). Έτσι, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι ο αναστολέας που προκαλείται από την καταστολή της έκφρασης ABCG2 μπορεί να είναι πιο συχνές από ό, τι έχει προβλεφθεί και υπάρχουν πιθανώς δύο ομάδες αναστολέων ABCG2.

Μια έκφραση ABCG2. ΗΕΚ293 κύτταρα /ABCG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 10 μΜ εκάστου των γνωστών αναστολέων ABCG2 NSC-168201, NSC-120668, ή FTC για διάφορους χρόνους που ακολουθείται από ανάλυση κηλίδος Western της έκφρασης ABCG2 ανιχνεύθηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα BXP-21. Β, συσσώρευση μιτοξαντρόνη. ΗΕΚ293 κύτταρα /ABCG2 επωάστηκαν με μιτοξαντρόνη για 30 λεπτά σε παρουσία DMSO (λεπτή γραμμή) ή 10 μΜ NSC-168201, NSC-120668, ή FTC (παχιά γραμμή) που ακολουθείται από ανάλυση FACS της ενδοκυτταρικής επίπεδο μιτοξαντρόνης.

Ειδικές επίδραση του PZ-34 και PZ-38 για ABCG2 μεσολάβηση μιτοξαντρόνη εκροή

για να διερευνηθεί περαιτέρω εάν αυτές οι νέες αναστολείς καταστέλλουν την έκφραση ABCG2 με την πρόκληση της υποβάθμισης ABCG2 στο λυσόσωμα, επιλέξαμε να εστιάσουμε σε PZ -34 και PZ-38 και το πρώτο εκτελείται μια λεπτομερή ανάλυση των επιπτώσεών τους στην συσσώρευση του φαρμάκου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, και οι δύο PZ-34 και PZ-38 σε ~ 4 μΜ αυξάνουν τη συσσώρευση μιτοξαντρόνη σε παρόμοιο βαθμό με την καθιερωμένη αναστολέας ABCG2 FTC στα κύτταρα /ABCG2 ΗΕΚ293. Αυτές οι ενώσεις, ωστόσο, δεν έχουν σημαντική επίδραση στην συσσώρευση μιτοξαντρόνη στον έλεγχο κύτταρα επιμολυσμένα με φορέα (ΗΕΚ293 /Vec), υποδεικνύοντας ότι η επίδραση της PZ-34 και PZ-38 για συσσώρευση μιτοξαντρόνη είναι πιθανόν μέσω αναστολής ABCG2. Στη συνέχεια εξετάσαμε την απόκριση δόσης του PZ-34 και PZ-38 στην αναστολή ABCG2 μεσολάβηση μιτοξαντρόνη εκροής σε κύτταρα /ABCG2 ΗΕΚ293 χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Β, η ενδοκυτταρική επίπεδο μιτοξαντρόνη είναι πολύ λιγότερο σε ΗΕΚ293 /ABCG2 κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα ΗΕΚ293 /Vec λόγω ABCG2 μεσολάβηση εκροής. Η προσθήκη του PZ-34 και PZ-38 αυξάνει την ενδοκυτταρική συσσώρευση της μιτοξαντρόνης σε μια δοσο-εξαρτώμενο τρόπο παρόμοιο ως FTC.

Α, συσσώρευση μιτοξαντρόνη. ΗΕΚ293 /Vec ή ΗΕΚ293 /ABCG2 κύτταρα επωάστηκαν με μιτοξαντρόνη για 30 λεπτό σε παρουσία DMSO ελέγχου, ή 3 μΜ PZ-34, PZ-38 ή τον έλεγχο FTC. Τα δεδομένα είναι μέσες τιμές ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Β, απόκριση δόσης του PZ-34, PZ-38, και τον έλεγχο της FTC για την αποκατάσταση της συσσώρευσης μιτοξαντρόνη σε κύτταρα /ABCG2 ΗΕΚ293. Η παχιά γραμμή δείχνει το επίπεδο της συσσώρευσης μιτοξαντρόνη σε κύτταρα ΗΕΚ293 /Vec, που χρησιμεύει ως ένα μέγιστο έλεγχο συσσώρευσης. C, επίδραση στην ABCB1 και ABCC1 μεσολάβηση Αδριαμυκίνη εκροής. ΗΕΚ293 κύτταρα με ABCC1 υπερ-έκφραση (ΗΕΚ293 /ABCC1) και BC19 κύτταρα με ABCB1 υπερ-έκφραση επωάστηκαν με Αδριαμυκίνη απουσία (γκρίζα περιοχή) ή παρουσία (διακεκομμένη γραμμή) του 3.8 μΜ PZ-34 ή PZ-38 ακολουθούμενη από FACS ανάλυση. Η παχιά γραμμή υποδεικνύει το μέγιστο επίπεδο της συσσώρευσης στα κύτταρα επιμολυσμένα με φορέα ελέγχου. D, επίδραση στην έκφραση ABCB1 και ABCC1. ΗΕΚ293 /ABCC1 και BC19 κύτταρα με ABCB1 υπερ-έκφραση υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 10 μΜ PZ-34 ή PZ-38 για 3 ημέρες που ακολουθείται από ανάλυση κηλίδος Western των ABCB1 χρήση μονοκλωνικού αντισώματος C219 και ABCC1 χρήση μονοκλωνικού αντισώματος MRPr1. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Για να προσδιοριστεί η ειδικότητα του PZ-34 και PZ-38, εξετάσαμε επίδρασή τους στις αποβολής του φαρμάκου που προκαλείται από δύο άλλους μεταφορείς ABC που είναι γνωστό ότι προκαλούν MDR, ABCB1 και ABCC1, χρησιμοποιώντας MCF7 κύτταρα επιμολυσμένα με ABCB1 (BC19) [13] και τα κύτταρα επιμολυσμένα ΗΕΚ293 με ABCC1 (ΗΕΚ293 /ABCC1) [14], [15]. Ωστόσο, βρήκαμε καμία επίδραση αυτών των ενώσεων επί της δράσεως της ABCB1 και ABCC1 σε φθίνουσα αδριαμυκίνη συσσώρευση (Σχ. 4C). Τόσο PZ-34 και PZ-38, επίσης, δεν επηρεάζει την έκφραση του ABCB1 και ABCC1 (Εικ. 4D). Έτσι, PZ-34 και PZ-38 μπορεί να είναι ειδικά για ABCG2 και δεν επηρεάζουν αποβολής του φαρμάκου που διαμεσολαβείται από δύο άλλες μεγάλες μεταφορείς ABC.

Επίδραση του PZ-34 και PZ-38 για ABCG2 μεσολάβηση αντίσταση σε πολλά φάρμακα

για να προσδιοριστεί αν τα δύο PZ-34 και PZ-38 έχουν την ικανότητα να ευαισθητοποιούν ABCG2 μεσολάβηση αντοχή φαρμάκου, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις των αποτελεσμάτων αυτών των ενώσεων στην επιβίωση των κυττάρων /ABCG2 ΗΕΚ293 απουσία ή παρουσία της μιτοξαντρόνης . Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, τόσο PZ-34 και PZ-38 μόνο του δεν έχουν καμία επίδραση στην επιβίωση των κυττάρων /ABCG2 ΗΕΚ293 σε συγκεντρώσεις μικρότερες από 10 μg /ml. Τους IC

50 εκτιμήθηκε ότι ήταν ~12.9 και & gt? 20 μΜ, αντίστοιχα (Πίνακας 1). Έτσι, και οι δύο PZ-34 και PZ-38 έχουν μικρή κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα /ABCG2 ΗΕΚ293 σε συγκεντρώσεις μικρότερες από 10 μΜ, υποδεικνύοντας ότι δεν μπορούν να ενεργούν άλλων βασικών μορίων με υψηλή συνάφεια για την επιβίωση των κυττάρων.

Α, δραστικότητα της PZ-34 και PZ-38 στην αναστροφή αντίστασης μιτοξαντρόνη. ΗΕΚ293 κύτταρα /ABCG2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χωρίς ή με 0,1 μΜ (IC

10) μιτοξαντρόνη απουσία ή παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων του PZ-34 ή PZ-38 ακολουθούμενη από δοκιμασία SRB. Β, ο δείκτης ευαισθητοποίηση του PZ-34 και PZ-38 σε κύτταρα ΗΕΚ293 /ABCG2. ΗΕΚ293 κύτταρα /ABCG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις της μιτοξαντρόνης απουσία ή παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων του PZ-34 ή PZ-38 ακολουθούμενη από δοκιμασία SRB. Γ και Δ, ο δείκτης ευαισθητοποίηση του PZ-34 και PZ-38 σε κύτταρα MCF7 /AdVp3000 ναρκωτικά επιλέξει. κύτταρα MCF7 /AdVp3000 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις μιτοξαντρόνη (C), ή αδριαμυκίνη (D) υπό την παρουσία DMSO (φορέας) ή 500 ηΜ PZ-34 και PZ-38 ακολουθούμενη από δοκιμασία ΜΤΤ. δείκτης Ευαισθητοποίηση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας IC

50 των αντικαρκινικών φαρμάκων με την απουσία ή παρουσία PZ-34, PZ-38, ή FTC. Τα δεδομένα που δείχνονται είναι μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων.

Η

επόμενο προσδιορίζεται η επίδραση του PZ-34 και PZ-38 επί ευαισθητοποιητικές κυτταρική απόκριση σε 0,1 μΜ μιτοξαντρόνη οποία μόνη παράγει λιγότερο από 10% αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων /ABCG2 ΗΕΚ293. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, τόσο PZ-34 και PZ-38 σε μία χαμηλή συγκέντρωση εύρος ευαισθητοποιούν αυτά τα κύτταρα να μιτοξαντρόνη. Σε περίπου 1,2 μΜ, τόσο PZ-34 και PZ-38 βοηθήσει 0,1 μΜ μιτοξαντρόνη να αναστέλλουν πλήρως την κυτταρική ανάπτυξη. Το IC

50 PZ-34 και PZ-38 στην ευαισθητοποίηση αντοχής μιτοξαντρόνη υπολογίστηκαν να είναι 71 και 45 ηΜ, αντιστοίχως (Πίνακας 1). Μπορούμε επίσης να δοκιμαστεί PZ-8 και PZ-16 και διαπίστωσε ότι το IC

50 από αυτές τις ενώσεις μόνη της είναι περίπου 20 μΜ και IC τους

50 στην ευαισθητοποίηση αντίσταση μιτοξαντρόνη των κυττάρων MCF7 /AdVp3000 είναι -80 και -70 nM , αντίστοιχα. Το IC

50 της FTC στην ευαισθητοποίηση αντίσταση μιτοξαντρόνη, από την άλλη πλευρά, είναι πολύ υψηλότερη στα 326 ηΜ (Πίνακας 1).

Στη συνέχεια, εξετάσαμε την απόκριση δόσης του PZ-34 και PZ-38 στην ευαισθητοποίηση ABCG2 μεσολάβηση αντίσταση μιτοξαντρόνη χρησιμοποιώντας κύτταρα /ABCG2 ΗΕΚ293. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Β, το IC

50 μιτοξαντρόνης μειώνεται δραματικά με την παρουσία του PZ-34 και PZ-38. Στα 50 ηΜ, PZ-34 και PZ-38 να μειώσει σημαντικά το IC

50 μιτοξαντρόνης με δείκτη ευαισθητοποίηση των 1.6 και 2.2, αντίστοιχα (Πίνακας 2). Στα 500 nm, ο δείκτης ευαισθητοποίηση του PZ-34 και PZ-38 είναι 8,7 και 14,3, αντίστοιχα (Πίνακας 2). Από την άλλη πλευρά, ο δείκτης ευαισθητοποίηση του FTC στα 500 nm είναι μόνο 3.9 (Πίνακας 2). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι PZ-34 και PZ-38 είναι πολύ ισχυροί νέοι αναστολείς ABCG2.

Η

Για να διερευνηθεί περαιτέρω εάν PZ-34 και PZ-38 μπορεί να αντιστρέψει ABCG2 μεσολάβηση MDR σε ένα φάρμακο ανθεκτικά καρκινικό κύτταρο γραμμή, χρησιμοποιήσαμε το φάρμακο επιλέγεται μαστού καρκινική κυτταρική σειρά MCF7 /AdVp3000 που υπερ-εκφράζει ABCG2 και δοκιμάζεται ένα επιπλέον υπόστρωμα αντικαρκινικό φάρμακο του ABCG2, αδριαμυκίνη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5C, τόσο PZ-34 και PZ-38 στα 500 nm μειώσει δραστικά την αντίσταση των MCF7 /AdVp3000 τόσο Αδριαμυκίνη και μιτοξαντρόνη.

PZ-34 και PZ-38 δεν επηρεάζουν ABCG2 ολιγομερισμό

Προηγουμένως, έχει δειχθεί ότι μπορεί να υπάρχουν ABCG2 και λειτουργία ως ομο-ολιγομερούς [4], [6]. Για να εξεταστεί εάν PZ-34 και PZ-38 πιθανώς αναστέλλουν ABCG2 ολιγομερισμό, συν-ανοσοκαταβύθιση των δύο διαφορικά tagged ABCG2 διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4] μετά από θεραπεία 6-ώρες με PZ-34 και PZ-38 στο 3,3 μΜ. Ωστόσο, καμία επίδραση της PZ-34 και PZ-38 επί ABCG2 συνανοσοκαθίζησης βρέθηκε (βλέπε. Συμπληρωματική Εικόνα S1), υποδηλώνοντας ότι PZ-34 και PZ-38, παρόμοια με PZ-39 [7], δεν μπορεί να επηρεάσει ABCG2 ολιγομερισμό. Ωστόσο, λόγω του περιορισμού της συν-ανοσοκαταβύθιση, αυτοί οι αναστολείς μπορεί να επηρεάσουν διμερισμού τα οποία δεν μπορούν να αποκαλυφθούν με συν-ανοσοκαταβύθιση λόγω της ύπαρξης τουλάχιστον 3 διαφορετικές θέσεις αλληλεπίδρασης της ολιγομερούς ABCG2 [4], [6].

Επίδραση του PZ-34 και PZ-38 για το χρόνο ημιζωής της ABCG2

Όπως προαναφέρθηκε, τόσο PZ-34 και PZ-38 κατέστειλε την έκφραση ABCG2 (Εικ. 2). Για να αποκλειστεί η πιθανότητα ότι η καταστολή αυτή οφείλεται στην αναστολή της γονιδιακής έκφρασης, πραγματοποιήσαμε ανάλυση πραγματικού χρόνου RT-PCR. Όπως φαίνεται στο Σχ. S2, τα επίπεδα σταθερής κατάστασης της ABCG2 mRNA είναι τα ίδια μεταξύ των ομάδων ελέγχου και την ένωση της θεραπείας και, ως εκ τούτου, εξαλείφοντας την πιθανότητα ότι οι ενώσεις αυτές επηρεάζουν τη μεταγραφή ή τη σταθερότητα της ABCG2 mRNA.

Για να καθοριστεί εάν η καταστολή της έκφρασης της ABCG2 οφείλεται σε αναστολέα προκαλούμενη αποικοδόμηση όπως προηγουμένως παρατηρηθεί με PZ-39 [7], εξετάσαμε την επίδραση της PZ-34 και PZ-38 σχετικά με το χρόνο ημιζωής του ABCG2 σε κύτταρα /ABCG2 ΗΕΚ293 με προ-κατεργασία των κυττάρων με κυκλοεξιμίδιο, η οποία αναστέλλει την επιμήκυνση κατά τη διάρκεια της σύνθεσης πρωτεϊνών, που ακολουθείται από κατεργασία με PZ-34 και PZ-38 για διάφορους χρόνους. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, η απώλεια ABCG2 σε κύτταρα κατεργασμένα με ένα συνδυασμό κυκλοεξιμίδιο και PZ-34 ή PZ-38 είναι πολύ ταχύτερη από εκείνη του ελέγχου θεραπείας με φορέα DMSO ή τον έλεγχο FTC. Ο χρόνος ημίσειας ζωής του ABCG2 παρουσία PZ-34 και PZ-38 εκτιμάται ότι είναι ~ 8 ώρες ενώ είναι σταθερή με εκτιμώμενη ημίσεια ζωή πάνω από 60 ώρες στην αγωγή ελέγχου με FTC ή DMSO (Εικ. 6Β ). Έτσι, PZ-34 και PZ-38 πιθανόν επιταχύνει την αποικοδόμηση της πρωτεΐνης ABCG2 ομοίως ως PZ-39 [7].

Α, ανάλυση κηλίδας Western. ΗΕΚ293 κύτταρα /ABCG2 υποβλήθηκαν αρχικά σε επεξεργασία με 5 μg /ml κυκλοεξιμιδίου (ΟΗΧ) που ακολουθείται από προσθήκη 3 μΜ PZ-34, PZ-38, FTC, ή DMSO ελέγχου για διάφορους χρόνους. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν για ανάλυση στυπώματος Western των ABCG2 ανιχνεύθηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα BXP-21. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β, χρόνος ημίσειας ζωής της ABCG2. επίπεδα ABCG2 επί κηλίδος Western, όπως φαίνεται στον πίνακα Α προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας Scion Image και συναρτήσει του χρόνου της θεραπείας. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι μέση τιμή ± SD τριών πειραμάτων.

Η

PZ-34 και PZ-38 επάγει την υποβάθμιση ABCG2 στο λυσόσωμα

Έχει αναφερθεί στο παρελθόν ότι άγριου τύπου και σωστά διπλωμένο οι πρωτεΐνες ABCG2 αποικοδομούνται σε λυσόσωμα ενώ τα μεταλλαγμένα και misfolded πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην αποδόμηση διαμεσολαβείται από την ουβικουϊτίνη σε πρωτεασώματος [16]. Επιπλέον, έχουμε βρει προηγουμένως ότι PZ-39 προκαλεί αποικοδόμηση ABCG2 μέσω λυσόσωμα μεσολάβηση αποικοδόμησης [7]. Για να προσδιοριστεί εάν η αποικοδόμηση ABCG2 PZ-34 και PZ-38 αιτία μέσω λυσόσωμα ή πρωτεασώματος, χρησιμοποιήσαμε βαφιλομυκίνη A

1, ένας αναστολέας της αποικοδόμησης πρωτεΐνης στο λυσόσωμα, και MG-132, ένας αναστολέας πρωτεασώματος όπως περιγράφεται προηγουμένως [7]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7Α, προ-επεξεργασία των κυττάρων με βαφιλομυκίνη A

1 αναστέλλει PZ-34 και PZ-38-επαγόμενη αποικοδόμηση ABCG2 ενώ προκατεργασία με MG-132 δεν το κάνει. Έτσι, πιθανόν PZ-34 και PZ-38 επάγει επίσης την υποβάθμιση ABCG2 σε λυσοσώματα, το ίδιο όπως PZ-39 [7].

Α, υποβάθμιση ABCG2 σε λυσοσώματα. ΗΕΚ293 /κυττάρων ABCG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 3 μΜ PZ-34 ή PZ-38 σε απουσία ή παρουσία 10 ηΜ βαφιλομυκίνη A

1 (BMA1) ή 2 μΜ MG-132 για διάφορους χρόνους. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν για ανάλυση στυπώματος Western της έκφρασης ABCG2 ανιχνεύθηκαν με μονοκλωνικό αντίσωμα BXP-21. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β, ABCG2 διαμορφωτικές αλλαγές. ΗΕΚ293 /ABCG2 και MCF7 /AdVp3000 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ του PZ-34, PZ-38, ή τον έλεγχο του οχήματος DMSO ακολουθούμενη από χρώση με μονοκλωνικό αντίσωμα 5D3 και FACS ανάλυση. Arrowhead δείχνουν το PZ-34 και PZ-38 ομάδες που έλαβαν.

Η

PZ-34 και PZ-38 συνδέονται με ABCG2

Έχει αναφερθεί στο παρελθόν ότι το μονοκλωνικό αντίσωμα 5D3 συνδέεται με ABCG2 στην επιφάνεια των κυττάρων ευκολότερα κατά την σύνδεση των αναστολέων να ABCG2 πιθανώς λόγω αναστολέα προκαλούμενη διαμορφωτικές αλλαγές του ABCG2 [7], [12], [17]. Για να προσδιοριστεί εάν PZ-34 και PZ-38 δυνητικά δεσμεύονται με ABCG2, εκτελέσαμε χρώση αναλύσεις ABCG2 χρησιμοποιώντας 5D3 με την παρουσία ή απουσία του PZ-34 και PZ-38. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7Β, τα δύο PZ-34 και PZ-38 προκαλούν μια αύξηση στην χρώση 5D3 στα δύο κύτταρα MCF7 /AdVp3000 και ΗΕΚ293 /ABCG2, υποδεικνύοντας ότι και οι δύο PZ-34 και PZ-38 μπορεί να δεσμεύεται με ABCG2 και των δεσμευτικών οδηγεί σε διαμορφωτική αλλαγή του ABCG2.

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι υπάρχουν πιθανώς δύο ομάδες αναστολέων ABCG2 και ο αναστολέας που προκαλείται υποβάθμιση ABCG2 σε λυσοσώματα μπορεί να είναι πιο συχνές από ό, τι αναμενόταν προηγουμένως. Δείχνουμε επίσης ότι PZ-34 και PZ-38 είναι ισχυροί αναστολείς ABCG2. Αν και PZ-34 και PZ-38 είναι δομικά διαφορετικό από το παρελθόν εντοπιστεί αναστολέα ABCG2, PZ-39, που φαίνεται να έχουν παρόμοιο μηχανισμό δράσης με την αναστολή της λειτουργίας ABCG2 και επιταχύνοντας υποβάθμιση ABCG2 σε λυσοσώματα.

Μεταξύ των πολλών αναστολείς ABCG2 προηγουμένως εντοπιστεί, λίγα είναι γνωστά για να είναι ειδικά για ABCG2 και κανένας δεν έχει ερευνηθεί για να δείξει εάν θα μπορούσαν να επιταχύνουν την υποβάθμιση ABCG2 στο λυσόσωμα. Σ ‘αυτό και προηγούμενες μελέτες μας [7], διαπιστώσαμε ότι FTC δεν επηρέασε την έκφραση ABCG2 ενώ τόσο NSC-168201 και NSC-120668 έκανε. Στις τέσσερις νέους αναστολείς ABCG2 (ΡΖ-8, 16, 34, και 38) δοκιμάστηκαν σε αυτή τη μελέτη, τρία κατασταλεί έκφραση ABCG2 ενώ η άλλη όχι. Στο σύνολό τους, πιστεύουμε ότι υπάρχουν δύο ομάδες των αναστολέων ABCG2 με μία ανασταλτική μόνη δραστηριότητα ABCG2 και το άλλο, επίσης, την καταστολή υποβάθμιση ABCG2 εκτός από την αναστολή της λειτουργίας του ABCG2. Ονομάζουμε αυτές τις αναστολέων ως στατική και δυναμική αναστολείς, αντίστοιχα.

Αυτή τη στιγμή είναι άγνωστο τι θεμελιώδεις διαφορές μεταξύ αυτών των δύο ομάδων αναστολείς προκαλούν τη διαφορά στο μηχανισμό δράσης τους. Είναι, ωστόσο, είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι δεσμεύονται με δύο διαφορετικές θέσεις επί ABCG2. Σύνδεση είτε τοποθεσία θα προκαλέσει διαμορφωτικές αλλαγές του ABCG2 που οδηγούν σε αναστολή της δράσης της ABCG2. Ωστόσο, η δέσμευση σε μία από τις θέσεις θα διευκολύνει επίσης ABCG2 ενδοκύτωση και αποικοδόμηση στο λυσόσωμα. Η αλλαγή του ABCG2 διαμόρφωση με PZ-34 και PZ-38 ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το μονοκλωνικό αντίσωμα 5D3 υποδηλώνει ότι PZ-34 και PZ-38 δεσμεύονται άμεσα με ABCG2 αν και θέσεις δέσμευσης τους είναι προς το παρόν άγνωστη. Από FTC προκαλεί επίσης διαμορφωτική αλλαγή, αλλά δεν επιταχύνει την υποβάθμιση ABCG2, PZ-34 και PZ-38 πιθανόν δεν συνδέονται προς το παρόμοιο χώρο ως FTC. Προηγουμένως, έχει δειχθεί ότι η δεσμευτική επιταχυνόμενη ενδοκύτωση και αποικοδόμηση της β

2-αδρενεργικού υποδοχέα σε λυσόσωμα [18] αγωνιστή, που υποστηρίζουν την παραπάνω υπόθεση. Αν και είναι απίθανο, είναι επίσης πιθανό ότι οι δυναμικές αναστολείς ABCG2 μπορεί να έχει εκτός στόχου επίδραση που ενεργοποιεί τους ανάντη οδών που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση ABCG2. Ανεξάρτητα, οι δυνατότητες αυτές θα πρέπει να δοκιμαστεί σε μελλοντικές μελέτες σε βάθος.

Στο παρελθόν, έχει αποδειχθεί ότι η υποβάθμιση ABCG2 γίνεται κυρίως μέσω δύο διαφορετικών μηχανισμών. Ενώ σωστά διπλωμένη άγριου τύπου ABCG2 αποικοδομούνται κυρίως μέσω λυσόσωμα [16], οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες αποικοδομούνται από πρωτεασώματος μέσω ενός μηχανισμού ελέγχου της ποιότητας [16], [19], [20]. Φαίνεται ότι ο μηχανισμός ελέγχου της ποιότητας λαμβάνει χώρα στη σωστή ER μετά τη σύνθεση του ABCG2 και φυσιολογική αποικοδόμηση των πρωτεϊνών άγριου τύπου μπορεί να συμβεί μέσω ενδοκυττάρωσης του ABCG2 από τις μεμβράνες του πλάσματος. Επί του παρόντος, δεν είναι ακόμη γνωστό αν η δυναμική που προκαλείται από αναστολέα αποικοδόμηση του ABCG2 λαμβάνει χώρα από τη διακίνηση προς λυσόσωμα από μεμβράνες πλάσματος μέσω ενδοκυττάρωσης και /ή από μεμβράνες ER αμέσως μετά τη σύνθεση τους.

Αν και επί του παρόντος είναι άγνωστο αν PZ -34 και PZ-38 είναι ειδικά για ABCG2, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι δεν επηρεάζουν ABCB1 και τη λειτουργία ABCC1 και της έκφρασης. Έτσι, PZ-34 και PZ-38 είναι πιο ειδικά για ABCG2 από μερικά από τα οποία έχουν αναγνωρισθεί προηγουμένως αναστολείς ABCG2 όπως το γνωστό GF120918 ABCG2 αναστολέα που φαίνεται να αναστέλλει ABCB1 ή /και ABCC1 εξίσου καλά [2], [21]. Βρήκαμε επίσης ότι τόσο PZ-34 και PZ-38 δεν είναι κυτταροτοξικά με μια συγκέντρωση έως και 10 μg /ml, υποδηλώνοντας ότι αυτοί οι αναστολείς ABCG2 πιθανώς δεν δεσμεύονται με και αναστέλλουν άλλες κυτταρικές πρωτεΐνες με υψηλή συγγένεια που είναι απαραίτητα για την κυτταρική επιβίωση. Ωστόσο, απαιτούνται περισσότερες μελέτες για τη διερεύνηση της ειδικότητας του PZ-34 και PZ-38 και για να προσδιοριστεί εάν συνδέονται προς και να αναστέλλουν άλλα μέλη της οικογένειας μεταφορέα ABC ανθρώπινη.

Το γεγονός ότι PZ-34 και PZ -38 δεν έχουν καμία κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα ΗΕΚ293 σε συγκεντρώσεις μικρότερες από 10 μΜ και μπορεί να αντιστρέψει αποτελεσματικά MDR υποδηλώνει ότι το παράθυρο του θεραπευτικού δείκτη των ενώσεων αυτών είναι μεγάλες. Ένα ιδανικό χημειο-ευαισθητοποιητής είναι ότι δεν πρέπει να είναι τοξική από μόνη της. Σαφώς, PZ-34 και PZ-38 πληροί την απαίτηση αυτή σε in-vitro μελέτες. Ωστόσο, δεν είναι γνωστό εάν αυτές οι ενώσεις είναι τοξικές και αποτελεσματικές στην αναστροφή MDR ίη νίνο, οι οποίες πρέπει να αξιολογηθεί σε μελλοντικές μελέτες χρησιμοποιώντας ζωικά μοντέλα.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά