Αφηρημένο

Η πρωτεΐνη MUC1 εκφράζεται μη φυσιολογικά σε πολλά συμπαγών καρκίνων. Σε αντίθεση με ακραίο ομαδοποίηση του σχετικά υγιή επιθηλιακά κύτταρα, κατανέμεται ομοιόμορφα πάνω από τα καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, μια μηχανιστική σύνδεση μεταξύ ανώμαλη έκφραση και καρκίνος έχει παραμείνει απροσδιόριστη. Εδώ, αναφέρουμε ότι ένα προϊόν διάσπασης MUC1 δεσμευμένη σε μεμβράνη, ότι καλούμε MUC 1 *, είναι η επικρατούσα μορφή της πρωτεΐνης σε καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα και σε καρκινικούς ιστούς. Περαιτέρω, έχουμε αποδείξει ότι η επιμόλυνση ενός ελάχιστου θραύσματος MUC1, MUC1 *

1110, το οποίο περιέχει μια απλή σαράντα πέντε (45) αμινοξέα της εξωκυτταρικής περιοχής, είναι επαρκής για να παρέχει τα ογκογόνους δραστηριότητες που είχαν προηγουμένως αποδοθεί στην πλήρη Η αρχαιότητα πρωτεΐνη. Με σύγκριση του μοριακού βάρους και της λειτουργίας, φαίνεται ότι MUC1 * και MUC1 *

1110 είναι περίπου ισοδύναμες. Προσκομισθεί η απόδειξη υποστηρίζει σθεναρά μηχανισμό με τον οποίο διμερισμό του εξωκυτταρικού πεδίου της MUC1 * ενεργοποιεί την κινάση ΜΑΡ καταρράκτη σηματοδότησης και διεγείρει την ανάπτυξη των κυττάρων. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν μεθόδους για να χειριστεί αυτό το μηχανισμό ανάπτυξης για θεραπευτικές παρεμβάσεις σε θεραπείες για τον καρκίνο

Παράθεση:. Mahanta S, Fessler SP, το Park J, Bamdad C (2008) Μια ελάχιστη Θραύσμα MUC1 Παρεμβαίνει ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. PLoS ONE 3 (4): e2054. doi: 10.1371 /journal.pone.0002054

Επιμέλεια: Nils Cordes, Dresden University of Technology, Γερμανία

Ελήφθη: 17 Δεκ του 2007? Αποδεκτές: 13 Μάρτη 2008? Δημοσιεύθηκε: 30 Απριλίου 2008

Copyright: © 2008 Mahanta et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Όλοι οι συγγραφείς είναι υπάλληλοι της εταιρείας βιοτεχνολογίας και να συμμετάσχουν σε ένα πρόγραμμα δικαιωμάτων προαίρεσης αγοράς μετοχών

Εισαγωγή

MUC 1 είναι ένας τύπος. Ι μεμβράνης γλυκοπρωτεΐνη της οικογένειας βλεννίνης που έχει μια εκτεταμένη εξωκυτταρική περιοχή που αποτελείται από εκατοντάδες επαναλαμβανόμενες μονάδες παράλληλα, μία μόνο διαμεμβρανική περιοχή και μια Ο-τελική κυτταροπλασματική ουρά [1] – [5]. MUC1 εκφράζεται συνήθως σε ακραία σύνορα της υγιούς επιθηλίου που ευθυγραμμίζουν το αναπνευστικό, αναπαραγωγικό και το γαστρεντερικό εκτάσεις. Σε έντονη αντίθεση με την υγιή πρότυπο έκφρασης που περιορίζει MUC1 να αυλού επιφάνειες, καρκινικούς ιστούς εμφανίζουν μια παρεκκλίνουσα πρότυπο έκφρασης όπου MUC1 κατανέμεται ομοιόμορφα σε ολόκληρη την επιφάνεια του ιστού [6], [7]. Αυτή τη στιγμή υπολογίζεται ότι το 75% όλων των ανθρώπινων καρκίνων στερεού όγκου εκφράζουν με παρεκκλίνοντα τρόπο την πρωτεΐνη MUC1 [8].

Η λειτουργία του MUC1 στην υγιή κατάσταση παραμένει ασαφής, ενώ αποδείξεις ταχέως συσσωρεύονται για το ρόλο του ως ογκοπρωτεΐνη . Η εισαγωγή του MUC1 σε προηγουμένως MUC1-αρνητικά αποτελέσματα κύτταρα σε αυξημένο ρυθμό ανάπτυξης [9], επιτρέπει ανεξάρτητη από προσκόλληση κυτταρική ανάπτυξη [10] και καθιστά τα κύτταρα ανθεκτικά στην απόπτωση που επάγεται με αγωγή με πρότυπους παράγοντες χημειοθεραπείας [8]. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ MUC1 και μέλη της οικογένειας ErbB αναφερθεί [11], [12]. MUC1 εμπλέκεται σε διάφορα ενδοκυτταρικά μονοπάτια σηματοδότησης. Αυτές οι μελέτες έχουν επικεντρωθεί στην MUC 1 κυτταροπλασματική ουρά (MUC1-CT), το οποίο είναι ίσως το καλύτερα χαρακτηρισμένο τμήμα της πρωτεΐνης [13]. Η ουρά 72 αμινοξέων φέρει υπολείμματα που μπορεί να φωσφορυλιωθεί από Ζαρ70, PCKδ, ΟδΚ3β, ErbB1, c-Src, Lyn, και Lck. Επιπλέον, τα στοιχεία μεταγωγής σήματος ΑΡ-2, ρ53, ER-α, β-κατενίνης και Grb2 έχουν δειχθεί να συνδέονται με την MUC1-CT, πιθανώς ως συνάρτηση της κατάστασης φωσφορυλίωσης της. Πράγματι, οι μελέτες εμπλέκουν την φωσφορυλίωση της MUC1-CT στην ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης της ΜΑΡ κινάσης [12]. Σε μια τέτοια μελέτη [14], διέγερση αντισώματος της εξωκυτταρικής περιοχής μιας χιμαιρικής πρωτεΐνης που αποτελείται από τα εξωκυτταρικών και διαμεμβρανικών τμημάτων των CD8, αλλά η κυτταροπλασματική ουρά του MUC1, είχε ως αποτέλεσμα την φωσφορυλίωση του ERK 1/2. ενεργοποίηση ERK δείχθηκε ότι εξαρτάται από την φωσφορυλίωση του MUC1-CT και μπορούν να καταργηθούν από ένα κυρίαρχο αρνητικό μετάλλαγμα Ras ή από έναν αναστολέα ΜΕΚ, υποστηρίζοντας έτσι ότι το MUC1-CT μεσολαβεί στην σηματοδότηση Grb2-SOS-Ras-ΜΕΚ-ΕΚΚ καταρράκτη που οδηγεί στην κυτταρική διαίρεση.

Μελέτες της εξωκυττάριας περιοχής MUC 1 (ECD) περιπλέκονται από το μέγεθος διάτμηση του (150-300 kDa), το γεγονός ότι είναι ιδιαίτερα γλυκοσυλιωμένο και ότι αποτελείται από ένα μεταβλητό αριθμό εν σειρά επαναλήψεων. Επιπλέον, η πρωτεΐνη μπορεί να διασπαστεί, τότε αποβάλλονται από την κυτταρική επιφάνεια. Shed MUC1, που αποτελείται σε μεγάλο βαθμό από διαδοχικές επαναλήψεις, μπορεί να ανιχνευθεί στον ορό του σταδίου ΙΙ ασθενών με καρκίνο του μαστού [15]. Ομοίως, κηλίδες Western των προϊόντων λύσης των καλλιεργημένων καρκινικών κυττάρων MUC1-θετικών παρουσιάζουν δύο είδη MUC1: ένα είδος υψηλού μοριακού βάρους (150-300 kDa) το οποίο αντιδρά με αντισώματα που δεσμεύονται με τις διαδοχικές επαναλήψεις και ένα είδος χαμηλού μοριακού βάρους (20-35 kDa) το οποίο αντιδρά με αντισώματα που δεσμεύονται με την κυτταροπλασματική ουρά. υπερκείμενα των κυττάρων περιέχουν μόνο τα υψηλού μοριακού βάρους είδη MUC1. Ορισμένες μελέτες παρέχουν ενδείξεις ότι η MUC1 αυτο-διασπά μέσω ενός τομέα αλιείας εντός των πρωτεϊνών [16], [17]. Άλλοι έχουν παρουσιάσει ενδείξεις ότι TACE (ADAM 17) και ΜΜΡ14 (ΜΤ1-ΜΜΡ) διασπούν MUC1 [18], [19]. Πρόωρη εκθέσεις υποτεθεί ότι μετά τη διάσπαση MUC1, οι απελευθερώνεται, το τμήμα υψηλού μοριακού βάρους εκ νέου συνεργάτες με τη μεμβράνη δεσμευμένο θραύσμα χαμηλού μοριακού βάρους, αποτελώντας έτσι ο συνδέτης για τον υποδοχέα δεσμευμένο σε μεμβράνη [20].

Η παρούσα έκθεση εστιάζει στην έκφραση και τη λειτουργία του προϊόντος διάσπασης βάρος MUC1 χαμηλού μοριακού που παραμένει δεσμευμένη σε μεμβράνη μετά το μεγαλύτερο μέρος του τομέα εξωκυτταρικών έχει διασπασθεί και απελευθερώνεται από την κυτταρική επιφάνεια.

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός ενός νέου MUC1 αντισώματος

για να διερευνήσει τα πρότυπα έκφρασης των MUC1 και των προϊόντων διάσπασης του, καθώς και τις αντίστοιχες λειτουργίες τους, που χρειάζονται για την ανάπτυξη αντισωμάτων που θα μπορούσαν να διακρίνουν το προϊόν διάσπασης χαμηλού μοριακού βάρους από το πλήρους μήκους πρωτεΐνης σε ακέραια κύτταρα και δείγματα ιστών. Αντισώματα που αναγνωρίζουν τα διαδοχική επανάληψη μοτίβα (VU4H5, Santa Cruz) και την κυτταροπλασματική ουρά (Ab-5, LabVision) είναι εμπορικά διαθέσιμες (Εικ. 1Α). Ωστόσο, αντισώματα που αναγνωρίζουν το εξωκυτταρικό τμήμα του προϊόντος διάσπασης δεσμευμένη σε μεμβράνη δεν είναι. Για να περιπλέξει τα πράγματα, η ακριβής τοποθεσία (ες) στην οποία MUC1 διασπάται σε καρκινικά κύτταρα είναι ασαφής. Αρκετές θέσεις διάσπασης για MUC1 έχουν αναφερθεί ή υποτεθεί [21], [22]. Στην πραγματικότητα, ένα από τα ένζυμα που διασπά MUC1, ΜΜΡ14, μπορεί να διασπάσει τα υποστρώματα του σε πολλαπλές θέσεις [23]. Ωστόσο, καμία θέση διάσπασης που έχει αναφερθεί ή προταθεί θα παρήγαγε ένα θραύσμα δεσμεύεται μεμβράνη με έναν εξωκυτταρικό τομέα μικρότερο από σαράντα πέντε (45) αμινοξέα. Ως εκ τούτου, θέσαμε αντίσωμα εναντίον της σαράντα πέντε (45) πεπτίδιο αμινοξέων (Ν-1110-1154-C) που είναι αμέσως Ν-τερματικά προς το πεδίο διαμεμβράνης (Σχ. 1Β). Εμείς αιτιολογημένη ότι αυτό το αντίσωμα θα αναγνωρίσει τις δεσμευμένες σε μεμβράνη προϊόντων όλων των αναφερόμενων ή προτείνονται θέσεις διάσπασης. Λόγω της αβεβαιότητας της ακριβούς θέσης της διάσπασης MUC1, εδώ, εμείς γενικώς αναφέρονται σε όλα τα προϊόντα διάσπασης MUC1 αγκυροβολημένες στην μεμβράνη ως MUC1 *. Ομοίως, αναφερόμαστε σε αντισώματα που δημιουργούνται εναντίον του πεπτιδίου σαράντα πέντε αμινοξέων (Ν-1110-1154-C) ως αντι-MUC1 *. Τόσο πολυκλωνικά και μονοκλωνικά αντισώματα παράχθηκαν και εκτελούνται ουσιαστικά ισοδύναμα.

Α. Πλήρους μήκους MUC1 πρωτεΐνη αποτελείται από ένα κυτταροπλασματική ουρά (CT), μία διαμεμβρανική περιοχή (ΤΜ), έναν τομέα αυτο-συσσωμάτωσης (SAD), και εκατοντάδες διαδοχικές επαναλήψεις (TRS). B. Η διάσπαση του προϊόντος, MUC1 *, αποτελείται από κυτταροπλασματικής ουράς, διαμεμβρανική περιοχή, και τουλάχιστον 45 αμινοξέα της εξωκυτταρικής περιοχής (ECD). Αν και η ακριβής θέση (θέσεις) διάσπασης παραμένουν κάπως αβέβαιη, εξ όσων γνωρίζουμε, δεν υπάρχουν θέσεις διάσπασης έχουν αναφερθεί ότι αφήνουν λιγότερο από ένα ECD 45 αμινοξέων. τοποθεσίες για αντισώματα VUH5, Ab-5 και Anti-MUC1 * δεσμευτική σημειώνονται. C. Ανάλυση Western των προϊόντων λύσης κυττάρου καλλιεργημένων καρκινικών κυττάρων MUC1-θετικός ακέραιος, λωρίδες 1-6, συγκρίνονται με MUC1-αρνητικά κύτταρα, Λωρίδες 7-9. Ένα 6% γέλη (άνω) αποτυπώθηκε με VU4H5 και ένα 12% gel (κάτω) αποτυπώθηκε με Anti-MUC1 *. D. T47D, MUC1-θετικά καλλιεργημένα κύτταρα καρκίνου του μαστού, ανοσοκαταβυθίστηκαν είτε με Ab-5 ή αντι-MUC1 *. Δείγματα του συνόλου κυτταρικό λύμα (WCL), Λωρίδα 1, ή τα προϊόντα ανοσοκαταβύθισης, διαδρομές 2 και 3, αναλύθηκαν με στύπωμα Western. Τα πηκτώματα ανιχνεύθηκαν με είτε VU4H5 (άνω) ή αντι-MUC 1 * (κατώτερο). Ε Western ανάλυση τριών καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές MUC1-θετικά πριν και μετά την απογλυκοζυλίωση και στυπώθηκαν με αντι-MUC 1 * δείχνει ότι το πραγματικό μοριακό βάρος του διασπάται MUC 1 είναι περίπου 16-18 kDa. F. Ο πίνακας συνοψίζει τις αντιδραστικότητες των αντισωμάτων είτε πλήρους μήκους MUC1 (Hi MW) ή διασπώνται MUC1 (Lo MW).

Η

Anti-MUC1 * αντισώματα χαρακτηρίζονται από κηλίδα western, FACS, και ανοσοκυτταροχημεία. Το σχήμα 1C δεικνύει μια κηλίδα western στην οποία κυτταρολύματα από ένα πάνελ καλλιεργημένων καρκινικών κυττάρων MUC1-θετικά ανιχνεύθηκαν είτε με VU4H5 (ανώτερη γέλη) ή αντι-MUC 1 * (κατώτερη γέλη). Όπως ήταν αναμενόμενο, VU4H5 βάφονται του υψηλού μοριακού βάρους MUC1 είδος από όλα τα MUC1-θετικών κυττάρων που δοκιμάστηκαν: T47D, ZR-75-1, ZR-75-30, ΒΤ474, DU145, και Capan 2. Αντι-MUC 1 * βάφονται ένα χαμηλού μοριακού βάρους 20-35 kDa πρωτεϊνική ζώνη που φάνηκε να είναι ειδική για MUC1. MUC1-αρνητικά κύτταρα, HCT116, 3Υ1, και ΗΕΚ293, δεν αντέδρασε είτε με αντίσωμα. Για να επιβεβαιωθεί ότι τα είδη χαμηλού μοριακού βάρους που αντιδρούν με αντι-MUC 1 * ήταν πράγματι MUC1, προϊόντα λύσης από MUC1-θετικά κύτταρα όγκου ανοσοκαταβυθίστηκαν είτε με Ab-5 (κυτταροπλασματική ουρά αντίσωμα) ή αντι-MUC 1 *, στη συνέχεια αναλύθηκαν με western blot ( Σχ. 1D). Anti-MUC1 * συνδέεται με τα ίδια είδη χαμηλού μοριακού βάρους που Ab-5 αναγνωρίζει, επιβεβαιώνοντας έτσι ότι το αντι-MUC1 * συνδέεται με το μοριακό βάρος του προϊόντος διάσπασης χαμηλή MUC1.

Όπως έχει ήδη αναφερθεί, με ανάλυση κηλίδος western, τα υψηλού μοριακού βάρους είδη MUC1 αντέδρασε μόνο με αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον των διαδοχικές επαναλήψεις, και δεν αντέδρασαν με αντι-MUC 1 * ή Ab-5 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, και τα δύο αντισώματα είναι ικανά να ανοσοκαθιζάνει ασθενώς τα είδη υψηλού μοριακού βάρους (Σχ. 1 D, ανώτερη γέλη). Σε αυτά τα πειράματα, ανοσοκαθίζηση μπορεί απλά να φέρει κάτω από ένα μη ομοιοπολικά ετερο-διμερές δύο θραυσμάτων διάσπασης. Τα αποτελέσματα αυτά θα μπορούσαν επίσης να εξηγηθεί από το γεγονός ότι VU4H5 προσδένεται σε μία μονάδα διαδοχική επανάληψη που έχει επαναληφθεί εκατοντάδες φορές ανά υποδοχέα ενώ Αντι-MUC 1 * και Ab-5 προσδένονται σε μη-επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες που εμφανίζονται μόνο μια φορά ανά υποδοχέα. Εναλλακτικά, αυτά τα αποτελέσματα θα μπορούσαν απλά να εξηγηθεί από το γεγονός ότι το μεγαλύτερο είδος σε καρκινικά κύτταρα είναι η διασπασμένο μορφή, MUC1 *. Ο πίνακας του σχήματος 1 συνοψίζει τα δεδομένα δέσμευσης αντισώματος.

Για να διερευνηθεί περαιτέρω το πραγματικό μέγεθος των ειδών βάρους MUC1 χαμηλού μοριακού, λύματα κυττάρων απογλυκοζυλιώθηκαν πριν από την ανάλυση κηλίδος western. Το Σχήμα 1 Ε δείχνει ότι μετά την απογλυκοζυλίωση, η προηγουμένως ευρείας 20-35 kDa πρωτεϊνική ζώνη συγκλίνει σε ένα διακριτό μπάντα που τρέχει με ένα φαινόμενο μοριακό βάρος περίπου 15-17 kDa. Σημειώνουμε ότι το υπολογιζόμενο μοριακό βάρος ενός προϊόντος διάσπασης MUC1, trunacted μετά από περίπου σαράντα πέντε αμινοξέα της εξωκυτταρικής περιοχής είναι περίπου 16 kDa.

πρότυπα έκφρασης των MUC1 και Διάσπαση της προϊόν, MUC1 *, επί καλλιεργημένων κύτταρα και σε καρκινικούς ιστούς

καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα αναλύθηκαν με ανοσο-κυτταροχημεία να καθοριστεί η μορφή έκφρασης του MUC 1 και MUC1 προϊόντων της διάσπασης *. MUC1-θετικό καρκίνο του μαστού κύτταρα χρωματίστηκαν με διπλό VU4H5 που δεσμεύεται με δίδυμες επαναλήψεις μονάδες στο θραύσμα υψηλού μοριακού βάρους και Anti-MUC1 * που δεσμεύεται με την χαμηλού μοριακού βάρους, το προϊόν διάσπασης δεσμευμένη σε μεμβράνη, MUC1 *. Φθορισμού απεικόνιση αποκάλυψε ότι MUC 1 * είναι η κυρίαρχη μορφή της πρωτεΐνης σε καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα και κατανέμεται ομοιόμορφα σε ολόκληρη την επιφάνεια του κυττάρου. Σε αντίθεση, οι πρωτεΐνες που βάφτηκαν με VU4H5 είτε δεν υπάρχει καθόλου ή ήταν τα ελάσσονα είδη (σχήμα 2Α). χρώση VU4H5 θα μπορούσε να δείξει ότι η πρωτεΐνη στην επιφάνεια είναι πλήρους μήκους MUC1 ή ότι είναι ένα μη ομοιοπολικά συνδεδεμένο ετερο-διμερές που αποτελείται από δύο προϊόντα διάσπασης. Αξίζει να σημειωθεί ότι, το μοτίβο της έκφρασης της πλήρους μήκους MUC1 είναι συγκεντρωμένα σε ένα ή δύο σημεία στην επιφάνεια του κυττάρου, η οποία θυμίζει την τάση των MUC1 για την υγιεινή επιθήλιο να συγκεντρώνονται στα ακραία σύνορα.

Α. Φθορισμού απεικόνιση των καλλιεργημένων κυττάρων καρκίνου του μαστού δείχνει ότι το προϊόν διάσπασης MUC1 * (κόκκινο) είναι το κυρίαρχο είδος και κατανέμεται ομοιόμορφα σε ολόκληρη την επιφάνεια του κυττάρου. Πλήρους μήκους MUC1 (πράσινο) είναι το είδος ήσσονος σημασίας και συγκεντρωμένα. Τα κύτταρα διπλό χρωματίστηκαν με αντι-MUC 1 * (κόκκινο) που δεσμεύεται σε έναν επίτοπο εντός της μεμβράνης εγγύς πρώτα 45 αμινοξέα της εξωκυτταρικής περιοχής και VU4H5 (πράσινο) που δεσμεύεται σε έναν επίτοπο εντός του τομέως διαδοχική επανάληψη της πρωτεΐνης πλήρους μήκους . ΕΊΝΑΙ. Ζεύγη συνεχόμενων τμημάτων ανθρώπινων δειγμάτων ιστού από ασθενείς άνευ αγωγής βάφτηκαν είτε με αντι-MUC 1 * (αριστερά) ή VU4H5 (δεξιά). Εικόνες φωτογραφήθηκαν σε 10 × ή 100 × μεγέθυνση. B. Μια διατομή ενός μη-καρκινικές σάλπιγγα δείχνει MUC1 * χρώση επιφάνειας στο αυλού άκρη (κάτω αριστερά). Πλήρους μήκους MUC 1 είναι κυτταροπλασματικό (κάτω δεξιά). Γ μαστού δείγματα καρκινικού ιστού. Δ Ο καρκίνος του πνεύμονα δείγματα. Ε καρκίνο του παχέος εντέρου δείγματα. Τα βέλη δείχνουν τις πιο εμπλέκονται τμήματα του καρκινικού ιστού, όπου όλα κυτταρική αρχιτεκτονική έχει χαθεί και ο ιστός δεν βάφονται με VU4H5.

Η

Είμαστε δίπλα κοίταξε το πρότυπο έκφρασης της πλήρους μήκους MUC1 έναντι MUC1 * υγιή και καρκινικά δείγματα ανθρώπινου ιστού από μη επεξεργασμένο ασθενείς. Διαδοχικές τομές ενός μη-καρκινικές σάλπιγγα βάφτηκαν είτε με αντι-MUC 1 * ή VU4H5. Αμφότερα τα αντισώματα MUC1 βάφονται επιφάνεια του αυλού της σάλπιγγας αλλά όχι στον περιβάλλοντα ιστό (σχ. 2Β, άνω πάνελ). 100-πλάσια μεγέθυνση αποκάλυψε ότι η διασπασμένο μορφή, MUC1 *, εκφράζεται αποκλειστικά στο

επιφάνεια

των επιθηλιακών κυττάρων που ευθυγραμμίζουν το σωλήνα, ενώ η πρωτεΐνη MUC1 πλήρους μήκους φαίνεται να περιορίζεται στο κυτταρόπλασμα (Σχ. 2Β, κάτω πάνελ). Back-to-back τμήματα των καρκινικών μαστού, του πνεύμονα, του παχέος εντέρου και των ιστών παρομοίως ανιχνεύθηκαν με τα δύο αντισώματα (Σχ. 2C-Ε, αντίστοιχα). Σε έντονη αντίθεση με το πρότυπο έκφρασης της MUC 1 σε υγιείς ιστούς, η οποία περιορίζεται στην αυλική άκρη, MUC1 εκφράζεται σε ολόκληρη την επιφάνεια των καρκινικών ιστών. Χρώση με αντι-MUC 1 * δείχνει ότι, όπως και σε καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα, η κύρια μορφή της MUC1 επί καρκινικών ιστών είναι MUC1 *. Μεγεθυσμένες εικόνες δείχνουν ότι MUC1 * εκφράζεται επί του κυττάρου

επιφάνεια

ενώ πλήρους μήκους MUC1 φαίνεται να είναι κυτταροπλασματική (Σχ. C, D, κάτω πάνελ). Αξιοσημείωτα, Anti-MUC1 * παράγεται βαρύτερο χρώση από VU4H5 παρά το γεγονός ότι η διαδοχική επανάληψη αντίσωμα μπορεί να δεσμευτεί σε εκατοντάδες επιτόπων ανά υποδοχέα σε σύγκριση με το ενιαίο επίτοπο στον οποίο Αντι-MUC 1 * δεσμεύεται. Μερικοί από τους καρκινικούς ιστούς που δοκιμάσαμε δεν λεκιάζει θετικό είτε με MUC1 αντίσωμα. Από τους εννέα (9) δείγματα καρκίνου του μαστού που εξετάστηκαν, μόνο ένας ήταν MUC1-αρνητικό καρκίνου, η οποία αντιστοιχεί περίπου με τις δημοσιευμένες εκθέσεις ότι περίπου 90% όλων των καρκίνων του μαστού είναι MUC1-θετικά καρκίνους. Σημειώνουμε ότι τα δείγματα ιστού που κρίθηκαν ότι είναι MUC1-αρνητικών καρκίνων έδειξε φυσιολογική κορυφής χρώση τόσο με MUC 1 αντισωμάτων σε περιοχές εκτός του περιθωρίου κακοήθειας (τα δεδομένα δεν φαίνονται) επιβεβαιώνουν ότι η δοκιμασία σωστά εκτελείται αλλά ότι αυτοί οι καρκίνοι δεν χαρακτηρίστηκαν από παρεκκλίνουσα έκφραση MUC1.

Είναι σημαντικό, έχουμε παρατηρήσει ότι κάποιοι δείγματα ιστού βάφονται θετικά για την παρουσία του MUC 1 *, αλλά αρνητικό για πλήρους μήκους MUC1. Για παράδειγμα, ένα δείγμα καρκίνου του παχέος εντέρου χρωματίστηκε με αντι-MUC 1 * με την πιο έντονη χρώση που συμβαίνουν στις πιο νοσούντα τμήματα του δείγματος. Σε αντίθεση, VU4H5 βάφηκε ελαφρά περιοχές κοντά στο περιθώριο της κακοήθειας, αλλά δεν παρήγαγαν χρώση στις πιο άρρωστα περιοχές, η οποία χαρακτηρίζεται από την απώλεια της κυτταρικής αρχιτεκτονικής (Σχ. 2Ε). Αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν με την ιδέα ότι μπορεί να εμφανιστεί τα πιο καρκινικές δειγμάτων που πρόκειται να MUC1-αρνητική εάν διερευνήθηκαν με αντισώματα έναντι μόνη της πρωτεΐνης πλήρους μήκους. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι το κυρίαρχο είδος MUC1 για καρκινικό ιστό, όπως σε καλλιεργημένα καρκινικά κύτταρα, είναι το διασπασμένο είδος, MUC1 *.

MUC1 * διαμεσολαβεί κυτταρική ανάπτυξη

Μετά τον προσδιορισμό ότι η κύρια είδη στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων και ιστών είναι MUC1 * και όχι η πρωτεΐνη πλήρους μήκους, αποφασίσαμε να μελετήσουμε τα χαρακτηριστικά ανάπτυξης του διασπάται μορφής σε σύγκριση με μη διασπασμένο. MUC1-αρνητικά κύτταρα, 3Υ1 και HCT116, επιμολύνθηκαν είτε με πλήρους μήκους MUC1 ή ένα κατασκεύασμα, MUC1 *

1110, του οποίου η εξωκυτταρική περιοχή τερματίστηκε μετά από σαράντα πέντε (45) αμινοξέα (Ν-1110-1255-C ) (Σχ. 1Β). Σταθερά επιμολυσμένα κατέληξε να είναι ανεπαρκής για τη μελέτη επειδή οι επιμολύνσεις πλήρους μήκους εξελίχθηκε γρήγορα σε έναν πληθυσμό που κυριαρχείται από το διασπασμένο μορφή, MUC1 *, έχει μικρή ή καθόλου πρωτεΐνη πλήρους μήκους διαθέσιμες στην κυτταρική επιφάνεια (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για το λόγο αυτό, μεμονωμένοι κλώνοι κυττάρων παρήχθησαν και χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα που περιγράφονται στην παρούσα μελέτη. FACS, ανοσοκυτταροχημεία και η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι οι κλώνοι απλού κυττάρου μας πλήρους μήκους MUC1 παρήγαγαν την πλήρους μήκους πρωτεΐνη αλλά δημιουργείται επίσης το προϊόν διάσπασης MUC1 * (Εικ. S1).

Ένα κλωνογονική δοκιμασία εκτελέστηκε για να αξιολογηθεί ο ρυθμός αύξησης του MUC1 *

1110 έναντι πλήρους μήκους MUC1 που είχαν διαμολυνθεί σε ινοβλάστες αρουραίου 3Υ1 κύτταρα. Κύτταρα επιστρώθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα αφέθηκαν να αναπτυχθούν για εννέα (9) ημέρες. Τα προκύπτοντα αποικίες έγιναν ορατές με χρώση με κρυσταλλικό ιώδες. MUC1 *

1110 κλώνοι, 3Υ1 MUC1 * 3 και 3Υ1 MUC1 * 44, που παράγεται περισσότερο, μεγαλύτερη και πυκνότερη αποικίες από κλώνους πλήρους μήκους, 3Υ1 MUC1 8 και 3Υ1 MUC1 17 (Σχ. 3Α). Στο τέλος των εννέα ημερών, οι MUC1 *

1110 κλώνοι προσκόμισε πέντε έως δέκα φορές περισσότερα κύτταρα από τους κλώνους πλήρους μήκους. Η διαφορά στην ανάπτυξη ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της ποσότητας του κρυσταλλικού ιώδους που απελευθερώθηκε από τα κύτταρα σε κάθε πλάκα (σχήμα 3Α:. Ραβδογράφημα). Ωστόσο, η αύξηση του αριθμού των κυττάρων που θα μπορούσε να οφείλεται στην αύξηση του ποσοστού επιβίωσης ή την αύξηση του ρυθμού ανάπτυξης. παράγοντες επιβίωσης των κυττάρων μπορεί να προσδιοριστεί από την ικανότητά τους να καθιστούν τα κύτταρα ανθεκτικά σε προκαλούμενη από χημειοθεραπεία θάνατο. Ενιαία κυτταρικοί κλώνοι του MUC1 ή MUC1 *

1110 που είχαν επιμολυνθεί σε MUC1-αρνητικά κύτταρα (3Υ1 ή HCT116) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AraC, σισπλατίνη ή η ετοποσίδη, στη συνέχεια προσδιορίζονται για να μετρηθεί η ποσότητα του κυτταρικού θανάτου. Κύτταρα επιμολυσμένα με είτε πλήρους μήκους MUC1 ή MUC1 *

1110 έγιναν ανθεκτικά στην απόπτωση που επάγεται από αυτούς τους παράγοντες χημειοθεραπείας. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα δείχνεται στο Σχήμα 3Β. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν ότι MUC1 ή MUC1 * επιβίωση αύξηση των κυττάρων. Για να καθοριστεί εάν αυτοί επίσης να αυξήσει την ανάπτυξη των κυττάρων, ένα πείραμα ανάλυση κυτταρικού κύκλου εκτελέστηκε. FACS χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση του αριθμού των κυττάρων σε G2 /M φάση (ένας δείκτης της κυτταρικής διαίρεσης) σε σύγκριση με τον αριθμό στη φάση G1. Η αναλογία των κυττάρων σε G2: G1 μετρήθηκε για κύτταρα HCT116 επιμολυσμένα με είτε πλήρους μήκους MUC1 ή MUC1 *

1110 (Σχήμα 3C).. Η εισαγωγή είτε MUC1 *

1110 ή πλήρους μήκους MUC1 οδήγησε περισσότερα κύτταρα στην φάση G2 /M από την επιμόλυνση έλεγχο του κενού φορέα. Ωστόσο, η επιμόλυνση MUC1 *

1110 αύξησε την αναλογία του G2:G1 περισσότερο από την επιμόλυνση του πλήρους μήκους proetin. Υπενθυμίζουμε ότι αν και τα κύτταρα επιμολύνονται με την πρωτεΐνη πλήρους μήκους, ένα σημαντικό ποσό πρωτεολύονται στην MUC 1 * μορφή.

A. Ένα κλωνογονική δοκιμασία εκτελέστηκε σε απλού κυττάρου κλώνους 3Υ1 κύτταρα MUC1-αρνητικά που είχαν επιμολυνθεί είτε με ένα κενό φορέα, πλήρους μήκους MUC1 ή MUC1 *

1110. Μια φωτογραφία από πιάτα Petri που περιέχουν κύτταρα επιστρώθηκαν στα 1000 κύτταρα ανά 100 mm, αναπτύχθηκαν για 9 ημέρες, στη συνέχεια, χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες. ραβδόγραμμα ποσοτικοποιεί την ανάπτυξη του κάθε κλώνου. Κρυσταλλικό ιώδες απορροφάται από τα κύτταρα σε κάθε πλάκα απελευθερώθηκε και η απορρόφηση στα 590 nm μετρήθηκε σε ένα φασματοφωτόμετρο. Μετρήσεις απορρόφησης κανονικοποιήθηκαν με το ποσό της κρυσταλλικού ιώδους απελευθερώνεται από τον κενό φορέα κλώνο. Ονοματολογία για το ενιαίο κλώνους κυττάρων μας είναι «γονικό κύτταρο όνομα /κατασκευή /κλώνος #». Β Αντοχή σε κυτταρικό θάνατο που επάγεται από το φάρμακο χημειοθεραπείας AraC δοκιμάζεται σε απλού κυττάρου κλώνους από είτε κενό φορέα, πλήρους μήκους MUC1 ή MUC1 * επιμολύνεται σε 3Υ1 κύτταρα. C. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου διεξήχθη επί είτε κενό φορέα, πλήρους μήκους MUC1 ή MUC1 * μορφομετατρέπονται σε MUC1-αρνητική κυτταρική σειρά HCT116. Η αναλογία του ποσοστού των κυττάρων σε G2 σε G1 φάση σχεδιάζεται ως συνάρτηση της συγκέντρωσης του ορού. Η αναλογία του% G2:% G1 για τα κενά μορφομετατροπείς διάνυσμα έχει κανονικοποιηθεί στο 1. D. Η ανάπτυξη του MUC1-θετικό καρκίνο του μαστού κύτταρα, ZR-75-30, διεγείρεται με την προσθήκη του δισθενούς (bv) Αντι-MUC 1 * και αναστέλλεται με την προσθήκη του μονοσθενούς (mv) Fab. Η προσθήκη δισθενούς αντισώματος παράγει την καμπύλη ανάπτυξης κωδωνοειδή που είναι χαρακτηριστική του διμερισμού υποδοχέα. Η ανάπτυξη των κυττάρων MUC1-αρνητικά ΗΕΚ 293 δεν επηρεάστηκε ούτε από την δισθενή ή μονοσθενή αντι-MUC1 *. Ε Η διέγερση της ανάπτυξης με την προσθήκη δισθενούς Αντι-MUC 1 * δοκιμάζεται χρησιμοποιώντας σταθερά επιμολυσμένα siRNA για την καταστολή της έκφρασης MUC 1 στον καρκίνο του μαστού κυτταρική γραμμή T47D. Τα δισθενή Αντι-MUC 1 διεγείρεται ανάπτυξη σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο siRNA, αλλά δεν επηρεάζει σημαντικά την ανάπτυξη των MUC1 κατασταλεί κύτταρα. ανάλυση κηλίδας Western (ένθετο) δείχνει ότι MUC1 siRNA κατασταλεί έκφραση MUC 1 κατά περίπου 90%. ΣΤ MUC1-θετικά κύτταρα καρκίνου του μαστού, T47Ds, αντιμετωπίζονται είτε με δισθενή Anti-MUC1 * ή το monvalent Fab, στη συνέχεια αναλύθηκαν με Western για την παρουσία φωσφορυλιωμένων ERK1 /2. Οι κηλίδες δείχνουν την επαγωγή της φωσφορυλίωσης ERK2 από δισθενή Αντι-MUC 1 * και την αναστολή της βασικής ERK1 /2 φωσφορυλίωση μετά από δύο ημέρες (2 δ) η θεραπεία με το μονοσθενές Fab.

Η

Έτσι, έχοντας δημιουργήσει μια σύνδεση μεταξύ της MUC1 * και την ανάπτυξη, εμείς εικάζουν ότι αυτό μπορεί να λειτουργεί ως ένας υποδοχέας αυξητικού παράγοντα. Χωρίς γνωστός συνδετήρας για MUC1 ή MUC1 *, θα ήταν δύσκολο να ελεγχθεί η υπόθεση. Ωστόσο, υποδοχείς αυξητικού παράγοντα Κατηγορίας Ι ενεργοποιούν την κυτταρική ανάπτυξη μέσω του διμερισμού της εξωκυτταρικής περιοχής του υποδοχέα. Είχαμε ένα δισθενές αντίσωμα έναντι του MUC 1 *

1110-ECD (εξωκυτταρική περιοχή) τμήμα, το οποίο θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την προσομοίωση συνδετήρα αυτού. Άλλοι είχαν αναφερθεί στο παρελθόν ότι η διέγερση αυτής της τάξης υποδοχέων αυξητικού παράγοντα με διμερισμού αντισώματα που δημιουργούνται καμπύλες ανάπτυξης σε σχήμα καμπάνας [24] – [26]. Αυτό συμβαίνει επειδή κυτταρική ανάπτυξη αυξάνεται με την αύξηση της συγκέντρωσης του αντισώματος μέχρι μέγιστη ανάπτυξη επιτυγχάνεται όταν ένα αντίσωμα διμερίζεται κάθε δύο υποδοχείς. Ωστόσο, καθώς η συγκέντρωση του αντισώματος πηγαίνει σε περίσσεια, κάθε αντίσωμα συνδέεται με έναν υποδοχέα, οπότε δεν λαμβάνει χώρα διμερισμό, και την ανάπτυξη των κυττάρων ξεκολλήσει. Πραγματοποιήσαμε παρόμοια πειράματα με κατεργασία MUC1-θετικά καρκινικά κύτταρα, καθώς και MUC1 και MUC1 *

1110 επιμολυσμένα κύτταρα με αντι-MUC 1 *. Ως αρνητικός έλεγχος, υποβάλλαμε σε αγωγή κύτταρα με το μονοσθενές Fab του αντι-MUC1 *, η οποία δεν θα ήταν σε θέση να διμεριστούν τους υποδοχείς. Για κάθε MUC1-θετικά ή MUC1 *

1110-θετική κυτταρική γραμμή που ελέγξαμε, η δισθενούς αντισώματος τόνωσε την ανάπτυξη των κυττάρων και παράγεται το αναμενόμενο σχήμα καμπάνας καμπύλη ανάπτυξης. Σε πλήρη αντίθεση, η μονοσθενής Fab, όχι μόνο δεν διέγειρε την κυτταρική ανάπτυξη, αλλά επάγεται κυτταρικό θάνατο. Τα αποτελέσματα ενός τέτοιου πειράματος παρουσιάζεται στο Σχήμα 3D, όπου η αύξηση του MUC1-θετικό καρκίνο του μαστού κύτταρα, ZR-75-30s, διεγείρεται από αντι-MUC 1 * και αναστέλλεται από την μονοσθενή Fab. MUC1-αρνητικά κύτταρα ΗΕΚ293 δεν επηρεάζονται από οποιοδήποτε αντίσωμα. αντισώματα ελέγχου, είτε δισθενής ή μονοσθενής, δεν είχε καμία επίδραση στην ανάπτυξη του MUC1-θετικού κυττάρου ανάπτυξης όγκου (Σχ. S2). Για να επιβεβαιωθεί ότι το αντίσωμα-διέγερση της κυτταρικής ανάπτυξης ειδικά διαμεσολαβείται από MUC1, τα πειράματα επαναλήφθηκαν χρησιμοποιώντας MUC 1-θετικά κύτταρα καρκίνου του μαστού, T47Ds, που είχαν σταθερά επιμολυσμένα με siRNA να knockdown MUC1 έκφρασης. κυτταρική ανάπτυξη T47D διεγείρεται με την προσθήκη του δισθενούς Αντι-MUC 1 * και η χαρακτηριστική καμπύλη ανάπτυξης κωδωνοειδή παράγεται. Ωστόσο, σε κύτταρα στα οποία η έκφραση MUC 1 έχει κατασταλεί με τουλάχιστον το 90%, το αντίσωμα δεν έχει καμία διεγερτική επίδραση (Σχ. 3Ε). Τέλος, τα πειράματα έδειξαν ότι η διέγερση της MUC1-θετικών κυττάρων με δισθενή Anti-MUC1 * προκάλεσε την φωσφορυλίωση των ERK1 /2. Σε αντίθεση, το μονοσθενές θραύσμα Fab του αντι-MUC 1 * κατέστειλε βασικά επίπεδα φωσφορυλιωμένης ERK1 /2 (Σχ. 3F). Η φωσφορυλίωση του ERK1 /2 είναι ένα βασικό βήμα στην ενεργοποίηση του καταρράκτη σηματοδότησης της ΜΑΡ κινάσης. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα είναι συνεπή με την ιδέα ότι MUC 1 * είναι ένας υποδοχέας αυξητικού παράγοντα ή συν-υποδοχέα που διαμεσολαβεί κυτταρική ανάπτυξη μέσω διμερισμό του εξωκυτταρικού πεδίου, οπότε το ΜΑΡ κινάσης μονοπάτι σηματοδότησης ενεργοποιείται.

MUC1 * συνδετήρες ενεργοποίησης

Αν MUC1 ή MUC1 * λειτουργεί ως υποδοχέας αυξητικού παράγοντα που ενεργοποιείται από διμερισμό του εξωκυτταρικού πεδίου, τότε έπεται ότι MUC1-θετικά καρκινικά κύτταρα μπορεί να εκκρίνουν ένα πρόσδεμα (ες) διμερισμού. Σχεδιάσαμε ένα πείραμα νανοσωματίδιο για τη διαλογή προϊόντων λύσης και υπερκείμενα κυττάρων καρκίνου για την παρουσία αυτής της ρίζας συνδέσεως. MUC1 *

1110-ECD πεπτίδια (Ν-1110-1054-C: βλ. Σχήμα 1Β) συνδέθηκαν με νανοσωματίδια χρυσού μέσω μιας Ο-τερματική ετικέτα ιστιδίνης και προϊόντος λύσης /υπερκειμένου δείγματα προστέθηκαν [27]. Εάν ένας συνδετήρας διμερισμού ήταν παρόντες, θα δεσμεύονται ταυτόχρονα με ένα πρώτο πεπτίδιο σε ένα πρώτο νανοσωματίδιο και ένα δεύτερο πεπτίδιο σε ένα δεύτερο νανοσωματίδιο, προκαλώντας έτσι χύμα σταυροειδών δεσμών των νανοσωματιδίων και πεπτίδια. Λόγω της εγγενούς ιδιότητα του νανοσωματίδια χρυσού, η διασύνδεση προκαλεί μια αλλαγή χρώματος από το χαρακτηριστικό ροζ σε ένα πορφυρό /μπλε [28]. Η προσθήκη του προϊόντος λύσης /υπερκειμένου μείγματα για MUC1 *

1110-ECD νανοσωματίδια πεπτίδιο που φέρουν προκάλεσε το διάλυμα να γυρίσει μωβ /μπλε. Ο ρυθμός της αλλαγής του χρώματος αντιστοιχούσε περίπου στο ποσό των MUC1 που παράγονται κάθε κυτταρική σειρά. Καμία αλλαγή χρώματος οδήγησε όταν το λύμα υπερκείμενο μίγματα /προστέθηκαν σε νανοσωματίδια φέρουν ένα πεπτίδιο ελέγχου (Σχ. 4Α).

A. Το λύμα-υπερκείμενο μίγματα από ένα πάνελ MUC1-θετικό καρκίνο του μαστού κύτταρα ελέγχθηκαν για την παρουσία ενός συνδετήρα ικανό διμερισμού ένα MUC1 *

1110-ECD πεπτίδιο (πλησίον της μεμβράνης 45 αμινοξέα της εξωκυτταρικής περιοχής: 1110-1155) . μίγματα Lysate-υπερκειμένου επωάστηκαν με νανοσωματίδια που φέρουν είτε ένα πεπτίδιο ελέγχου ή MUC1 *

1110-ECD πεπτίδιο, ιστιδίνη-tagged στο Ο-άκρο. Μια αλλαγή χρώματος διάλυμα νανοσωματιδίων από ροζ σε ένα πορφυρό /μπλε υποδεικνύει ότι ένα είδος στο μίγμα έχει συγχρόνως συνδεδεμένο με 2 ή περισσότερα MUC1 *

1110-ECD πεπτίδια. Β δισθενή (bv) Αντι-MUC 1 * (0,77 ug) προστίθεται σε νανοσωματίδια που φέρουν είτε ένα πεπτίδιο ελέγχου (σειρά Α) ή MUC1 *

1110-ECD, πεπτίδια (σειρά Β). δέσμευση με δύο πεπτίδια σε ξεχωριστές νανοσωματίδια αντισωμάτων προκαλεί συσσωμάτωση νανοσωματιδίων και την αλλαγή του χρώματος του διαλύματος από ροζ έως πορφυρό /μπλε. Στη γραμμή Α, πηγάδια 3-5, αυτή η συσσωμάτωση αναστέλλεται από την μονοσθενή προσθήκη Anti-MUC1 * Fab (mv Fab). Γ ΝΜ23 στα 0,05, 0,1 ή 0,2 υΜ, (σειρές Α, Β και C αντίστοιχα) προστίθεται στο νανοσωματίδια φέρουν MUC1 *

1110-ECD πεπτίδια (Στήλες 2-5). Προστέθηκε ΝΜ23 προκαλεί μία αλλαγή χρώματος, πιθανώς ως ΝΜ23 διμερή δεσμεύονται με νανοσωματίδια ακινητοποιημένο MUC1 *

1110-ECD πεπτίδια. Η προσθήκη μονοσθενών Αντι-MUC 1 * (mv Fab), σε Στήλες 3-5, αναστέλλει την αλλαγή του χρώματος. Δ Ρυθμισμένα μέσα από MUC1-θετικά κύτταρα καρκίνου του μαστού, T47Ds, και MUC1-αρνητικά ινοβλαστών αρουραίου, 3Y1s, αναμίχθηκε με σφαιρίδια που φέρουν το MUC1 *

1110-ECD πεπτιδίου. Ανοσοκαταβυθισμένες είδη στη συνέχεια αναλύθηκαν με Western, όπου το πήκτωμα στυπώθηκε με ένα αντίσωμα αντι-ΝΜ23. Η κηλίδα western δείχνει ότι T47Ds εκκρίνουν ΝΜ23 ενώ 3Y1s δεν το κάνουν. Ε συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων (SPR) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση άμεσης δέσμευσης μεταξύ ΝΜ23 (15 ηΜ) και MUC1 *

1110-ECD πεπτίδια. Η sensogram δείχνει ότι 1044 ΕΣ του ΝΜ23, εγχύεται σε 15 ηΜ, δεσμευμένο σε μία επιφάνεια που φέρει MUC1 *

1110-ECD πεπτίδια (συνεχής γραμμή), αλλά όχι ΝΜ23 δεσμευμένο σε μία επιφάνεια ελέγχου που φέρει ένα άσχετο πεπτίδιο (διακεκομμένη γραμμή). F. Η διέγερση της ανάπτυξης T47D καρκίνου του μαστού κυττάρου με ΝΜ23 εξαρτάται από την έκφραση MUC1. Εξωγενείς ΝΜ23 προστίθεται στο T47D κύτταρα καρκίνου του μαστού διεγείρει την ανάπτυξη και παράγει σχήμα καμπάνας καμπύλη ενδεικτικό του διμερισμού υποδοχέα. Η ανάπτυξη μειώνεται σημαντικά σε κύτταρα τα οποία εκφράζουν σταθερά MUC1-ειδικά siRNA, συγκριτικά με κύτταρα που εκφράζουν ένα στοιχείο ελέγχου siRNA. κηλίδα Western ποσοτικοποιεί την καταστολή siRNA της MUC1.

Η

Για να προσδιορίσει αυτό που φαινόταν να είναι ένα MUC1 * συνδέτη (ες), χάντρες φέρει MUC1 *

1110-ECD πεπτίδια χρησιμοποιήθηκαν για να ανοσοκαθιζάνει τις άγνωστες πρωτεΐνες από το προϊόν λύσεως /υπερκείμενο μίγματα από MUC1-θετικά καρκινικά κύτταρα. Τα εκλούσματα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και κατέστησαν ορατά με χρήση αργύρου μεθόδους χρώσης. Υπήρχαν ουσιαστικά μόνο δύο ζώνες που καταβυθίστηκαν από το MUC 1 *

1110-ECD πεπτίδιο και δεν καταβυθίζεται από ένα πεπτίδιο ελέγχου: ένας εξέχων ζώνη 23 kDa και μία αμυδρά 17 μπάντα kDa (Σχ S3.). Οι πρωτεϊνικές ζώνες αποκόπηκαν από την πηκτή και αναλύθηκε χρησιμοποιώντας Ν-τερματική μικροκαθορισμού, η οποία τους προσδιορίζονται ως ΝΜ23, ισομορφές Η1 και Η2 αντίστοιχα. ΝΜ23 βρίσκεται κανονικά στο κυτταρόπλασμα όλων των κυττάρων, αλλά είναι συχνά εκκρίνεται από τα καρκινικά κύτταρα [29] δείχνει ότι θα μπορούσε να είναι ένας συνδέτης για το εξωκυτταρικό τμήμα του MUC1 *. Τα υπερκείμενα των κυττάρων ανοσοκαταβυθίστηκαν με MUC1 *

1110-ECD πεπτίδια που συνδέονται με τα σφαιρίδια, στη συνέχεια αναλύθηκαν με στύπωμα Western. Τα υπερκείμενα από MUC1-θετικά καρκινικά κύτταρα, αλλά όχι στα κύτταρα ελέγχου, δημιούργησαν μια ισχυρή πρωτεΐνη ζώνη στα περίπου 23 kDa που αντιδρούν με αντι-NM23H1 (Εικ. 4Β). Αυτό επιβεβαίωσε ότι οι πρωτεΐνες των καρκινικών κυττάρων υπερκείμενα που ανοσοκαταβυθίστηκαν με MUC1 *

1110-ECD πεπτίδια ήταν πράγματι ΝΜ23.

Για την ανίχνευση άμεσης σύνδεσης μεταξύ ΝΜ23 και MUC1 *

1110-ECD πεπτίδια και για να επιβεβαιώσετε την ιδιαιτερότητα, ένα άλλο πείραμα νανοσωματιδίων έγινε. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ΝΜ23 προστέθηκε σε MUC1 * νανοσωματίδια

1110-ECD-πεπτιδίου που φέρει ή νανοσωματίδια φέρουν ένα πεπτίδιο ελέγχου. Η προσθήκη ΝΜ23 σε νανοσωματίδια φέρουν MUC1 *

1110-ECD, προκάλεσε μια αλλαγή χρώματος διάλυμα από ροζ σε μωβ /μπλε και το βαθμό της αλλαγής χρώματος ήταν συνάρτηση συγκέντρωση ΝΜ23. Το μονοσθενές Fab του αντι-MUC 1 * ανέστειλε ανταγωνιστικά την πρόσδεση μεταξύ MUC1 * πεπτιδίων σωματιδίων ακινητοποιείται και ΝΜ23 (Εικ. 4C). Για να καταδειχθεί περαιτέρω η ειδικότητα της ανάλυσης νανοσωματιδίων μόνη της, δισθενής αντι-MUC 1 προστέθηκε σε MUC1 *

1110-ECD-πεπτιδίου που φέρει νανοσωματίδια, η οποία όπως αναμένεται ως αποτέλεσμα την ροζ σε κυανούν αλλαγή χρώματος. Η πρόσδεση επίσης ανταγωνιστικά αναστέλλεται από το μονοσθενές Fab (Σχ. 4D).