Αφηρημένο

Το ζήτημα του ελέγχου μονοκύτταρους έχει προσελκύσει πρόσφατα τεράστιο ενδιαφέρον. Ωστόσο, παρά την επί του παρόντος εφικτό ενδοκυτταρικό επίπεδο φυσιολογικές ανίχνευση μέσω βιο-φωτονική, νανο-ανιχνευτή που βασίζεται, και κάποιες άλλες τεχνικές, το θέμα της επαγωγής επιλεκτικής, μονοκύτταρους ακρίβειας απόπτωση, χωρίς να επηρεάζει τα γειτονικά κύτταρα παραμένει ουσιαστικά ανοιχτό. Εδώ έχουμε να επιλύσετε αυτό το ζήτημα και να υποβάλει έκθεση σχετικά με την αποτελεσματική αντιμετώπιση καρκινικού κυττάρου μονοκύτταροι ακρίβειας χρησιμοποιώντας την αντιδραστική χημεία της τοπικής απόρριψης πλάσμα στέμματος τύπου γύρω από μια βελόνα-όπως ηλεκτρόδιο με το μέγεθος κηλίδας ~ 1 μm. Όταν το ηλεκτρόδιο είναι τοποθετημένο με το μικρόμετρο ακρίβεια έναντι ενός επιλεγμένου κυττάρου, μια εστιασμένη και εξαιρετικά εντοπισμένες εκκένωσης μικρο-πλάσματος προκαλεί απόπτωση σε μόνο τις επιλεγμένες ατομικές HepG2 και τον καρκίνο HeLa κύτταρα, χωρίς να επηρεάζει οποιεσδήποτε περιβάλλοντα κύτταρα, ακόμα και σε μικρές ομάδες κυττάρων. Αυτό επιβεβαιώνεται από την παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο των μορφολογικών και δομικών αλλαγών στα επίπεδα κυτταρικής και κυτταρικό πυρήνα μετά την έκθεση στο πλάσμα

Παράθεση:. Tan Χ, Zhao S, Lei Q, Lu Χ, Ο G, Ostrikov K (2014) Single-Cell-ακριβείας Μικρόπλασμα-Induced Cancer Cell απόπτωση. PLoS ONE 9 (6): e101299. doi: 10.1371 /journal.pone.0101299

Επιμέλεια: Mohammed Yousfi, Πανεπιστήμιο Paul Sabatier, Γαλλία

Ελήφθη: 10 Δεκεμβρίου, 2013? Αποδεκτές: 5 Ιούν 2014? Δημοσιεύθηκε: 27 Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Tan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. XL αναγνωρίζει υποστήριξη από το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών της Κίνας (Grant Νο 51077063, 51277087). KO αναγνωρίζει την υποστήριξη της ARC και το Πρόγραμμα Ηγεσίας Science CSIRO OCE. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η ικανότητα να απομονώσει, να χειριστείτε, περιοριστεί, ανακρίνει και τον έλεγχο των κυττάρων με την ακρίβεια ενός κυττάρου που ζουν γίνεται γρήγορα ένα ζήτημα υψίστης σημασίας λόγω του ανακαλύφθηκε πρόσφατα γενικό φαινόμενο των κυττάρων-να-κυττάρων μεταβλητότητα τους αποκρίσεις σε εξωτερικά ερεθίσματα [1] – [3]. Η απόπτωση είναι ένας από τους πιο σημαντικούς και ευρέως μελετηθεί κυτταρικές αποκρίσεις, λόγω της σημασίας του για το σχηματισμό και τη λειτουργία των ιστών και οργανισμών σε όλα τα στάδια της ζωής, την προέλευση και την ανάπτυξη των ασθενειών, καθώς και οι αντιδράσεις των κυττάρων σε χημικές θεραπείες [4].

Λαμβάνοντας υπόψη ένα πολύ μεγάλο αριθμό φυσιολογικών, βιοχημικών, ηλεκτροχημικές και άλλους παράγοντες που επηρεάζουν κυτταρικές αποκρίσεις, ένας μεγάλος αριθμός προσεγγίσεων ασκούνται [5] – [12]. Αυτές οι προσεγγίσεις μονοκύτταροι επιπέδου περιλαμβάνουν microelectrochemistry [5], την ενδοσκόπηση και την ανάκριση βασίζεται στην μονοδιάστατη νανοδομών [6], [10], συστοιχίες ενεργό και διευθυνσιοδοτούμενα μικροπλάκα /μικροηλεκτροδιακές [7], [9], χειραγώγηση των κυττάρων, σχηματομόρφωσης, διέγερση και διέγερση για προσαρμοσμένες, υψηλής ακρίβειας μηχανική ιστών [8], [11], [12], και διάφορα άλλα. Παρά το παρόν εφικτό ενδοκυτταρικό επίπεδο φυσιολογικές σχολαστικά μέσω της βιο-φωτονική και τεχνικές νανο-αισθητήρα που βασίζεται, το θέμα της επαγωγής επιλεκτικής, μονοκύτταρους ακρίβειας απόπτωση, χωρίς να επηρεάζει τα γειτονικά κύτταρα παραμένει ουσιαστικά ανοικτή.

Πρόσφατα, πλάσμα αερίου ατμοσφαιρικής πίεσης έχουν αναδειχθεί ως αποτελεσματικά εργαλεία για να επάγει διάφορες φυσιολογικές αποκρίσεις σε ζωντανά κύτταρα και ιστούς συμπεριλαμβανομένων των υψηλών αποπτωτικών εκλεκτικότητα μεταξύ κακοήθη καρκινικά και φυσιολογικά κύτταρα των ιστών [13] – [15]. Μείωση των μεγεθών τόπου επεξεργασία πλάσματος έως μικρομέτρου διαστάσεις πρόσφατα enabled εφαρμογές του πίδακα πλάσματος και στέμματος τύπου εκκένωσης που προκαλείται αντιδραστική χημεία στη θεραπεία μονοκύτταροι επιπέδου και άκρως εντοπισμένο σύνθεση νανοσωματιδίων [16] – [20].

ακόμα κι αν τα μεγέθη κηλίδας των πιδάκων πλάσματος μπορεί να είναι τόσο μικρό όσο 15 μm [17], το οποίο είναι συγκρίσιμο ή ακόμη μικρότερο από τυπικά μεγέθη κυττάρου, επιλεκτικό έλεγχο με ακρίβεια μονοκύτταροι δεν έχει αποδειχθεί. Πράγματι, πρόσφατες πρόοδοι στην θεραπεία μονού κυττάρου επίπεδο επέτρεψε να εκθέσει ταυτόχρονα αρκετά μεγάλο αριθμό απομονωμένων ξεχωριστών κυττάρων στο πίδακα πλάσματος που υπέστη σε μια ροή ηλίου μέσω ενός λεπτού οπτική ίνα [16], [17]. Αυτή η έκθεση παράγει ένα κοκτέιλ από σχετικά μεγάλη διάρκεια ζωής, χημικά ενεργό (π.χ., αντιδραστικά είδη οξυγόνου /αζώτου, ROS /RNS) τα είδη που αλληλεπιδρούν με τα κύτταρα [13].

Ωστόσο, ελλείψει ακριβών μικροχειρισμού και την τοποθέτηση του τόπου πίδακα πλάσματος, τα ηλεκτρόνια του πλάσματος που δημιουργείται και ειδών ROS /RNS κατανέμονται τυχαία στην όγκο του μέσου κυτταρικής καλλιέργειας και επηρεάζει τουλάχιστον αρκετές κύτταρα που έρχονται σε επαφή με τα είδη του πλάσματος που δημιουργείται. Το συμπέρασμα αυτό είναι σύμφωνο με τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης των κυτταρικών αποκρίσεων που δείχνουν ότι ένας μεγάλος αριθμός κυττάρων (ένα σημαντικό κλάσμα του ενός τυπικού αριθμού ~ 3 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) μπορεί να επηρεαστεί ακόμη και μετά από μια σύντομη ( π.χ., -10 s) έκθεση του πλάσματος και την ανάπτυξη αποπτωτικών αποκρίσεις μέσα σε 24 ώρες μετά την αγωγή [16], [17]. Επιπλέον, η κατευθυνόμενη ροή αερίου Αυτός και γρήγορη σφαίρες πολλαπλασιαστικού πλάσμα στον πίδακα πλάσματος μπορεί να διαταράξει το μέσο καλλιέργειας, μετακινήστε τα κύτταρα ή ακόμη και να προκαλέσει αφυδάτωση τους. Αυτός είναι ο λόγος για το ζήτημα του ελέγχου των κυττάρων του πλάσματος δυνατότητα με την ακρίβεια ενός κυττάρου παραμένει ουσιαστικά ανοικτή.

Εδώ θα επιλύσετε αυτό το ζήτημα και να υποβάλει έκθεση σχετικά με την αποτελεσματική αντιμετώπιση καρκινικού κυττάρου μονοκύτταροι ακρίβειας χρησιμοποιώντας την τοπική στέμμα -τύπου εκκένωση πλάσματος γύρω από ένα βελονοειδές ηλεκτρόδιο με το μέγεθος κηλίδας ~ 1 μm. Όταν το ηλεκτρόδιο είναι τοποθετημένο σε ορισμένη απόσταση έναντι ενός επιλεγμένου κυττάρου, μια εστιασμένη και εξαιρετικά εντοπισμένες εκκένωση πλάσματος προκαλεί απόπτωση σε μόνο τις επιλεγμένες ατομικές HepG2 και τον καρκίνο HeLa κύτταρα, χωρίς να επηρεάζει οποιεσδήποτε περιβάλλοντα κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των μικρών συστάδων κυττάρων. Αυτό επιβεβαιώνεται από την παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο των μορφολογικών και τις διαρθρωτικές αλλαγές σε κυτταρικό και κυτταρικό πυρήνα επίπεδα μετά από την έκθεση στο πλάσμα. Επιπλέον, η εκκένωση πλάσματος τροφοδοτείται από μια μπαταρία 12 V και παράγεται χωρίς καμία εξωτερική παροχή ροής αερίου ή ηλεκτρικής ενέργειας.

Υλικά και Μέθοδοι

θεραπεία Micro-πλάσματος

Ένα ηλεκτροφυσιολογική μικρο- βραχίονα (CFT-8000D, Jiangsu, Ruiqi Co., Ltd) χρησιμοποιείται για τον έλεγχο της θέσης άκρο ηλεκτροδίου με την ακρίβεια των μερικών δεκάδων νανομέτρων (όπως φαίνεται στο σχήμα 1), η οποία καθιστά δυνατή την δυνητικά αναδεύει επιλεγμένες τομείς (π.χ., συγκεκριμένους υποδοχείς ή οργανίδια) στην κυτταρική επιφάνεια. Η έξοδος του τροφοδοτικού είναι συνδεδεμένος με το ηλεκτρόδιο μέσω ενός αντιστάτη έρμα R 10 ΜΩ χρησιμοποιείται για να περιορίσει το ρεύμα εκφόρτισης. Αυτό μικροπλάσμα οδηγείται από ένα custom-made τροφοδοτικό AC οδηγείται από 12 volt μπαταρία και όχι από οποιαδήποτε εξωτερική γεννήτρια ή τοίχο εξουσία. Το συνολικό βάρος της συσκευής μικροπλάσμα, συμπεριλαμβανομένης της τροφοδοσίας, είναι μικρότερη από 200 g. Η έξοδος του booster AC μπορεί να φθάσει 5 kV με συχνότητα 25 kHz. Μικρο-χειριζόμενα βολφράμιο χρησιμοποιείται ως ηλεκτρόδιο. Η ακτίνα άκρο του ηλεκτροδίου βολφραμίου είναι μικρότερο από 0,5 μm με κλίσεως 13 ° γωνία λέπτυνσης. Η διάμετρος του άκρου καθετήρα βολφραμίου είναι μικρότερα από τα συμβατικά κύτταρα (δεκάδες μικρόμετρα). Η θερμοκρασία του αερίου του μικροπλάσμα είναι κοντά σε θερμοκρασία δωματίου, γεγονός που υποδηλώνει ότι η κυτταρική απόκριση δεν οφείλεται στο θερμικό σοκ. Επιλέχθηκε ένα ενιαίο προσκολλημένων κυττάρων και αντιμετωπίζονται από την μικροπλάσμα. Η έκθεση στο πλάσμα κράτησε μόνο -10-15 s και τα αποτελέσματα της θεραπείας μελετήθηκαν αμέσως ή μετά από αρκετές ώρες αργότερα.

Η

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο ηπατώματος κυτταρική γραμμή καρκίνου (HepG2) , ανθρώπινου τραχηλικού καρκινική κυτταρική γραμμή (HeLa) και φυσιολογικό ήπαρ κυτταρική γραμμή (L-02) αγοράστηκαν από την Κίνα Center for Type Culture Collection (CCTCC, Wuhan, Κίνα). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο υψηλής γλυκόζης ϋυΐββοοο Eagle (ϋΜΕΜ, Hyclone, Logan, UT) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) αδρανοποιημένο με θερμότητα ορό εμβρύου μόσχου (FBS, Hyclone) σε έναν επωαστήρα που περιέχει μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5 % CO

2 στους 37 ° C. Μετά την επίτευξη συρροής, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με 0,25% θρυψίνη (Hyclone), σπάρθηκαν πάνω σε 35 mm δίσκου καλλιέργειας κυττάρων (Corning, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) σε πυκνότητα 2 × 10

4 κύτταρα και επωάστηκαν για μία νύχτα για να επιτραπεί η σύνδεση των κυττάρων .

σε πραγματικό χρόνο παρακολούθηση των μορφολογικών αλλαγών

για να εκτιμηθεί η αποπτωτική επίδραση της έκθεσης από μικρό σχετικά με την αγωγή μόνο κύτταρο, σε πραγματικό χρόνο μορφολογικές παρατηρήσεις έγιναν με το φως αντίθεση μικροσκόπιο ανεστραμμένης φάσης ( XD-202, Nanjing Jiangnan Μυθιστόρημα Optics Co., Ltd). παρατηρήσεις σε πραγματικό χρόνο των αλλαγών μορφολογία των κυττάρων πραγματοποιήθηκαν και φωτογραφήθηκαν. Τα περιβάλλοντα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

σε πραγματικό χρόνο απεικόνιση φθορισμού των κυτταρικών μεμβρανών αλλάζει

Τα κύτταρα μικροπλάσμα επεξεργασμένα βάφτηκαν με Αννεξίνη V-FITC σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Beyotime, Jiangsu, Κίνα). Εν συντομία, το μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε και πλύθηκε μια φορά με PBS. Στη συνέχεια, 500 μι ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης με 5 μL αννεξίνης V-FITC προστέθηκε στα κύτταρα, και καλλιεργημένα σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά στο σκοτάδι. Χωρίς να πλυθεί με οποιοδήποτε υγρό μετά την αντίδραση με το φθορόχρωμα, ένα απλό κύτταρο επιλέχθηκε και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με το μικροπλάσμα (15 s). Μια επαρκής ποσότητα αννεξίνης V-FITC έμεινε στο μέσο για να επιτραπεί η σύνδεση με το μετατοπισμένο PS κατά τη διάρκεια της εν εξελίξει διαδικασία της απόπτωσης και σε πραγματικό χρόνο διαδικασία απεικόνισης διεξήχθη υπό σκοτεινές συνθήκες σε ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus TH4-200, η ​​Olympus Optical Co Ltd, Tokyo, Japan) αμέσως μετά τη θεραπεία μικροπλάσμα. Στη μελέτη μας, το λευκό και το φθορισμό εικόνες ελήφθησαν αμέσως μετά την διαδικασία σήμανσης Annexin V-FITC να καταγράψει τις αρχικές συνθήκες και τις θέσεις των κυττάρων. Η έναρξη της απόπτωσης θα μπορούσε να παρακολουθείται όταν η ένταση φθορισμού υπερέβη το όριο ανίχνευσης.

Σε πραγματικό χρόνο απεικόνιση φθορισμού του πυρήνα αλλάζει

Για να αναλύσουμε τα μορφολογικά σημάδια αποπτωτικών πυρήνων, χρώση Hoechst 33342 εκτελέστηκε. Εν συντομία, ζωντανά κύτταρα HepG2 και HeLa επωάστηκαν με Hoechst 33342 (Beyotime, Jiangsu, Κίνα) σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Αφού πλύθηκαν 3 φορές με μέσο καλλιέργειας, μια ενιαία Hoechst 33342-χρώση των κυττάρων επελέγη και κατευθείαν αγωγή με το μικροπλάσμα. Σε πραγματικό χρόνο παρακολούθηση του πυρήνα αλλαγές πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού Nikon.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Single-κυττάρου-ακρίβειας επεξεργασίας πλάσματος

Το Σχήμα 2 δείχνει την μονοκύτταρους -precision θεραπεία μικροπλάσμα ενός κυττάρου HepG2. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2 (α), η νέφος πλάσματος δημιουργείται γύρω από το μηχανοκίνητο μικροηλεκτρόδιο με τη διάμετρο άκρη του ~ 1 μm είναι πολύ μικρό (~ 2 μm) και είναι έτσι κατάλληλος για την ακριβή επεξεργασία των μεμονωμένων κυττάρων με συγκρίσιμη ή μεγαλύτερα μεγέθη. Όταν το άκρο του ηλεκτροδίου προσεγγίζει το κύτταρο, η κυτταρική μεμβράνη χρησιμεύει ως πλωτό αντίθετο ηλεκτρόδιο, ενώ το πλάσμα έρχεται σε άμεση επαφή με την επιφάνεια του, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2 (b).

Η

Η εκκένωση τάσης και ρεύματος μετρήθηκαν με έναν ανιχνευτή P6015 Tektronix HV και ενός ανιχνευτή ρεύματος TCP202 Tektronix, αντίστοιχα. Έχουν καταγραφεί από DPO7104 Tektronix ευρείας ζώνης ψηφιακό παλμογράφο και φαίνεται στο Σχήμα 3. Από το σχήμα 3 μπορεί κανείς να δει καθαρά ότι η απόρριψη εμφανίζεται πραγματικά περιοδικά με ρυθμό επανάληψης παλμού περίπου 25 kHz. Το ρεύμα εκφόρτισης κυματομορφή δείχνει ότι η απόρριψη συμβαίνει μόνο μία φορά σε μια περίοδο τάσης κατά τη διάρκεια της φάσης αύξηση της τάσης. Το ρεύμα εκφόρτισης έχει ένα πλήρες πλάτος στο μισό-μέγιστο περίπου 270 ns και μια μέγιστη τιμή περίπου 1 mA. Η μέση ισχύς που παραδίδεται στο πλάσμα είναι περίπου 4 mW. Η θερμοκρασία του αερίου του μικροπλάσμα είναι κοντά σε θερμοκρασία δωματίου, και το πλάσμα μπορεί να χρησιμοποιηθεί απ ‘ευθείας για το ανθρώπινο δέρμα ή ακόμη και θεραπείες εσωτερικό όργανο, χωρίς ανεπιθύμητα θερμικές ή ηλεκτρικές επιδράσεις σοκ.

Η

Κυττάρου επιπέδου μορφολογική αλλαγές

για να μελετηθεί η επίδραση της microplasmas σε κατεργασμένα μόνο κύτταρο HepG2, έχουν μορφολογικές αλλαγές μελετηθεί. Αυτές οι αλλαγές περιλαμβάνουν συστολή των κυττάρων, διόγκωση μεμβράνης, συμπύκνωση χρωματίνης, κατακερματισμός DNA, κ.λπ., και είναι ενδεικτικές της απόπτωσης [21]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, πριν από την έκθεση μικροπλάσμα, όλα τα κύτταρα ήταν υγιείς και ατρακτοειδή με σαφή περιγράμματα. Αμέσως μετά την επαφή με το μικροπλάσμα, η πληγείσα μόνο κύτταρο άρχισε να συρρικνώνεται και σταδιακά να αλλάξει κανονικό σχήμα τους σε ένα πιο κατέρρευσε σφαιροειδές σχήμα που είναι αρκετά κοινό να αποπτωτικά σώματα.

επιλέχθηκε και να αντιμετωπίζονται από ένα ενιαίο προσκολλημένων κυττάρων HepG2 η μικροπλάσμα για 15 (πάνω αριστερά). Τα κύτταρα επισημαίνονται με μπλε πλήρη σειρά είναι μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (κάτω δεξιά γωνία).

Η

Μπορεί κανείς να δει ότι οι φλύκταινες μεμβράνης εμφανίζονται μετά από 20 λεπτά μετά τα 15 s της επεξεργασίας πλάσματος. Μία παραμόρφωση της κυτταρικής μεμβράνης είναι επίσης φαίνεται καθαρά. Από την άλλη πλευρά, τα μη κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου ήταν ανεπηρέαστο και υγιείς κατά τη διάρκεια ολόκληρης της περιόδου επώασης. Αυτές οι έντονες μορφολογικές αλλαγές είναι τα απλούστερα δείκτες της προόδου του κυτταρικού θανάτου, ακόμη δεν είναι επαρκείς για να καθορίσει την αποπτωτική φύση της απόκρισης. Αυτός είναι ο λόγος των κυττάρων membrane- φθορισμού και δοκιμές χρώση πυρήνα ειδικά πραγματοποιήθηκαν.

Μεμβράνη επιπέδου αλλάζει

Για την επικύρωση του αποτελέσματος της από μικρό, απεικόνιση σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας πράσινη φθορίζουσα Αννεξίνη ετικέτα V-FITC διεξήχθη για να απεικονίσει τις αλλαγές HepG2 κυτταρικής μεμβράνης (Σχήμα 5). Annexin-V έχει ισχυρή συγγένεια για φωσφατιδυλοσερίνη (PS), το οποίο είναι ένα φωσφολιπίδιο μεμβράνη που κανονικά εκφράζεται μόνο στην εσωτερική επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης. Καθώς προχωρά η απόκριση απόπτωσης, η PS ταχέως μετατοπίζεται προς την επιφάνεια της εξωτερικής μεμβράνης, όπου είναι διαθέσιμο για δέσμευση αννεξίνης-V. Η μετατόπιση PS στη μεμβράνη προηγείται οποιαδήποτε αλλαγή στον πυρήνα και θεωρείται ως ένα από τα πρώτα χαρακτηριστικά της κυτταρικής απόπτωσης [22], [23]. Έτσι, μέσω σύνδεσης προς Annexin V, αποπτωτικά και μη αποπτωτικά κύτταρα μπορούν να διακριθούν εύκολα οπτικά από τον φθορισμό.

Η επισήμανση των κυττάρων είναι η ίδια όπως στο Σχήμα 4.

Η

τα δείγματα ελέγχου, δεν μπορέσαμε να παρατηρήσουμε οποιαδήποτε δέσμευση αννεξίνης V-FITC σε κύτταρα HepG2 πριν από τη θεραπεία μικροπλάσμα. Η δέσμευση αννεξίνης V-FITC στο κύτταρο πλάσματος επεξεργασμένο έγινε ανιχνεύσιμη 5 λεπτά μετά την θεραπεία και αυξάνεται σταδιακά στη συνέχεια. Ωστόσο, για τους μη-κατεργασμένα κύτταρα, δεν φθορισμός ανιχνεύθηκε ακόμα και έξι ώρες αργότερα. Είναι αξιοσημείωτο ότι η διόγκωση της μεμβράνης παρατηρήθηκε 10 λεπτά μετά το τέλος της έκθεσης στο πλάσμα. Το κύτταρο έγινε πιο φωτεινή και μεγαλύτερα με σαφώς φθορισμού όριο μετά από περαιτέρω επώαση. διόγκωση μεμβράνης είναι ένα άλλο μορφολογική αλλαγή χαρακτηριστική της απόπτωσης, έτσι η παρατήρηση αυτή επιβεβαιώνει την εμφάνιση απόπτωσης μόνο στο μικροπλάσμα επεξεργασμένου κυττάρου [24].

Nucleus επιπέδου αλλάζει

αλλαγές Nucleus, η οποία συνέβη σχετικά αργά στη διαδικασία της απόπτωσης, απεικονίστηκαν με χρώση ΟΝΑ με χρωστική Hoechst 33342. Παρόμοια με την χρώση μεμβράνη, το λευκό και ο φθορισμός εικόνες ελήφθησαν αμέσως μετά την επισήμανση Hoechst 33342 για την καταγραφή των αρχικών συνθηκών και τις θέσεις των κυττάρων (δύο πρώτες εικόνες στο Σχήμα 6). Το κύτταρο στην πάνω αριστερή γωνία αντιμετωπίστηκε από το πλάσμα για 15 s, ενώ το κύτταρο στην κάτω δεξιά γωνία ήταν το κύτταρο ελέγχου. Στην αρχή, και οι δύο θα θεραπευθεί και un-επεξεργασμένα κύτταρα χρωματίστηκαν μπλε με την ίδια φωτεινότητα. Από πυρήνας αλλαγές συμβαίνουν σχετικά αργά στη διαδικασία της απόπτωσης, καμία εμφανής διαφορά μπορεί να δει κανείς ακόμη και στα 20 λεπτά μετά την αγωγή μικροπλάσμα. Ωστόσο, 30 λεπτά μετά την έκθεση στο πλάσμα, τον πυρήνα του επεξεργασμένου απλού κυττάρου έγινε φωτεινότερο σύγκριση με το μη επεξεργασμένο κύτταρο.

Η επισήμανση των κυττάρων είναι η ίδια όπως στο Σχήμα 4.

Η

η παρατηρούμενη διαφορά στην ένταση του φθορισμού μπορεί να οφείλεται σε, από τη μία πλευρά, η δυσλειτουργία της Ρ-γλυκοπρωτεΐνης, έναν μεταφορέα μεμβράνη η οποία θα μπορούσε εκχύλιση της Hoechst 33342 στο κύτταρο. Ωστόσο, Ρ-γλυκοπρωτεΐνης λειτουργία της αντλίας είναι συνήθως εξασθενημένη και δεν θα μπορούσε αποτελεσματικά μεταφέρει Hoechst 33342 έξω από το αποπτωτικό κύτταρο. Αυτό προκαλεί τη συσσώρευση και ως εκ τούτου ισχυρότερη εκπομπή Hoechst 33342 από το αποπτωτικό κυτταρικό [25], [26]. Από την άλλη πλευρά, πυρήνας άρχισε να συμπυκνώσει, προκαλώντας σχετικά ισχυρότερη φθορισμού. 6 ώρα αργότερα, συμπύκνωση πυρήνας φαίνεται καθαρά στο κατεργασμένο μόνο κύτταρο. Στη συνέχεια, η πυρηνική μεμβράνη ήταν σαφώς διαταραχθεί, που συνοδεύεται από διάχυτο θραύσματα DNA. Για τη χώρα, μη επεξεργασμένα κύτταρα διατήρησε μια φυσιολογική πυρηνική μορφολογία.

Πιθανές συνέπειες της αντιδραστικά είδη

Για να χαρακτηρίσουμε χημικώς ενεργών ειδών στο μικροπλάσμα, χρησιμοποιείται φασματοσκοπία εκπομπής οπτικής (ΠΓΕ), η οποία επιτρέπει την ανάλυση της ακτινοβολίας που εκπέμπεται από τα άτομα, ιόντα, μόρια, και ρίζες. Ως εκ τούτου, ένα φασματόμετρο μισό μέτρο (Princeton Όργανα Acton SpectraHub 2500i? Φασματική ανάλυση: 2 nm, το τρίψιμο: 1200 g mm

-1, πλάτος σχισμής: 150 um) χρησιμοποιείται για τη μέτρηση της οπτικής εκπομπής του νέφους από μικρό. Το Σχήμα 7 δείχνει τα φάσματα οπτικής εκπομπής (OES) του θυσάνου μικροπλάσμα στην nm φασματική περιοχή 250-800. Όπως μπορεί να φανεί, τα φάσματα οπτικής εκπομπής κυριαρχούνται από τις διεγερμένο είδος άζωτο και οξυγόνο.

Η

Ο ROS παίζουν κρίσιμο ρόλο σε θάνατο των καρκινικών κυττάρων, και μπορεί να διεγείρει απόπτωση επηρεάζοντας το DNA, καθώς και ως λιπίδια και πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην ενδοκυτταρική σηματοδότηση καταρρακτών [27]. Η υπερβολική παραγωγή των ROS μπορεί είτε να βλάψει άμεσα την κυτταρική δομή να προκαλέσει νέκρωση των κυττάρων ή έμμεσα επηρεάζουν την κανονική μονοπάτια κυτταρικής σηματοδότησης και της γονιδιακής ρύθμισης για να επάγει απόπτωση [28]. Τα αντιδραστικά είδη άζωτο μπορεί επίσης να επηρεάσει την διαδικασία κυτταρικής αδρανοποίησης [13]. Ειδικότερα, δεν ρίζες μπορούν να προκαλέσουν απόπτωση, νέκρωση ή, εναλλακτικά, προστατεύουν τα κύτταρα από τον θάνατο, ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου, ρίζα συγκέντρωση, καθώς και η διάρκεια και συγκεκριμένες περιοχές του ανοίγματος [29]. Αριθμητικές προσομοιώσεις των ενεργών ειδών που παράγονται σε απορρίψεις άκρη-που υπέστη στέμματος τύπου πλάσμα [30] και την επέκτασή τους προς βιολογικά σχετικών μέσων, ως εκ τούτου άκρως δικαιολογημένη στο εγγύς μέλλον.

πλάσμα έναντι του ηλεκτρικού πεδίου αποτελέσματα

Οι μικρο-συμβουλές στα πειράματά μας δημιουργεί επίσης σημαντική χρονική μεταβλητή ηλεκτρικά πεδία στην περιοχή τους. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [31], παλμικού ηλεκτρικά πεδία μπορεί επίσης να προκαλέσει κυτταρικό θάνατο, π.χ., μέσω των ηλεκτρικών παλμών που προκαλείται από ηλεκτροδιαπόρωση της κυτταρικής μεμβράνης. Σε κοντινή απόσταση από το μικρο-tip που χρησιμοποιούνται σε πειράματα μας, το μέγεθος του ηλεκτρικού πεδίου μπορεί να φτάσει δεκάδες ή ακόμη και εκατοντάδες κιλοβόλτ ανά εκατοστό. Ωστόσο, το ηλεκτρικό πεδίο μειώνεται πολύ γρήγορα με την απόσταση μακριά από το άκρο. Στα πειράματά μας η άκρη του ηλεκτροδίου τυπικά τοποθετημένο περίπου 150 μm μακριά από την κυτταρική επιφάνεια. Ως εκ τούτου, οι κυτταρικές μεμβράνες παρουσίασαν πολύ ασθενέστερη από ό, τι τα ηλεκτρικά πεδία κοντά στην επιφάνεια του άκρου του, με το εκτιμώμενο μέγεθος περίπου 1-2 τάξεις μεγέθους χαμηλότερη. Γι ‘αυτό η πιθανότητα απλώς ηλεκτρικού πεδίου που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο είναι χαμηλότερη στα πειράματά μας σε σχέση με τις επιδράσεις του ηλεκτρικού πεδίου που αναφέρθηκαν προηγουμένως [31].

Για να καταδειχθεί η πρωταρχική σημασία των αντιδραστικά είδη που παράγονται από το μικροπλάσμα απαλλαγή σε σύγκριση με τις ηλεκτρικές επιδράσεις πεδίου που σχετίζονται έχουμε διεξάγει μια σειρά από πειράματα ελέγχου όπου η μικροσκοπική αιχμή επικαλύφθηκε με ένα πολύ λεπτό στρώμα κεριού παραφίνης η οποία εμποδίζει την παραγωγή του πλάσματος, αλλά όχι πολύ σημαντικά διαταράσσει το μέγεθος του ηλεκτρικού πεδίου (σε τουλάχιστον παραμένει στην ίδια τάξη μεγέθους όπως και για το μη επικαλυμμένο μικροσκοπική αιχμή πλάσμα ροών). Τα μη επικαλυμμένα και παραφίνη επικαλυμμένο με κηρό microtips που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτές τις μελέτες φαίνεται στο Σχήμα 8.

Η

Σημαντικά, τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με το επικαλυμμένο με κηρό μικροσκοπική αιχμή δεν παρουσίασαν απόπτωση, η οποία μπορεί να ερμηνευθεί ότι οι παρατηρούμενες αποπτωτική αποκρίσεις των κυττάρων είναι πράγματι πιο σχετικές με τα είδη του πλάσματος που δημιουργείται και όχι απλώς τις ηλεκτρικές επιδράσεις πεδίου. Συγκεκριμένα, για τη διαλεύκανση των επιδράσεων της έκθεσης στο πλάσμα έναντι των ηλεκτρικών επιδράσεις πεδίου που σχετίζονται, υποβάλλαμε σε αγωγή τέσσερα κύτταρα HepG2 χρησιμοποιώντας τόσο παρθένα και επικαλυμμένο με κηρό microtips φαίνεται στα Σχήματα 8 (α) και (β), αντίστοιχα.

οι μορφολογικές μελέτες των κυττάρων υποβάλλονται στην έκθεση του πλάσματος έχουν πραγματοποιηθεί. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 9, πριν από την έκθεση μικροπλάσμα, όλα τα κύτταρα HepG2 ήταν υγιείς και ατρακτοειδή με σαφή περιγράμματα. Τέσσερις κύτταρα επιλέχθηκαν τυχαία και κατεργάζεται με παρθένα microtip (που φαίνεται στο Σχήμα 8 (α)) για 15 s. Μεμβράνη φλύκταινες εμφανίστηκαν περίπου 10 λεπτά μετά την έκθεση και παραμόρφωσης μεμβράνη τους είναι επίσης φαίνεται καθαρά με το παρατεταμένο χρόνο επώασης. Από την άλλη πλευρά, τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ήταν ανεπηρέαστα και υγιή κατά την διάρκεια ολόκληρου του περιόδους επώασης.

Η

Ακριβώς η ίδια μεταχείριση των τεσσάρων τυχαία επιλεγμένων κυττάρων HepG2 με τη χρήση του επικαλυμμένου με κηρό μικροσκοπική αιχμή φαίνεται στην Εικόνα 8 ( β) έδειξε εντελώς διαφορετικά αποτελέσματα. Στο Σχήμα 10, μπορεί κανείς να δει καθαρά ότι οι τέσσερις κύτταρα δεν επηρεάζονται σημαντικά.

Η

Αυτές οι παρατηρήσεις υποστηρίζουν σαφώς το συμπέρασμά μας ότι οι επιδράσεις που παρατηρούνται σε πειράματα από μικρό μας είναι πιο στενά συνδεδεμένη με την αντιδραστική γενιά ειδών σε το πλάσμα. Αυτές οι επιδράσεις μπορεί επίσης να είναι αρκετά διαφορετική από τις κοινώς γνωστές ηλεκτρικές επιδράσεις τομέα όπως η ηλεκτροδιάτρηση.

Τα φυσιολογικά κύτταρα δεν επηρεάζονται από κατεργασία πλάσματος

Έχουμε αξιολόγησε επίσης τις συνέπειες της έκθεσης μικροπλάσμα για μια φυσιολογικό ήπαρ κυτταρική γραμμή (L-02) με τις ίδιες μικροπλάσμα και θεραπεία παραμέτρους. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 11, η επεξεργασία των τεσσάρων τυχαίως επιλεγμένα κύτταρα L-02 στο πλάσμα δεν οδήγησε σε σημαντικές επιπτώσεις, ακόμη και μετά από 2 ώρες παρατήρησης. Το αποτέλεσμα αυτό ανοίγει μια ευκαιρία για τις λεπτομερείς μελέτες παραμετρικές και διαδικασία βελτιστοποίησης, η οποία θα είναι ένα θέμα των μελλοντικών εργασιών μας και, ενδεχομένως, την εργασία άλλων ερευνητών.

Η

Εφέ πλάσματος σε άλλα καρκινικά κύτταρα

Μια άλλη καρκινική κυτταρική σειρά (HeLa) χρησιμοποιήθηκαν για να διευκρινιστεί η επίδραση της έκθεσης από μικρό. Στα Σχήματα 12-14, τα επεξεργασμένα κύτταρα και μη κατεργασμένα κύτταρα είναι στενά σε επαφή για να σχηματίσουν μικρές συστάδες συμπαγές κύτταρο. Σημαντικά, μόνο τα κύτταρα του πλάσματος επεξεργασμένα σκοτώθηκαν, ενώ τα γειτονικά κύτταρα δεν επηρεάστηκαν σημαντικά. Αυτό μπορεί να φανεί καθαρά από το 2 πολύωρη εξέταση των μορφολογικών αλλαγών που φαίνεται στο Σχήμα 12.

Η

Το μπλε φθορισμός από τα κύτταρα του πλάσματος επεξεργασμένα είναι πολύ ισχυρότερη από ό, τι από μη επεξεργασμένα κύτταρα.

Η

Τα αποτελέσματα της Annexin V-FITC (Σχήμα 13) και Hoechst 33342 (Σχήμα 14) χρώση περαιτέρω επιβεβαίωσε αυτά τα αποτελέσματα. Ακριβώς τα μικροπλάσμα-κατεργασμένα κύτταρα HeLa έδειξε πυρήνα συμπύκνωση και την μετατόπιση PS με Hoechst 33342 συσσώρευση και χρώση αννεξίνης V, οι οποίες είναι οι δείκτες κυτταρικής απόπτωσης. Ως εκ τούτου, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι η έκθεση μικροπλάσμα είναι πράγματι επαρκής για να επάγει απόπτωση επιλεκτικά, χωρίς να επηρεάζει τα γειτονικά κύτταρα.

Περιορισμοί των μελετών μονοκύτταρους ακρίβειας

Οι μελέτες αυτές περιορίζονται σε απλούς δείκτες της το κύτταρο απόπτωσης, χωρίς σκοπό να μελετήσει τον κυτταρικό κύκλο ή ενδοκυττάριο μηχανισμούς σε σύγκριση με πρόσφατες δημοσιεύσεις [32], [33]. Ο κύριος λόγος είναι λόγω των περιορισμών της κυτταρομετρίας ροής, κηλίδωση Western, και τις τεχνικές Q-PCR για τον προσδιορισμό των αποπτωτικών απαντήσεις από μεμονωμένα κύτταρα. Όπως μπορεί να φανεί στα Σχήματα 9-14 ανωτέρω, η σύντομη έκθεση μικροπλάσμα είναι επαρκής για να επάγει απόπτωση μόνο στα επεξεργασμένα καρκινικά κύτταρα, ενώ τα γειτονικά κύτταρα δεν επηρεάζονται. Ωστόσο, η κυτταρομετρία ροής και οι μέθοδοι κηλιδώσεως Western τυπικά απαιτούν τουλάχιστον 10

4 κύτταρα, και οι μέθοδοι συχνά χρησιμοποιούνται για τη μελέτη των αλλαγών από ένα σχετικά μεγάλο πληθυσμό κυττάρων. Η απόπτωση των κυττάρων μονοκύτταροι ακρίβειας δεν μπορεί να δείξει τις αλλαγές ανιχνεύσιμες από το κυτταρομετρία ροής και μεθόδους κηλίδος Western. Αυτός είναι ο λόγος που χρησιμοποιείται απλή Annexin V και Hoechst 33342 χρώση ως δείκτες της κυτταρικής απόπτωσης, και διαπίστωσε ότι η μικροπλάσμα που χρησιμοποιείται στην παρούσα εργασία οδηγεί πράγματι σε απόπτωση με ακρίβεια μονοκύτταρους.

Πιθανές εφαρμογές

Τα αποτελέσματα της δουλειάς μας είναι σημαντικές για πολλές μελλοντικές βιοϊατρικές εφαρμογές. Για παράδειγμα, με την έλευση της ανίχνευσης πρώιμου σταδίου του μικρού αριθμού καρκινικών κυττάρων μπορεί να είναι δυνατό για τη θεραπεία επιλεκτικά τα κακοήθη κύτταρα, ενώ κρατώντας ανέπαφο το φυσιολογικά κύτταρα. Είναι προς το παρόν εξακολουθεί να είναι πολύ δύσκολο να εντοπιστούν πολύ μικρές συστάδες των καρκινικών κυττάρων κάτω από ένα συγκεκριμένο ελάχιστο αριθμό των κυττάρων. Όταν οι σχετικές σαφείς τεχνικές έγκαιρης ανίχνευσης είναι διαθέσιμα, η μικροπλάσμα προσέγγιση της εργασίας αυτής μπορεί δυνητικά να έχει σημαντικό αντίκτυπο στις θεραπείες θεραπεία του καρκίνου.

Άλλες δυνατότητες περιλαμβάνουν διέγερση επιλεγμένων περιοχών στην επιφάνεια των κυττάρων για την επαγωγή ειδικών κυτταρικών επιδράσεις όπως στοχευμένη επαναπρογραμματισμό βλαστοκυττάρων (πιθανώς συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου βλαστικών κυττάρων) για να επιτευχθούν τα επιθυμητά αποτελέσματα δραστικότητας και επιλογή μοίρα, καθώς και ενδοκυτταρική σχολαστικά και ανακίνηση των επιλεγμένων οργανίδια. Σε αυτές τις περιπτώσεις πρέπει επίσης να συμπεριληφθούν με σαφήνεια και να ερμηνεύονται τα αποτελέσματα της χρονικώς μεταβαλλόμενα ηλεκτρικά πεδία.

Συμπέρασμα

Εν ολίγοις, έχουμε αποδείξει ότι η ατομική HepG2 και τα καρκινικά κύτταρα HeLa μπορεί να είναι αποτελεσματικά αδρανοποιημένο μέσω του ενιαίου-κυττάρου-ακρίβειας, μικροπλάσμα που προκαλείται αποπτωτική απόκριση, ενώ η κανονική L-02 κύτταρα του ήπατος παραμένει ανεπηρέαστη από την ίδια την έκθεση στο πλάσμα. Το μικροπλάσμα μπορεί να περιορίζεται στο μικρό (~ 1 μm) όγκος γύρω από την άκρη μιας βελόνας που μπορεί να τοποθετείται σε οποιαδήποτε συγκεκριμένη περιοχή με χρήση ενός μικροχειριστή. Η ισχύς που παραδίδεται στο κύτταρο είναι πολύ μικρή (λίγα mW) ακόμη επαρκής για να επάγει απόπτωση επιλεκτικά, χωρίς να επηρεάζει τα γειτονικά κύτταρα, ακόμη και μέσα σε μικρές συστάδες στενά επαφή κυττάρων. Η πηγή πλάσματος είναι που λειτουργούν με μπαταρία και δεν βασίζεται σε καμία εξωτερική τροφοδοσία ή αερίου προμήθειες, οι οποίες μπορεί να είναι ιδιαίτερα χρήσιμο σε περιπτώσεις όπου εξωτερικό τροφοδοτικό δεν είναι διαθέσιμο ή φορητότητα της συσκευής είναι ένα θέμα.

Η προκαταβολή είναι γενική και εφαρμόζεται σε διαφορετικούς τύπους καρκινικών κυττάρων. Μπορεί να οδηγήσει σε επόμενης γενιάς microsurgeries μονοκύτταροι ακρίβειας. αλλαγές Βήμα είναι επίσης δυνατή στην ικανότητα κατευθυνομένων μικροσυστοιχιών προς στιγμιαία αδρανοποίηση των ως-ανιχνεύθηκε κακοήθη κύτταρα, όπου οι βελόνες σε συστοιχίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως τόσο τα ηλεκτροφυσιολογικά ιχνηλατών και των ηλεκτροδίων για την παραγωγή του πλάσματος.