Αφηρημένο

Ιστορικό

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) παραμένει ένας από τους κύριους τύπους καρκίνου και θανάτου που σχετίζονται με τον καρκίνο σε όλο τον κόσμο. Ευαίσθητα, μη επεμβατική βιοδείκτες που μπορούν να διευκολύνουν την ανίχνευση της νόσου, σταδιοποίηση και πρόβλεψη θεραπευτικό αποτέλεσμα είναι ιδιαίτερα επιθυμητή η βελτίωση του ποσοστού επιβίωσης και να βοηθήσει να καθορίσει βελτιστοποιημένη θεραπεία για CRC. Τα μικρά μη-κωδικοποίησης RNAs, microRNAs (miRNAs), έχουν πρόσφατα αναγνωριστεί ως κρίσιμες ρυθμιστικές αρχές για διάφορες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου και μπορεί να αντιπροσωπεύει μια νέα κατηγορία της βιοδείκτες του καρκίνου. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να προσδιοριστούν και να επικυρωθούν κυκλοφορούν microRNAs στο ανθρώπινο πλάσμα για χρήση ως τέτοια βιοδείκτες στον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Με τη χρήση της αλυσίδας μεταγραφή-αντίδραση πολυμεράσης ποσοτική αντίστροφη, βρήκαμε ότι κυκλοφορούν miR-141 ήταν σημαντικά σχετίζονται με τον καρκίνο του παχέος εντέρου σταδίου IV σε μία ομάδα από 102 δείγματα πλάσματος. πραγματοποιούν χαρακτηριστική ανάλυση δέκτη (ROC) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της ευαισθησίας και της ειδικότητας των δεικτών microRNA υποψηφίου πλάσματος. Παρατηρήσαμε ότι ο συνδυασμός του miR-141 και το καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο (CEA), ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο δείκτη για CRC, βελτιώνεται περαιτέρω η ακρίβεια του εντοπισμού. Τα ευρήματα αυτά επικυρώθηκαν σε μια ανεξάρτητη ομάδα από 156 δείγματα πλάσματος που συλλέγονται σε Tianjin, Κίνα. Επιπλέον, η ανάλυσή μας έδειξε ότι τα υψηλά επίπεδα πλάσματος miR-141 προβλέψει κακή επιβίωση και στις δύο ομάδες και ότι miR-141 ήταν ένα ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα για τον προχωρημένο καρκίνο του παχέος εντέρου.

Συμπεράσματα /Σημασία

προτείνουν ότι το πλάσμα miR-141 μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα νέο βιοδείκτη που συμπληρώνει CEA στην ανίχνευση του καρκίνου του παχέος εντέρου με μακρινή μετάσταση και ότι τα υψηλά επίπεδα του miR-141 στο πλάσμα σχετίζονται με κακή πρόγνωση

Παράθεση:. Cheng Η Ζανγκ L , Κόγκντελ DE, Zheng Η Schetter AJ, Nykter M, et al. (2011) Κυκλοφορούν Plasma MiR-141 είναι ένα μυθιστόρημα βιοδεικτών για το μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου και προβλέπει κακή πρόγνωση. PLoS ONE 6 (3): e17745. doi: 10.1371 /journal.pone.0017745

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 15η Οκτωβρίου 2010? Αποδεκτές: 11 Φλεβάρη, 2011? Δημοσιεύθηκε: 17 του Μάρτη του 2011

Copyright: © 2011 Cheng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ίδρυμα για την Έρευνα του Καρκίνου (WZ και SRH) και Tianjin Ινστιτούτο Καρκίνου και το Νοσοκομείο (KC). Hanyin Cheng υποστηρίχθηκε από μια υποτροφία Pharmacoinformatic Εκπαίδευση Επιχορήγηση από ΝΙΗ (ΝΙΗ Grant Νο R90 DK071505-05). Δεδομένα και δείγμα συλλογής υποστηρίχθηκαν από τον M. D. Anderson του Πανεπιστημίου του Ταμείου Καρκίνου, το Κέντρο για την Κλινική και Μεταγραφική Επιστημών του Πανεπιστημίου του Τέξας Health Science Center στο Χιούστον, και ΝΙΗ Κέντρο Καρκίνου Υποστήριξη Grant CA16672. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι ένα παγκόσμιο πρόβλημα υγείας με 655.000 θανάτους ετησίως [1]. Στις Ηνωμένες Πολιτείες, CRC είναι το τρίτο πιο κοινό είδος καρκίνου και η δεύτερη πιο κοινή αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με το θάνατο [2], με εκτιμώμενη 51.370 θάνατοι το 2010 σύμφωνα με το National Cancer Institute. Στην Κίνα, CRC παραμένει η πέμπτη πιο κοινός τύπος καρκίνου και η τέταρτη πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται [3]. Παρά την έγκαιρη διάγνωση και την ανάπτυξη νέων χημειοθεραπευτικών στρατηγικών, CRC ποσοστά επιβίωσης κατά τη διάρκεια των τελευταίων 20 ετών δεν έχουν βελτιωθεί σημαντικά. Επιπλέον, η συχνότητα εμφάνισης της CRC αυξάνεται με ταχείς ρυθμούς τα τελευταία χρόνια στην Κίνα [4]. Μυθιστόρημα βιοδείκτες που έχουν κλινική αξία, επομένως, επιτακτική ανάγκη να βελτιώσουν τα ποσοστά συμμόρφωσης. Καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο (CEA) έχει χρησιμοποιηθεί ως ένας δείκτης της CRC ορού, αν και η ευαισθησία του έχει ποικίλει στις διάφορες μελέτες [5], [6]. Πρόσφατα, μία οικογένεια μικρών ρυθμιστικών RNAs, microRNAs, έχει αναδειχθεί ως το δυνατόν δείκτες πλάσματος για ασθένειες του ανθρώπου, συμπεριλαμβανομένων καρκίνων λόγω της σχετικής σταθερότητας τους στην κυκλοφορία [7].

Τα microRNAs είναι μικρά μη-κωδικοποίησης RNAs (18- 22 nt σε μήκος) που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων στόχων παρεμβαίνοντας με μεταγραφή ή την αναστολή της μετάφρασης [8]. Μελέτες έχουν δείξει ότι microRNAs παίζουν κρίσιμο ρόλο σε όλες σχεδόν τις κυτταρικών βιολογικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένου του μεταβολισμού, την επιβίωση, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση. Απορρύθμιση ειδικών microRNAs συμβάλλει σε μια ποικιλία ασθενειών, κυρίως στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του CRC. Συγκεκριμένα, microRNA προφίλ έκφρασης σε CRC έδειξαν ότι ένας αριθμός microRNAs, συμπεριλαμβανομένων miR-21, miR-20a και miR155 ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω σε ιστούς όγκων και ότι οι υψηλότερες miR-21 συσχετίστηκε με κακή θεραπευτικό αποτέλεσμα [9], [10]. Το δυναμικό των κυκλοφορούντων miRNAs στο πλάσμα ως βιοδείκτες του καρκίνου έχει επίσης αξιολογηθεί σε μερικές μελέτες. Για CRC, μία πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι miR-92 επίπεδα ήταν σημαντικά υψηλότερα σε δείγματα πλάσματος από ασθενείς σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες και μπορούν να είναι ένας πιθανός δείκτης για ανίχνευση CRC [11]. Μια μελέτη δειγμάτων πλάσματος από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη ανέφεραν ότι το πλάσμα επίπεδα miR-141 μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διαλογή μεταστατικό καρκίνο του προστάτη με υψηλή ευαισθησία [12].

Σε αυτό απόδειξη της αρχής της μελέτης για τον εντοπισμό πιθανών βιοδεικτών για CRC, εξετάσαμε αν επιλεγέντα υποψήφιο microRNAs θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μη επεμβατική, δείκτες με βάση το αίμα για CRC αναλύοντας τα σχετικά επίπεδα των τριών microRNAs (miR-21, miR-92, και miR-141) σε μία ομάδα από 102 πλάσματος δείγματα από υγιή άτομα και ασθενείς CRC λαμβάνονται από TexGen, μια συνεργασία του Τέξας Ιατρικών Ιδρυμάτων Center. Η αρχική μας δεδομένα έδειξαν ότι μεταξύ αυτών των τριών microRNAs, πλάσμα επίπεδα miR-141 ήταν σημαντικά αυξημένα στο πλάσμα των ασθενών με καρκίνο παχέος εντέρου με νόσο Σταδίου IV και θα μπορούσε εύκολα να διακρίνουν μακρινή μετάσταση περιπτώσεις από κανονικούς ελέγχους και τους ασθενείς με άλλα στάδια. Συνδυασμός του miR-141 με CEA ήταν συμπληρωματικές και θα μπορούσε να αυξήσει περαιτέρω την ακρίβεια εντοπισμού των μακρινών μεταστάσεων στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Τα ευρήματα αυτά επικυρώθηκαν σε μια ανεξάρτητη ομάδα από 156 δείγματα πλάσματος που λαμβάνονται από Tianjin, Κίνα. περαιτέρω αναλύσεις μας παρέχονται αποδεικτικά στοιχεία ότι το πλάσμα miR-141 ήταν ένα δυνητικό προγνωστικός παράγοντας που προβλέπεται για κακή επιβίωση σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε αντίθεση με πλάσμα, miR-141 δεν ήταν εκφράζονται διαφορικά σε ιστούς όγκων μεταξύ Stage IV και Στάδιο Ι-ΙΙ ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου ή μεταξύ ιστών όγκου και των παρακείμενων ιστών μη-όγκου σε ασθενείς σταδίου IV, υποδηλώνοντας ότι η ανύψωση του πλάσματος miR-141 σε ασθενείς σταδίου IV θα μπορούσαν να προέρχονται από άλλες συστηματικές αντιδράσεις, όπως φλεγμονώδεις αντιδράσεις σε αυτούς τους ασθενείς.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Τόσο το πλάσμα και τους ιστούς που βασίζονται σε μελέτες εγκρίθηκαν από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review (IRB) στο MD Anderson Κέντρο Καρκίνου και από την επιτροπή δεοντολογίας του Αντικαρκινικού Ινστιτούτου Tianjin Ιατρικό Πανεπιστήμιο και το Νοσοκομείο. Όλοι οι συμμετέχοντες έδωσαν γραπτή συγκατάθεση των πληροφοριών τους να αποθηκεύονται στη βάση δεδομένων του νοσοκομείου και να χρησιμοποιηθούν για την έρευνα.

Κλινικά δείγματα

Χρησιμοποιήθηκαν δύο ανεξάρτητα σύνολα δειγμάτων πλάσματος. Συνολικά 102 δείγματα πλάσματος από την ηλικία και το φύλο υγιών ατόμων και ασθενών CRC (Στάδιο Ι-IV) ελήφθησαν από TexGen μεταξύ του 2002 και του 2008, μια συνεργασία των ιδρυμάτων Ιατρικό Κέντρο του Τέξας που παρέχει βιολογικά δείγματα, καθώς και επιδημιολογικές και κλινικές δεδομένων (δείγματα TexGen, Βλέπε πίνακα S1). Μια ανεξάρτητη ομάδα των 156 δειγμάτων πλάσματος από ηλικιακά και κατά φύλλο υγιείς δότες και ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου (Στάδιο Ι-IV) ελήφθησαν στο Cancer Institute Tianjin Ιατρικό Πανεπιστήμιο και το Νοσοκομείο, Tianjin, Κίνα (δείγματα TCH) μεταξύ 2007 και 2009 ( Βλέπε πίνακα S2). Παθολογική ταξινόμηση της νόσου σε όλους τους ασθενείς έγινε μετά από τη Διεθνή Ένωση κατά του Καρκίνου (UICC) και αμερικανικές μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο (AJCC) σύστημα TNM στάσης για τον καρκίνο του παχέος εντέρου ιδρύθηκε το 2003. δείγματα αίματος συλλέχθηκαν από όλους τους ασθενείς πριν από τη λειτουργία και τη θεραπεία. επίπεδα CEA και των δύο δειγμάτων πλάσματος TexGen και TCH μετρήθηκαν με πρότυπες ένζυμο ανοσολογική δοκιμή ως μέρος των συνήθων κλινικών δοκιμών και αποκτήθηκαν από την κλινική βάση δεδομένων σε κάθε ίδρυμα. Παρακολούθηση δεδομένων όλων των προσληφθεί ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και από τις δύο TexGen και TCH αποκτήθηκαν και ο χρόνος επιβίωσης υπολογίστηκε από την ημερομηνία της διάγνωσης μέχρι την ημερομηνία θανάτου ή την τελευταία παρακολούθηση, τον Ιούνιο του 2010. Όλοι οι ασθενείς που προσλαμβάνονται με τη μελέτη αυτή δεν είχε υποβληθεί σε χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία πριν από το αίμα ισοπαλίες. Η δημογραφική πληροφορία από τα δύο σύνολα δειγμάτων συνοψίζεται στο συμπληρωματικό υλικό.

Για τους ιστούς ανάλυση του όγκου του ιστού που βασίζεται από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου 21 με μακρινό μεταστατική νόσο (στάδιο IV) και 24 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου με μη -metastatic νόσο (στάδιο Ι και ΙΙ) συλλέχθηκαν μεταξύ 2007 και 2009 από Tianjin Ιατρικό Πανεπιστήμιο Cancer Institute και το Νοσοκομείο από τους ίδιους τους ασθενείς των οποίων τα δείγματα πλάσματος χρησιμοποιήθηκαν.

απομόνωση RNA και ποσοτική RT-PCR

Μικρές RNA εμπλουτίστηκε από όλα τα δείγματα πλάσματος με τη χρήση της mirVana PARIS κιτ απομόνωσης RNA (Ambion, Austin, ΤΧ). Εν συντομία, 250 μΐ πλάσματος επανατήχθηκε επί πάγου και φυγοκεντρήθηκε στις 14.000 rpm για 10 λεπτά για να απομακρυνθούν τα κυτταρικά υπολείμματα και άλλα κυτταρικά οργανίδια. Στη συνέχεια, 150 μι του υπερκειμένου λύθηκαν με ένα ίσο όγκο διαλύματος μετουσίωσης 2x. Για την ομαλοποίηση του δείγματος προς δείγμα μεταβολή κατά τη διάρκεια των διαδικασιών απομόνωσης RNA, 25 fmol του συνθετικού

C. elegans

miRNA cel-miR-39 προστέθηκε σε κάθε μετουσιωμένο δείγμα. Μικρές RNAs στη συνέχεια εμπλουτίζεται και καθαρίστηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, με την εξαίρεση ότι οι εμπλουτισμένο μικρά RNAs εκλούσθηκαν σε 45 μλ προθερμανθέντος ύδατος άνευ νουκλεάσης. Πρότυπη μέθοδος TRIZOL (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για να απομονώσει ολικού RNA από ιστούς του παχέος εντέρου.

Για microRNA βάση προσδιορισμούς RT-PCR, 2.5 μί εμπλουτισμένου μικρών RNAs από δείγματα πλάσματος μεταγράφηκαν ανάστροφα χρησιμοποιώντας το TaqMan microRNA Reverse μεταγραφής του Kit ( Applied Biosystems, San Diego, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή σε ένα συνολικό όγκο αντίδραση των 7.5 μL. Μια αραίωση των προϊόντων RT 1:20 χρησιμοποιήθηκε σαν εκμαγείο για το στάδιο PCR. αντίδραση PCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν χρησιμοποιώντας TaqMan 2x καθολική PCR Master Mix με συνθήκες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. Μάρτυρες χωρίς πρόπλασμα για τόσο RT βήμα και το βήμα της PCR περιελήφθησαν για να εξασφαλιστεί συγκεκριμένο στόχο ενίσχυση. Οι 7900 Sequence Detection System προεπιλογές 2.3 (Applied Biosystems) του λογισμικού χρησιμοποιήθηκαν για να υπολογιστεί η σχετική μεταβολή στην έκφραση του RNA από το 2

-ΔΔCt μέθοδο με διαστήματα εμπιστοσύνης 95%. Δοκιμασίες για τα δείγματα TexGen έγιναν στο MD Anderson και αναλύσεις για τα δείγματα TCH πραγματοποιήθηκαν στο Tianjin Ιατρικό Πανεπιστήμιο Cancer Institute και το Νοσοκομείο.

microRNA προφίλ

microRNA μικροσυστοιχιών προφίλ εκτελέστηκε με RNA που απομονώθηκε από η ομάδα Μέριλαντ χρησιμοποιώντας το Ohio State microRNA μικροσυστοιχιών έκδοση 2.0 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. έχουν δεδομένων των μικροσυστοιχιών (συμπεριλαμβανομένων των πρώτων και τα επεξεργασμένα δεδομένα) έχουν κατατεθεί στο National Center for Biotechnology Information του Gene Expression (NCBI του) Omnibus (NCBIGEO GSE7828).

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε με τη χρήση η Wilcoxon τεστ signed-rank μεταξύ των ομάδων. χαρακτηριστικό λειτουργίας (ROC) καμπύλη Receiver δημιουργήθηκαν για να εκτιμηθεί η διαγνωστική ακρίβεια της κάθε παραμέτρου, και η ευαισθησία και η ειδικότητα της βέλτιστο σημείο αποκοπής ορίστηκαν ως εκείνες τις αξίες που μεγιστοποιείται το εμβαδόν κάτω από την καμπύλη ROC (AUC). Τα σχετικά επίπεδα του microRNA ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCt μέθοδο, και τα δεδομένα αναλύθηκαν ως αρχείο καταγραφής

10 της σχετικής ποσότητας του στόχου microRNA. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση των πακέτων λογισμικού SPSS έκδοση 16.0 (WPSS Ltd., Surrey, Ηνωμένο Βασίλειο) και γραφήματα παρήχθησαν χρησιμοποιώντας Graphpad Prism 5.0 (Graphpad Software Inc, Καλιφόρνια). ανάλυση συσχέτισης Spearman διεξήχθη για να αποκαλύψει συσχέτιση μεταξύ του πλάσματος έκφραση του miR-141 και τα στάδια CRC. Όλες οι στατιστικές δοκιμασίες ήταν δύο όψεων, και

P

αξίας 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Η συσχέτιση μεταξύ της συνολικής επιβίωσης και πλάσματος miR-141 αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier και δοκιμασία log-rank. Cox ανάλυση παλινδρόμησης αναλογικών κινδύνων χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί το κατά πόσον το πλάσμα miR-141 ήταν ένα ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα για τον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Αποτελέσματα

Τα επίπεδα πλάσματος miR-141 συσχετίζεται με κλινικά στάδια σε καρκίνο του παχέος εντέρου

Τρεις microRNAs (miR-21, miR-92 και miR-141) επιλέχθηκαν στις μελέτες μας για να εξετάσει τις δυνατότητές τους να χρησιμεύσει ως βιοδείκτες για τον καρκίνο του παχέος εντέρου. Η επιλογή των υποψήφιων miRNAs αυτά επειδή 1) miR-21 έχει βρεθεί να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε ιστούς όγκων CRC [9], [10], [14]? 2) miR-92 έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι είναι ένας δείκτης πλάσματος για τον καρκίνο του παχέος εντέρου [11]? και 3) miR-141 έχει δειχθεί ότι είναι ένας δυνητικός δείκτη πλάσματος για μεταστατικό καρκίνο του προστάτη [12]. Διεξήχθησαν ποσοτική RT-PCR δοκιμασίες που βασίζονται microRNA για τα τρία αυτά miRNAs. Εξετάσαμε πρώτα τη συσχέτιση μεταξύ αυτών των τριών miRNAs και καρκίνου του παχέος εντέρου κλινικά στάδια. Στάδιο Ι και υποθέσεις της φάσης ΙΙ συγκεντρώθηκαν στην ανάλυσή μας, γιατί μόνο περιορισμένες Στάδιο I περιπτώσεις ήταν διαθέσιμα. ανάλυση Heat-map έδειξαν ότι τα επίπεδα miR-141 σε σύμπλεγμα σύμφωνα με τα διάφορα στάδια (Σχήμα 1, Α). ανάλυση συσχέτισης Spearman έδειξε ότι τα επίπεδα πλάσματος miR-141 ήταν σε μεγάλο βαθμό με τα στάδια του καρκίνου του παχέος εντέρου (r = 0,605, P = 1,17 × 10

-8). Σε αντίθεση, miR-21 και miR-92 ήταν λιγότερο συσχετίζονται με κλινικά στάδια (Σχήμα 1, Α).

(Α) Σε κάθε σειρά αντιστοιχεί σε ένα πλάσμα miRNA και κάθε στήλη αντιστοιχεί σε κάθε δείγμα. Τα επίπεδα έκφρασης για κάθε miRNA ομαλοποιήθηκε σε όλα τα δείγματα και σκιασμένες σε χρώματα όπως το κόκκινο υποδηλώνει υψηλή έκφραση και το πράσινο υποδηλώνει χαμηλή έκφραση. Spearman συσχέτισης δείχνει ότι το miR-141 είναι υψηλή συσχέτιση με τα στάδια (r = 0,605, P = 1,17 × 10

-8). (Β-G) Τα σχετικά επίπεδα των επιλεγμένων microRNAs πλάσματος ομαλοποιήθηκαν να ακίδα-in ελέγχου cel-miR-39 και εμφανίζεται ως log10 της σχετικής ποσότητας (RQ). Οι δοκιμές δύο δειγμάτων Wilcoxon πραγματοποιήθηκαν για να εξεταστεί η διαφορά των επιλεγμένων microRNAs πλάσματος μεταξύ φυσιολογικούς ελέγχους και τους ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου (Β-D), ή μεταξύ της κανονικής ελέγχων και /ή ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου με διαφορετικά κλινικά στάδια (E-G).

επόμενο ανέλυσε αν αυτές οι υποψήφιες microRNAs μπορεί να χρησιμεύσει ως κυκλοφορούν δείκτες καρκίνου του παχέος εντέρου, συγκρίνοντας τα επίπεδα τους στο πλάσμα μεταξύ ασθενών με καρκίνο και των φυσιολογικών μαρτύρων. Παραδόξως, σε αντίθεση με την προηγούμενη έκθεση ότι προς τα πάνω ρύθμιση του πλάσματος miR-92 ήταν ένας βιοδείκτης καρκίνο του παχέος εντέρου, η δοκιμή δύο δειγμάτων Wilcoxon έδειξε ότι μεταξύ αυτών των τριών microRNAs, πλάσμα miR-92 μειώθηκε σημαντικά στην ομάδα ασθενών TexGen των ασθενών με καρκίνο παχέος εντέρου (em

σ

= 0,03) (Σχήμα 1, D). Ωστόσο, η μείωση στο πλάσμα miR-92 παρατηρήθηκε μόνο στο Στάδιο Ι-ΙΙ και σταδίου III και το επίπεδο αυξήθηκε σε παρόμοιο επίπεδο με εκείνη των φυσιολογικών μαρτύρων σε καρκίνο του παχέος εντέρου σταδίου IV (Σχήμα 1, G). επίπεδα miR-21 και miR-141 στο πλάσμα δεν έδειξε σημαντική διαφορά ανάμεσα στους ελέγχους και τους ασθενείς με καρκίνο (Σχήμα 1, B & amp? C). Μετά διαστρωμάτωση των ασθενών με καρκίνο, σύμφωνα με κλινικά στάδια τους, πλάσμα miR-141 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε Στάδιο IV καρκίνο του παχέος εντέρου (Σχήμα 1, E). Σε πολύ λιγότερο βαθμό, πλάσμα miR-21 αποδείχθηκε επίσης να είναι αυξημένα στα καρκινικά Stage IV του κόλου (Σχήμα 1, F). Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, επιδιώξαμε να επικεντρωθεί στην miR-141 για περαιτέρω χαρακτηρισμό.

Τα υψηλά επίπεδα πλάσματος miR-141 συνδέεται με τον καρκίνο του παχέος εντέρου σταδίου IV και συμπληρώνουν με CEA στη διάγνωση

Το παραπάνω αποτελέσματα έδειξαν ότι μεταξύ των τριών επιλεγμένων microRNAs, miR-141 συσχετίστηκε σημαντικά με τα στάδια του καρκίνου του παχέος εντέρου. Η λεπτομερής δοκιμή δύο δειγμάτων Wilcoxon έδειξε ότι το πλάσμα miR-141 ήταν σημαντικά αυξημένα σε στάδιο IV περιπτώσεις, σε σύγκριση με το Στάδιο Ι-ΙΙ, Φάση ΙΙΙ και Στάδιο Ι-ΙΙΙ σε συνδυασμό. Η καμπύλη ROC παραστάθηκε γραφικά για την αναγνώριση ενός τιμή αποκοπής που θα μπορούσαν να διακρίνουν καρκίνο του παχέος εντέρου σταδίου IV από άλλες ομάδες. ανάλυση καμπύλης ROC έδειξε ότι στο βέλτιστο αποκοπής, πλάσμα miR-141 είχε ευαισθησία 90.9% και ειδικότητα 77,1% σε διαχωρισμό περιπτώσεις Stage IV από περιπτώσεις Στάδιο Ι-ΙΙ με την AUC του 0,861 (Εικόνα 2, Β), μία 77,1% ευαισθησία και ειδικότητα 89,7% σε διαχωρισμό περιπτώσεις Stage IV και σταδίου III με την AUC του 0,803 (Εικόνα 2, C), και μια ευαισθησία 77.1% και ειδικότητα 89,7% σε διαχωρισμό της φάσης IV και συνδυασμένων περιπτώσεις Στάδιο Ι-ΙΙΙ με την AUC του 0,836 (Εικόνα 2, D). Η ανάλυσή μας αποκάλυψε, επίσης, ότι σε αυτή την ομάδα, το πλάσμα miR-141 ήταν σημαντικά αυξημένα σε στάδιο ΙΙΙ ασθενείς σε σύγκριση με τους ασθενείς πρώιμο στάδιο (

σ

= 0,025) (Εικόνα 2, A). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι κυκλοφορούν miR-141 θα μπορούσε να είναι ένα νέο βιοδείκτη για μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου.

(Α) Small RNA απομονώθηκε από δείγματα πλάσματος και miR-141 μετρήθηκε με ποσοτικές αναλύσεις RT-PCR. Η δοκιμή δύο δειγμάτων Wilcoxon διεξήχθη για να αξιολογηθεί διαφορές των επιπέδων miR-141 μεταξύ των ομάδων σταδίου III και φάσης Ι-ΙΙ. ανάλυση ROC πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η ευαισθησία και ειδικότητα με την τιμή του AUC στο δεξί πλαίσιο. Οι Wilcoxon τεστ δύο δειγμάτων μεταξύ (Β) Στάδιο IV και Στάδιο Ι-ΙΙ, (Γ) Στάδιο IV και Sage ΙΙΙ, και (Δ) Στάδιο IV και Στάδιο Ι-ΙΙΙ ομάδες έγιναν για να αξιολογηθεί η συσχέτιση του πλάσματος miR-141 με την κατάσταση της νόσου Stage IV.

η

Επειδή η δοκιμή CEA στο αίμα είναι ευρέως χρησιμοποιούμενο δείκτη για τους ασθενείς CRC, επιδιώξαμε να συγκρίνουν την απόδοση του miR-141 με CEA ως βιοδείκτη. Εξετάσαμε αν ένας συνδυασμός του miR-141 και CEA ήταν περισσότερο ευαίσθητη από κάθε δείκτη όταν χρησιμοποιούνται μεμονωμένα. Η ανάλυσή μας έδειξε ότι ήταν όντως συμπληρωματικά. Όταν η ειδικότητα ορίστηκε σε 100%, miR-141 εντοπίστηκαν επτά Στάδιο IV καρκίνο του παχέος εντέρου που είχαν χαθεί από την CEA μόνο και CEA προσδιόρισε τέσσερις Stage IV περιπτώσεις μεταστατικού καρκίνου του παχέος εντέρου που είχαν χαθεί από το miR-141 μόνο (Σχήμα 3).

Δύο παραμέτρων (έκφραση του miR-141 και CEA στο πλάσμα) ταξινόμηση χρησιμοποιείται για τη διάκριση μακρινά μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου. Η τιμή αποκοπής για το CEA είναι 5,0 ng /mL, και για miR-141 είναι 16,77 ορίζεται από την καμπύλη ROC. Οι αντίστοιχες τιμές αποκοπής σημειώνονται με γκρι γραμμές.

Η

Επικύρωση πλάσμα miR-141 ως ένας δείκτης του καρκίνου του παχέος εντέρου σε ένα ανεξάρτητο πληθυσμού

Τα αποτελέσματα από τις παραπάνω μελέτες στοιχεία που αποδεικνύουν ότι υψηλά επίπεδα κυκλοφορούντων miR-141 θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός βιολογικός δείκτης που συμπληρώνει CEA για μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου. Για να επικυρώσετε περαιτέρω το δυναμικό χρησιμότητα των miR-141 στην κλινική αντιμετώπιση του καρκίνου του παχέος εντέρου, πραγματοποιήσαμε μια μελέτη επικύρωσης με ένα ανεξάρτητο σύνολο των δειγμάτων πλάσματος (δείγματα TCH) (Βλέπε Πίνακα S2 για δημογραφικά στοιχεία των περιπτώσεων TCH). Οι μετρήσεις έγιναν ανεξάρτητα ακολουθώντας τις ίδιες πειραματικές διαδικασίες που χρησιμοποιούνται για τα δείγματα TexGen.

Τα αποτελέσματα επικυρώνονται ότι το πλάσμα miR-141 το επίπεδο ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ασθενείς σταδίου IV σε σχέση με φυσιολογικούς μάρτυρες, Στάδιο Ι-ΙΙ και Σταδίου ασθενείς III (Σχήμα 4, Α). Συγκεκριμένα, οι καμπύλες ROC έδειξαν ότι ένα cut-off για το πλάσμα miR-141 θα μπορούσε να προσδιοριστεί με ευαισθησία 66,7% και ειδικότητα 80,8% για το διαχωρισμό το στάδιο IV υποθέσεις από τις υποθέσεις της φάσης Ι-ΙΙ (AUC = 0,756) (Εικόνα 4 , Β), μία ευαισθησία 66,7% και ειδικότητα 89,7% για το διαχωρισμό από το στάδιο III περιπτώσεις (AUC = 0.779) (Σχήμα 4, C), και μια ευαισθησία 66.7% και ειδικότητα 84,0% για τον διαχωρισμό από τις περιπτώσεις Στάδιο 1-ΙΙΙ ( AUC = 0.764) (Σχήμα 4, Δ). Σε αντίθεση με τα δείγματα TexGen πλάσμα, που όμως απέτυχαν να ανιχνεύσουν μια σημαντική διαφορά στα επίπεδα miR-141 μεταξύ των περιπτώσεων (δεν απεικονίζεται) Στάδιο ΙΙΙ και Στάδιο Ι-ΙΙ, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι υψηλότερες πλάσμα miR-141 είναι πιο σχετίζεται με μακρινές και λιγότερο με lymph- κόμβος μετάσταση στον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Μικρές απομόνωση RNA και miR-141 ποσοτικές αναλύσεις RT-PCR πραγματοποιήθηκαν με τον ίδιο τρόπο όπως και για την ομάδα της κατάρτισης. (Α) Η δοκιμή δύο δειγμάτων Wilcoxon διεξήχθη για να συγκρίνουν τα επίπεδα miR-141 μεταξύ φυσιολογικούς ελέγχους ή /και ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου με διαφορετικά κλινικά στάδια. (Β-Δ) Οι ίδιες αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη σύγκριση των επιπέδων του miR-141 μεταξύ Stage IV υποθέσεις και υποθέσεις της φάσης Ι-ΙΙ (Β), μεταξύ Stage IV και σταδίου III περιπτώσεις (C), καθώς και μεταξύ Stage IV και Στάδιο Ι-ΙΙΙ περιπτώσεις (D), αντίστοιχα. ανάλυση ROC πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η ευαισθησία και ειδικότητα με την τιμή του AUC στο δεξί πλαίσιο. (Ε) Συνδυασμός CEA και miR-141 εντοπίστηκαν επιπλέον μεταστατικό οι ασθενείς που είχαν χάσει από οποιονδήποτε δείκτη μόνο. Δείτε το Σχήμα 3 για τον ορισμό των τιμών αποκοπής για CEA και miR-141.

Η

Θα αξιολογηθούν επίσης τα δεδομένα CEA στο σύνολο δεδομένων TCH. Παρόμοια με ό, τι φάνηκε στα δείγματα TexGen, συνδυασμός του miR-141 και CEA προσδιορίζονται επιπλέον μεταστατικό υποθέσεις που αλλιώς χαθεί από οποιοδήποτε δείκτη που χρησιμοποιείται μόνο του (Σχήμα 4, Ε). Αυτό το εύρημα επικυρωθεί ότι ο συνδυασμός αυτών των δύο βιοδεικτών ήταν μια πιο αποτελεσματική προσέγγιση για την ανίχνευση ασθενών Stage IV CRC.

Plasma miR-141 συσχετίζεται με κακή επιβίωση στον καρκίνο του παχέος εντέρου

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω κατά πόσον επίπεδα στο πλάσμα miR-141 μπορεί να προβλέψει την πρόγνωση, είμαστε δίπλα πραγματοποιηθεί μια ανάλυση επιβίωσης για TexGen και TCH περιπτώσεις. Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier έδειξε ότι υψηλότερη έκφραση του πλάσματος miR-141 συσχετίστηκε σημαντικά με κακή επιβίωση τόσο στην TexGen (

P

= 0,004, δοκιμασία log-rank) και Tianjin (

P

= 0,002, δοκιμασία log-rank) ομάδες (Σχήμα S1, Α και Β). Μονοπαραγοντική Cox ανάλυση παλινδρόμησης έδειξε ότι το πλάσμα miR-141 ήταν ένα σημαντικό προγνωστικό δείκτη του καρκίνου του παχέος εντέρου σε TexGen (HR = 3,80, 95% CI = 1,46 – 91) και των περιπτώσεων Tianjin (HR = 4,83, 95% CI = 2,06 – 11,35) , αντίστοιχα (Πίνακας 1). Για να αποφευχθεί οποιαδήποτε πιθανή προκατάληψη ανάμεσα στην ομάδα TexGen και Tianjin ομάδα, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις η μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική επιβίωσης για όλες τις περιπτώσεις. Η Cox ανάλυση ανάλογη παλινδρόμησης κινδύνου πολυπαραγοντική έδειξαν ότι το πλάσμα miR-141was ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου όταν συγχωνεύτηκαν τα δείγματα και από τις δύο κέντρα (HR = 2,40, 95% CI = 1,18 – 4,86) (Πίνακας 1).

miR-141 δεν είναι διαφορικά εκφρασμένο σε ιστούς του καρκίνου του παχέος εντέρου

Σας ζητείται να προσδιοριστεί αν τα αυξημένα miR-141 στο πλάσμα από το στάδιο IV CRC ασθενείς αντανακλάται διαφορική έκφραση στους καρκινικούς ιστούς από διαφορετικά νόσο στάδια. Πρέπει πρώτα σε σύγκριση miR-141 επίπεδα σε ιστούς όγκων μεταξύ φάσης Ι-ΙΙ και Σταδίου IV στην ομάδα TCH, που παραδόξως έδειξαν ότι το miR-141 δεν ρυθμίζεται αυξητικά στο Stage IV περιπτώσεις (

σ

= 0.495) (Σχήμα 5, Α). Είμαστε δίπλα ανέλυσε περιγράφηκε προηγουμένως δεδομένα microRNA μικροσυστοιχιών προφίλ μας (GEO, GSE7828). Η ανάλυσή μας επιβεβαίωσε επίσης ότι το επίπεδο miR-141 δεν ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ιστούς όγκων σε σχέση με το γειτονικό φυσιολογικούς ιστούς σε στάδιο IV ασθενείς, καθώς επίσης και σε ασθενείς από άλλα στάδια (Σχήμα 5, Β).

(Α ) Ολικό RNA απομονώθηκε από ιστούς όγκων του μεταστατικού ή μη μεταστατικό ασθενείς από κοόρτη Tianjin, και τα επίπεδα miR-141 μετρήθηκαν με ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιώντας RNU6B σαν ενδογενές ελέγχου. Η δοκιμή δύο δειγμάτων Wilcoxon διεξήχθη για σύγκριση της έκφρασης miR-141 σε ιστούς όγκων μεταξύ αυτών των δύο ομάδων. Ένα

P

& lt? 0,05 θεωρείται σημαντική. (Β) Τα επίπεδα έκφρασης miR-141 μετρήθηκαν με τη χρήση microRNA προφίλ δεδομένα από την κοόρτη Μέριλαντ των δειγμάτων CRC. Οι δοκιμές ταιριάζουν ζεύγη Wilcoxon έγιναν για να συγκρίνουν τα επίπεδα miR-141 μεταξύ των ιστών του όγκου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών σε αυτούς τους ασθενείς CRC.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, πήραμε μια εστιασμένη προσέγγιση και εξετάζονται τρεις υποψήφιες microRNAs για την πιθανή αξία τους ως βιοδείκτες πλάσματος για τον καρκίνο του παχέος εντέρου. Τα αποτελέσματα από τη μελέτη του Τέξας αποκάλυψε ότι το πλάσμα miR-141 ήταν ένας ευαίσθητος δείκτης και συμπληρώνονται CEA για την ανίχνευση του καρκίνου του παχέος εντέρου σταδίου IV. Το αποτέλεσμα αυτό ανεξάρτητα επικυρωθεί χρησιμοποιώντας μία ομάδα των δειγμάτων από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου στην Tianjin, Κίνα. Έτσι, αυτή η συνεργατική έρευνα που διενεργήθηκε από δύο ανεξάρτητες ομάδες ερευνητών σε δύο διαφορετικές τοποθεσίες για διαφορετικούς πληθυσμούς εθνικής ασθενή παρέχει ισχυρά αποδεικτικά στοιχεία ότι το miR-141 είναι ένας έγκυρος δείκτης πλάσμα που συμπληρώνει CEA στον καθορισμό καρκίνο του παχέος εντέρου σταδίου IV. Σημαντικά, τα δεδομένα μας έδειξαν επίσης ότι οι υψηλότεροι στο πλάσμα miR-141 συνδέθηκε με βραχύτερη επιβίωση και στις δύο ομάδες και ότι miR-141 ήταν ένα ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη για τον καρκίνο του παχέος εντέρου.