Αφηρημένο

Η επιλογή των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα για θεραπεία με αναστολείς της τυροσινικής κινάσης απευθύνονται σε EGFR απαιτεί τον προσδιορισμό συγκεκριμένων

EGFR

μεταλλάξεις. Στους περισσότερους ασθενείς με προχωρημένο, ανεγχείρητο καρκίνο του πνεύμονα δείγματα περιορισμένου όγκου συχνά αντιπροσωπεύουν το μόνο υλικό που είναι διαθέσιμο τόσο για ιστολογική πληκτρολόγηση και μοριακή ανάλυση. Ορίσαμε ένα επόμενο πρωτόκολλο αλληλουχίας γενιά στοχεύουν στο

EGFR

εξώνια 18-21 κατάλληλο για τη συνήθη διάγνωση αυτών των κλινικών δειγμάτων. Το πρωτόκολλο ελέγχθηκε σε ένα μη επιλεγμένο σειρά 80 μικρών βιοψιών (n = 14) και κυτταρολογία (n = 66) είναι αντιπροσωπευτικά του υλικού συνήθως υποβάλλονται για διαγνωστική αξιολόγηση για τρία παραπομπής ιατρικά κέντρα στην Ιταλία. Τα δείγματα αξιολογήθηκαν συστηματικά για τον αριθμό των κυττάρων του όγκου και αναλογία σε σχέση με μη νεοπλασματικά κύτταρα. Αυτοί αναλύθηκαν σε παρτίδες των 100-150 αμπλικονίων ανά εκτέλεση, φθάνοντας μια αναλυτική ευαισθησία 1% και την απόκτηση επαρκή αριθμό διαβάζει, να καλύψει όλες τις εξόνια σε όλα τα δείγματα που αναλύθηκαν. αλληλουχίας επόμενη γενιά συγκρίθηκε με αλληλουχίας Sanger. Η τελευταία προσδιορίζεται 15

EGFR

μεταλλάξεις σε 14/80 περιπτώσεις (17,5%), αλλά δεν ανιχνεύονται μεταλλάξεις όταν η αναλογία των νεοπλασματικών κυττάρων ήταν κάτω από 40%. αλληλουχίας επόμενης γενιάς εντοπίστηκαν 31

EGFR

μεταλλάξεις σε 24/80 περιπτώσεις (30,0%). Οι μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν με μία αναλογία νεοπλασματικών κυττάρων τόσο χαμηλή όσο 5%. Όλες οι μεταλλάξεις που εντοπίστηκαν με τη μέθοδο Sanger επιβεβαιώθηκαν. Σε 6 περιπτώσεις αλληλούχισης επόμενης γενιάς προσδιορίζονται εξόνιο 19 διαγραφές ή τη μετάλλαξη L858R δεν παρατηρήθηκε μετά από αλληλούχιση Sanger, επιτρέποντας στον ασθενή προς θεραπεία με αναστολείς της κινάσης της τυροσίνης. Σε μια πρόσθετη περίπτωση η μετάλλαξη R831H που σχετίζονται με την αντίσταση στην θεραπεία εντοπίστηκε σε ένα

φυσικού τύπου EGFR

όγκου μετά αλληλουχίας Sanger. αλληλουχίας επόμενη γενιά είναι ισχυρή, οικονομικά αποδοτική και σημαντικά βελτιώνει την ανίχνευση των

EGFR

μεταλλάξεις. Θα πρέπει να προωθηθεί η χρήση της για την κλινική διάγνωση των μεταλλάξεων σε δείγματα με δυσμενείς περιεχόμενο των καρκινικών κυττάρων

Παράθεση:. de Biase D, Visani Μ, Malapelle U, Simonato F, Cesari V, Bellevicine C, et al. (2013) Next-Generation αλληλουχίας του καρκίνου του πνεύμονα

EGFR

εξώνια 18-21 επιτρέπει την αποτελεσματική Μοριακή Διάγνωση των Μικρών δείγματα ρουτίνας (Κυτταρολογικό και βιοψία). PLoS ONE 8 (12): e83607. doi: 10.1371 /journal.pone.0083607

Επιμέλεια: Pan-Chyr Γιανγκ, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν, Ταϊβάν

Ελήφθη: 18 του Αυγούστου 2013? Αποδεκτές: 5 Νοέμ 2013? Δημοσιεύθηκε: 23 Δεκεμβρίου του 2013

Copyright: © 2013 de Biase et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι η μελέτη αυτή υποστηρίζεται από έναν Ιταλό επιχορήγηση κυβέρνηση MURST (Grant όχι. 20093XZC57_003) σε GT. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνωμα του πνεύμονα παρουσιάζει συχνά σε προχωρημένο στάδιο και είναι η κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με το θάνατο στις ανεπτυγμένες χώρες (https://seer.cancer.gov/statfacts/html/lungb.html#survival). Η ανακάλυψη το 2004 ότι η ενεργοποίηση σωματικές μεταλλάξεις εις το κινάσης τυροσίνης

EGFR

γονίδιο κάνει το όγκο ευαίσθητο στην τυροσίνη αναστολείς κινάσης (ΤΚΙδ) θεραπεία έχει εκπροσωπήσει μία από τις πιο σημαντικές σημαντική ανακάλυψη στον τομέα της μοριακής ογκολογίας κατά την τελευταία δεκαετία [1,2]. Τυχαιοποιημένες κλινικές μελέτες έχουν δείξει αποκρίσεις ασθενούς στο TKIs Η erlotinib (Tarceva, OSI Pharmaceutical) ή Gefitinib (Iressa, η AstraZeneca) ως θεραπεία πρώτης γραμμής σε περίπου δύο τρίτα των ασθενών με

EGFR

μεταλλαγμένα όγκων με ρυθμούς κατά πολύ ανώτερη από εκείνα που λαμβάνονται με τα συμβατικά με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία [3-9].

EGFR

μεταλλάξεις έχουν γίνει «κρίσιμη» βιοδεικτών για να επιλέξετε την κατάλληλη ασθενών για τη θεραπεία TKIs, και οι κατευθυντήριες γραμμές για τη μοριακή διάγνωση έχουν σκιαγραφηθεί από επαγγελματικές οργανώσεις τόσο στην Ευρώπη όσο και στις Ηνωμένες Πολιτείες [10, 11]. Οι περισσότεροι – 80-90% – από το

EGFR

μεταλλάξεις είτε είναι μικρό εξόνιο 19 διαγραφές ή η μετάλλαξη L858R στο εξόνιο 21, αλλά και άλλες TKIs ευαίσθητα

EGFR

μεταλλάξεις μπορεί να συμβούν στα εξόνια 12, 19 , 20, 21. Μεταλλάξεις που σχετίζονται με την αντίσταση TKIs, όπως το Τ790Μ στο εξόνιο 20, μπορεί επίσης να αναπτυχθεί σε μικρές καρκινικών κυττάρων sublclones και πρέπει να προσδιορίζονται [1,2,8,12-23].

EGFR

μεταλλαγμένα όγκοι είναι συνήθως αδενοκαρκινώματα, όπου οι μεταλλάξεις μπορούν να εντοπιστούν σε περίπου το ένα τέταρτο των περιπτώσεων, και σε ένα υψηλότερο ποσοστό των όγκων από τις ασιατικές ασθενείς.

Τα αδενοκαρκινώματα σήμερα θεωρείται ως η πιο κοινή υπότυπο καρκίνωμα του πνεύμονα, που αποτελούν περίπου το 40% όλων των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) [24] και μοριακή ανάλυση των

EGFR

εξώνια 18, 19, 20, 21 συνιστάται σε όλες αδενοκαρκίνωμα ή πνευμονικό όγκους με ένα συστατικό αδενοκαρκίνωμα [10]. Έτσι, η παθολογική αξιολόγηση ενός καρκινώματος πνεύμονα απαιτεί πλέον τόσο ακριβή υποτύπου από ιστολογικές και ανοσοϊστοχημικές μελέτες, καθώς και τον προσδιορισμό του

EGFR

κατάστασης μεταλλάξεων για την επιλογή ασθενών για θεραπεία TKIs. Αυτή η σε βάθος αξιολόγηση προφανώς απαιτεί επαρκείς ποσότητες του ιστού του όγκου της καλής ποιότητας, όπως αυτά που λαμβάνονται από εκτομές του πνεύμονα [25].

Δυστυχώς το 60% των NSCLC είναι υψηλό στάδιο τοπικά προχωρημένο και /ή ακατάλληλο για όγκους που έχουν ήδη κάνει μετάσταση σε μακρινές περιοχές από τη στιγμή που εντοπίζονται (https://seer.cancer.gov/statfacts/html/lungb.html#survival). Έτσι, σε ασθενείς με τέτοιους όγκους είναι πολύ περιορισμένη δείγματα – μικρές βιοψίες ή δείγματα κυτταρολογίας – είναι συνήθως το μόνο διαθέσιμο υλικό για ιστολογική πληκτρολόγηση και για μοριακή ανάλυση [26]. Σε αυτά τα δείγματα το θέμα της καθαρότητας του δείγματος δηλαδή το ποσοστό του αλλοιωμένου υλικού στα «μολύνουν» καλοήθεις ή μη αλλοιωμένο κυττάρων είναι συχνά κρίσιμη [27,28]. αλληλούχισης Sanger, η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος για την ανίχνευση μετάλλαξης δεν έχουν αρκετά αναλυτική ευαισθησία για τον εντοπισμό αξιόπιστα μεταλλάξεις σε δείγματα με χαμηλή αναλογία των κυττάρων του όγκου. Μπορεί να δώσει ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα, εάν το ποσοστό των νεοπλασματικών κυττάρων είναι κάτω από ένα γενικό κατώτατο όριο του 50% που αντιστοιχεί στο 25% μεταλλαγμένα αλληλόμορφα, αν υποτεθεί ότι η μετάλλαξη είναι ετερόζυγο και ότι το

EGFR

χρωμοσωμική περιοχή 7p12 είναι dysomic [29 ]. Ως εκ τούτου, οι εναλλακτικές μέθοδοι – το καθένα με τα δικά της πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματά του – έχουν προταθεί για την ανίχνευση

EGFR

μεταλλάξεις με στόχο την επίτευξη μεγαλύτερης ευαισθησίας. Πολλοί χρησιμοποιούνται σήμερα για μοριακή ανάλυση των δειγμάτων ρουτίνας [30]. Αυτές περιλαμβάνουν High Resolution τήξης (HRM) [31] μήκους τεμαχίου διασπάσεως Πολυμορφισμός (RFLP) [32], μεταλλαγμένο αλληλόμορφο-ειδική PCR [33], Peptide Nucleic Acid Locked PCR σύσφιξης (PNA-PCR) [34,35], pyrosequencying [36], και ανοσοϊστοχημεία με ειδικά αντισώματα EGFR που ανιχνεύουν την μετάλλαξη L858R και εξόνιο 19 διαγραφή [37,38]. Ορισμένες μέθοδοι μετάλλαξη συγκεκριμένο, όπως τα όπλα Scorpion (TheraScreen EGFR29 σετ μετάλλαξη από QIAGEN Μάντσεστερ [πρώην DxS], Μάντσεστερ, Αγγλία) [39] φθάσει σε πολύ υψηλή ευαισθησία (~ 1%), αλλά μην υποτιμούμε προ-σχεδιασμένες μεταλλάξεις και απαιτούν μια μάλλον σημαντική ποσότητα DNA, δεν είναι πάντα διαθέσιμη σε περιορισμένο δείγματα [40,41]

Η ανάπτυξη της αλληλουχίας επόμενης γενιάς (NGS) μεθόδους. – επίσης γνωστό ως μαζική παράλληλη αλληλουχίας, δεδομένου ότι επιτρέπουν την παράλληλη ανάλυση μιας πολύ μεγάλης αριθμός των μορίων DNA – έχει εκπροσωπήσει μία από τις πιο σημαντικές τεχνικές πρόοδοι στη μοριακή βιολογία [42]. Οι μέθοδοι αυτές έχουν γίνει διαθέσιμα από το 2005 και παράγει αξιόλογα επιτεύγματα στην ογκολογία, συμπεριλαμβανομένου του ορισμού του συνόλου του DNA αλληλουχία του κοινούς τύπους καρκίνων του ανθρώπου [43].

Αυτή είναι μια πολυκεντρική μελέτη για την αξιολόγηση της εφαρμογής της NGS στη μοριακή διάγνωση του

EGFR

μεταλλάξεις σε περιορισμένες δείγματα των NSCLC, μικρές βιοψίες και δείγματα κυτταρολογίας. Αντί της ανάλυσης μερικές περιπτώσεις για ένα μεγάλο αριθμό γονιδίων, επιλέξαμε να στοχεύουν παράλληλα αλληλούχιση στο

EGFR

μετάλλαξη «καυτά σημεία». Το επίκεντρο ήταν στο

EGFR

ανάλυση, επειδή, όπως προαναφέρθηκε,

EGFR

μεταλλάξεις συχνά χρειάζεται να προσδιορίζονται στο DNA από δείγματα που είναι τόσο προβληματική για τη μοριακή διάγνωση και την ίδια στιγμή είναι πολύ ζωτικής σημασίας για να αποφασίσει τη θεραπεία του ασθενούς. Αποτελέσματα αλληλούχισης NGS συγκρίθηκαν με αυτά της αλληλουχίας Sanger, η μέθοδος που χρησιμοποιείται σήμερα για τη συνήθη μοριακή ανάλυση στα τρία ιταλικά κέντρα εταίρος στην Μπολόνια, Πάντοβα και της Νάπολης, που συμμετείχε στη μελέτη.

Εμείς αιτιολογημένη ότι στην παρά μεγαλύτερη πολυπλοκότητα του σε σύγκριση με αλληλούχιση Sanger (ή άλλες εναλλακτικές μεθόδους) NGS προσφέρει αρκετά πλεονεκτήματα – υψηλή αναλυτική ευαισθησία, η διαλογή της πλήρους αλληλουχίας νουκλεοτιδίων της περιοχής στόχου, ημιποσοτική εκτίμηση του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου, ανάλυση πολλών δειγμάτων σε μία μόνο κίνηση (υψηλής απόδοσης) – που την καθιστούν ιδανική για τη μελέτη του καρκινώματος του πνεύμονα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η NGS μπορεί να εφαρμοστεί αποτελεσματικά για να καλύψει τις ανάγκες της συνήθους ανάλυσης του DNA, και ότι αυτό αποτελεί μια πρακτική εναλλακτική λύση σε άλλες μεθόδους που χρησιμοποιούνται σήμερα για την ανίχνευση

EGFR

μεταλλάξεις.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

από

EGFR

ανάλυση μεταλλάξεων είναι μέρος της ρουτίνας διαγνωστικό έλεγχο των ασθενών με NSCLC η ανάγκη για την έγκριση ηθική επιτροπής δεν ήταν αναγκαία για τη μελέτη αυτή, σύμφωνα με ιατρικές ηθικές κατευθυντήριες γραμμές της Azienda Unità Sanitaria Locale di Bologna, Azienda Universitaria Policlinico Università degli Studi di Napoli Federico II, Azienda Universitaria Policlinico Università degli Studi di Padova και σύμφωνα με γενική άδεια για την επεξεργασία δεδομένων προσωπικού χαρακτήρα για σκοπούς επιστημονικής έρευνας από το «The ιταλικά Αρχή Προστασίας δεδομένων «(https://www.garanteprivacy.it/web/guest/home/docweb/-/docweb-display/export/2485392). Κατά συνέπεια σε αυτές τις κατευθυντήριες γραμμές, μια ολοκληρωμένη γραπτή συγκατάθεση υπεγράφη για τις διαδικασίες (αναρρόφηση με λεπτή βελόνα, βιοψίες και χειρουργικές εκτομές) που παράγονται τα δείγματα ιστών και για διαγνωστικό έλεγχο τους. Όλες οι πληροφορίες σχετικά με το ανθρώπινο υλικό κατάφερε χρήση ανώνυμων αριθμητικούς κωδικούς. Κλινικά δεδομένα και παρακολούθηση πληροφοριών δεν χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη. Όλα τα δείγματα αντιμετωπίζονται σύμφωνα με τη δήλωση του Ελσίνκι (https://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/).

Επιλογή υπόθεση και συλλογή υλικού όγκου για μοριακή ανάλυση

Ογδόντα δείγματα NSCLC επιλέχθηκαν τυχαία από τους ασθενείς που υποβλήθηκαν σε διαγνωστικό έλεγχο στα τμήματα της Ανατομικά Παθολογία στην Bellaria Νοσοκομείο Πανεπιστημίου της Μπολόνια και Maggiore Νοσοκομείο στην Μπολόνια, και στα Πανεπιστημιακά Νοσοκομεία της Νάπολης και της Padova. Όλοι οι ασθενείς είχαν μια κλινική ένδειξη για

EGFR

δοκιμές μετάλλαξης για προχωρημένο καρκίνωμα του πνεύμονα. Καρκινικά κύτταρα για μοριακή ανάλυση ελήφθησαν από διαφάνειες κυτταρολογική εξέταση σε 66 περιπτώσεις και από φορμόλη σταθερές τομές παραφίνης ενσωματωμένα (FFPE) ιστού σε 14 δείγματα βιοψίας. Και τα δύο δείγματα κυτταρολογική εξέταση και βιοψία ήταν συνήθως σε επεξεργασία και διαγνώσεις που παρέχονται σύμφωνα με το πρότυπο κριτήρια.

Όλες οι περιπτώσεις υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για την εκχύλιση του DNA μετά από παθολογική επανεξέταση εξασφάλισε την παρουσία τουλάχιστον εκατό νεοπλασματικά κύτταρα. Η αναλογία των νεοπλασματικών κυττάρων /συνολικός αριθμός των κυττάρων (δηλ εμπλουτισμός των καρκινικών κυττάρων) εκτιμήθηκε σε όλες τις περιπτώσεις. Ο συνολικός αριθμός των νεοπλασματικών κυττάρων που υπάρχουν στο δείγμα σε επεξεργασία για μοριακή ανάλυση αξιολογήθηκε επίσης. Εκτιμήθηκε ως εξής: σε ένα δεδομένο δείγμα νεοπλασματικά κύτταρα μετρήθηκαν σε πέντε πεδία ένα τετραγωνικό χιλιοστό (1 mm

2) και ο μέσος όρος των πέντε αυτών τιμές που υπολογίστηκαν? η μέση τιμή στη συνέχεια πολλαπλασιάζεται επί της συνολικής έκτασης (σε χιλιοστά) του δείγματος – κυτταρολογική εξέταση επιχρίσματος ή τμήμα ιστολογία της βιοψίας. – που έχουν επιλεγεί για μοριακή ανάλυση

Για κυτταρολογικά δείγματα κύτταρα ξύνεται από την περιοχή που επιλέγεται για την ανάλυση μετά την αφαίρεση κάλυμμα ολίσθησης με εμβάπτιση του πλακιδίου σε ξυλόλιο. Για υλικό FFPE, έξι πάχους 10 μm τομές κόπηκαν από κάθε επιλεγμένο μπλοκ, ακολουθούμενη από μια χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης (Η &? Ε) πλακίδιο ελέγχου. Η περιοχή του όγκου σημαδεύτηκε στη διαφάνεια του ελέγχου και το υλικό του όγκου χειροκίνητα αποσυντίθενται κάτω από μικροσκοπική καθοδήγηση από τις αντίστοιχες 10 μm τομές χρησιμοποιώντας μια αποστειρωμένη λεπίδα. Είκοσι επιπλέον δείγματα DNA – προηγουμένως χαρακτηρίζεται για το

EGFR

κατάστασης μεταλλάξεων – χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η δυνατότητα αναπαραγωγής των 454 παράλληλες αλληλουχίας (βλέπε παρακάτω)

DNA

εξόρυξη

Για Sanger. DNA αλληλούχιση εκχυλίζεται σύμφωνα με τυπικές διαδικασίες, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [44-46]. Για να εξασφαλιστεί η μέγιστη απόδοση του DNA για NGS ακολουθήθηκαν δύο ξεχωριστές πρωτόκολλα για κυτταρολογική εξέταση και δείγματα βιοψίας. DNA εκχυλίζεται από δείγματα κυτταρολογίας χρησιμοποιώντας MasterPure DNA Purification Kit (Epicentre, Madison, WI, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για τα δείγματα που λαμβάνονται από βιοψίες DNA εκχυλίζεται με την Ύπατη Αγνό Κιτ PCR Template Παρασκευής (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

αλληλουχίας

Ογδόντα δείγματα εξετάστηκαν για

EGFR

(εξόνιο 18, 19, 20 και 21) με τη χρήση Sanger ή /και αλληλουχίας Next Generation. αλληλουχίας Sanger έγινε στις Μοριακής Παθολογίας εγκαταστάσεις των τμημάτων Ανατομικά Παθολογία της Bellaria Νοσοκομείο Πανεπιστημίου της Μπολόνια (33 περιπτώσεις), του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου της Νάπολης (29 περιπτώσεις) και Πάδοβα (18 περιπτώσεις). αλληλουχίας Next Generation όλων των περιπτώσεων έγινε παράλληλα με τη χρήση ενός GS-Τζούνιορ sequencer Next Generation 454 στην εγκατάσταση Μοριακής Παθολογίας του Bellaria Νοσοκομείο Πανεπιστημίου της Μπολόνια, Ανατομικά τμήμα Παθολογίας, αρχίζοντας από συνήθως επεξεργασμένο υλικό που είχε αρχικά επιλεγεί από την ενότητα Ανατομικά Παθολογία το Νοσοκομείο Bellaria και από τις υποβολή ιδρύματα στην Πάδοβα και τη Νάπολη. Οι αρνητικοί έλεγχοι και δεν έλεγχοι μήτρα DNA συμπεριλήφθηκαν σε όλα τα πειράματα.

Sanger αλληλούχισης.

αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ πολυμεράση FastStartTaq DNA (Roche Applied Science, Mannheim, Germany), με εκκίνηση από 15-50 ng του DNA. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την PCR περιγράφονται στον Πίνακα 1. προϊόντα PCR ελέγχθηκαν επί 2,5% πηκτής αγαρόζης και αμπλικόνια καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας σφαιρίδια Agencourt Ampure XP (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA). Ο προσδιορισμός αλληλουχίας διεξήχθη σύμφωνα με τυποποιημένες διαδικασίες χρησιμοποιώντας το GenomeLab DTCS Kit (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA) και ένα αυτόματο sequencer DNA CEQ2000 XL (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA) στο Νοσοκομείο Bellaria , χρησιμοποιώντας το κιτ BigDye Terminator (έκδοση 3.1? Life Technologies). και να τρέξει στον αναλυτή ABI 3730 (Life Technologies) στο Πανεπιστήμιο της Νάπολης Νοσοκομείο και στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Πάντοβα

EGFR

Exon

Sanger αλληλουχίας 5′-3 ‘

NGS 5′-3′

μια

η Μήκος (bp)

Ex18 FwCATgTCTggCACTgCTTTCCggCTgAggTgACCCTTgTC184Ex18 RvAgggACCTTACCTTATACACCgCCTgTgCCAgggACCTTACEx19 FwAgCATgTggCACCATCTCACAgCATgTggCACCATCTCAC182Ex19 RvATgAgAAAAggTgggCCTgACCCACACAgCAAAgCAgAAAEx20 FwAgCCACACTgACgTgCCTCTAgCCACACTgACgTgCCTCT208Ex20 RvCCTTATCTCCCCTCCCCgTATgCACACACCAgTTgAgCAgEx21 FwTgCAgAgCTTCTTCCCATgACCTCACAgCAgggTCTTCTC196Ex21 RvgCATgTgTTAAACAATACAgCCCACCTCCTTACTTTgCCTCCTTable 1. οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για ενίσχυση του EGFR εξώνια 18-21

αποτελούν Εκκινητές για 454 αλληλούχιση επόμενη γενιά συνδεδεμένο με μία αλληλουχία 10 νουκλεοτιδίων (MID – Πολλαπλές Identifier)., 4 νουκλεοτιδίων «διασταύρωση» και 25 νουκλεοτιδίων του » καθολική αλληλουχία «, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (δεν φαίνεται στον πίνακα). Ex, εξόνιο? Fw, προς τα εμπρός? Χειμώνα, Αντίστροφη. CSV Λήψη CSV

454:. Next Generation Sequencing

Η ανάλυση της αλληλουχίας του

EGFR

εξόνιο 18, 19, 20 και 21 πραγματοποιήθηκε με το sequencer 454 GS-Τζούνιορ Next Generation (Roche Diagnostics , Mannheim, Germany), σύμφωνα με καθιερωμένα πρωτόκολλα (https://www.454.com/).

Εν συντομία, αυτά περιλαμβάνουν τα ακόλουθα βήματα: PCR ενίσχυση της αλληλουχίας στόχου, ο καθαρισμός των τεμαχίων ενισχυμένου, γαλάκτωμα PCR, και την ανάκτηση του γαλακτώματος PCR προϊόντα που στη συνέχεια φορτώνονται στο Titanium PicoTiterPlate (Roche Diagnostics) του το 454 GS Νέων μέσο για μαζικά παράλληλη Pyrosequencing. Οι εκκινητές για το αρχικό τρέξιμο ενίσχυση τροποποιηθεί με την καθολική ακολουθίες ουρά και πολλαπλά αναγνωριστικά (MID) νουκλεοτίδια (Integrated DNA Technologies Inc, www.idtdna.com). Ένα ειδικό ζευγάρι των ακολουθιών MID προσδιορίζει με μοναδικό κάθε δείγμα (αλληλουχία στόχου).

Για

EGFR

μετάλλαξη ανάλυση ορίσαμε την ακόλουθη μορφή ροής εργασιών, χρησιμοποιώντας τους εκκινητές που φαίνονται στον Πίνακα 1 για να αναλύσει τα εξώνια 18- 19-20-21. Περίπου 10 ng γονιδιωματικού DNA ενισχύθηκαν για κάθε εξόνιο. Όλες οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν FastStart High Fidelity Taq πολυμεράσης (Roche Diagnostic, Mannheim, Germany). Σε κάθε πείραμα αλληλούχισης τους 100 έως 120 διαφορετικές αλληλουχίες στόχοι αναλύθηκαν για παράλληλη Pyrosequencing. Αυτό μας επέτρεψε να μελετήσουμε 25-30 περιπτώσεις ανά εκτέλεση, δεδομένου ότι τα τέσσερα

EGFR

εξώνια αξιολογήθηκαν σε όλους τους ασθενείς, με ένα υποθετικό αριθμό των περίπου 700 διαβάζει ανά στόχο, σύμφωνα με τις προδιαγραφές των κατασκευαστών (http: //. www.454.com/)

Θεωρώντας ότι κάθε αλληλουχίας στόχου – εξόνιο και συγκεκριμένο ασθενή – είναι μονοσήμαντα προσδιορίζονται από ένα συγκεκριμένο ζευγάρι των μεσαίων και τουλάχιστον 5 εναύσματα προς τα εμπρός και τουλάχιστον 6 αντίστροφη αστάρια με μοναδικό MIDs ήταν απαραίτητο να αναλύσει τις 30 περιπτώσεις στην ίδια επιχείρηση (ή αντίστροφα τουλάχιστον 6 εκκινητών προς τα εμπρός και τουλάχιστον 5 αντίστροφη αυτά). Χρησιμοποιήσαμε τα συστήματα του δικτύου για κάθε

EGFR

εξόνιο για να προσδιορίσει τη μοναδική σχέση μεταξύ MID ζευγάρια και ειδικές αλληλουχίες-στόχους (βλέπε Εικόνα 1). Τόσο τα εμπρός και αλληλουχίες αντίστροφης κλώνου ( «διαβάζει») εκτιμήθηκαν μετά παράλληλη ενίσχυση του DNA στόχου. Οι αλληλουχίες που ελήφθησαν αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Λογισμικό αμπλικονίου Variant Analyzer (AVA) (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Μόνο παραλλαγές νουκλεοτιδίων που παρατηρήθηκαν σε δύο κλώνους εξετάστηκαν για μεταλλακτική κλήση. Διφορούμενη κλήσεις βάση που συνδέεται με τα τμήματα του ομοπολυμερούς 4 ζευγών βάσεων ή περισσότερο δεν θεωρήθηκαν μεταλλάχθηκαν λόγω των περιορισμών της χημείας Pyrosequencing που χρησιμοποιείται από 454 NGS για ανάλυση αλληλουχίας [47,48].

Για να εξασφαλιστεί ότι σε μια δεδομένη 454 αλληλούχισης επόμενης γενιάς εκτελέσετε μια συγκεκριμένη αλληλουχία-στόχο συνδέεται με ένα μοναδικό ζευγάρι MID χρησιμοποιήσαμε συστήματα δικτύου? τα ζεύγη MID για το εξόνιο EGFR 18 απεικονίζεται? λατινικούς αριθμούς δείχνουν μεμονωμένα δείγματα ασθενών. Ex, εξόνιο? Fw, προς τα εμπρός? Χειμώνα, Αντίστροφη

Η

Αναλυτική ευαισθησία

Η αναλυτική ευαισθησία του μορφή ροής 454 αλληλούχιση μας για

EGFR

ανάλυση μεταλλάξεων δοκιμάστηκε με διαδοχική αραίωση (1:.. 1 , 1: 2, 1:10, 1: 100, 1: 1000) DNA από ένα σύνολο δειγμάτων που φιλοξενούν ένα ομόζυγο νουκλεοτιδίου πολυμορφισμού G & gt? Α στη θέση του

EGFR

αλληλουχία (c2470 G & gt 2470? Α , CAG CAA, Q787Q εξόνιο 20) σε σύνολο δειγμάτων που δεν φιλοξενούν την υποκατάσταση νουκλεοτιδίου (c2470, CAG). Κάθε ανάλυση επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο φορές.

ελάχιστη ποσότητα DNA εισόδου στο αναλυτικό όριο ευαισθησίας.

Το DNA εισόδου στο αναλυτικό όριο ευαισθησίας σειριακά αραιώνονται σε H

2O να καθορίσει η ελάχιστη ποσότητα DNA που απαιτείται για την ανίχνευση μετάλλαξης

454:.. Next Generation Sequencing επαναληψιμότητα

επαναληψιμότητα Inter-προσδιορισμού (δηλαδή η συνοχή των αποτελεσμάτων με το ίδιο πρωτόκολλο σε διαφορετικές πίστες) προσδιορίστηκε με επαναλαμβάνοντας την ανάλυση της αλληλουχίας των 20 δειγμάτων DNA που είχαν προηγουμένως χαρακτηριστεί για τους

EGFR

κατάστασης μεταλλάξεων (11 περιπτώσεις άγριου τύπου και 9

EGFR

μεταλλαγμένες – 7 με απαλοιφή στο εξόνιο 19, το ένα με η L858R και μία με τις μεταλλάξεις Τ790Μ).

Αποτελέσματα

Απόδοση του πρωτοκόλλου αλληλουχίας 454 Next Generation

Αναλυτική ευαισθησία και τον ορισμό του ορίου για μετάλλαξης κλήση.

Η αναλυτική ευαισθησία των 454 NGS εξαρτάται από τον συνολικό αριθμό των αναφέρει ότι μπορεί να ληφθεί για ένα δεδομένο δείγμα. Μετά πρωτόκολλο μορφή 454 αλληλούχιση μας, που στοχεύει σε ένα υποθετικό αριθμό περίπου 700 διαβάζει ανά amplicon, ελέγξαμε μια σειριακή (1: 1, 1: 2, 1:10, 1: 100, 1: 1000) αραίωση του DNA με το c 0.2470 G & gt? μια αντικατάσταση νουκλεοτιδίων στο πολυμορφικό χώρο του

EGFR

γονιδιακή αλληλουχία σε μια πισίνα του ανθρώπινου DNA και χωρίς την αντικατάσταση (c.2470 G)

η c.2470 G & gt 2470. ? μια αντικατάσταση ανιχνεύθηκε σταθερά κάτω σε μια αραίωση 1: 100 μόνο εάν τουλάχιστον το 10 συναινετική c.2470 G & gt? ένα νουκλεοτίδιο διαβάζει ελήφθησαν μετά από παράλληλη 454 αλληλουχίας. Αυτή η παρατήρηση απεικονίζεται στο Σχήμα 2. Με αραίωση 1: 100 του c.2470 G & gt? Ένα DNA η υποκατάσταση νουκλεοτιδίων παρατηρήθηκε όταν ο συνολικός αριθμός των διαβάζει ήταν 2.359, που αντιστοιχεί σε 23 συναινετική c.2470 G & gt? Α αλληλουχίες (Εικόνα 2D ). Δεν παρατηρήθηκε όταν ο συνολικός αριθμός των διαβάζει ήταν 750, που θα αντιστοιχούσε σε 7 συναινετική c.2470 G & gt? Α αλληλουχίες (Σχήμα 2Ε). Το c.2470 G & gt? Α υποκατάσταση επίσης δεν παρατηρήθηκε με αραίωση 1: 1000, ακόμη και όταν ο συνολικός αριθμός των αναγνώσεις που αναλύθηκαν ήταν πολύ υψηλή (μεταξύ 3000 και 4000), αλλά όχι αρκετά για να φθάσει το 10 c.2470 G & gt? Α διαβάζει ότι θα απαιτούσε συνολικά 10.000 διαβάζει ανά προϊόν ενίσχυσης (Σχήμα 2F)

AF) το πολυμορφικό c.2470 G & gt? ένα υποκατάστασης παρατηρήθηκε με τις ακόλουθες αραιώσεις του DNA που δεν φέρουν τον πολυμορφισμό:. 1: 1 ( Α), 1: 2 (Β), 1:10 (C), 1: 100 (Δ), αλλά όχι σε 1: 1000 (F). Σε αραίωση 1: 100 ο c.2470 G & gt? Παρατηρήθηκε μία υποκατάσταση όταν ο συνολικός αριθμός των αναγνώσεις επιτρέπεται να ανιχνεύει τουλάχιστον 10 διαβάζει με τη c.2470 G & gt? Μια αλλαγή (αυτό σημαίνει τουλάχιστον 1.000 σύνολο διαβάσει) (D). Η c.2470 G & gt? Ένα υποκατάστασης δεν παρατηρήθηκε όταν ο συνολικός αριθμός των διαβάζει δεν ήταν επαρκής για την ανίχνευση τουλάχιστον 10 διαβάζει με το c.2470 G & gt?. Μια αλλαγή (Ε)

Η

Με βάση την Οι παρατηρήσεις αυτές θα καθιερωθεί ως κριτήρια για τον ορισμό ενός δείγματος μεταλλαγμένου τον εντοπισμό της μετάλλαξης σε τουλάχιστον 10 διαβάζει (i)

και

σε τουλάχιστον 1% του συνολικού αριθμού των αναγνώσεις αναλύθηκαν (ii). Η απαίτηση των 10 συναινετική διαβάζει καθιστά τα κριτήρια για την μεταλλάξεων πρόσκληση αυστηρότερες για τα δείγματα που δημιουργούν ένα συνολικό αριθμό των διαβάσει χαμηλότερη από την αναμενόμενη, εξασφαλίζοντας έτσι την ιδιαιτερότητα των αποτελεσμάτων.

ελάχιστη ποσότητα DNA εισόδου στο αναλυτικό κατώφλι ευαισθησίας

το DNA ποσό που απαιτείται για την ανίχνευση c.2470 G & gt? Ένα DNA στο αναλυτικό όριο ευαισθησίας 1% (1: 100 c.2470 G & gt? Μια αραίωση του DNA). εν σειρά μειώθηκε ξεκινώντας από 10 ng , για να προσδιοριστεί η ελάχιστη DNA εισόδου αναγκαία για την ανίχνευση της υποκατάστασης νουκλεοτιδίων. Μία ελάχιστη ποσότητα 2 ng του DNA ήταν επαρκής για να ληφθεί σταθερά ενισχύσιμου DNA και την ανίχνευση της c.2470 G & gt? A υποκατάστασης. Λαμβάνοντας υπόψη ότι κάθε ανθρώπινη διπλοειδές κύτταρο περιέχει 7 pg του DNA, 2 ng ενός 1: 100 αραίωση του c.2470 G & gt? Ένα DNA σε c.2470_G DNA αντιστοιχούν στην ανίχνευση περίπου 4 μεταλλαγμένα κύτταρα σε ένα σύνολο 200 κυττάρων χωρίς το μετάλλαξη, υποθέτοντας ότι η μετάλλαξη είναι ετερόζυγο και

EGFR

dysomic.

αναπαραγωγιμότητα.

για να αξιολογηθεί η δυνατότητα αναπαραγωγής των 454 παράλληλες αλληλουχίας που χρησιμοποιήθηκαν 20 δείγματα DNA χαρακτηρίζεται προηγουμένως για τους

EGFR

κατάστασης μεταλλάξεων: 11 ήταν

EGFR

άγριου τύπου, 7 είχε ένα εξόνιο 19 διαγραφή, και από μία είχε L858R-εξόνιο 21 μετάλλαξη και μια μετάλλαξη Τ790Μ-εξόνιο 20. Κάθε δείγμα επαναλήφθηκε δύο φορές με 454 NGS και σε όλες τις περιπτώσεις επιβεβαιώθηκε η μεταλλακτική κατάσταση. Σε δείγματα που έτρεφε

EGFR

μεταλλάξεις το ποσοστό των μεταλλαγμένων διαβάζει ποικίλη κατά μέσο όρο 2,6% (μέση μεταβολή 1,45%, εύρος 0. 6% – 8,6%)

παθολογική διάγνωση και μικροσκοπική αξιολόγηση. κυτταροβρίθεια όγκου σε δείγματα καρκίνωμα μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα

Ογδόντα περιπτώσεις μελετήθηκαν. Τα παθολογικά διαγνώσεις συνοψίζονται στον Πίνακα 2. Πενήντα έξι από 80 περιπτώσεις ήταν πρωταρχικός αλλοιώσεις πνευμόνων διαγνωστεί ως αδενοκαρκίνωμα (n = 33) ή NSCLC που δεν ορίζεται διαφορετικά (NOS) (n = 23). Είκοσι δύο δείγματα ήταν από μεταστάσεις όγκου: 18 σε λεμφαδένες, 2 στον υπεζωκότα, και 2 στο οστό. Δύο δείγματα ήταν παρασκευάσματα της κυτταρολογίας από πλευριτική συλλογή.

Δείγματα βιοψίας

Διάγνωση

Αριθμός των νεοπλασματικών κυττάρων

μια

Η εμπλουτισμό του όγκου των κυττάρων

Ν = 1414 Adenocarcinoma848-42,504 (διάμεση τιμή: 11.828) 15-80% (μέσος όρος: 60,0%)

9 Δημοτικά

5Metastasis (LN 3, των οστών 2)

Κυτταρολογίας SamplesDiagnosisNumber των νεοπλασματικών κυττάρων

b

καρκινικών κυττάρων enrichmentN = 66190-730,000 (διάμεση τιμή: 11.200) 5-80% (μέσος όρος: 42,5%) 38 Adenocarcinoma952-228,150 (διάμεση τιμή: 3,956) 10-80% (μέσος όρος: 32,5%)

24Primary

12Metastasis (LN 10, Pleura 2)

2 υπεζωκοτική συλλογή

28 NSCLC190-730,000 (διάμεση τιμή: 18.000) 5-80% (μέσος όρος: 50,0%)

23Primary

5 Μετάσταση (LN 5)

Σύνολο SamplesDiagnosisNumber των νεοπλασματικών κυττάρων

ένα

,

β

καρκινικών κυττάρων enrichmentN = 80190-730,000 (διάμεση τιμή: 17.400) 5 -80% (μέσος όρος: 50,0%) 52 Adenocarcinoma848-228,150 (διάμεση τιμή: 5,000) 10-80% (μέσος όρος: 45,0%)

33 Πρωτοβάθμια

17Metastasis (LN 13, Pleura 2, των οστών 2)

2 υπεζωκοτική συλλογή

28 NSCLC190-730,000 (διάμεση τιμή: 18.000) 5-80% (μέσος όρος: 50,0%)

23Primary

5 Μετάσταση (LN 5)

Πίνακας 2. κλινικοπαθολογοανατομικών δεδομένων των δειγμάτων που αναλύθηκαν

ένα

Αριθμός των νεοπλασματικών κυττάρων εκτιμήθηκε σε όλα τα δείγματα 14 βιοψίας.?

β

Αριθμός των νεοπλασματικών κυττάρων αξιολογήθηκε σε 39 από 66 δείγματα κυτταρολογίας? ποσοτική εκτίμηση του ποσοστού των νεοπλασματικών κυττάρων διεξήχθη σε όλες τις 80 περιπτώσεις. LN, λεμφαδένα? NSCLC, μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα. CSV Λήψη CSV

Τα αποτελέσματα της αξιολόγησης των κυτταροβρίθεια όγκων συνοψίζονται στον Πίνακα 2 και απεικονίζονται στο Σχήμα 3. Η αναλογία των νεοπλασματικών κυττάρων /συνολικός αριθμός των κυττάρων (δηλ εμπλουτισμός των καρκινικών κυττάρων) αξιολογήθηκε σε όλες τις περιπτώσεις. Τα ποσοστά των νεοπλασματικών κυττάρων κυμαινόταν από 5 έως 80% (μέση τιμή 45,2%, η διάμεση 50,0%). Σε 35 δείγματα η αναλογία των νεοπλασματικών κυττάρων ήταν μικρότερο από 40%. Στις μισές από τις περιπτώσεις, η αναλογία των νεοπλασματικών κυττάρων ήταν μικρότερο από 50%. Ο συνολικός αριθμός των νεοπλασματικών κυττάρων στο δείγμα που υποβλήθηκε στο

EGFR

ανάλυση μεταλλάξεων εκτιμήθηκε σε 53 περιπτώσεις. Κυμάνθηκε μεταξύ 190 και 730.000 (μέσος όρος 68.147, μέση 17.400). Μια αριθμητική εκτίμηση του εμπλουτισμού των κυττάρων του όγκου και του συνολικού αριθμού των νεοπλασματικών κυττάρων αναλύθηκαν για

EGFR

μετάλλαξη ήταν διαθέσιμο σε όλες εκτός από δύο περιπτώσεις με αντιφατικά αποτελέσματα μεταξύ Sanger και αλληλούχηση επόμενης γενιάς (βλέπε παρακάτω).

Α) κυτταρολογικών δειγμάτων από 72 χρόνια παλιά γυναίκα με αδενοκαρκίνωμα μεταστατικό σε μεσοθωρακίου λεμφαδένα (Μάιος Grumwald Giemsa, μεγέθυνση 200Χ, ένθετο 600X)? η αναλογία των νεοπλασματικών κυττάρων στο δείγμα είναι 35%? ανάλυση του DNA ήταν άγριου τύπου μετά αλληλουχίας Sanger, αλλά NGS έδειξε δύο

EGFR

μεταλλάξεις (G721W, R831H) (περίπτωση 57 του πίνακα 5). B) βιοψία δείγματος από έναν γέρο 65 χρόνων με αδενοκαρκίνωμα μεταστατικό στα οστά (σπονδυλικού σώματος) (αιματοξυλίνη και ηωσίνη, μεγέθυνση 200Χ, ένθετο 600X)? η αναλογία των νεοπλασματικών κυττάρων στο δείγμα είναι 5%? ανάλυση του DNA ήταν άγριου τύπου μετά αλληλουχίας Sanger, αλλά NGS έδειξε την L858R

EGFR

μετάλλαξη (περίπτωση 80 του πίνακα 5).

Η

EGFR κατάστασης μεταλλάξεων

Sanger αλληλούχισης .

Τα αποτελέσματα της αλληλούχισης Sanger συνοψίζονται στους πίνακες 3, & gt? 4 και 5 και απεικονίζονται στα Σχήματα 4 και 5. Οι μεταλλάξεις εντοπίστηκαν σε 14 από 80 περιπτώσεις (17,5%) με τη χρήση προσδιορισμού αλληλουχίας Sanger. Ένα σύνολο 15 μεταλλάξεων ταυτοποιήθηκαν: 10 ήταν εξόνιο 19 διαγραφές, 3 ήταν L858R (εξόνιο 21), ένα ήταν G719A (εξόνιο 18) και μία ήταν μία μετάλλαξη Τ790Μ (εξόνιο 20). Σε μία περίπτωση υπήρχε ένα διπλό Τ790Μ και L858R μετάλλαξη. Μεταλλάξεις βρέθηκαν σε 9 από 52 (17,3%) περιπτώσεις διαγιγνώσκονται ως αδενοκαρκίνωμα και σε 5 από 28 δείγματα (17,8%), κυτταρολογική εξέταση που δεν θα μπορούσε να είναι περισσότερο υποτύπου και διαγνώστηκαν ως NSCLC. Βρέθηκαν σε 3 από 14 δείγματα βιοψίας (21,4%) και σε 11 από 66 (16,7%) δείγματα κυτταρολογία αλληλούχισης Sanger ανιχνευθεί μεταλλάξεις σε ένα ευρύ φάσμα των νεοπλασματικών αριθμού των κυττάρων. Ένα εξόνιο 19 διαγραφή (del L747-A752) αναγνωρίστηκε στο δείγμα με το χαμηλότερο αριθμό των νεοπλασματικών κυττάρων σε σειρά μας (190 νεοπλασματικά κύτταρα). Ωστόσο, σε όλες τις περιπτώσεις όπου ανιχνεύθηκαν αλληλούχισης Sanger

EGFR

μεταλλάξεις η αναλογία των νεοπλασματικών κυττάρων στο δείγμα ήταν & gt? 40% (Πίνακας 3, Σχήματα 4 και 5)

δείγματα βιοψίας

Αριθμός μεταλλαγμένου περιπτώσεις

Σύνολο μεταλλάξεις που παρατηρήθηκαν

Μεταλλάξεις που παρατηρείται σε δείγματα με & gt?. 40% των νεοπλασματικών κυττάρων

μεταλλάξεις που παρατηρήθηκαν σε δείγματα με & lt? 40% των νεοπλασματικών κυττάρων

Η

Sanger (%)

Η

NGS (%)

Sanger

NGS

Sanger

NGS

Sanger

NGS

N=14 3 (21,4)

μια

6 (42.9)

β

494

μια

8

β

01

Del Ex19

2

2

2

2

2

2

0

0

L858R

1

2

1

2

1

1

0

1

Other muts.

1

5

1

5

1

5

0

0

Κυτταρολογίας SamplesNumber μεταλλαγμένων casesTotal Μεταλλάξεις observedMutations παρατηρήθηκε σε δείγματα με & gt? το 40% των νεοπλασματικών cellsMutations παρατηρήθηκε σε δείγματα με & lt? το 40% των νεοπλασματικών κυττάρων

Sanger (%)

NGS (%)

Sanger

NGS

Sanger

NGS

Sanger

NGS

Ν = 6611 (16,7) 18 (27,3)

γ

11.221.114

γ

08

δ

Del Ex19

8

12

8

12

8

9

0

3

L858R

3

3

3

3

3

3

0

0

Others muts.

0

7

0

7

0

2

0

5

Όλα SamplesNumber μεταλλαγμένων casesTotal Μεταλλάξεις observedMutations παρατηρήθηκε σε δείγματα με & gt? το 40% των νεοπλασματικών cellsMutations παρατηρήθηκε σε δείγματα με & lt? το 40% των νεοπλασματικών κυττάρων

Sanger (%)

NGS (%)

Sanger

NGS

Sanger

NGS

Sanger

NGS

Ν = 8014 (17,5)

μια Τετάρτη 24 (30,0)

δ

153.115

μια

22

γ

09

β

Πίνακας ανάλυσης μεταλλάξεων 3. EGFR χρησιμοποιώντας αλληλουχίας Sanger και Next Generation

α

Σε μία περίπτωση, παρατηρήθηκαν διπλές μεταλλάξεις.?

β

σε δύο περιπτώσεις διπλής παρατηρήθηκαν /πολλαπλές μεταλλάξεις?

γ

σε τέσσερις περιπτώσεις διπλής παρατηρήθηκαν /πολλαπλές μεταλλάξεις?

δ

σε έξι περιπτώσεις παρατηρήθηκαν διπλά /πολλαπλές μεταλλάξεις. NGS, Next Generation Sequencing? Del ex19, διαγραφή στο εξόνιο 19? Άλλες muts, μεταλλάξεις εκτός από το εξόνιο 19 διαγραφή ή L858R. CSV CSV Κατεβάστε

Η SANGER

Η

Τύπος περιπτώσεις mutationExNum

μια

Προβλεπόμενη ρόλο για ΤΚΙ treatmentReferencesG719A181Response [1,2,15,17] εξόνιο 19 deletions1910Response [1,2,8,13,15-17] L858R213Response [1,14-16] T790M201Resistance [19-21] NGSType της mutationExNum περιπτώσεις

β

Προβλεπόμενη ρόλο για ΤΚΙ treatmentReferencesG719A181Response [1,2 , 15,17] εξόνιο 19 deletions1914Response [1,2,8,13,15-17] L858R215Response [1,14-16] P772S201Response (Υποθετικά) [18] T790M201Resistance [19-21] R831H211Resistance [22] F795S201Undefined (αναφέρθηκαν σε SCC, καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων? LN, λεμφαδένων?