Αφηρημένο

AZD6244 και MK2206 είναι στοχευμένα φάρμακα μικρών μορίων, ότι αναστέλλει ΜΕΚ και AKT αντίστοιχα. Η αποτελεσματικότητα αυτού του συνδυασμού στον καρκίνο του πνεύμονα είναι άγνωστη. προηγούμενη εργασία μας έδειξε τη σημασία της ενεργοποιημένης ΑΚΤ στην μεσολάβηση αντίσταση του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (NSCLC) προς AZD6244. Έτσι υποθέσαμε ότι διπλή αναστολή των δύο επακόλουθων οδών ΜΕΚ και ΑΚΤ θα επάγει συνεργική δράση κατά των όγκων. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την αποτελεσματικότητα του AZD6244 και MK2206 ατομικά σε ένα μεγάλο πάνελ των κυτταρικών γραμμών καρκίνου του πνεύμονα. Στη συνέχεια, κατεργάζεται 28 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα με έναν συνδυασμό AZD6244 και MK2206 σε κλινικά εφαρμόζεται φάρμακο μοριακές αναλογίες. Η θεραπεία συνδυασμού AZD6244-MK2206 είχε ως αποτέλεσμα μια συνεργική επίδραση στην αναστολή της ανάπτυξης καρκίνου του πνεύμονα σε σύγκριση με τα αποτελέσματα του ενιαίου φαρμακευτική θεραπεία μόνη της. MK2206 ενισχυμένη AZD6244 που προκαλείται Bim υπερέκφραση και την απόπτωση στα Α549 και Η157 κύτταρα. Όταν εξετάσαμε τον συνδυασμό AZD6244 και MK2206 σε αναλογίες 8:01, 4:01, 2:01, και 1:08, βρήκαμε ότι η συνεργιστική δράση της θεραπείας συνδυασμού ήταν αναλογία-εξαρτώμενη. Σε αναλογίες από 8:01, 4:01, και 2:01, ο συνδυασμός του φαρμάκου με συνέπεια αποδεικνύεται συνεργία, ενώ μειώνοντας την αναλογία να 1:08 ως αποτέλεσμα την απώλεια της συνέργειας και παρήγαγε ένα πρόσθετο ή ανταγωνιστικό αποτέλεσμα, στις περισσότερες κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, η θεραπεία συνδυασμού AZD6244-MK2206 έδειξε συνέργεια στην καταστολή της Α549 και της ανάπτυξης του όγκου ξενομοσχεύματος Η157 και αυξημένο μέσο χρόνο επιβίωσης των ζώων. Η θεραπεία συνδυασμού AZD6244-MK2206 οδήγησε σε αποτελεσματική αναστολή τόσο της ρ-ERK και π-ΑΚΤ έκφραση σε ιστό όγκου. Επιπλέον, μια σημαντική αύξηση της απόπτωσης ανιχνεύθηκε σε ιστό όγκου από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με AZD6244-MK2206 σε σύγκριση με εκείνη από το ενιαίο παράγοντας ποντίκια με αγωγή. Η μελέτη μας δείχνει ότι ο συνδυασμός του AZD6244 και MK2206 έχει μια σημαντική συνεργιστική επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου

in vitro

και

in vivo

και οδηγεί σε αυξημένη ποσοστά επιβίωσης σε ποντικούς που φέρουν εξαιρετικά επιθετική ανθρώπινους όγκους του πνεύμονα.

Παράθεση: Meng J, Dai Β, Fang Β, Bekele ΒΝ, Bornmann WG, Sun D, ​​et al. (2010) θεραπείας συνδυασμού με ΜΕΚ και Αναστολείς ΑΚΤ είναι πιο αποτελεσματική από κάθε φάρμακο Μόνος στην Ανθρώπινη μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα

In Vitro

και

In Vivo

. PLoS ONE 5 (11): e14124. doi: 10.1371 /journal.pone.0014124

Συντάκτης: Eric J. Bernhard, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7 Ιουνίου, 2010? Αποδεκτές: 5 Νοέμβρη, 2010? Δημοσιεύθηκε: 29 Νοέμ του 2010

Copyright: © 2010 Meng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται εν μέρει από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας, μέσω του Κέντρου Καρκίνου Επιχορήγηση για τη στήριξη MD Anderson του CA-016672 – Lung Πρόγραμμα, κυτταρομετρία ροής και Κυτταρικής Imaging (FCCI) Πυρήνας διευκόλυνση και διευκόλυνση Έρευνα Υποστήριξη των ζώων, ένα πρόγραμμα Specialized της ερευνητικής αριστείας (SPORE) Επιχορήγηση CA-070 907 (J. Minna και J. Roth), ένα R01 Grant CA-124 951 (Β Fang) και ο Cohen-Reinach Οικογένεια Φιλανθρωπικό Ίδρυμα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ) /Akt και RAS /RAF /ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεΐνη κινάση (ΜΕΚ) /εξωκυτταρικό σήμα ρυθμίζεται κινάσης (ERK) μονοπάτια, μεσολαβούν τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα και μοιράζονται αρκετές κατάντη μορίων, όπως FOXO3a [1], [2], και Bad [3].

Επί του παρόντος, έχουν αναπτυχθεί κασπάσης-9 ένα ευρύ φάσμα των αναστολέων κινάσης τυροσίνης μικρού-μορίου που στοχεύουν οδούς σηματοδότησης , και δύο από αυτούς τους παράγοντες επί του παρόντος υπό αξιολόγηση σε κλινικές δοκιμές. AZD6244 είναι ένας αναστολέας αλλοστερικής των /2 κινάσες ΜΕΚ1 που δεν ανταγωνίζεται με δράση δέσμευσης τριφωσφορική αδενοσίνη (ΑΤΡ) [4]. Αυτή η ένωση δεσμεύεται με ΜΕΚ1 /2 και επάγει διάφορες διαμορφωτικές αλλαγές στα μη φωσφορυλιωμένη ένζυμα ΜΕΚ1 /2, αναστέλλοντας την καταλυτική τους δράση, η οποία οδηγεί σε αναστολή της ενεργοποίησης ERK και αποκλεισμό των οδών μεταγωγής σήματος. MK2206 είναι ένας εξαιρετικά εκλεκτικός μη-ΑΤΡ ανταγωνιστικός αναστολέας αλλοστερική του ΑΚΤ με IC

50 στην περιοχή ηΜ και έχει ευρείες προκλινικές αντικαρκινική δράση. Είναι, επίσης, σε κλινικές δοκιμές πρώιμη φάση και αξιολογείται για τη θεραπεία των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα. Ωστόσο, η πιθανή αποτελεσματικότητα ενός συνδυασμού AZD6244 και MK2206 στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα είναι άγνωστη. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την επίδραση του συνδυασμού του AZD6244 και MK2206 στη θανάτωση ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών πνεύμονα και βρήκαν ότι ο συνδυασμός αυτός ήταν ιδιαίτερα συνεργιστική

in vitro

και πολύ αποτελεσματική στη θεραπεία ξενομοσχευμάτων καρκίνου του πνεύμονα. Διερευνήσαμε επίσης το μηχανισμό της συνεργείας για αυτές τις δύο ενώσεις. προκλινικά ευρήματα μας υποστηρίζουν κλινικές έρευνες της θεραπείας συνδυασμού AZD6244 και MK2206 σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

AZD6244 και MK2206, συντίθενται σε Δρ William G. εργαστήριο Bornmann στο Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer Κέντρο, διαλύθηκαν σε συγκεντρώσεις 25 mM και 20 mM, αντίστοιχα, σε διμεθυλοσουλφοξείδιο και αποθηκεύθηκε στους -80 ° C. Αντισώματα έναντι συνολικού και φωσφορυλιωμένης ERK και ΑΚΤ αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Αντισώματα έναντι Bim λήφθηκαν από την Calbiochem (San Diego, CA). Πρωτεάσης κοκτέιλ αναστολέα αντίσωμα β-ακτίνης, και σουλφοροδαμίνης Β ελήφθησαν από τη Sigma Chemical Corporation (St. Louis, ΜΟ). υλικά δοκιμασίας πρωτεΐνης αγοράσθηκαν από την Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Αδιέξοδο ™ Flurometic ΤΟΥΝΕΛ σύστημα αγοράστηκε από την Promega (Madison, WI).

καλλιέργειας κυττάρων

Όλες οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα που παρέχονται είτε από τον Δρ John V. Heymach στο MD Anderson Cancer κέντρο ή δρχ. Adi Gazdar και John D. Minna στο Πανεπιστήμιο του Τέξας Southwestern Medical Center στο Ντάλας. Οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 ή υψηλής γλυκόζης μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 μg /mL αμπικιλλίνη και 0.1 mg /mL στρεπτομυκίνη? τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2 και 95% αέρα.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Τα ανασταλτικά αποτελέσματα του AZD6244, MK2206, και ο συνδυασμός του AZD6244 και MK2206 επί της κυτταρικής ανάπτυξης προσδιορίστηκε με την χρησιμοποίηση της δοκιμασίας Β σουλφοροδαμίνης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [5]. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τετραπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Η σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων (%) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση OD

T /OD

C χ 100% (όπου OD

Τ αντιπροσωπεύει την απορρόφηση της ομάδας θεραπείας και OD

C αντιπροσωπεύει την απορρόφηση η ομάδα ελέγχου). Η μέση ανασταλτική συγκέντρωση (IC

50) τιμές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας CurveExpert 1,3 λογισμικό και παρουσιάζεται στο διάγραμμα καμπύλες δόσης-απόκρισης.

Western ανάλυση κηλίδος

ολόκληρου-κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν με πλύσιμο του κυττάρων με ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) και την υποβολή τους σε λύση με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος Laemmli συμπληρωμένο με το κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης. Αφού τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε υπερήχους για 15 s, οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν ποσοτικά χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πρωτείνης Bio-Rad. Ισοδύναμες ποσότητες της κάθε πρωτεΐνης φορτώθηκαν, διαχωρίστηκαν με 10% ή ηλεκτροφόρηση θειικού δωδεκυλ-πολυακρυλαμιδίου 12% γέλη, και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) μεμβράνες σε 80 V για 2 ώρες. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για 1 ώρα με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε PBS ρυθμιστικό που περιέχει 0.1% Tween-20 (PBST) και ανιχνεύθηκαν με αραιωμένο πρωτογενές αντίσωμα στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα PBST και ανιχνεύθηκαν με υπέρυθρο χρωστική-επισημασμένο δευτερογενή αντισώματα? οι ανοσοαντιδραστικές ζώνες οπτικοποιήθηκαν με την Οδύσσεια Imager (Li-COR Biosciences, Lincoln, ΝΕ).

κυτταρικού κύκλου και προσδιορισμούς απόπτωσης

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, πλύθηκαν δύο φορές σε ψυχρό PBS, μονιμοποιήθηκαν με παγωμένη 70% μεθανόλη, και επωάζονται στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με 25 μg /mL ιωδιούχου προπιδίου που περιέχει 30 μg /mL ριβονουκλεάση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα αναλύθηκαν σε ένα EPICS Profile ροής II κυτταρόμετρο (Coulter Corp., Hialeah, FL) χρησιμοποιώντας το λογισμικό Multicycle AV (Systems Flow Phoenix, San Diego, CA). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Μελέτες σε ζώα

Όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν μετά την έγκριση από την επιτροπή δεοντολογίας MD Anderson (11-03-09932) και πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με οι κατευθυντήριες γραμμές για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου δημοσιεύονται από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας.

Γυναίκα BALB /c γυμνά ποντίκια αγοράστηκαν από Charles River Laboratories (Wilmington, ΜΑ). Οι ποντικοί στεγάστηκαν σε στρωτή ροή ντουλάπια κάτω από ειδικές συνθήκες ελεύθερες παθογόνων και χρησιμοποιούνταν όταν ήταν ηλικίας 6 έως 8 εβδομάδων. Ένα σύνολο 3 × 10

6 Η157 ή Α549 κύτταρα εμβολιάστηκαν υποδορίως στα δεξιά ραχιαία πλευρά των γυμνών ποντικών. Όταν οι όγκοι έφθασαν έναν μέσο όγκο 0.1 εκατοστά

3, οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε ομάδες ελέγχου και θεραπείας (

n

= 5 ζώα ανά ομάδα). Για τους ποντικούς Η157 που φέρουν, οι ομάδες θεραπείας χορηγήθηκαν 20 mg /kg AZD6244, 10 mg /kg MK2206, ή συνδυασμός AZD6244-MK2206 σε 20mg /kg-10 mg /kg, τα οποία είχαν διαλυτοποιηθεί σε ένα μέσο που περιέχει 0.5% υδροξυπροπυλομεθυλοκυτταρίνη και 0,1% ρυθμιστικό πολυσορβικό. Στα ποντίκια Α549 που φέρουν, οι ομάδες θεραπείας χορηγήθηκαν 24 mg /kg AZD6244, 6 mg /kg MK2206, ή AZD6244-MK2206 συνδυασμός σε 24mg /kg-6mg /kg, τα οποία είχαν διαλυτοποιηθεί σε ένα μέσο που περιέχει 0.5% υδροξυπροπυλομεθυλοκυτταρίνη και 0,1% ρυθμιστικό πολυσορβικό. Όλα τα φάρμακα διαλύθηκαν σε 100 μΙ ρυθμιστικού του οχήματος για κάθε ποντίκι. Όλα τα φάρμακα χορηγούνται δύο φορές ημερησίως από του στόματος καθετηριασμό. Η ομάδα ελέγχου έλαβε το ρυθμιστικό φορέα μόνο. Η διάρκεια της θεραπείας ήταν 20 d. Το μέγεθος του όγκου, το οποίο μετράται με παχύμετρο, καταγράφηκε κάθε 5 d. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε, λαμβάνοντας το μήκος να είναι η μακρύτερη διάμετρος κατά μήκος του όγκου και το πλάτος να είναι το αντίστοιχο κάθετο διάμετρος, χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: μήκος Χ πλάτος

2 × 0,52. Ο ρυθμός αναστολής της ανάπτυξης του όγκου υπολογίστηκε ως 100% χ (μέγεθος όγκου

κατεργάζεται /μέγεθος όγκου

έλεγχος) κάθε ημέρα μέτρησης. ποντίκια που φέρουν όγκο συνέχισαν τη θεραπεία, όπως αναφέρεται παραπάνω, μετά από 20 d. Τα ποντίκια είχαν τη δυνατότητα να ζήσουν μέχρι και το φυσικό τους θάνατο ή θυσιάστηκαν όταν ο όγκος του όγκου τους ήταν μεγαλύτερη από 2000 mm

3. Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier χαράχθηκαν και αναλύθηκαν στατιστικά. σωματικού βάρους του ζώου μετρήθηκε και καταγράφηκε κάθε 5 d κατά τη διάρκεια της θεραπείας.

Για την φαρμακοδυναμική μελέτη, οι όγκοι δημιουργήθηκαν όπως περιγράφεται ανωτέρω και αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε μέγεθος 0.5-0.8cm

3 πριν από τη θεραπεία ξεκίνησε. Ποντικοί που φέρουν s.c. όγκοι Α549 στη συνέχεια ημερησίως χορηγούμενη όχημα, AZD6244, MK2206 ή AZD6244-MK2206 στις ίδιες συγκεντρώσεις που αναφέρθηκαν παραπάνω (

n

= 5 ζώα ανά ομάδα) για 3 ημέρες. Τέσσερις ώρες μετά την τελευταία δόση, τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία και οι όγκοι ανατμήθηκαν, μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και εγκλεισμένα σε παραφίνη για χρώση ανοσοϊστοχημείας και δοκιμασία TUNEL.

Ανοσοϊστοχημεία

Οι τομές αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και διαδοχικές αραιώσεις με αιθανόλη. Τα αντιγόνα ανακτώνται και ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,3% για 10 λεπτά. Οι τομές στη συνέχεια σε επεξεργασία με 10% κανονικό γίδινο ορό αλόγου ή για 30 λεπτά. Μετά από ολονύκτια επώαση με πρωτογενή αντισώματα, συμπεριλαμβανομένων ρ-ΑΚΤ (αραίωση 1:100) και ρ-ΕΚΚ (αραίωση 1:100), οι τομές ανιχνεύθηκαν με βιοτινυλιωμένα δευτερογενή αντισώματα και στη συνέχεια επωάστηκαν με στρεπταβιδίνη-βιοτίνης (Lab Vision, Fremont , CA). Οι τομές στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ένα διάλυμα από 3,3-διαμινοβενζιδίνης τετραϋδροχλωρική (DAB? Lab Vision, Fremont, CA), αντίθετη χρώση με αιματοξυλίνη Mayer του (Fisher Scientific, Pittsburgh, ΡΑ), αφυδατωμένα και τοποθετημένα

TUNEL. δοκιμασία

Τα τμήματα αποπαραφινοποιήθηκαν και η δοκιμασία TUNEL εκτελέσθηκε ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή ενός εμπορικά διαθέσιμου σετ (αδιέξοδο ™ Φθορομετρικής TUNEL System) από την Promega. Τα αποπτωτικά κύτταρα εμφανίζουν μια ισχυρή πυρηνική πράσινο φθορισμό που θα μπορούσε να ανιχνευθεί χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο φίλτρο φλουορεσκεϊνης. Όλα τα κύτταρα χρωματίστηκαν με DAPI εμφανίζουν ισχυρή μπλε πυρηνικό φθορισμό. Τα πλακίδια παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού με σχετική αποπτωτικά κύτταρα προσδιορίστηκε με μέτρηση TUNEL-θετικών κυττάρων σε πέντε τυχαία πεδία (σε μεγέθυνση χ 100) για κάθε δείγμα.

Στατιστική ανάλυση

Ο

in vitro

πειράματα κυτταροτοξικότητας διεξήχθησαν εις τριπλούν για κάθε χρονικό σημείο και τη συγκέντρωση. Η σημασία του

in vitro

δεδομένα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το Student

t

δοκιμής (2-tailed). Ρ-τιμές μικρότερες από 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Το γονίδιο μεταλλάξεις των κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την ηλεκτρονική βάση δεδομένων (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/CellLines/). Οι συσχετίσεις των

in vitro

απάντηση AZD6244 ή MK2206 (IC

50) και γονιδιακές μεταλλάξεις αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τεστ Wilcoxon και λογιστικής παλινδρόμησης.

Για την

in vivo

μελέτες, οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση. Wilcoxon τεστ rank ποσό και τεστ Kruskal-Wallis χρησιμοποιήθηκαν για να συγκρίνουν τις διαφορές μεταχείρισης. Spearman συντελεστής συσχέτισης χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η συσχέτιση μεταξύ δύο συνεχείς μεταβλητές. διαφορές μεταχείρισης σε σχέση με την επιβίωση αξιολογήθηκαν μέσω της δοκιμασία log-rank. Όλες οι δοκιμασίες ήταν δύο όψεων. Ρ-τιμές μικρότερες από 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Στατιστικό λογισμικό SAS 9.1.3 και S-PLUS 8.0 χρησιμοποιήθηκαν για όλες τις αναλύσεις.

Αποτελέσματα

Επιδράσεις της AZD6244 ή MK2206 Θεραπεία Single-φάρμακο για τον Καρκίνο του Πνεύμονα κυτταρικές γραμμές

Πριν την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της θεραπείας συνδυασμού, ελέγξαμε την αντιπολλαπλασιαστική επίδραση της AZD6244 και MK2206 ως θεραπείες απλού παράγοντα σε ένα πάνελ από 47 ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών πνεύμονα (Σχήμα 1). Η απόκριση σε AZD6244 ποικίλει σε μεγάλο βαθμό, από εξαιρετικά ευαίσθητο (IC

50 & lt? 0,2 μΜ) για ιδιαίτερα ανθεκτικά (IC

50 & gt? 150 μΜ), μεταξύ των κυτταρικών σειρών. Το εύρος απόκρισης δόσης MK2206 ήταν πιο συνεπής, με την IC

50 κυμαίνονται από 0,4 μΜ έως 25 μΜ. Βρήκαμε μερικά κυτταρικές γραμμές ήταν ευαίσθητα σε AZD6244 αλλά ανθεκτικά σε MK2206 (όπως Calu-6, HCC1171, και H1993), ενώ άλλες κυτταρικές γραμμές ήταν ανθεκτικά σε AZD6244 αλλά ευαίσθητα σε MK2206 (όπως Η522, H1395, και Calu-3) . Δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ της ευαισθησίας σε αυτές τις δύο ενώσεις. Συγκρίνοντας τα αποτελέσματα δόσης-απόκρισης και την online βάση δεδομένων γονιδιακής μετάλλαξης, δεν βρέθηκε συσχέτιση μεταξύ του EGFR, KRAS, BRAF ή γονιδιακές μεταλλάξεις PI3K και το IC

50 του AZD6244 ή MK2206. Επίσης, δεν τήρησε τις συσχετίσεις μεταξύ των συνολικών γονιδιακές μεταλλάξεις του EGFR /KRAS /BRAF και το IC

50 του AZD6244 ή συνολικό /γονιδιακές μεταλλάξεις PI3K EGFR και το IC

50 MK2206 (Πίνακας 1 και 2).

Τα υποδεικνυόμενα κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις είτε AZD6244 ή MK2206 για 96 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας σουλφοροδαμίνη Β και IC

50 υπολογίστηκε σύμφωνα με την καμπύλη δόσης-απόκρισης.

Η

Η

Επιπτώσεις του συνδυασμού AZD6244-MK2206 ποικίλλουν μεταξύ του καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές σειρές

από τις κυτταρικές σειρές 47, επιλέξαμε 28 για να ελέγξετε τα αποτελέσματα κατά του όγκου της θεραπείας συνδυασμού AZD6244 και MK2206. Οι κυτταρικές γραμμές επελέγησαν να αντιπροσωπεύουν ένα φάσμα ευαισθησίας σε ένα ή αμφότερα τα φάρμακα. Το IC

50 ήταν & gt? 5 μΜ τόσο για AZD6244 και MK2206 για 21 από τις κυτταρικές σειρές 28. Για τις άλλες κυτταρικές σειρές το IC

50 ήταν & lt? 5 μΜ για AZD6244 ή MK2206 ή και τα δύο. Για να προσδιοριστεί εάν τα αποτελέσματα κατά των όγκων που λαμβάνονται με διαφορετικούς συνδυασμούς AZD6244 και MK2206 ήταν συνεργιστική, υπολογίσαμε το δείκτη συνδυασμού (CI) σύμφωνα με τη μέθοδο Chou-Talalay χρησιμοποιώντας λογισμικό Calculsyn (Biosoft, Cambridge, UK). (CI & gt? 1.1, ο ανταγωνισμός? CI = 0,9-1,1, αθροιστική δράση? CI = 0,2-0,9, συνέργεια? CI & lt? 0,2 ισχυρή συνέργεια). Δεδομένου ότι το μοντέλο Chou-Talalay ζητεί κυτταροτοξικών παραγόντων που θα χρησιμοποιηθούν σε μια σταθερή αναλογία, επιλέξαμε να χρησιμοποιήσει AZD6244 και MK2206 σε μοριακή αναλογία 5:01. Μετά την επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του AZD6244 (0,024 έως 100 μΜ), MK2206 (0,005 – 20 μΜ) και AZD6244 /MK2206 (0,024 /0,005 με 100/20 μΜ), τα οποία είναι στην περιοχή από συγκεντρώσεις που επιτυγχάνονται στον ορό των ασθενών που έλαβαν προφορική AZD6244 και MK2206, ο δείκτης συνδυασμού (CI) μετρήθηκε σε κάθε κυτταρική σειρά. Σε 67% των κυτταρικών γραμμών, συμπεριλαμβανομένων των H2023, H2347, HCC827, και Η23 φαίνεται στο Σχήμα 2, η θεραπεία συνδυασμού προκάλεσε ισχυρή συνεργική δράση. Η συνδυασμένη θεραπεία παρήγαγε ένα πρόσθετο ή ανταγωνιστικό αποτέλεσμα μόνο στο 11% των κυτταρικών γραμμών (Πίνακας 3).

πνεύμονα κυτταρικές σειρές καρκίνου του υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες συγκεντρώσεις του AZD6244 (0,024 έως 100 μΜ), MK2206 (0.005- 20 μΜ) και AZD6244 /MK2206 (0,024 /0.005-100 /20 μΜ) για 96 ώρες. Οι καμπύλες δόσης-αποτελέσματος του συνδυασμού και του κάθε παράγοντα μόνου παρουσιάζονται για σύγκριση. Αντιπροσωπευτικές κυτταρικές σειρές που κατέδειξε τα ισχυρά συνεργιστικά αποτελέσματα της συνδυαστικής θεραπείας φαίνονται.

Η

Synergistic επίδραση του AZD6244-MK2006 συνδυαστική θεραπεία είναι ο λόγος που εξαρτώνται

Οι σταθερές αναλογίες των ναρκωτικών επεκτάθηκαν για 7 κυτταρικές γραμμές (H1792, Η157, Α549, H515, H1693, H1703 και H3122), που ήταν ευαίσθητα στο συνδυασμό AZD6244 και MK2206 να 8:01, 4:01, 2:01, 1:02, 1: 4, και 1:08. Βρήκαμε ότι η συνεπής συνέργεια προέκυψε όταν οι 8:01, 4:01 και 2:01 αναλογίες χρησιμοποιήθηκαν (Σχήμα 2, Πίνακας 4), ενώ μείωση της αναλογίας AZD6244:MK2206 σε 1:08 ως αποτέλεσμα την απώλεια της συνέργειας και παράγονται ένα πρόσθετο ή ανταγωνιστικό αποτέλεσμα, στις περισσότερες κυτταρικές σειρές (Πίνακας 4). Βρήκαμε επίσης ότι κάθε κυτταρική σειρά είχε τη δική του βέλτιστη αναλογία ναρκωτικά. Για παράδειγμα, H1703 έδειξε το υψηλότερο επίπεδο συνέργειας σε αναλογία AZD6244:MK2206 του 8:01? H1693 και Α549 ήταν υψηλότερη στο 4:01 (Σχήμα 3Α, αριστερά)? και Η157 ήταν υψηλότερη στο 2:01 (Σχήμα 3Α, δεξιά).

(Α) και Α549 Η157 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με AZD6244, MK2206, ή ένα συνδυασμό αυτών των δύο ενώσεων στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 48 ώρες. (Β) δείγματα πρωτεΐνης συλλέχθηκαν και ΑΚΤ, ρ-ΑΚΤ, ERK, ρ-ERK και έκφραση Bim ανιχνεύθηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. (C) Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και σταθερό, και ο κυτταρικός κύκλος μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν ποσοστά των αποπτωτικών υπο-G

1-φάσης κύτταρα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα.

Στήλες

, μέση?

μπαρ

, SD *,

P

& lt?.. 0.05, σε σύγκριση με τις θεραπείες απλού παράγοντα

Η

MK2206 ενισχύει το AZD6244 απόπτωση

για να προσδιορίσετε αν MK2206 είχε επιπτώσεις στην AZD6244 απόπτωση, εξετάσαμε την έκφραση της ΑΚΤ, π-ΑΚΤ, ERK, π-ΕΚΚ, και Bim και ποσοτικά αποπτωτικών κυττάρων μετά από θεραπεία με ατομική και συνδυασμό παραγόντων. AZD6244 είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν προς τα πάνω έκφραση Bim, ενός BH3-μόνο πρωτεΐνη, οδηγώντας σε μιτοχονδριακή ενεργοποίηση μονοπατιού και την απόπτωση, που διαμεσολαβείται από FOXO3a [6]. Επιπλέον, η ΑΚΤ μπορεί επίσης να φωσφορυλιώνει FOXO3a, και η αναστολή της ΑΚΤ θα μπορούσε να ενισχύσει την ενεργοποίηση FOXO3a από αποφωσφορυλίωση. Παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία με AZD6244 μόνη της οδήγησε σε μια σχετικά μέτρια υπερέκφραση του Bim σε 48 ώρες. Παρά το γεγονός ότι δεν είχαμε εντοπίσει μια προφανής αλλαγή στην έκφραση Bim μετά από θεραπεία με MK2206, όταν MK2206 συνδυάστηκε με AZD6244, Bim έκφραση αυξήθηκε σε επίπεδο υψηλότερο από εκείνο που προκαλείται από AZD6244 μόνο του (Σχήμα 3Β). Βρήκαμε επίσης ότι ο συνδυασμός 2-φαρμάκου οδήγησε σε περισσότερες αποπτωτικά κύτταρα, είτε από θεραπεία μονού φαρμάκου μόνο. Μόλις συνδυαστούν με MK2206, AZD6244 επαγόμενη απόπτωση αυξήθηκε από 14,4% σε 29,8% στο Α549 κυτταρική γραμμή και από 6,0% σε 27,0% κατά την Η157 κυτταρική γραμμή (

P

& lt? 0,05, Εικόνα 3C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι MK2206 ενισχυθούν αποτελεσματικά AZD6244 που προκαλείται από την ενεργοποίηση της μιτοχονδριακής απόπτωσης.

Synergistic επίδραση

in vivo

Η

Η ανταπόκριση στη θεραπεία συνδυασμού AZD6244-MK2206

in vivo

αξιολογήθηκε σε υποδόριους όγκους που δημιουργούνται με ένεση Α549 ή Η157 κύτταρα στα πλευρά του BALB /c γυμνά ποντίκια. Ποντικοί με καθιερωμένους όγκους πλευρό ίσων όγκων υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα, μια εφάπαξ χορήγηση AZD6244, μια εφάπαξ χορήγηση MK2206, ή τον συνδυασμό AZD6244-MK2206. Τόσο στην Α549 και Η157 μοντέλα ποντικών υποδόρια ξενομοσχεύματος, τα ποντίκια έλαβαν το συνδυασμό του AZD6244 και MK2206 έδειξε ένα σημαντικά μειωμένο μέσο μέγεθος όγκου (135 ± 120 και 188 ± 107 mm

3), σε σύγκριση με τα ποντίκια που έλαβαν AZD6244 μόνο (848 ± 302 και 669 ± 154 χιλιοστά

3), MK2206 μόνο (1497 ± 380 και 858 ± 125 χιλιοστά

3), ή θεραπεία ελέγχου (2666 ± 275 και 1437 ± 217 χιλιοστά

3) από την ημέρα 20 (

P

& lt? 0.01 και για τις τρεις συγκρίσεις? Σχήμα 4Α). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι η καταστολή της ΑΚΤ με MK2206 αυξημένη ευαισθησία των Α549 και Η157 κυττάρων να AZD6244

in vivo

. Επιπλέον, βρήκαμε ότι χρόνοι επιβίωσης των ζώων ήταν πλέον στις ομάδες που έλαβαν το συνδυασμό 2-φαρμάκου σε σύγκριση με τις ομάδες που έλαβαν τις ενώσεις μονοθεραπεία ή θεραπεία ελέγχου (Σχήμα 4Β). Ο μέσος χρόνος επιβίωσης των ζώων που έλαβαν θεραπεία με τον συνδυασμό AZD6244-MK2206 αυξήθηκε σημαντικά (

P

& lt? 0,01, Σχήμα 4Β). Στο μοντέλο ξενομοσχεύματος Α549, τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με AZD6244-MK2206 είχαν διάμεσο χρόνο επιβίωσης των 50 d, ενώ εκείνοι που έλαβαν θεραπεία με AZD6244 μόνο, MK2206 μόνο, και το όχημα ελέγχου είχαν μέσους χρόνους επιβίωσης των 32 d, 23 d και 17 d, αντίστοιχα (

P

& lt? 0.01 και για τις τρεις συγκρίσεις). Είχαμε παρόμοια αποτελέσματα στο μοντέλο ξενομοσχεύματος Η157: οι μέσοι χρόνοι επιβίωσης για τη θεραπεία συνδυασμού αξιοσημείωτα αυξάνεται σε 45 d ενώ για AZD6244-alone, MK2206-alone, και θεραπείες ελέγχου ήταν 33,5 d, 33 d, και 26,5 d, αντίστοιχα (

σ

& lt? 0.01 και για τις τρεις συγκρίσεις). Επιπλέον, το 20% των ποντικών που φέρουν όγκο Η157 και το 40% των Α549 ποντικούς που φέρουν όγκο που έλαβαν τη θεραπεία συνδυασμού επέζησε τελευταία 55 d και δεν είχαν όγκους στην τελευταία παρατήρηση. Επιπλέον, δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές στο βάρος σώματος ποντικού βρέθηκαν μεταξύ των τεσσάρων ομάδων μετά την 20 d θεραπεία, και δεν υπήρχαν προφανείς τοξικότητες από το συνδυασμό του φαρμάκου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο συνδυασμός του AZD6244 και MK2206 έχει μια συνεργιστική θεραπευτική επίδραση επί της ανάπτυξης καρκινικών κυττάρων ανθρώπινου πνεύμονα σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών NSCLC

in vitro

, και σε Α549 και κυτταρικές σειρές Η157

σε vivo

.

Πλευρά όγκοι ιδρύθηκε το γυμνό ποντίκια και αγωγή με όχημα, AZD6244, MK2206, ή συνδυασμό AZD6244-MK2206 θεραπεία από το στόμα δύο φορές την ημέρα σε ενδεικνυόμενες δόσεις. (Α) Οι όγκοι των όγκων. Συνολικά διαφορές μεταξύ των θεραπειών ήταν στατιστικά σημαντική (

P

& lt? 0,001? Kruskal-Wallis Test). Παρατηρήσαμε στατιστικά σημαντική στιγμή-με-τη θεραπεία επιδράσεις κατά τη σύγκριση Ελέγχου vs Α (

P

& lt? 0,05)? Ελέγχου vs M (

P

& lt? 0,05)? Ελέγχου vs A + M (

P

& lt? 0,05)? Ένα vs M (

P

= 0,05)? Ένα vs A + M (

P

= 0,05) και Μ vs Α + Μ (

P

& lt? 0,05) για Α549? αποτελέσματα ήταν παρόμοια για Η157 εκτός του ότι ένα vs. M δεν ήταν στατιστικά σημαντική. φορές (Β) επιβίωση. Συνολικά διαφορές μεταξύ των θεραπειών ήταν στατιστικά σημαντική (

P

& lt? 0,001? Log-RankTest).

Η

ρύθμιση στόχου στο μοντέλο ποντικού Α549 ξενομοσχεύματος

Στη φαρμακοδυναμική μελέτη , τέσσερις ώρες μετά την τελική δόση την ημέρα 3, τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία και οι ιστοί όγκοι αφαιρέθηκαν και αναλύθηκαν για ρ-ERK και ρ-ΑΚΤ με ανοσοϊστοχημική χρώση. Η αναστολή της έκφρασης ρ-ERK παρατηρήθηκε σε όγκους ποντικών που έλαβαν μόνο AZD6244 ή του συνδυασμού AZD6244-MK2206. Η αναστολή της ρ-ΑΚΤ παρατηρήθηκε σε όγκους των ποντικών που έλαβαν MK2206 μόνη ή συνδυασμό AZD6244-MK2206 (Σχήμα 5Α). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η Ρ-ERK και ρ-ΑΚΤ ήταν αποτελεσματικά ανέστειλε με AZD6244 και MK2206

in vivo

. Ο συνδυασμός του AZD6244 και MK2206 θα μπορούσε επίσης να αναστείλουν τους στόχους αποτελεσματικά. Η δοκιμασία TUNEL έδειξε ότι MK2206 ενίσχυσε σημαντικά AZD6244 επαγόμενη απόπτωση (

P

& lt? 0,05). Από 2,6% έως 11,2% σε ιστό ξενομοσχεύματος όγκου (Σχήμα 5Β)

Τα μοντέλα xerograft ποντικού ήταν αγωγή με έκδοχο ελέγχου, AZD6244 (24 mg /kg), MK2206 (6 mg /kg) ή AZD6244-MK2206 (24 mg /kg-6 mg /kg) συνδυασμού για 3 ημέρες. Τέσσερις ώρες μετά την τελευταία δόση, οι όγκοι αποκόπηκαν, σταθεροποιήθηκαν και εγκλεισμένα σε παραφίνη. (Α) Οι τομές αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας ρ-ERK και π-ΑΚΤ αντισώματα και οι αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες σε τομές όγκων απεικονίζεται. (Β) Τα τμήματα υποβλήθηκαν σε χρώση TUNEL και DAPI. Οι σχετικές αποπτωτικά κύτταρα προσδιορίστηκε με μέτρηση TUNEL θετικά κύτταρα σε πέντε τυχαία πεδία (στα 100 χ μεγέθυνση) για κάθε δείγμα.

Στήλες

, μέση?

μπαρ

, SD. *,

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με τις θεραπείες και μόνο παράγοντα. Οι αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες σε τομές όγκων εμφανίζεται.

Η

Συζήτηση

Στη μελέτη αυτή αναφέρει ότι η θεραπεία συνδυασμού του ΜΕΚ αναστολέα AZD6244 και αναστολέα της ΑΚΤ MK2206 μπορεί να προκαλέσει δραματική συνεργιστική αναστολή της ανάπτυξης του όγκου

in vitro

και

in vivo

. Προηγουμένως μελέτες έχουν παρατηρήσει ότι η αντίσταση να AZD6244 σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα προκαλείται από την ενεργοποίηση ΑΚΤ [5], [7]. Ο βρόχος ανάδρασης του RAS /RAF /MEK /ERK και μονοπάτια /ΑΚΤ ΡΙ3Κ μας ώθησε να υποθέτουν ότι η καταστολή αυτών των δύο οδών μπορεί να ξεπεράσει την αντίσταση στη AZD6244 και δρουν συνεργιστικά για να αναστέλλουν την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι η θεραπεία μονού παράγοντα είτε με AZD6244 ή MK2206 έχει μέτρια ανασταλτική δράση σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. Επειδή ορισμένες γονιδιακές μεταλλάξεις μπορεί να εμπλέκεται σε απάντηση σε αυτούς τους παράγοντες, ελέγξαμε επίσης την κατάστασης μεταλλάξεων του BRAF, KRAS, EGFR και PI3K σε αυτές τις κυτταρικές σειρές. Η μετάλλαξη BRAF V600E έχει αναφερθεί ότι συσχετίζεται με την ευαισθησία σε αναστολείς ΜΕΚ [8], [9] και έχει χρησιμοποιηθεί ως ένα σημαντικό κριτήριο για την πρόσληψη των ασθενών σε μια κλινική δοκιμή των αναστολέων ΜΕΚ σε ασθενείς με μελάνωμα. KRAS, BRAF /KRAS, και ΕΚΒ /KRAS μετάλλαξη (μεταλλάξεις) συσχετίζονται με την ευαισθησία σε αναστολείς ΜΕΚ στον καρκίνο των ωοθηκών [10], ορθοκολικό καρκίνο [11], και NSCLC [12], αντίστοιχα. Ωστόσο, δεν είχαμε εντοπίσει μια προφανής συσχέτιση μεταξύ μεταλλάξεων έκφραση του EGFR, BRAF, PI3KI, ή KRAS και ευαισθησία σε AZD6244 ή MK2206 στις γραμμές του καρκίνου του πνεύμονα που δοκιμάσαμε. Αυτό μπορεί να οφείλεται στις διαφορετικές επιδράσεις των μεταλλάξεων σε συγκεκριμένες ιστολογική τύπους καρκίνου ή στην κυτταρική σειρά ειδικών οδών. Για παράδειγμα, για τον καρκίνο του μαστού και του πνεύμονα, η έκφραση γονιδίου που σχετίζεται με διαφορική ευαισθησία σε AZD6244 περιλαμβάνονται πολλά γονίδια που δεν ήταν σε κοινή και για τα δύο ιστολογίες [13]. Μια άλλη πιθανή εξήγηση για την ασυμφωνία των αποτελεσμάτων μας και προηγούμενες μελέτες μπορεί να οφείλεται σε διάφορες συχνότητες των γονιδιακών μεταλλάξεων σε διάφορους τύπους καρκίνου. Για παράδειγμα, BRAF είναι μεταλλαγμένο σε πολλούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένου του κακοήθους μελανώματος (27-70%), ο καρκίνος του θυρεοειδούς θηλώδες (36 – 53%), ο καρκίνος των ωοθηκών (περίπου 30%), και ορθοκολικό καρκίνο (5-22%). Ωστόσο, οι μεταλλάξεις BRAF ανιχνευθεί μόνο σε 1-2% των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα. Θα ήταν δύσκολο να δείξει στατιστικά σημαντικές σχέσεις με τέτοια γεγονότα χαμηλής συχνότητας.

Η έρευνά μας έδειξε ότι η διπλή παράγων AZD6244-MK2206 θεραπεία συνδυασμού έδειξε μια συνεργική επίδραση επί της ανάπτυξης όγκου σε σχέση με τον κάθε παράγοντα ξεχωριστά. Ως θεραπεία μονού παράγοντα, AZD6244 ήταν αναποτελεσματική εναντίον ορισμένων καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικών σειρών (όπως Calu-1, H460 και H661). Ωστόσο, όταν συνδυάζεται με MK2206, αυτές οι ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές ήταν ευαίσθητα στην θεραπεία συνδυασμού. Σύμφωνα με τις μεθόδους Chou-Talalay [14], χρησιμοποιήσαμε ένα σταθερό λόγο φαρμάκου προς δοκιμή για μια συνεργιστική δράση. Σε κλινικές μελέτες, η θεραπεία συνδυασμού θα δοθεί σε ασθενείς σε επανάληψη 28-d κύκλους. Η προγραμματισμένη δόση έναρξης του MK2206 είναι 45 mg /kg κάθε δεύτερη ημέρα (η υψηλότερη φορά κάθε δεύτερη ημέρα δόση MK2206 θα είναι 45 mg /kg) ή 90 mg /kg μία φορά την εβδομάδα και η αύξηση σε ποσοστό ως 250 mg /kg μία φορά την εβδομάδα ? η σχεδιαζόμενη δόση έναρξης του AZD6244 είναι 75 mg /kg δύο φορές την ημέρα (https://clinicaltrials.gov/). Έχουμε επιλέξει μια αναλογία φάρμακο 5:01 AZD6244:MK2206 που είναι σε αυτό το εύρος για την αρχική μας μελέτη

in vitro

. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι AZD6244:MK2206 μπορούν να προκαλέσουν συνεργιστικά αποτελέσματα μεταξύ των κυτταρικών σειρών 89%. Για να αποκτήσετε μια πιο ποσοτική ανάλυση, επεκτείναμε τις αναλογίες των ναρκωτικών να προσδιορίσει το πιο αποτελεσματικό εύρος και το βέλτιστο λόγο συνεργίας. Βρήκαμε ότι αυτά τα δύο φάρμακα παρουσίασαν σταθερά συνεργικά αποτελέσματα σε 8:01, 4:01 και 2:01 αναλογίες AZD6244 να MK2206, ενώ μειώνεται το ποσοστό αυτό σε 1:08 ως αποτέλεσμα την απώλεια της συνέργειας και την παρουσία μόνο αθροιστικών επιδράσεων ή ακόμη και ανταγωνισμός στις περισσότερες κυτταρικές σειρές. Στη συνέχεια επέλεξε δύο KRAS μεταλλαγμένο κυτταρικές σειρές, Α549 και Η157, να διερευνήσει περαιτέρω την επίδραση του AZD6244-MK2206 συνδυασμό

in vivo

. Η ανάπτυξη του όγκου αναστέλλεται σημαντικά με θεραπεία συνδυασμού σε σύγκριση με τη θεραπεία μόνο παράγοντα. Οι φαρμακοδυναμικές επιδράσεις στην xerografts Α549 έδειξε ότι το επίπεδο έκφρασης του π-ERK και p-ΑΚΤ κατεστάλησαν επαρκώς με AZD6244 και MK2206 αντίστοιχα. Ο συνδυασμός του AZD6244 και MK2206 ανέστειλε τόσο π-ERK και ρ-ΑΚΤ αποτελεσματικά. Η δοκιμασία TUNEL έδειξε ότι ο συνδυασμός θεραπείας που προκαλείται από πολύ πιο καρκινικών κυττάρων απόπτωση των μεμονωμένων φαρμάκων. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι AZD6244 και MK2206 επάγει συνεργικά απόπτωση με διπλή αναστολή της ERK και ΑΚΤ φωσφορυλίωση.

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι αν οι συνδυασμοί αντικαρκινικού φαρμάκου αλληλεπιδρούν συνεργικά ή ανταγωνιστικά μπορεί να εξαρτάται από την αναλογία των συνδυασμένων παραγόντων [15 ], [16]. Η αποτυχία να ελέγχει αναλογίες φαρμάκου λόγω της μη συντονισμένων μηχανισμών ή φαρμακοκινητική θα μπορούσε συνεπώς να οδηγήσει σε αντίσταση στο φάρμακο εάν τα καρκινικά κύτταρα που εκτίθενται σε ανταγωνιστικών λόγων φαρμάκου. Είναι πιθανό ότι οι ακριβείς αναλογίες που περιγράφονται

in vitro

δεν μπορεί να ληφθεί στον όγκο ενός ασθενούς, λόγω της διαφορικής κατανομής και του μεταβολισμού αυτών των δύο ενώσεων. Ωστόσο, βρήκαμε ότι οι συνεργιστικές επιδράσεις παρατηρήθηκαν πάνω από ένα ευρύ φάσμα των συγκεντρώσεων του φαρμάκου καθιστά πιθανό ότι ένα θεραπευτικό αποτέλεσμα θα επιτευχθεί.

Σε μηχανιστικές μας και

in vivo

μελέτες, χρησιμοποιήσαμε Α549 και κυτταρικές σειρές Η157 επειδή και οι δύο από αυτούς λιμάνι KRAS μεταλλάξεις. Οι μεταλλάξεις στο γονίδιο KRAS έχουν βρεθεί σε 20% έως 30% των καρκίνων του πνεύμονα και πιστεύεται ότι παίζουν βασικό ρόλο σε αυτή την κακοήθεια [17].