Αφηρημένο

Ιστορικό

Έχει θεωρηθεί ότι η μέθοδοι ανίχνευσης κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (ΚΜΑ) με βάση την επιθηλιακών μορίου προσκόλλησης κυττάρων (EpCAM) υποτιμούν τον αριθμό των ΚΜΑ και μπορεί να χάσετε ένα μεταστατικό υποπληθυσμό με καρκίνο βλαστικών κυττάρων (CSC) ιδιότητες. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε EpCAM-θετικών και -αρνητικοί κέντρα θεραπείας χολέρας σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) ασθενείς που βρίσκονται σε διαφορετικά στάδια, αξιολόγησε την κλινική αξία αυτών των ΚΜΑ και εξερεύνησε την ιδιότητά τους κατά το επόμενο μοντέλο CSC.

Μέθοδοι

ΚΜΑ εμπλουτίστηκαν από την εξάντληση των λευκοκυττάρων με δι-αντισώματα χρησιμοποιώντας ένα μαγνητικό τεχνικής διαχωρισμού σφαιριδίων και, στη συνέχεια, προσδιορίζονται από την έκφραση του EpCAM και κυτοκερατίνη 7 και 8 χρησιμοποιώντας πολλαπλών παραμέτρων κυτταρομετρίας ροής. Έχουμε καθορίζεται η κατανομή των CTCs έχουν ταξινομηθεί από την έκφραση της EpCAM σε 46 ασθενείς με NSCLC με τα στάδια I έως IV, αξιολόγησε την διαγνωστική αξία αυτών των CTCs από διαμήκη παρακολούθηση σε ασθενείς δείκτη 4 κατά τη διάρκεια της επικουρικής θεραπείας και χαρακτήρισε την βλαστική ικανότητα αυτών των CTCs από την έκφραση CXCR4 και CD133 σε 10 ασθενείς.

Αποτελέσματα

EpCAM-αρνητικό (Ε-) ΚΜΑ εντοπίστηκαν να είναι σημαντικά υψηλότερο από ό, τι EpCAM-θετικά (e +) κέντρα θεραπείας χολέρας στο στάδιο IV (

p

= 0,003). Οι ασθενείς με το ποσοστό του E-ΚΜΑ περισσότερο από το 95% (

r

& gt? 95%) ανιχνεύθηκαν να αυξηθεί σημαντικά από 13,3% το στάδιο Ι-ΙΙ σε 61,1% το στάδιο IV (

p

= 0,006). Η ανάλυση Kaplan-Meier έδειξε ότι οι ασθενείς με

r

& gt? 95% είχαν σημαντικά μικρότερο χρόνο επιβίωσης από ό, τι εκείνοι με

r

≤ 0.95 (

σ

= 0,041). Διαμήκης παρακολούθηση των CTCs έδειξε ότι οι ασθενείς με υψηλό ποσοστό της Ε-CTCs στο αίμα δεν ήταν αποκριτικά είτε χημειοθεραπεία ή στοχευμένη θεραπεία. Περαιτέρω χαρακτηρισμός των CTCs αποκάλυψε ότι ένα στέλεχος που μοιάζει με υποπληθυσμό CXCR4 + CD133 ΚΜΑ + εντοπίστηκαν να είναι σημαντικά πιο διαδεδομένη στο E-CTCs από εκείνο στο Ε + ΚΜΑ (

σ

= 0,005).

Συμπεράσματα

Ο εμπλουτισμός του ΚΜΑ από την εξάντληση των λευκοκυττάρων με bi-αντισωμάτων είναι μια πολύτιμη μέθοδος για την εκτίμηση του αριθμού των ΚΜΑ, η οποία μπορεί να εφαρμοστεί δυνητικά στην πρόβλεψη της πρόγνωσης, παρακολούθησης το θεραπευτικό αποτέλεσμα των ασθενών με NSCLC και περαιτέρω ανάλυση της βιολογίας των CTCs

Παράθεση:. Yin J, Wang Υ, Γιν H, Chen W, Jin G, Ma H, et al. (2015) Κυκλοφορούν Tumor Cells Εμπλουτισμένο με την εξάντληση των λευκοκυττάρων με Bi-αντισωμάτων σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα: Πιθανή Κλινική Εφαρμογή. PLoS ONE 10 (8): e0137076. doi: 10.1371 /journal.pone.0137076

Επιμέλεια: Huei-Wen Chen, Πανεπιστημιακό Ινστιτούτο Τοξικολογίας, Ταϊβάν

Ελήφθη: 24η του Ιανουαρίου 2015? Αποδεκτές: 12 Αύγ, 2015? Δημοσιεύθηκε: 28 Αυγούστου 2015

Copyright: © 2015 Yin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. το έργο υποστηρίζεται από Jiangsu Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών (BK20141435)? Η εισαγωγή του ταλέντου του Ιδρύματος (2011RC11)? Ιατρικό Ίδρυμα Επιστήμης και Τεχνολογίας Ανάπτυξης, Nanjing Υπουργείο Υγείας (YKK13088)? Το Πρόγραμμα Κλειδί του Εθνικού Ιδρύματος Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81230067)? Εθνικό Key Βασική Έρευνα Πρόγραμμα επιχορήγησης (2013CB911400)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου

πνεύμονα είναι η κύρια αιτία του καρκίνου. -σχετικών θάνατος [1], και περίπου το 85% των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα είναι μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Παρά το γεγονός ότι η συστηματική θεραπεία έχει βελτιωθεί, το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών είναι μόνο 10-20% [2]. Ο πρωταρχικός λόγος για την χαμηλό ποσοστό επιβίωσης είναι μακρινή μετάσταση των καρκινικών κυττάρων. Στον μεταστατικό καταρράκτη, έχουν κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (ΚΜΑ) θεωρήθηκαν ως βασικοί συμμετέχοντες στο σχηματισμό του απομακρυσμένων μεταστάσεων [3]. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι ΚΜΑ που εκφράζουν μόριο κυτταρικής προσκόλλησης επιθηλιακών (EpCAM) είναι ανιχνεύσιμα σε ασθενείς με NSCLC σταδίου IV και αποτελούν μια νέα προγνωστικός παράγοντας για τη νόσο αυτή [4]. Ωστόσο, έχει προταθεί ότι οι μέθοδοι με βάση την έκφραση του EpCAM υποτιμούν τον αριθμό των ΚΜΑ και μπορεί να χάσει ένα μεταστατικό υποπληθυσμό CTCs με καρκίνο βλαστοκυττάρων (CSC) ιδιότητες [5, 6]. Μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι οι ΚΜΑ ανιχνεύονται 2 φορές πιο αποτελεσματικά από ISET (απομόνωση με μέγεθος των επιθηλιακών κυττάρων του όγκου) από εκείνα με CellSearch, και ότι ένα υποπληθυσμό ΚΜΑ, η οποία δεν εκφράζουν EpCAM (δηλαδή, Ε-CTCs), μπορεί να είναι ανιχνεύεται στο αίμα των ασθενών με NSCLC [7]. Μια άλλη μελέτη έδειξε επίσης ότι η απαρίθμηση αυτών των κυττάρων είναι πολύ υψηλότερη από εκείνη των ΚΜΑ συλλαμβάνεται από CellSearch [8]. Μέχρι τώρα, η κλινική αξία και τη βιολογία αυτών των E-ΚΜΑ υπήρξε ασαφής, και μια πρόσφατη δημοσίευση έδειξε ότι οι μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να περιλαμβάνουν την ανίχνευση των E-ΚΜΑ [9].

ΚΜΑ που υποβάλλονται σε επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) έχουν θεωρηθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό των νεοπλασμάτων [5]. EMT μπορεί να παράγει κύτταρα με ιδιότητες βλαστικών κυττάρων [10]. Κατά τη διάρκεια της ΕΜΤ, η έκφραση του EpCAM στα κύτταρα όγκου θα ρυθμισμένα προς τα κάτω. Μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι ο άξονας /CXCR4 SDF-1 παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη διαμεσολάβηση κυτταρική μετανάστευση και την επιβίωση μετά από ένα ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT [11]. Ωστόσο, παραμένει ασαφές εάν αυτά (ή οποιαδήποτε) ΚΜΑ με κάτω-ρυθμίζονται EpCAM έχουν αυξημένο μεταστατικό δυναμικό σπορά ή αυξημένη αντοχή σε συστηματική θεραπεία, και, όπως δήλωσε πρόσφατα, μια μεγαλύτερη προγνωστική αξία [12]. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι ΚΜΑ CXCR4 που εκφράζουν ανιχνεύθηκαν στο αίμα των ασθενών με συμπαγείς όγκους [13]. Μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι η αυξητική ρύθμιση του CXCR4 είναι λειτουργικά κρίσιμη για τη διατήρηση της βλαστική ικανότητα σε NSCLC κύτταρα ανθεκτικά σε φάρμακο [14]. Ως εκ τούτου, είναι αναγκαίο να χαρακτηριστεί η βλαστική ικανότητα της Ε-CTCs.

CTCs είναι σπάνιες στο αίμα καρκινοπαθών ασθενών, και οι μελέτες σχετικά με την βιολογία του ΚΜΑ περιορίζεται από τη χαμηλή συγκέντρωση και την απόδοση του ΚΜΑ [9] . Αν και προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η τεχνική ISET είναι πιο αποτελεσματικό στη σύλληψη E-CTCs σε NSCLC [7, 8], μία πρόσφατη μελέτη ανέφερε ότι πνεύμονα όγκοι αναπτύσσονται ταχύτερα και να ρίξει ένα σημαντικό αριθμό θανατηφόρων μεταστατικών κυττάρων σε μικρά μεγέθη [15]. Συνεπώς, μια «αμερόληπτη» μέθοδος απομόνωσης του CTCs είναι επιθυμητή. Έχουμε αναπτύξει προηγουμένως μια αρνητική εμπλουτισμό ΚΜΑ [16], η οποία βασίζεται στην εξάντληση των λευκοκυττάρων χρησιμοποιώντας ένα μαγνητικό τεχνικής διαχωρισμού σφαιριδίων και την επακόλουθη ανίχνευση με πολλαπλών παραμέτρων κυτταρομετρίας ροής. Στην παρούσα μελέτη, βελτιώσαμε την τεχνική αυτή με τη μείωση των λευκοκυττάρων με bi-αντισώματα για τη βελτίωση της καθαρότητας της ΚΜΑ για το χαρακτηρισμό τους και την μελλοντική εφαρμογή στη μοριακή ανάλυση. Με τη μέθοδο αυτή, θα καθορίσει την κατανομή των CTCs έχουν ταξινομηθεί από την έκφραση της EpCAM σε 46 ασθενείς με NSCLC με τα στάδια από Ι έως IV, ερευνώνται διαγνωστική αξία τους σε συστηματική θεραπεία με διαμήκη παρακολούθηση αυτών των CTCs σε ασθενείς δείκτη 4, αξιολόγησε την προγνωστική αξία της αυτά τα κέντρα θεραπείας χολέρας και χαρακτήρισε την βλαστική ικανότητα αυτών των CTCs μετρώντας την έκφραση των CXCR4 και CD133.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και υγιείς εθελοντές πριν από τη συμμετοχή στη μελέτη. συλλογή και ανάλυση δειγμάτων αίματος εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας της Nanjing Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Ο σχεδιασμός και η εκτέλεση της παρούσας μελέτης αφορούν τα ανθρώπινα υποκείμενα που περιγράφεται με σαφήνεια σε ένα ερευνητικό πρωτόκολλο.

Πληθυσμός μελέτης και προετοιμασίας των δειγμάτων αίματος

δείγματα περιφερικού αίματος από 46 ασθενείς με ΜΜΚΠ συλλέχθηκαν από τον Ιανουάριο έως Νοεμβρίου 2013 στο Nanjing Στήθος νοσοκομείο Jiangsu και του καρκίνου του νοσοκομείου. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών συνοψίζονται στον πίνακα 1. Ελήφθη αίμα μετά την απόρριψη του πρώτου 2 mL ώστε να αποφευχθεί τυχόν μόλυνση των κυττάρων του δέρματος από φλεβοπαρακέντηση, και στη συνέχεια σε επεξεργασία μέσα σε 4 ώρες μετά τη συλλογή. Τα δείγματα αίματος από ασθενείς δείκτη 4 συλλέχθηκαν επίσης στο τέλος της κάθε περιόδου της χημειοθεραπείας ή στοχευμένη θεραπεία αμέσως, και αξιολογήθηκαν τα θεραπευτικά αποτελέσματα των ασθενών σύμφωνα με Κριτηρίων Αξιολόγησης της Ανταπόκρισης σε συμπαγείς όγκους.

Η

CTC εμπλουτισμός

Οι κυτταρικές λύσεις από δείγματα αίματος παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. ΚΜΑ στη συνέχεια εμπλουτίζεται από την εξάντληση των λευκοκυττάρων με bi-αντισώματα σύμφωνα με τα ακόλουθα βήματα: πρώτον, με βάση Leukocyte κοινό αντιγόνο CD45, CD45 ανθρώπινο ολικό αίμα εξάντληση Kit (EasySep, Stem Cells Technologies, Inc., Vancouver, BC, Canada) χρησιμοποιήθηκε ως το πρώτο βήμα για την απομάκρυνση λευκοκυττάρων? δευτερόλεπτο, με βάση αντιγόνο επιφανείας λευκοκυττάρου CD53, τα κύτταρα χρώστηκαν με αντι-ανθρώπινο CD53 αντίσωμα ΡΕ ποντικού (BD Bioscience, USA), πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια περαιτέρω εξαντλούνται με Kit ΡΕ θετικής επιλογής (EasySep, Stem Cells Technologies, Inc., Vancouver , BC, Canada) ως το δεύτερο βήμα για τα λευκοκύτταρα. Η διαδικασία διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών με μικρές τροποποιήσεις.

Η κυτταρομετρία ροής

Μετά τον εμπλουτισμό, την ΚΜΑ διαιρέθηκαν εξίσου σε 2 σωλήνες και χρωματίστηκαν με ανθρώπινο αντι-EpCAM, αντι-CK7 /8 , αντι-CD45 (BD Bioscience, USA) στον πρώτο σωλήνα και αντίστοιχα αντισώματα ελέγχου ισοτύπου στο δεύτερο σωλήνα. Για να διερευνήσουν τη βιολογία των CTCs σε βλαστική ικανότητα, τα εμπλουτισμένα κύτταρα μαζί χρωματίστηκαν με ανθρώπινο αντι-CXCR4 (BD Bioscience, USA) και αντι-CD133 (Miltenyi Biotec GmbH, Germany) (στον πρώτο σωλήνα) και τα αντισώματα ελέγχου αντίστοιχα ισοτύπου ( στο δεύτερο σωληνάριο) σε 10 δείγματα. Η τελική συγκέντρωση του κάθε αντισώματος ήταν 10 μg /mL. Ένα σύστημα FACS AriaIII (BD Biosciences) διεξήχθη για να προσδιοριστεί η έκφραση όλων των δεικτών, και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FlowJo 7.2.5 λογισμικού (Tree Star, Ashland, OR, USA). Τα κύτταρα με την έκφραση των παραπάνω δεικτών περιορίστηκαν από την αντίστοιχη ισοτυπικού ελέγχου βασίζεται σε διακριτές διαίρεση μεταξύ τους. ΚΜΑ ορίστηκαν ως κύτταρα Cytokeratin + CD45-CD53-.

πείραμα εμβολιασμού

Το ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα γραμμή PC9 (υψηλή έκφραση του EpCAM και Cytokeratin) είχε εισφέρει το Αντικαρκινικό Κέντρο της Nanjing Medical University και καλλιεργήθηκαν σε υψηλής γλυκόζης μέσο DMEM που περιείχε 10% FBS, 2 mM L-γλουταμίνη, 100 U /mL πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα. κύτταρα PC9 συλλέχθηκαν σύμφωνα με την ίδια διαδικασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Zero, 10, 50, 100 και 500 κύτταρα PC9 εμπλουτίστηκαν σε 2 mL αίματος από υγιείς εθελοντές. κύτταρα PC9 στη συνέχεια εμπλουτίζεται σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται παραπάνω. Μετά τον εμπλουτισμό, CTCs διαιρέθηκαν εξίσου σε 2 σωλήνες και χρωματίστηκαν με ανθρώπινο αντι-ΕρΟΑΜ, αντι-CK7 /8, αντι-CD45 και των αντιστοίχων αντισώματα ελέγχου ισοτύπου. Στην ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, το ποσοστό των CTCs σε όλα παρέμεινε κύτταρα (συμπεριλαμβανομένων των λευκοκυττάρων και των CTCs) μετά από εμπλουτισμό ορίστηκε ως η καθαρότητα του CTCs. Ανάκτηση και καθαρότητα υπολογίστηκαν για να αξιολογηθεί η απόδοση της μεθόδου, οι οποίες καθορίστηκαν ως ακολούθως: Ανάκτηση = n

1 /n

2 χ 100%, καθαρότητα = n

1 /(n

1 + n

3) × 100% (n

1 ήταν ο αριθμός των PC9 κύτταρα που βρίσκονται μετά τον εμπλουτισμό? n

2 ο αριθμός των κυττάρων PC9 εμπλουτισμένου σε 2 mL αίματος? n

3 ήταν ο αριθμός των λευκοκυττάρων βρέθηκε μετά από εμπλουτισμό). Το πείραμα εμβολιασμού σε κάθε συνθήκη επαναλήφθηκε τρεις φορές

Για έλεγχο πλατφόρμα μας CTC εξακολουθεί να είναι εφαρμόσιμη, ελήφθη PC9 κυτταρική σειρά με χαμηλή έκφραση του EpCAM σύμφωνα με τα ακόλουθα βήματα: α. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 × 10

5 κύτταρα σε τέσσερις 6 εκατοστών-πιάτα και επωάστηκαν σε 5% CO

2, 95% αέρα στους 37 ° C μέχρι πυκνότητα του φτάσει το 80%. Τα καλλιεργημένα κύτταρα διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ άνευ ορού (0,1% BSA, 2 mM L-γλουταμίνη, 100 U /mL πενικιλλίνη και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη) στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5%

2 ατμόσφαιρα CO για τη διάρκεια της νύχτας, και στη συνέχεια διεγείρονται με 5ng /mL rhTGF-β1 (PeproTech, USA) στο ίδιο μέσο για 3 ημέρες. Τα πειράματα εμβολιασμού είχαν προχωρήσει χρήση αυτού του τύπου των κυττάρων PC9 (ονομάζεται PC9-EMT), σύμφωνα με την ίδια διαδικασία που περιγράφεται παραπάνω.

αποκοπής αξίας

Η αρχική τιμή της E + και E-ΚΜΑ προσδιορίστηκαν με απαρίθμηση τους στα δείγματα αίματος από 11 υγιείς εθελοντές. Οι τιμές αποκοπής E + και E-ΚΜΑ υπολογίστηκαν από το άνω όριο της μέσης τιμής των CTCs συν Τυπική Απόκλιση (SD). Αν οι δύο τύποι της ΚΜΑ ήταν και οι δύο κάτω από τις τιμές αποκοπής, ο ασθενής θα πρέπει να ορίζονται ως έχουσες απαρατήρητα ΚΜΑ και θα αποκλείονται από τη στατιστική ανάλυση. Αν μόνο ένας τύπος CTC ήταν κάτω από την τιμή αποκοπής, αυτός ο τύπος CTC θα αντιμετωπίζονται ως 0 για ευκολία στη στατιστική ανάλυση. Το ποσοστό των Ε-CTCs υπολογίστηκε σύμφωνα με τον συνολικό αριθμό των Ε + και E-CTCs. Αν το ποσοστό των E-ΚΜΑ ήταν μεγαλύτερη από 95% (

r

& gt? 95%)., Ο ασθενής θα πρέπει να θεωρούνται ότι έχουν την απόλυτη πλειοψηφία των E-CTCs στο αίμα

Στατιστικές ανάλυση

η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με Stata στατιστικών πακέτων (Stata Corporation, College Station, TX, USA). Mann-Whitney και χ

2 δοκιμές χρησιμοποιήθηκαν για να συγκρίνουμε τις δύο ομάδες. Cox μοντέλο αναλογικών κινδύνων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του SPSS (Στατιστικού Πακέτου για τις Κοινωνικές Επιστήμες) v. 16.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL) για να αξιολογεί τη συσχέτιση μεταξύ του χρόνου επιβίωσης των ασθενών και το ποσοστό της ΚΜΑ.

P

τιμές & lt? 0.05 θεωρήθηκαν να παρουσιάσουν σημαντικές διαφορές.

Αποτελέσματα

Αξιολόγηση της μεθόδου εμπλουτισμού CTC

Μετά την διέγερση με ΤΟΡ-β για 3 ημέρες, η έκφραση του EpCAM στα κύτταρα PC9 μειώθηκε από 97,7% σε 51,7%. Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο μας καρφώσει τα πειράματα, η μέση τιμή της ανάκτησης /καθαρότητα PC9 και PC9-EMT κύτταρα ήταν 80,7% /9,5% και 74,3% /9,5%, αντίστοιχα. Η καμπύλη βαθμονόμησης που φαίνεται στην Εικόνα 1. Υπάρχει μία γραμμική σχέση με την κλίση σε 0.678 (0.782) μεταξύ των λογαρίθμων των κυττάρων PC9 (κύτταρα PC9-ΕΜΤ) βρέθηκε και κύτταρα PC9 (κύτταρα PC9-EMT) προστέθηκε.

Οι καμπύλες βαθμονόμησης σε καρφώσει πειράματα χρησιμοποιώντας (Α) PC9 κυτταρική γραμμή και (Β) κύτταρα PC9-EMT? (Γ) FACS ανάλυση για την έκφραση της EpCAM σε PC9 και PC9-ΕΜΤ κύτταρα διεγερμένα από 5ng /mL ΤΟΡ-β για 3 ημέρες.

Η

Οι τιμές αποκοπής E + και E-CTCs προσδιορίστηκαν σε 11 δείγματα αίματος από υγιείς εθελοντές. Ε + CTCs ανιχνεύθηκαν μόνο σε ένα δείγμα, και E-CTCs ανιχνεύθηκαν σε 8 δείγματα. Η μέση τιμή της ΚΜΑ + SD ήταν 0,09 + 0,30 και 1,18 + 0,98 /mL αίματος για Ε + και E-CTCs, αντίστοιχα. Ως εκ τούτου, το μηδέν και 2 ορίζονται ως οι τιμές αποκοπής για το E + και E-CTCs, αντίστοιχα.

Σε 46 δείγματα αίματος, κέντρα θεραπείας χολέρας ήταν απαρατήρητα σε πέντε δείγματα (1 στη φάση ΙΙ και 4 στο στάδιο IV), λόγω τόσο E + και E-ΚΜΑ κάτω από τις αντίστοιχες τιμές αποκοπής. Σε 41 δείγματα αίματος με ανιχνεύεται ΚΜΑ, Η μέση τιμή [εύρος] της καθαρότητας της ΚΜΑ ήταν 10,6% [0,1% -51,1%]. Από αυτά τα δείγματα, 36.6% (15 από 41) είχε καθαρότητα πάνω από ΚΜΑ 10.0%. Η μέγιστη καθαρότητα της ΚΜΑ ήταν 51,1%. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα της ανάλυσης FACS που προβλέπεται στο S1 Σχ.

Κατανομή των CTCs σε ασθενείς

Τα ποσοστά ανίχνευσης της Ε + και E-CTCs φαίνεται στο σχήμα 2Α. E + ΚΜΑ ανιχνεύθηκαν σε 13 από 16 (81,3%) το στάδιο Ι-ΙΙ, 6 από 8 (75,0%) σταδίου ΙΙΙ και 8 του 22 (36,4%) φάση IV ασθενείς. E-CTCs ανιχνεύθηκαν σε 13 από 16 (81,3%) το στάδιο Ι-ΙΙ, 8 από 8 (100%) σταδίου ΙΙΙ και 18 του 22 (81,8%) φάση IV ασθενείς. E + ΚΜΑ προσδιορίστηκαν να είναι σημαντικά χαμηλότερη σε στάδιο IV ασθενείς από ό, τι στο στάδιο ασθενείς Ι-ΙΙ (

σ

= 0,007). E + ΚΜΑ και E-ΚΜΑ εντοπίστηκαν να είναι σημαντικά διαφορετική σε στάδιο IV ασθενείς (

σ

= 0,003). Επιπλέον, 2 από 15 (13,3%) το στάδιο Ι-ΙΙ, 3 από 8 (37,5%) σταδίου III και 11 του 18 (61,1%) φάση IV ασθενείς εντοπίστηκαν να έχουν την απόλυτη πλειοψηφία των E-CTCs στο αίμα τους (

r

& gt? 95%). Η συχνότητα των ασθενών με

r

& gt? 95% ανιχνεύτηκε να είναι σημαντικά υψηλότερη σε στάδιο IV σε σχέση με το στάδιο των ασθενών Ι-ΙΙ (

σ

= 0,006, σχήμα 2Β).

(Α) κατανομή των ποσοστών ανίχνευσης της Ε + και E-CTCs σε ασθενείς που βρίσκονται σε διαφορετικά στάδια? (Β) Ποσοστό ανιχνεύεται ασθενείς με ποσοστό E-ΚΜΑ υψηλότερο από το 95% (

r

& gt? 95%)? (Γ) κατανομή του αριθμού των Ε + και E-CTCs σε ασθενείς που βρίσκονται σε διάφορα στάδια? (D) Κατανομή Ποσοστό E-CTCs σε διαφορετικά στάδια. (+ /+, Cytokeratin + EpCAM +? +/-, Cytokeratin + EpCAM-).

Η

Σύμφωνα με τις τιμές αποκοπής, κέντρα θεραπείας χολέρας εντοπίστηκαν σε 41 ασθενείς και η κατανομή του αριθμού των Ε + και Ε -CTCs φαίνεται στο Σχ 2C. Οι μέσες τιμές [διατεταρτημοριακό εύρος, IR] /mL αίματος E + και E-ΚΜΑ ήταν 6,0 [2,5 – 12,0] και 18 [11,0 έως 47,5] στο στάδιο ασθενείς Ι-ΙΙ, 11.0 [3,25 – 16,0] και 31.5 [22.5 -31,5] στο στάδιο ΙΙΙ και 6.5 [2,25 – 49,25] και 15.5 [5,75 – 35,75] στο στάδιο IV ασθενείς, αντίστοιχα. Υπήρξε σημαντική διαφορά στον αριθμό των Ε + και E-CTCs τόσο στάδιο Ι-ΙΙ και ΙΙΙ (

σ

= 0,001 για τα δύο), αλλά όχι σε στάδιο IV, επειδή ο αριθμός των Ε + ΚΜΑ αυξήθηκε σε μερικούς ασθενείς. Η κατανομή του ποσοστού των E-CTCs φαίνεται στο Σχ 2D. Οι μέσες τιμές [IR] του ποσοστού της E-ΚΜΑ ήταν 83,0% [50,0% -91,0%] στο στάδιο Ι-ΙΙ, 90,0% [72,8% -99,0%] στο στάδιο ΙΙΙ και 100,0% [60,5% -100,0% ] στο στάδιο IV ασθενείς. Παρά το γεγονός ότι ένα υψηλό ποσοστό των E-CTCs βρέθηκε σε όλα τα στάδια, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά.

Μακροχρόνια παρακολούθηση της ΚΜΑ στην επικουρική θεραπεία

E + και E-ΚΜΑ ήταν δυναμικά παρακολουθείται σε 4 οι ασθενείς δείκτη, και τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 3. ο ασθενής 1 (σχήμα 3Α και S2 Σχήμα), οι οποίοι είχαν προοδευτική ασθένεια μετά την αρχική θεραπεία με Gefitinib, έδειξε την ασθένεια από μερική σε πλήρη ύφεση στη θεραπεία με ALIMTA (pemetrexeddisodium) + σισπλατίνη . Ο αριθμός των Ε + ΚΜΑ μειώθηκε από 4 έως 0 /mL αίματος, αλλά ο αριθμός των E-CTCs αυξήθηκε από 15 σε 44 /mL αίματος κατά την πρώτη περίοδο και μειώθηκε σε σχεδόν 0 /mL αίματος στις τελευταίες τρεις περιόδους. Το ποσοστό των E-ΚΜΑ ήταν 79% στην αρχή, ελαφρώς αυξημένο κατά 100% κατά τη διάρκεια της πρώτης περιόδου, μειώθηκε στο 50% και να διατηρηθεί σε αυτό το επίπεδο στις ακόλουθες δύο περιόδους, αλλά απαρατήρητα στην τελευταία περίοδο.

(Α) Gefitinib και στη συνέχεια ALIMTA + σισπλατίνη θεραπεία? (Β) πακλιταξέλη λιποσωμάτων + σισπλατίνη και στη συνέχεια ακτινοθεραπεία + erlotinib θεραπεία? (C) ALIMTA + καρβοπλατίνη και, στη συνέχεια, ερλοτινίμπη θεραπεία? θεραπείας (Δ) Η erlotinib. Κάθε περίοδος της θεραπείας ήταν ενός μηνός.

Η

Ασθενής 2 (σχήμα 3Β και S3 Εικ), ο οποίος είχε προοδευτική ασθένεια μετά την αρχική θεραπεία με πακλιταξέλη λιποσωμάτων + σισπλατίνη, έδειξαν σταθερή νόσο κατά τη διάρκεια της πρώτης περιόδου, αλλά είχε προοδευτική ασθένεια κατά τη διάρκεια της δεύτερης περιόδου οφείλεται σε μετάσταση εγκεφάλου. Μετά τη θεραπεία με ακτινοθεραπεία + erlotinib, αυτός ο ασθενής εμφάνισε μερική ύφεση της νόσου. Ο αριθμός των E-CTCs μειώθηκε από 34 έως 3 /mL αίματος κατά την πρώτη περίοδο, αυξήθηκε σε 13 /mL αίματος στη δεύτερη περίοδο και στη συνέχεια μειώθηκε σε 3 /mL αίματος κατά την τελευταία περίοδο, ενώ ο αριθμός των Ε + ΚΜΑ έδειξε αναίσθητος μεταβολή από 0, 0, 2 έως 1 /mL αίματος κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Το ποσοστό των E-ΚΜΑ διατηρήθηκε σε κατά τη διάρκεια της πρώτης περιόδου το υψηλό επίπεδο (100%), και στη συνέχεια μειώθηκε σε 87% και 75% στις τελευταίες δύο περιόδους.

Ασθενής 3 (Σχήμα 3C και S4 Εικ ), οι οποίοι είχαν προοδευτική ασθένεια μετά την αρχική θεραπεία με ALIMTA + καρβοπλατίνη, έδειξε μερική ύφεση κατά τη διάρκεια της πρώτης περιόδου, αλλά είχαν προοδευτική ασθένεια κατά τη διάρκεια της δεύτερης περιόδου της θεραπείας με erlotinib. Ο ασθενής πέθανε ένα μήνα αργότερα. Ο αριθμός των E-CTCs μειώθηκε από 69 έως 10 /mL αίματος κατά την πρώτη περίοδο, και αυξήθηκε σε 25 και 19 /mL αίματος στις τελευταίες δύο περιόδους. Ο αριθμός των Ε + ΚΜΑ έδειξε μια διαταραγμένη αλλαγή από 8 έως 23 /mL αίματος κατά την πρώτη περίοδο, και στη συνέχεια μειώθηκε σε 7 /mL αίματος και μη ανιχνεύσιμη στις τελευταίες δύο περιόδους. Το ποσοστό των Ε-CTCs διατηρήθηκε σε υψηλό επίπεδο (90%) στην αρχή, μειώθηκε στο 30%, μαζί με μια απάντηση σε μερική ύφεση της νόσου και στη συνέχεια αυξήθηκε σε 78% και 100% μετά την εξέλιξη της νόσου.

Ο ασθενής 4 (Σχ 3D και S5 σχήμα), ο οποίος είχε προοδευτική ασθένεια κατά την αρχική διάγνωση, έδειξε μερική ύφεση, σταθερή νόσο, προοδευτική νόσος και σταθερή ασθένεια από την πρώτη έως τέταρτη περίοδο στη θεραπεία με erlotinib. Ο αριθμός των E-CTCs παρουσίασε ένα κυμαινόμενο αλλαγή από 23, 17, 6, 17 με 5 /mL αίματος, ενώ E + ΚΜΑ ήταν σχεδόν απαρατήρητα ανά πάσα στιγμή. Το ποσοστό των Ε-CTCs διατηρήθηκε κοντά στο 100% σε κάθε περίπτωση.

Συνέχεια

Όλοι οι ασθενείς είχαν παρακολούθηση εγγραφές από 10 έως 20 μήνες, ανάλογα με το χρόνο δειγματοληψίας. Δεκαεπτά ασθενείς πέθαναν εξαιτίας μια μακρινή μετάσταση (στάδια Ι-ΙΙ: 3 περιπτώσεις? Σταδίου ΙΙΙ: 3 περιπτώσεις? Σταδίου IV: 11 περιπτώσεις). Στις 17 περιπτώσεις, 4 ασθενείς αποκλείστηκαν από τη στατιστική ανάλυση, διότι CTCs ήταν απαρατήρητα. Σε 41 ασθενείς με ανιχνεύσιμα ΚΜΑ, 9 από τους 16 ασθενείς με απόλυτη πλειοψηφία των E-CTCs στο αίμα τους (

r

& gt? 95%) και 8 από τους 25 ασθενείς με

r

≤ 95% πέθανε. Η ανάλυση Kaplan-Meier έδειξε ότι οι ασθενείς με

r

& gt? 95% είχαν σημαντικά μικρότερο χρόνο επιβίωσης από ό, τι εκείνοι με

r

≤ 95% (

σ

= 0,041, σχήμα 4).

Η

Χαρακτηρισμός της ΚΜΑ σε βλαστική ικανότητα

για να εξερευνήσετε την ικανότητα της ΚΜΑ ακόλουθο υπόδειγμα CSC, προσδιορίσαμε την έκφραση των CXCR4 και CD133 για Ε + και E-CTC, αντιστοίχως, σε 10 ασθενείς. CXCR4 ανιχνεύθηκε σε 8/10 των ασθενών στο πλαίσιο της υποομάδας της E-ΚΜΑ, ενώ ανιχνεύθηκε μόνο σε 3/10 των ασθενών στο πλαίσιο της υποομάδας της Ε + ΚΜΑ. Τόσο CXCR4 και CD133 ανιχνεύθηκαν σε 6/10 των ασθενών στο πλαίσιο της υποομάδας της E-ΚΜΑ, ενώ ανιχνεύθηκαν σε μόνο το 1/10 των ασθενών στο πλαίσιο της υποομάδας E + ΚΜΑ. ΚΜΑ CXCR4 + ΚΜΑ και CXCR4 + CD133 + εντοπίστηκαν να είναι σημαντικά υψηλότερη σε E-CTCs από ό, τι στην Ε + ΚΜΑ (

σ

= 0,021 και 0,005, αντίστοιχα, Σχήμα 5Α). Επιπλέον, η έκφραση του CD133 βρέθηκε να είναι σημαντικά υψηλότερη σε CXCR + E-CTCs ό, τι σε άλλους τύπους ΚΜΑ (

σ

= 0,029, Σχήμα 5Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, στα ίδια άτομα, ο αριθμός των CTCs με την έκφραση του CXCR4 και /ή CD133 ήταν πάντα πιο μέσα στην υποομάδα των E-CTCs από εκείνη του Ε + CTCs. Κανένας ασθενής δεν θα μπορούσε να βρεθεί ότι η έκφραση των CXCR4 και /ή CD133 ανιχνεύθηκαν μόνο σε Ε + ΚΜΑ αλλά όχι στο E-CTCs.

Διανομή (α) τον αριθμό των CXCR4 + και CXCR4 + CD133 + κύτταρα και ( Β) τα ποσοστά ανίχνευσης θετικότητας του CXCR4 + CD133 + κυττάρων σε κέντρα θεραπείας χολέρας έχουν ταξινομηθεί από την έκφραση της EpCAM σε 10 ασθενείς με NSCLC.

η

Συζήτηση

ΚΜΑ μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως προγνωστικός δείκτης [17 , 18]. Ωστόσο, ο μικρός αριθμός και η χαμηλή συγκέντρωση του ΚΜΑ έχει περιορισμένη μελέτη της βιολογίας των CTCs [9, 19]. Λόγω της ετερογένειας της ΚΜΑ, είναι δύσκολο να συλλάβει όλους τους τύπους των CTCs με μεθόδους EpCAM-βάση. Μια πιο λογική στρατηγική είναι να καταστρέφουν τα λευκοκύτταρα. Χρησιμοποιώντας βελτιωμένη μέθοδο μας, η καθαρότητα του CTCs αυξήθηκε κατά 10 φορές σε αιχμηρό πειράματα, και μέχρι 50 φορές υψηλότερη σε δείγματα αίματος σε σύγκριση με προηγουμένως αναφερθείσα μέθοδο που βασίζονται σε μαγνητικά σφαιρίδια που όπως διαπιστώθηκε [16]. Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, η μέση τιμή της καθαρότητας του CTCs θα μπορούσε να είναι έως και 10% σε αιχμηρό πειράματα και 10,6% στα δείγματα αίματος ασθενών, το οποίο υποστήριξε επίσης την περαιτέρω εφαρμογή της στην μοριακή ανάλυση. Αυτή η μέθοδος είναι συγκρίσιμη για την ανίχνευση των CTCs με και χωρίς την έκφραση του EpCAM. Στα αποτελέσματα, το 36,4% (για την Ε + ΚΜΑ) και 81,8% (για το E-CTCs) των ασθενών είχαν νόσο σταδίου IV. Αυτά τα δεδομένα είναι σύμφωνα με τα δημοσιευμένα αποτελέσματα ότι E + ΚΜΑ ανιχνεύθηκαν σε μόνο 23 ~ 32% των ασθενών με προχωρημένο NSCLC από CellSearch και το 80% εκείνων με τη στρατηγική απομόνωσης μέγεθος [4, 7]. Αυτή η μέθοδος είναι ειδική για τον εντοπισμό των CTCs με και χωρίς την έκφραση του EpCAM. Τόσο Ε + και E-ΚΜΑ ανιχνεύθηκαν να είναι πολύ χαμηλότερη στα δείγματα αίματος από υγιείς εθελοντές σε σχέση με αυτές των ασθενών, η οποία ήταν επίσης συνεπής με μια προηγουμένως δημοσιευμένη μελέτη [20]. Αν και Ε + και E-CTCs είχαν απαρατήρητα σε πέντε ασθενείς, είναι πιθανό ότι η απαρίθμηση των ΚΜΑ ήταν χαμηλότερα από τις τιμές αποκοπής ή απουσιάζει από επιπλέον ειδικοί δείκτες για τον προσδιορισμό των ετερογενών κυττάρων όγκου σε NSCLC [21, 22].

στην παρούσα μελέτη, μελετήθηκε η κατανομή των CTCs με και χωρίς την έκφραση του EpCAM σε ασθενείς με NSCLC από μία βελτιωμένη μέθοδο. Στα αποτελέσματα, E + και E-ΚΜΑ εντοπίστηκαν να είναι σημαντικά διαφορετική μόνο στο στάδιο IV ασθενείς, αν και δεν ήταν στο στάδιο Ι-ΙΙ και ΙΙΙ ασθενείς. Επιπλέον, το ποσοστό των ασθενών με απόλυτη πλειοψηφία των E-CTCs στο αίμα αυξήθηκε σημαντικά από το στάδιο Ι-ΙΙ έως IV. Επιπλέον, τα αποτελέσματα από την ανάλυση Kaplan-Meier έδειξε ότι οι ασθενείς με την απόλυτη πλειοψηφία των E-CTCs στο αίμα είχαν μικρότερο χρόνο επιβίωσης από εκείνους τους ασθενείς με χαμηλό ποσοστό του E-ΚΜΑ. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι το ποσοστό των Ε-CTCs θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για να προβλεφθεί η πρόγνωση των ασθενών με NSCLC.

Σήμερα, η διαγνωστική αξία των CTCs με και χωρίς την έκφραση του EpCAM σε NSCLC είναι ασαφής. Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήσαμε διαμήκη παρακολούθηση σε ασθενείς δείκτη 4 κατά τη διάρκεια της επικουρικής θεραπείας. Το ποσοστό των Ε-CTCs βρέθηκε να είναι πιο ακριβής από τον αριθμό των Ε + CTCs στην αξιολόγηση του θεραπευτικού αποτελέσματος τόσο χημειοθεραπεία και στοχευμένη θεραπεία. Επιπλέον, ένας μικρός αριθμός E-CTCs συνδέθηκαν με μία θετική απόκριση σε ασθενείς. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι το ποσοστό των Ε-ΚΜΑ μπορεί να έχει δυνατότητες ως δείκτης για την παρακολούθηση και την πρόβλεψη του θεραπευτικού αποτελέσματος σε NSCLC. Είναι πιθανό ότι noncancerous κύτταρα μπορούν να συμπεριληφθούν στο E-ΚΜΑ [9], και εμείς επίσης δεν βρήκε καμία κλινική αξία στην απλή απαρίθμηση των E-ΚΜΑ. Αυτό το φαινόμενο ήταν επίσης συνεπής με τα πρόσφατα δημοσιευμένα αποτελέσματα για τη χημειοθεραπεία στον καρκίνο του μαστού [23]. Ωστόσο, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι ένα υψηλό ποσοστό των E-ΚΜΑ μπορεί να συνεπάγεται μια ενισχυμένη ικανότητα των καρκινικών κυττάρων στην εισβολή και πολλαπλασιασμό.

Για να εξερευνήσετε την παραπάνω βιολογία της ΚΜΑ, χαρακτηρίσαμε την βλαστική ικανότητα του ΚΜΑ με διαφορετικά προφίλ έκφρασης της EpCAM μετά τα αποτελέσματα της προηγούμενης δουλειάς μας [13]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ένας συνδυασμός CXCR4 και CD133 μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης CSC [24, 25]. Στα αποτελέσματά μας, CXCR4 + CD133 + ΚΜΑ εντοπίστηκαν να είναι σημαντικά πιο διαδεδομένη στο E-CTCs από εκείνες Ε + ΚΜΑ, καθώς και ο αριθμός των E-ΚΜΑ με την έκφραση των CXCR4 και /ή CD133 ήταν πάντα περισσότερο από αυτό της Ε + ΚΜΑ μέσα στα ίδια τα άτομα, τα οποία αποδεικνύουν ότι E-ΚΜΑ φάνηκε να είναι πιο στέλεχος-όπως. Το αποτέλεσμα αυτό μπορεί να εξηγήσει, τουλάχιστον εν μέρει, την κακή έκβαση σε ασθενείς με συντριπτική E-CTCs στο αίμα σε κάποιο βαθμό. Επιπλέον, CXCR4 ήταν επάνω ρυθμισμένη κατά την διάρκεια του ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT. Η πιθανή σχέση μεταξύ του πιο στέλεχος-όπως E-ΚΜΑ και EMT θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω. Παρά το γεγονός ότι ένας σχετικά μικρός αριθμός των ασθενών που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, τα αποτελέσματα αυτά συμβάλλουν στην καλύτερη κατανόηση της σχέσης μεταξύ CSC και EMT σε CTCs. Πρόσθετες έρευνα με μεγάλο μέγεθος του δείγματος και προσδιορισμός EMT απαιτούνται για να αποσαφηνιστεί το καθεστώς αυτού του τύπου ΚΜΑ και τη λειτουργία του στην εξέλιξη του όγκου των NSCLC.

Συμπέρασμα

Με βάση την τεχνική της CTC ο εμπλουτισμός με την εξάντληση των λευκοκυττάρων με bi-αντισώματα, αυτή η μελέτη αξιολόγησε την κλινική αξία της ΚΜΑ με και χωρίς EpCAM έκφραση σε NSCLC. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι το ποσοστό των Ε-CTCs αυξήθηκε σημαντικά από το στάδιο Ι-ΙΙ έως IV και θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για να αξιολογηθεί η μακρινή μετάσταση, θεραπευτικό αποτέλεσμα και την πρόγνωση των ασθενών σε NSCLC. Επιπλέον, E-ΚΜΑ φάνηκε να είναι πιο στέλεχος-όπως από Ε + ΚΜΑ. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν την πρώτη ένδειξη για την πιθανή κλινική εφαρμογή E-CTCs σε NSCLC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. Αντιπροσωπευτική ανάλυση FACS σε κέντρα θεραπείας χολέρας στα δείγματα αίματος από 4 ασθενείς με NSCLC

doi:. 10.1371 /journal.pone.0137076.s001

(ΔΕΘ)

S2 Εικ. Αξονική Τομογραφία (CT) εικόνες για τον ασθενή 1 αντιμετωπίζονται με Gefitinib και στη συνέχεια το ALIMTA (pemetrexeddisodium) + σισπλατίνη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0137076.s002

(ΔΕΘ)

S3 Εικ. CT εικόνες για τον ασθενή 2 που έλαβαν θεραπεία με πακλιταξέλη λιποσωμάτων + σισπλατίνη και στη συνέχεια ακτινοθεραπεία + erlotinib

doi:. 10.1371 /journal.pone.0137076.s003

(ΔΕΘ)

S4 Εικ. CT εικόνες για τον ασθενή 3 έλαβαν θεραπεία με ALIMTA + καρβοπλατίνη και στη συνέχεια ερλοτινίμπη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0137076.s004

(ΔΕΘ)

S5 Εικ. CT εικόνες για τον ασθενή 4 αγωγή με erlotinib

doi:. 10.1371 /journal.pone.0137076.s005

(ΔΕΘ)