Αφηρημένο

Οι κλινικές μελέτες δείχνουν ότι οι απαντήσεις σε πρωτεΐνη σύντηξης HPV16 E6E7L2 (TA-CIN) εμβολιασμό μόνο είναι μέτρια, και GPI-0100 είναι μια καλά ανεκτή, ισχυρό ανοσοενισχυτικό. Εδώ επιδιώξαμε να βελτιστοποιήσει τόσο την ανοσογονικότητα του TA-CIN μέσω σκεύασμα με GPI-0100 και τη θεραπεία του HPV16 + καρκίνου από τον εμβολιασμό μετά την σισπλατίνη, χημειοθεραπεία. οι τίτλοι αντισωμάτων ορού HPV16 εξουδετέρωσης, πολλαπλασιαστική CD4 + Τ κυττάρων και Ε6 /Ε7-ειδικές αποκρίσεις CD8 + Τ κυττάρων ήταν σημαντικά αυξημένη όταν τα ποντίκια εμβολιάστηκαν υποδορίως (s.c.) ή ενδομυϊκά (i.m.) με TA-CIN τυποποιούνται με GPI-0100. Ο εμβολιασμός ελέγχθηκε για θεραπεία των ποντικών που φέρουν συγγενικά /Ε7 + όγκους HPV16 Ε6 (TC-1) είτε στον πνεύμονα ή υποδορίως. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με TA-CIN /ΟΡΙ-0100 εμβολιασμός εμφάνισε ισχυρή Ε7-ειδικά CD8 αποκρίσεις + Τ κυττάρων, τα οποία σχετίζονται με μειωμένη φορτίο όγκου στον πνεύμονα, ενώ τα ποντίκια που έλαβαν είτε συστατικό μόνο του ήταν παρόμοια με τους ελέγχους. Δεδομένου ότι ο εμβολιασμός μόνο δεν ήταν επαρκής για τη θεραπεία, τα ποντίκια που φέρουν s.c. TC-1 καρκινικά πρώτα σε επεξεργασία με δύο δόσεις σισπλατίνης και στη συνέχεια εμβολιάζονται. Ο εμβολιασμός με το TA-CIN /GPI-0100 ενδομυϊκά ουσιαστικά καθυστερημένη ανάπτυξη του όγκου και παρατεταμένη επιβίωση μετά από θεραπεία με σισπλατίνη. Ένεση του ΤΑ-CIN μόνο, αλλά όχι GPI-0100, εντός του όγκου (ε.τ.) ήταν παρομοίως αποτελεσματική μετά τη θεραπεία cisplatin, αλλά τα ποντίκια τελικά υπέκυψαν. Ωστόσο, υποχώρηση του όγκου και παρατεταμένη ύφεση παρατηρήθηκε στο 80% των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με σισπλατίνη και έπειτα ενδονεοπλαστική TA-CIN /ΟΡΙ-0100 εμβολιασμό. Αυτοί οι ποντικοί εμφάνισαν επίσης ισχυρή Ε7-ειδικά CD8 + Τ κυττάρων και HPV16 εξουδετερωτικού αντισώματος αποκρίσεις. Έτσι διαμόρφωση TA-CIN με GPI-0100 και ενδονεοπλαστική παράδοσης μετά από θεραπεία με σισπλατίνη προκαλεί ισχυρές θεραπευτικές απαντήσεις σε ένα μοντέλο ποντικού της HPV16 + καρκίνο

Παράθεση:. Peng S, Wang JW, Karanam Β, Wang C, huh WK, Alvarez RD, et al. (2015) Διαδοχική Cisplatin Θεραπεία και εμβολιασμός με πρωτεΐνη HPV16 E6E7L2 Fusion σε σαπωνίνη ανοσοενισχυτικό GPI-0100 για τη θεραπεία ενός μοντέλου HPV16 + Cancer. PLoS ONE 10 (1): e116389. doi: 10.1371 /journal.pone.0116389

Επιμέλεια: Hiroshi Shiku, Mie Πανεπιστημίου Graduate School of Medicine, Ιαπωνία

Ελήφθη: 15 Αυγούστου του 2014? Αποδεκτές: 8, Δεκέμβρη, 2014? Δημοσιεύθηκε: 5 Γενάρη, 2015

Copyright: © 2015 Peng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις από το ίδρυμα V (www.jimmyv.org) για SP και RBSR και Υπηρεσία Δημόσιας Υγείας (επιχορηγήσεις. nih.gov) χορηγεί P50 CA098252 να TCW, RO1 CA133749 να WKH, και CA118790 να RBSR. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. RBSR είναι ένας εφευρέτης του L2 που σχετίζονται με τα διπλώματα ευρεσιτεχνίας (US εφαρμογή 20090047301 θηλωμάτων L2 Ν- τερματικών πεπτιδίων για την επαγωγή γενικές αντισώματα διασταυρούμενης εξουδετέρωσης, και την εφαρμογή των ΗΠΑ 20130177585 Θηλωμάτων L2 Ν-τερματικών πεπτιδίων για την επαγωγή των ευρέως CROSS-αντισώματα εξουδετέρωσης) την άδεια να Shantha Biotechnics Ltd, GlaxoSmithKline, PaxVax, Inc. και Acambis, Inc. RBSR και TCW είναι ιδρυτές της Papivax LLC και επιστημονικών συμβούλων για Papivax Biotech Inc. Οι όροι του εν λόγω καθεστώτος που διαχειρίζεται το Πανεπιστήμιο Johns Hopkins, σύμφωνα με τη σύγκρουση των πολιτικών συμφερόντων. Αυτό δεν μεταβάλλει των συγγραφέων τήρηση όλων των PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

» ιού των ανθρωπίνων θηλωμάτων υψηλού κινδύνου (hrHPV) αιτία 5,2% όλων των καρκίνων σε όλο τον κόσμο [ ,,,0],1]. Ενώ επίμονη λοίμωξη hrHPV είναι ένα απαραίτητο αιτία του καρκίνου, η μεγάλη πλειοψηφία των λοιμώξεων αυθόρμητα εκκαθαρίζονται από την ασυλία υποδοχής. Δευτερογενή πρόληψη μέσω προγραμμάτων κυτταρολογικά και τον έλεγχο του HPV και την παρέμβαση, έχουν μειωθεί το άχθος του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας κατά περίπου 80% στις ανεπτυγμένες χώρες και τώρα δύο προληπτικά εμβόλια HPV στοχεύουν οι δύο πιο συνηθισμένες από τις 14 είδη hrHPV, HPV16 και HPV18. HPV16 είναι ο γονότυπος παρούσα σε 50-60% του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, στο 87% των HPV + στοματοφαρυγγικής καρκινώματα [2], σε 55% και 76% των HPV + επεμβατική κολπική και του αιδοίου καρκινώματα [3], και το 73% του καρκίνου του πρωκτού [ ,,,0],4]. Η ουσιαστική αποτελεσματικότητα και η ασφάλεια του άδεια εμβολίων HPV για την πρόληψη των νέων μολύνσεων HPV16 και HPV18 είναι καλά τεκμηριωμένη [5]. Ωστόσο, η προστασία που παρέχεται από αυτά τα εμπορικά διαθέσιμα εμβόλια είναι γενικά τύπο περιορίζεται [6], και τα ποσοστά εμβολιασμού, δυστυχώς παραμένουν σε χαμηλά επίπεδα στις αναπτυσσόμενες χώρες. Σημαντικά, αυτά τα εμβόλια δεν έχουν θεραπευτική δράση για εκείνους τους ασθενείς με επίμονη λοίμωξη από HPV και HPV εγκατεστημένων συνδέονται τραχηλική δυσπλασία [7], Θεραπευτικό HPV εμβολιασμός έχει τη δυνατότητα να αυξήσει την αποτελεσματικότητα των συμβατικών μη ειδικές, χειρουργικές και αφαιρετική θεραπείες υψηλής ποιότητας νεοπλασίας, ή ακόμη chemoradiation θεραπεία της εν τω βάθει HPV + καρκίνους. Παρά τη χρήση σισπλατίνης και /ή ακτινοθεραπεία [8], η πενταετής επιβίωση των ασθενών με προχωρημένο καρκίνο του τραχήλου της μήτρας παραμένει & lt? 30%. Έτσι, στοχευμένες στρατηγικές θεραπείας, όπως θεραπευτικά εμβόλια κατά του HPV, είναι απαραίτητες για την βελτίωση των αποτελεσμάτων σε ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [9].

Το υποψήφιο θεραπευτικό εμβόλιο κατά του HPV TA-CIN είναι μια ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη που περιλαμβάνει μια σύντηξη του HPV16 ογκοπρωτεΐνες Ε6, Ε7 και η ελάσσονα πρωτεΐνη καψιδίου L2 που καθαρίζεται από το

Ε. coli

[10]. Ε6 και Ε7 ιική ογκοπρωτεΐνες είναι ελπιδοφόρα στόχοι για ανοσοθεραπεία, που εκφράζεται σε όλα τα μολυσμένα κύτταρα, που απαιτούνται για τη βιωσιμότητα του HPV + καρκινικά κύτταρα και απουσιάζει από τα φυσιολογικά κύτταρα ξενιστές. Η ελάσσων καψιδική πρωτεΐνη L2 δεν είναι ανιχνεύσιμα εκφράζεται σε HPV + καρκινικά κύτταρα, αλλά είναι ένας πιθανός θεραπευτικός αντιγόνο για πρόδρομες βλάβες [11], [12], [13]. Επιπλέον L2 περιέχει συντηρημένες επίτοπους εξουδετέρωσης και έχει δυναμικό ως γενικά προφυλακτικά HPV αντιγόνου [14]. Τρεις μηνιαία ανοσοποιήσεις υγιών εθελοντών με TA-CIN χωρίς ανοσοενισχυτικό, προκάλεσε μία L2-ειδικά αντισώματα εξουδετέρωσης στον ορό και πολλαπλασιαστικών αποκρίσεων Τ κυττάρου σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο [15]. Ε6 και Ε7-ειδική ανοσία CD8 Τ κυττάρων ανιχνεύθηκε με ΙΡΝγ ELISPOT σε 8 από 11 αξιολογήσιμα υποκείμενα στην υψηλότερη δόση, αν και Ε6 ήταν η κυρίαρχη αντιγόνο. Ωστόσο, η συνολική ανταπόκριση ήταν μέτρια, υποδεικνύοντας την ανάγκη για μια επικουρική [16], [17] ή ετερόλογη ενίσχυση με ανασυνδυασμένο ιικό φορέα [18], [19], [20].

Protein-based εμβολιασμός χωρίς ανοσοενισχυτικό επάγει τυπικά αδύναμο ανοσοαποκρίσεις. GPI-0100 είναι ένας ισχυρός ανοσοενισχυτικό που προέρχεται από την τροποποίηση επιλεγμένα φυσικά σαπωνίνες [21] για την εξάλειψη σχετικά τοξικές και ασταθή τμήματα ακυλίου, και την εισαγωγή ενός λιπόφιλη χαρακτηριστική ομάδα [22], [23]. Δόσεις των 100 μg έως 5000 μg του GPI-0100 έχουν δοκιμαστεί με αρκετά αντιγόνα σε κλινικές δοκιμές πρώιμη φάση και έγιναν καλά ανεκτές [21], [24]. Ο εμβολιασμός των μακάκων με TA-CIN σε συνδυασμό με το ανοσοενισχυτικό ΟΡΙ-0100 (TA-CIN /ΟΡΙ-0100) ήταν επίσης καλά ανεκτή και προκάλεσε ισχυρή τίτλους αντισώματος εξουδετέρωσης έναντι HPV 16, με μικρότερο αποκρίσεις έναντι άλλων τύπων HPV που δοκιμάστηκαν, και Τ κυτταρικές αποκρίσεις για HPV16 Ε6 και Ε7 [16]. Διατύπωση TA-CIN με GPI-0100 βαθύτατα ενίσχυσε την αντίδραση εξουδετέρωσης αντισώματος και προστάτευσε τα ποντίκια από την πειραματική πρόκληση δέρμα με ψευδοϊοσωμάτια HPV16 που παραδίδουν ένα ανταποκριτή λουσιφεράσης. Συμπερίληψη GPI-0100 ενίσχυσε επίσης την Ε7-ειδική απόκριση CD8 Τ κυττάρων προς TA-CIN εμβολιασμό και προστάτευσε τα ποντίκια από την πρόκληση με την κυτταρική γραμμή TC-1, ένα μοντέλο HPV16 Ε6 /Ε7 + ποντικού όγκου [16]. Ωστόσο, η θεραπευτική δραστικότητα του έναντι καθιερωμένου όγκου δεν έχει ελεγχθεί.

Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η τοπική ανοσοποίηση είναι σημαντικό να αποσπάσει μια κυτταρική ανοσολογική απόκριση ότι τα σπίτια πίσω στη σχετική περιοχή και ότι η χημειοθεραπεία μπορεί να ενισχύσει την ανοσολογική αντίδραση εν μέρει από συρρίκνωση βάρος της νόσου, απελευθερώνοντας τα αντιγόνα όγκου και παροδικά την τροποποίηση του ανοσοποιητικού μικροπεριβάλλον εντός του όγκου [25], [26], [27], [28], [29], [30], [31]. Η θεραπεία με σισπλατίνη ή /και ακτινοβολία χαμηλής δόσης μπορεί να ενισχύσει την δραστικότητα των θεραπευτικών εμβολίων HPV σε μοντέλα ποντικών [32], [33], [34]. Ταυτόχρονη θεραπεία με σισπλατίνη και ενδοογκική ένεση (ΙΤ) του πεπτιδίου Ε7 σε C57BL /6 ποντικούς που φέρουν Ε6 /Ε7 που εκφράζουν TC-1 όγκων που δημιουργούνται σημαντικά περισσότερο Ε7-ειδικά ΙΡΝ-γ εκκρίνοντα CD8

+ Τ κύτταρα και θα μπορούσε να θεραπεύσει πολλά ποντικούς, ενώ εκείνοι που έλαβαν μόνο είτε θεραπεία δεν παρήγαγε παρόμοιο έλεγχο της ανάπτυξης του όγκου. Σημαντικά, υποδόρια χορήγηση Ε7 πεπτιδίου αύξησης ελέγχεται όγκου λιγότερο αποτελεσματικά από ό, τι εντός του όγκου χορήγηση, υποδεικνύοντας ότι η παράδοση του αντιγόνου στο μικροπεριβάλλον του όγκου ενισχύει εκκίνηση ενός όγκου αντιγόνου-ειδικά CD8 + Τ κυττάρων άνοση απόκριση μετά από χημειοθεραπεία [34]. θεραπεία Cisplatin επίσης παροδικά προκάλεσε μια σημαντική συσσώρευση των δενδριτικών κυττάρων (DCs) στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Επιπλέον, εντός του όγκου έγχυση του αντιγονικού πεπτιδίου οδήγησε στην πρόσληψη του πεπτιδίου Ε7 από τον CD11c + DCs και μετανάστευση των φορτωμένων με πεπτίδιο Ε7 DCs στους λεμφαδένες παροχέτευσης [34]. Οι Ε7 πεπτίδιο φορτωμένα DCs στο λεμφογάγγλιο αποστράγγισης θα μπορούσε να ενεργοποιήσει Ε7-ειδικά CD8 + Τ κύτταρα. Σημαντικά, αυτή η σημαντική ενίσχυση του Ε7-ειδικών CD8 + Τ κυττάρων σε κυκλοφορία και αντικαρκινική δράση παρατηρήθηκε επίσης όταν TC 1-ποντικούς που φέρουν όγκο υπέστησαν αγωγή με σισπλατίνη και ενδοογκική εμβολιασμός TA-CIN [35].

πριν μας μελέτες σε ποντίκια και μακάκους την υποστήριξη της ασφάλειας και αποτελεσματικότητας των GPI-0100 ως ανοσοενισχυτικό για TA-CIN, αλλά δεν εξετάζει τις επιπτώσεις της πάνω θεραπευτική δράση [16]. Εδώ συγκρίναμε εμβολιασμό μόνο και σισπλατίνη ακολουθείται από ενδοογκική ή ενδομυϊκή εμβολιασμός TA-CIN τυποποιούνται με GPI-0100 ανοσοενισχυτικό για τη θεραπεία των εγκατεστημένων όγκων TC-1.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

η κυτταρική γραμμή ανθρώπινης προέλευσης 293TT χρησιμοποιείται σε αυτή τη μελέτη. Αυτή η κυτταρική σειρά έχει περιγραφεί προηγουμένως [37], [38]. Οι μελέτες σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας και με την προηγούμενη έγκριση της Επιτροπής ζώων Φροντίδα και Χρήση του Πανεπιστημίου Johns Hopkins (MO14M43). Τα ποντίκια παρακολουθήθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές την εβδομάδα, και τα τελικά σημεία ευθανασίας χρησιμοποιήθηκαν σε μελέτες επιβίωσης? ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία μετά από υπερβολική επιβάρυνση του όγκου (cm διαμέτρου ≥2 ή εξέλκωση), ή την πρώτη απόδειξη του κινδύνου, όπως η απώλεια του βάρους (≥10%), λήθαργο, την κακή ποιότητα τριχώματος, ευαισθησία στο φως, φωλιάζουν ή γρατσουνιές. Οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με εισπνοή ισοφλουράνης, υποβάλλονται σε ευθανασία με ασφυξία με διοξείδιο του άνθρακα και το θάνατο διασφαλίζεται με αυχενική εξάρθρωση.

Ποντίκια

παλιό 5-8 εβδομάδων θηλυκών /6 ή BALB /c ποντίκια C57BL αγοράσθηκαν από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (Frederick, MD) και στεγάστηκαν επί τουλάχιστον μία εβδομάδα πριν από την μελέτη. Όλα τα ποντίκια διατηρήθηκαν στο Johns Hopkins University School of Medicine (Βαλτιμόρη, MD) εγκατάσταση κέντρου καρκίνου των ζώων σύμφωνα με το συγκεκριμένο παθογόνο χωρίς όρους. Τα ποντίκια διατηρήθηκαν 5 ανά μικροαπομονωτικά κλουβί με αποστειρωμένη τροφή και η στρωμνή, αλλάζονται κάθε εβδομάδα, και τυχαία από το κλουβί.

πεπτίδια, αντισώματα και αντιδραστήρια

Η H-2K

b-περιορισμένη HPV16 E6aa50-57 πεπτίδιο, YDFAFRDL, και H-2d

b-περιορισμένο HPV16 E7aa49-57 πεπτίδιο, RAHYNIVTF συντέθηκαν με Macromolecular Resources (Denver, CO) με καθαρότητα ≥80%. FITC ή ΡΕ-συζευγμένα αντι-ποντικού CD4 (κλώνος RM4-5) και CD8a (κλώνος 53.6.7) και ΡΙΤΟ-συζευγμένο αντι-ποντικού ΙΡΝ-γ (κλώνος XMG 1.2) αντισωμάτων αγοράστηκαν από Βϋ Pharmingen (San Diego, CA). ΡΕ-συζευγμένο, φορτωμένο HPV16 E7aa49-57 πεπτίδιο Η2-D

β τετραμερή ελήφθησαν από το Εθνικό Ινστιτούτο Αλλεργιών και Λοιμωδών Νοσημάτων τετραμερούς Διευκόλυνσης. οξική μεδροξυπρογεστερόνη αγοράστηκε από Greenstone LLC (Peapack, NJ), και 4% Nonoxynol-9 (N-9) αγοράστηκε από Revive προσωπική εταιρεία προϊόντων (Madison, NJ). Η σισπλατίνη, Tween-40 και μαννιτόλη αγοράστηκαν από τη Sigma (St. Louis, ΜΟ).

Cells

TC-1 κύτταρα HPV-16 Ε6 και Ε7-εκφράζοντα δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],36]. κύτταρα καρκινώματος κόλου CT26 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI συμπληρωμένο με 2 mM γλουταμίνη, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο, 100IU /ml πενικιλίνη, 100 μg /mL στρεπτομυκίνη και 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). κύτταρα 293TT καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM που περιέχει 2 mM γλουταμίνη, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο, 100IU /ml πενικιλίνη, 100 μg /mL στρεπτομυκίνης και 10% FBS [37].

Εμβόλιο και τυποποίηση

TA-CIN έχει περιγραφεί προηγουμένως και παρασχέθηκε ευγενώς από τον Cancer Research Technology, UK [15]. GPI-0100 προβλέφθηκε γενναιόδωρα από τη Χαβάη Biotech Inc. (Aiea, HI). Για τις μελέτες εμβολιασμού, TA-CIN (31,25 μg /mL) διαμορφώθηκε με ΟΡΙ-0100 (250 μg /mL), μόνο του ή με είτε Tween-40 (4 mg /ml), ή μαννιτόλη (50,7 mg /mL) σε 0.025 Μ ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού νατρίου (ρΗ 7,2). Για την παρασκευή εμβολίου για την ενδο-ογκική έγχυση, TA-CIN (312,5 μg /mL) διαμορφώθηκε με ΟΡΙ-0100 (2500 μg /mL), μαζί με μαννιτόλη (50.7 mg /mL) σε 0,025 Μ ρυθμιστικό φωσφορικού νατρίου (ρΗ 7,2). Το σχηματισμένο εμβόλιο επωάστηκε για όλη τη νύχτα σε ένα απαλό αναδευτήρα στους 4 ° C πριν από τη χρήση. Το κατεψυγμένο σκεύασμα TA-CIN /ΟΡΙ-0100 συμπεριλαμβάνεται μαννιτόλη, και μετά από ολονύκτια επώαση, χωρίστηκε σε κλάσματα και καταψύχθηκαν χρησιμοποιώντας ξηρό πάγο /ισοπροπανόλη. Τα δείγματα στη συνέχεια αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση.

Παραγωγή HPV16 και HPV58 pseudovirus και εξουδετέρωση

δοκιμασία

Pseudoviruses (PSV) παρήχθησαν με συν-επιμόλυνση των κυττάρων 293TT [37] [38], με πλασμίδια που κωδικοποιούν HPV L1 και L2 και πλασμίδιο ανταποκριτή που εκφράζει εκκρινόμενη είτε αλκαλική φωσφατάση (SEAP) ή λουσιφεράση πυγολαμπίδας [39], [40]. δοκιμασίες εξουδετέρωσης pseudovirus SEAP-based διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [38]. Εν συντομία, HPV16 SEAP PSVs επωάστηκαν με ορούς τιτλοδοτήθηκαν ποντικού (ξεκινώντας 1:50 αραίωση) ή 4 μι θετικός έλεγχος μονοκλωνικού αντισώματος RG-1 (1,1 mg /ml) επί 2 ώρες στους 37 ° C πριν από την προσθήκη στα κύτταρα 293TT. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 72 ώρες, και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν. δραστικότητα SEAP μετρήθηκε με τη μέθοδο μέσω χρωματομετρικής δοκιμασίας. τίτλοι εξουδετέρωσης ορού που ορίζεται ως η υψηλότερη αραίωση που είχε ως αποτέλεσμα τουλάχιστον 50% μείωση της δραστηριότητας SEAP συγκριτικά με τον ιό μόνο έλεγχοι μόλυνσης.

χρώση Ενδοκυτταρική κυτοκίνης και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Για την ανίχνευση HPV 16 Ε6 ή Ε7-ειδικά CD8

+ Τ κυττάρου αποκρίσεις από την ΙΡΝ-γ ενδοκυτταρική χρώση, σπληνοκύτταρα διεγέρθηκαν με είτε HPV16 E6aa50-57 ή πεπτίδιο E7aa49-57 (1 μg /mL) σε παρουσία GolgiPlug (BD Pharmingen, San Diego , CA) στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Για την ανίχνευση TA-CIN-ειδικά CD4

+ και CD8

αποκρίσεις + Τ κυττάρων, σπληνοκύτταρα διεγέρθηκαν με 10 μg /mL του ΤΑ-CIN πρωτεΐνης για 24 ώρες στους 37 ° C. GolgiPlug συνέχεια προστέθηκε στα κύτταρα και επωάζονται περαιτέρω όλη τη νύκτα στους 37 ° C. Όταν χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα CT26 διαμολύνθηκαν με HPV16 L2, τα κύτταρα CT26 πρώτα επιμολυσμένα με πλασμίδιο που κωδικοποιεί βελτιστοποιημένων κωδικονίων HPV16 L2 [41] χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Σπληνοκύτταρα τότε συν-καλλιεργήθηκαν με HPV16 L2 επιμολυσμένα κύτταρα CT26 με την αναλογία E:T του 10:01 κατά την παρουσία GolgiPlug στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Τα διεγερμένα σπληνοκύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν μία φορά με PBS που περιέχει 0.5% BSA και χρωματίστηκαν είτε με ΡΕ-συζευγμένο αντι-ποντικού CD4 ή CD8 αντίσωμα. Τα κύτταρα διαπερατά και σταθεροποιήθηκαν με κιτ Cytofix /Cytoperm σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (BD Pharmingen, San Diego, CA). Η ενδοκυτταρική ΙΡΝ-γ βάφτηκε με ΡΙΤΟ-συζευγμένο αρουραίου ποντικού ΙΡΝ-γ. Κυτταρομετρία ροής ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur με το λογισμικό CellQuest (BD Biosciences, Mountain View, CA).

τετραμερούς χρώση

Για χρώση τετραμερούς, PBMCs από τους ποντικούς βάφτηκαν με καθαρισμένο αντι- CD16 ποντικού /32 (Fc block, BD Pharmingen, San Diego, CA) πρώτα, και στη συνέχεια βάφτηκαν με αντι-ποντικού CD8-FITC, ΡΕ-συζευγμένο, HPV16 E7aa49-57 πεπτίδιο, RAHYNIVTF φορτωμένα Η2-D

b τετραμερές στο 4 ° C. Μετά πλύση, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 7-AAD πριν την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για τον αποκλεισμό των νεκρών κυττάρων. Τα κύτταρα που αποκτήθηκαν με κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur και αναλύονται με το λογισμικό CellQuest.

Παθητική μεταφορά του ποντικιού ή macacque ορούς και κολπική HPV PSV πρόκληση

Για τις μελέτες παθητικής μεταφοράς, ομάδες θηλυκών ποντικών BALB /c (n = 5) εγχύθηκαν με 3 mg από μεδροξυπρογεστερόνης υποδορίως τέσσερις τελευταίες ημέρες πριν να κολπική πρόκληση pSV. Μία ημέρα πριν από την κολπική πρόκλησης, 90 μί ορών από κάθε έλεγχο ή TA-CIN εμβολιασμένα θηλυκά ποντίκια BALB /c συνενώθηκαν σε αντίστοιχες ομάδες τους με ένα πρόσθετο 150 μL PBS (συνολικός όγκος 600 μί). Ως θετικός μάρτυρας, το μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού RG-1 χρησιμοποιήθηκε σε τρεις ξεχωριστές doses- High (50 μg /ποντικό), Medium (25 μg /ποντικό) και χαμηλής (12,5 μg /ποντικό). Στη συνέχεια, 100 μι του αντίστοιχου συγκεντρωμένων ορών ή RG-1 δόσεις ήταν στη συνέχεια εγχέονται ί.ρ. σε κάθε ποντικό της αντίστοιχης ομάδας. Σε 24 ώρες μετά την παθητική μεταφορά, κολπική πρόκληση με HPV PSV διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [42] χρησιμοποιώντας ~ 10

8 ιικό γονιδιωματικό ισοδύναμο (VGE) μονάδες /ποντικό. Τρεις ημέρες μετά την πρόκληση HPV PSV, η έκφραση της λουσιφεράσης στον κολπικό θόλο αποκτήθηκε με Xenogen IVIS 100 (δαγκάνα Life Science, Hopkinton ΜΑ) κάμερας και αναλύθηκαν με ζωντανή εικόνα 2.5 του λογισμικού. Τα ίδια βήματα έγιναν για μελέτες μεταφοράς παθητική χρησιμοποιώντας ορούς από 3 μακάκους (εσωτερική διάμετρος 746, 811 ή 831) είτε πριν ή μετά τον εμβολιασμό με τρίτες TA-CIN + ΟΡΙ-0100 που παράγεται σε μία προηγούμενη μελέτη [16]. 100 μL του προ-άνοσο οροί (αραίωση = 1:200, με βάση την εκτίμηση του όγκου του αίματος ποντικού του 2 mL) ή εμβολιασμένα ορούς τιτλοδοτήθηκε με μία σειρά αραιώσεων 1:200-1:2000 ήταν παθητικά μεταφέρθηκε ε.π. σε ομάδες παρθένα ποντίκια (η = 5). Την επόμενη ημέρα, οι ποντικοί προκλήθηκαν ενδοκολπικώς με HPV58 PSV και απεικονίστηκαν 72 ώρες μετέπειτα να αξιολογήσει μολυσματικότητα.

μελέτες θεραπείας των καρκινικών κυττάρων hematogeneosuly εξάπλωση TC-1

C57BL /6 ποντικοί εγχύθηκαν με 5 × 10

4 κυττάρων TC-1 ενδοφλεβίως. Για να δοκιμαστεί η επίδραση κατά του όγκου που προκαλείται από τον εμβολιασμό, 3 ημέρες αργότερα οι ποντικοί εμβολιάστηκαν τρεις φορές με την υποδεικνυόμενη αγωγή. Όταν το μη επεξεργασμένο ποντικοί έδειξαν σημάδια ασθένειας (βλέπε δήλωση ηθική), όλοι οι ποντικοί θυσιάστηκαν, και τα σπληνοκύτταρα παρασκευάσθηκαν για ανίχνευση HPV 16 Ε6 ή Ε7 ή TA-CIN-ειδικά CD4

+ και CD8

αποκρίσεις + Τ κυττάρων. Συλλέχθηκαν πνεύμονες για να ελέγξετε την ανάπτυξη του όγκου. Εναλλακτικά, τα PBMC και οροί συλλέχθηκαν από τους ποντικούς για την ανάλυση του HPV16 Ε7-ειδικά CD8

+ Τ κυτταρικές αποκρίσεις με τετραμερή χρώση ή HPV16-ειδικό τίτλο αντισώματος εξουδετέρωσης με HPV16-SEAP pSV αντίστοιχα.

Θεραπεία μελέτες υποδόριας TC-1 καρκινικά

1 × 10

5 TC-1 κύτταρα όγκου εγχύθηκαν υποδορίως σε ποντικούς C57BL /6. Την ημέρα 5 και 12 μετά την πρόκληση των καρκινικών κυττάρων, τα ποντίκια ενέθηκαν με 5 mg /kg σισπλατίνης ή αλατόνερο ενδοπεριτοναϊκά. Μία ημέρα μετά την σισπλατίνη ή φυσιολογικό ορό ένεση, τα ποντίκια αφέθηκαν είτε χωρίς θεραπεία, ή έχουν εμβολιασθεί με μόνο GPI-0100, ή TA-CIN μόνο, ή TA-CIN συν GPI-0100 εντός του όγκου. Μία ομάδα ποντικών που υπέστησαν αγωγή σισπλατίνης εμβολιάστηκε με TA-CIN συν GPI-0100 ενδομυϊκά. Ένας όγκος 200 μL χρησιμοποιήθηκε για όλες τις μελέτες εμβολιασμού με εξαίρεση 20 μL για τον εμβολιασμό εντός του όγκου. Οι ποντικοί ενισχύθηκαν δύο φορές με την ίδια αγωγή. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε με οπτική επιθεώρηση και μέτρηση της διαμέτρου του όγκου με καλίμπρες δύο φορές κάθε εβδομάδα. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο [μεγαλύτερη διάμετρος χ (κάθετος διάμετρος)

2] χ π /6. επιβίωση του όγκου καταγράφηκε είτε ως φυσικό θάνατο ή διάμετρο όγκου άνω των 2 cm.

Η στατιστική ανάλυση

δεδομένα ανοσία με τη μεσολάβηση κυττάρων εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD). Οι συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων που χρησιμοποιείται

t

test του Student. διανομές επιβίωσης για ποντίκια σε διαφορετικές ομάδες εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier και συγκρίθηκε με την δοκιμασία log-rank. Για πειράματα παθητικής μεταφοράς, τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± λοίμωξη ποσοστό τυπικό σφάλμα (SE). Η τιμή p & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Πολλαπλότητα προσαρμογή δεν θεωρήθηκε εξαιτίας της διερευνητικής φύσης της ανάλυσης των δεδομένων.

Αποτελέσματα

GPI-0100 ενισχύει σημαντικά HPV16 Ε7-ειδικών CD8 + Τ κυτταρικές αποκρίσεις και όγκου θεραπεία που προκαλείται από TA-CIN

Έχουμε αποδείξει προηγουμένως ότι σκεύασμα TA-CIN με GPI-0100 ενισχύει σημαντικά τις δύο τίτλους αντισώματος εξουδετέρωσης ορού HPV16-ειδικά και Ε7-ειδικές αποκρίσεις CD8 + Τ κυττάρων σε υποδόριο εμβολιασμό αφελή ποντικούς [16]. Για να ελεγχθεί αν διαφορετικές παρτίδες GPI-0100 και ΤΑ-CIN μπορούν να παράγουν παρόμοια δεδομένα, μπορούμε εμβολιαστεί αφελείς C57BL /6 ποντίκια με δύο διαφορετικές παρτίδες cGMP του ΤΑ-CIN (0847FP και 0861FP) διαμορφώνονται με τρεις διαφορετικές παρτίδες cGMP από ΟΡΙ-0100 ( 0400806, 0400306R και 0400106R) υποδορίως. Καμία σημαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε τόσο για τίτλο αντισώματος εξουδετέρωσης HPV16-ειδικά και Ε6 /Ε7-ειδικές αποκρίσεις CD8 + Τ κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επειδή διαδρομή εμβολιασμός μπορεί δυνητικώς να επηρεάσει την ανοσοαπόκριση, συγκρίναμε επίσης την ανοσογονικότητα του ΤΑ-CIN τυποποιούνται με GPI-0100 που δόθηκε είτε υποδόρια (s.c.) ή ενδομυϊκή ένεση (i.m.). Καμία σημαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε ούτε για HPV16-ειδική τίτλος εξουδετέρωσης ορού αντισωμάτων ή Ε6 /Ε7-ειδικές αποκρίσεις CD8 + Τ κυττάρων (S1 Εικ.).

Στην προηγούμενη μελέτη μας, ο εμβολιασμός με TA-CIN τυποποιούνται με με GPI 0100 εντελώς προστάτευσε τα ποντίκια από μεταγενέστερη υποδόρια πρόκληση με το μοντέλο HPV16 Ε6 /Ε7 που εκφράζουν TC-1 καρκινικά [16], αλλά η θεραπεία των προ-υφισταμένων και μεταστατικών TC-1 καρκινικά δεν έχει ελεγχθεί. Ένεση κυττάρων TC-1 στην ουραία φλέβα (ε.φ.) οδηγεί σε εγκατάσταση τους στους πνεύμονες, παρέχοντας ένα μοντέλο πνευμονικής μεταστατικού HPV16 + καρκίνο [43]. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε κατά πόσο διατύπωση του ΤΑ-CIN με GPI-0100 αντίκτυπο το θεραπευτικό αποτέλεσμα έναντι TC-1 εμφυτεύματα όγκων στους πνεύμονες. Τα καρκινικά κύτταρα TC-1 εγχύθηκαν στη φλέβα της ουράς των ποντικών C57BL6 και 3 ημέρες αργότερα, τα ποντίκια που φέρουν όγκο εμβολιάστηκαν υποδορίως είτε με μια χαμηλή δόση (6,25 μg /ποντικό) μόνης TA-CIN ή τυποποιούνται με 50 μg GPI -0100, που ακολουθείται από δύο ενισχυτές σε διαστήματα μίας εβδομάδας. Πνεύμονες συλλέχθηκαν δέκα ημέρες αργότερα για να αξιολογηθεί η ανάπτυξη του όγκου (Σχ. 1Α). Ούτε ο εμβολιασμός με TA-CIN μόνο, ούτε GPI-0100 μόνος παρεμπόδισε TC-1 ανάπτυξης όγκου στους πνεύμονες. Σε αντίθεση, οι ποντικοί που εμβολιάστηκαν με TA-CIN τυποποιούνται με GPI-0100 είχαν σημαντικά λιγότερες οζίδια πνευμονική όγκου και ως εκ τούτου μικρότερο βάρος πνεύμονα σε σύγκριση με μη εμβολιασμένα ποντίκια (Σχ. 1 Β και C και S2A Εικ.). Πάντως, το βάρος του όγκου μόνο μειωμένη, δεν εξαλείφεται πλήρως. Όταν αναλύθηκαν HPV16 Ε6 /Ε7-ειδικές αποκρίσεις CD8 + Τ κυττάρων, βρήκαμε ότι TC 1-φέρουν όγκο ποντικούς εμβολιασμένους με TA-CIN τυποποιούνται με GPI-0100 που προκαλείται από δραματικά υψηλότερα Ε7-ειδικές αποκρίσεις κυττάρων CD8 + Τ από ό, τι είτε TA-CIN ή GPI-0100 μόνο (Σχ. 1D και S2B Εικ.). Αν και TA-CIN περιέχει επίσης ένα επιτόπιο Τ-κυττάρων CD8 + E6, μόνο ασθενή Ε6-ειδικές αποκρίσεις CD8 + Τ κυττάρων παρατηρήθηκε ως Ε7 είναι η κυρίαρχη αντιγόνο σε C57BL /6 ποντικούς (Σχ. 1D και S2B Εικ.). Σκεύασμα με Tween-40, έχει προταθεί να ενισχύσει την επίδραση ανοσοενισχυτικό του GPI-0100 [44]. Ωστόσο, σε συμφωνία με προηγούμενα ευρήματα μας σε αφελή ποντίκια [16], η συμπερίληψη του Tween-40 σε TA-CIN /ΟΡΙ-0100 σκεύασμα δεν επηρέασε σημαντικά την αντικαρκινική δράση ή Ε6 /Ε7-ειδικές αποκρίσεις CD8 + Τ κυττάρων (Σχ. 1D και S2B Εικ.). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα επεκτείνουν προηγούμενο εύρημα μας ότι GPI-0100 είναι σε θέση να ενισχύσει σημαντικά την ανοσογονικότητα του ΤΑ-CIN συμπεριλαμβανομένου ενός Ε7-ειδική απόκριση CD8 + κυττάρων-Τ και εδώ δείχνουν το δυναμικό της για θεραπευτική δράση έναντι HPV16-μετασχηματισμένα όγκου σε ποντίκια C57BL6.

Α. Σχηματική απεικόνιση του σχεδιασμού πειράματος. Εν συντομία, 5-8 εβδομάδων σε ηλικία θηλυκών ποντικών C57BL /6 ποντίκια (10 ποντικοί /ομάδα) εγχύθηκαν με 5 × 10

4 TC-1 κύτταρα ενδοφλεβίως την ημέρα 0. Την ημέρα 3, οι ποντικοί εμβολιάστηκαν με είτε 6,25 μg /ποντίκι του ΤΑ-CIN, ή τυποποιούνται με 50 μα GPI-0100, ή τυποποιούνται με 50 μα GPI-0100 σε 800 μg του Tween-40 μέσω υποδόριας ένεσης. Οι ποντικοί ενισχύθηκαν δύο φορές με την ίδια αγωγή. Την ημέρα 27, οι ποντικοί θυσιάστηκαν για να μαζέψουν τους πνεύμονες και σπλήνες. B. Περίληψη του αριθμού των TC-1 οζίδια μετάσταση στους πνεύμονες του κάθε ποντικού (και φωτογραφίες των πνευμόνων παρουσιάζονται στον S2A Σχ.). Γ Περίληψη του βάρους των πνευμόνων. D. Σύνοψη ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του HPV16 Ε6 και Ε7-ειδικά CD8

κυτταρικές αποκρίσεις + Τ αναλύθηκαν με ΙΡΝ-γ ενδοκυτταρική χρώση. Τα δεδομένα που αποκτήθηκαν με FACSCalibur, αναλύονται με CellQuest και αντιπροσωπευτικά στοιχεία φαίνεται στο S2B Σχ.

Η

Η ανοσογονικότητα του TA-CIN διατυπώνονται με GPI-0100 στην μαννιτόλη και κατεψυγμένα

Για την καλύτερη εξυπηρέτησή και βελτιωμένη σταθερότητα, είναι δυνητικά ωφέλιμο να διατυπώσει μια μεγάλη παρτίδα TA-CIN /GPI-0100 εμβολίου και υποπολλαπλάσιο του σε δόσεις μιας χρήσης που μπορούν να καταψυχθούν για μακροχρόνια αποθήκευση. Λόγω της δωδεκυλ ομάδα του, GPI-0100 είναι περισσότερο υδρόφοβο από του

Quillaja

σαπωνίνη πρόδρομος και η αποφυγή της ρυθμιστικά διαλύματα υψηλής ιοντικής ισχύος και τυποποίηση σε 5% (ισοτονικό) μαννιτόλη είναι πλεονεκτική. Ως εκ τούτου, διατυπώσαμε TA-CIN με GPI-0100 με την ανάμειξή τη διάρκεια της νύχτας σε διάλυμα μαννιτόλη 5%. Οι δόσεις καταψύχονται και φυλάσσονται στους -80 ° C μέχρι να χρειαστεί για χορήγηση. Για να δοκιμαστεί εάν ένα ενιαίο επιπτώσεις κύκλο ψύξης /απόψυξης η ανοσολογική απόκριση, θα εμβολιαστεί αφελείς BALB /c ποντικών με είτε προσφάτως διαμορφωθούν TA-CIN /ΟΡΙ-0100, ή ΤΑ-CIN τυποποιούνται με GPI-0100 σε 5% μαννιτόλη και κατεψυγμένα to – 80 ° C για αποθήκευση μέχρι τη χρήση. Οι ποντικοί ενισχύθηκαν δύο φορές όπως υποδεικνύεται στο Σχ. 2Α. Δύο εβδομάδες μετά τον τελευταίο εμβολιασμό, σπληνοκύτταρα και οροί συλλέχθηκαν για την ανίχνευση HPV 16-ειδικών Τ κυττάρων αποκρίσεις (Σχ. 2Β-D, S3A και C Σχ.) Και το αντίσωμα εξουδετέρωσης (Σχ. 2Ε), αντίστοιχα. Ο εμβολιασμός με το TA-CIN /GPI-0100 προκάλεσε απόκριση αντισωμάτων εξουδετέρωσης έναντι HPV 16, ενώ μόνος TA-CIN ή GPI-0100 δεν προκαλέσει μια ανιχνεύσιμη (τίτλος ≥50) εξουδετέρωσης απόκριση αντισώματος έναντι HPV 16 (Σχ. 2Ε). Όσον αφορά την κυτταρική ανοσία, ο εμβολιασμός με TA-CIN μόνη της ήταν σε θέση να παράγει τόσο TA-CIN-ειδικά CD4

+ και CD8

+ Τ κυττάρου αποκρίσεις (Σχ. 2Β-D, S3A και C Σχ.). Ωστόσο, η διαμόρφωση TA-CIN με GPI-0100 ενισχύεται σε μεγάλο βαθμό και τις δύο αυτές αποκρίσεις Τ κυττάρων, ιδίως την TA-CIN-ειδικά CD4

+ κύτταρο αποκρίσεις Τ κατά 7 φορές (Σχ. 2Β, S3A και C Σχ.). Αυτή η CD4

+ Τ κυτταρική απόκριση είναι τουλάχιστον εν μέρει L2-ειδική καθώς HPV16 L2, αλλά όχι τα ψευδώς επιμολυσμένα, τα κύτταρα CT26 ήταν σε θέση να ενεργοποιήσουν CD4

+ Τ κύτταρα από εμβολιασμένα ποντίκια για να παράγουν IFN-γ (Σχ. 2C, S3b Σχ.). Δοκιμάσαμε επίσης αν υπάρχει απόκριση CD4 + Τ κυττάρων έναντι HPV16 Ε7 χρησιμοποιώντας ένα πεπτίδιο που περιέχει ένα προηγουμένως αναφερθεί επιτόπιο κυττάρων CD4 T [45] και δεν βρήκε καμία ανιχνεύσιμη απόκριση (S4 Εικ.). Σημαντικά, τα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με TA-CIN τυποποιούνται με GPI-0100 σε διάλυμα μαννιτόλης και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C δημιουργούνται παρόμοιες TA-CIN-ειδικά CD4

+, CD8

+ Τ κυττάρου και αποκρίσεων αντισώματος εξουδετέρωσης HPV16-ειδική σε πρόσφατα διατυπώθηκε TA-CIN με ΟΡΙ-0100 (Εικ. 2). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ΤΑ-CIN τυποποιούνται με GPI-0100 σε διάλυμα μαννιτόλης μπορούν να καταψυχθούν και να αποθηκευτούν στους -80 ° C για μια εκτεταμένη περίοδο (ισχύς διατηρήθηκε μετά από αποθήκευση 11 μηνών το μεγαλύτερο χρονικό διάστημα που ελέγχθηκαν μέχρι σήμερα), χωρίς να διακυβεύεται η ανοσογονικότητα του .

Α. Σχηματική απεικόνιση του πειραματικού πρωτοκόλλου. Εν συντομία, τα παλιά 5-8 εβδομάδων θηλυκούς ποντικούς BALB /c (5 ποντικοί /ομάδα) εμβολιάστηκαν υποδόρια με είτε 6,25 μg /ποντικό του ΤΑ-CIN, ή τυποποιούνται με 50 μα GPI-0100, ή τυποποιούνται με 50 μα GPI-0100 σε 50,7 mg /mL μαννιτόλης και υποβλήθηκε σε ένα μόνο κύκλο κατάψυξης /απόψυξης. Οι ποντικοί ενισχύθηκαν δύο φορές με το ίδιο σχήμα με μεσοδιάστημα 2 εβδομάδων. Δύο εβδομάδες μετά τον τελευταίο εμβολιασμό, οι οροί και τα σπληνοκύτταρα συλλέχθηκαν. B. Περίληψη της ανάλυσης κυτταρομετρίας ροής των TA-CIN-ειδικά CD4

κυτταρικές αποκρίσεις + Τ αναλύθηκαν με ΙΡΝ-γ ενδοκυτταρική χρώση (και αντιπροσωπευτικά δεδομένα φαίνεται στο S3A Σχ.). Γ Περίληψη της ανάλυση κυτταρομετρίας ροής εξέταση HPV16-ειδικά CD4

+ Τ κυτταρικές αποκρίσεις που επάγονται από TA-CIN τυποποιούνται με GPI-0100 σε μαννιτόλη και κατεψυγμένα /αποψυγμένα μία φορά. Σπληνοκύτταρα συλλέχθηκαν μετά τον εμβολιασμό και διεγείρονται είτε με TA-CIN ή HPV16 L2 επιμολυσμένα CT26 κύτταρα (και αντιπροσωπευτικά δεδομένα φαίνεται στο S3b Σχ.). D. Περίληψη της ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του ΤΑ-CIN-ειδικά CD8

κυτταρικές αποκρίσεις + Τ αναλύθηκαν με ΙΡΝ-γ ενδοκυτταρική χρώση. Τα δεδομένα που αποκτήθηκαν με FACSCalibur και αναλύονται με CellQuest (και αντιπροσωπευτικά στοιχεία φαίνεται στο S3C Εικ.). Ε Περίληψη της HPV16 L2-ειδικό τίτλο εξουδετερωτικών αντισωμάτων αναλύθηκαν με δοκιμασία εξουδετέρωσης HPV16-SEAP pseudovirus βάση.

Η

Για να ελέγξετε περαιτέρω κατά πόσον η κατεψυγμένη σύνθεση διατηρεί την ανοσογονικότητα μετά από έναν κύκλο ψύξης /απόψυξης, C57BL /6 ποντίκια που φέρουν TC-1 καρκινικά στους πνεύμονες χορηγήθηκαν είτε TA-CIN προσφάτως τυποποιούνται με GPI-0100, ή τΑ-CIN τυποποιούνται με GPI-0100 σε διάλυμα μαννιτόλης, φυλαγμένο στους -80 ° C και αποψύχθηκαν μόλις πριν την χρήση. Οι ποντικοί ενισχύθηκαν δύο φορές όπως υποδεικνύεται στο Σχ. 3Α, και 4 ημέρες μετά την τελευταία εμβολιασμό, οι πνεύμονες και τα σπληνοκύτταρα συλλέχθηκαν για να ανιχνεύσει την ανάπτυξη του όγκου και Τ κυτταρικές αποκρίσεις. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Β, C και S5A Σχ.), Τα ποντίκια που έλαβαν μόνο GPI-0100 δεν ανέστειλε TC-1 ανάπτυξης όγκου, και τα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με TA-CIN κατέδειξε μόνη μικρή αντικαρκινική δράση σε σύγκριση με χωρίς θεραπεία ποντικούς. Σε αντίθεση, οι ποντικοί που εμβολιάστηκαν με /ΟΡΙ-0100 σημαντικά ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου TA-CIN σε σύγκριση με TA-CIN ή ΟΡΙ-0100 μόνος ποντίκια με αγωγή, και η ανταπόκριση ήταν παρόμοια στα φρέσκα και κατεψυγμένα /αποψυγμένα σκευάσματα. Στη συνέχεια αναλύσαμε την CD8

+ Τ κυτταρικές αποκρίσεις εναντίον HPV16 Ε6 /Ε7 που προκαλείται από τον εμβολιασμό (Σχ. 4Α και S5B Εικ.). Καμία από τις ομάδες εμφάνισαν σημαντική Ε6-ειδικά CD8

αποκρίσεις + Τ κυττάρων. TA-CIN εμβολιασμένα ποντίκια που δημιουργούνται αδύναμη Ε7-ειδικών CD8

κυτταρικές αποκρίσεις + T (0.074 ± 0.065% σε σύγκριση με 0,013 ± 0,008% σε θεραπεία και 0,027 ± 0,024% του GPI-0100 αγωγή). Σε αντίθεση, οι ποντικοί που εμβολιάστηκαν με φρέσκο ​​διαμορφωθούν TA-CIN /ΟΡΙ-0100 που παράγεται 25 φορές περισσότερο (1,888 ± 1,679%, ρ = 0,003) και κατεψυγμένης μορφής δημιουργούνται 27-φορές περισσότερο (2,049 ± 2,078%, ρ = 0,008) Ε7 ειδικά CD8

+ Τ κύτταρα. Ε7-ειδικών CD8

+ Τ κύτταρα που δημιουργούνται από τη νωπά ή κατεψυγμένης μορφής του TA-CIN /GPI-0100 ήταν συγκρίσιμες (p = 0,851).

Α. Σχηματική απεικόνιση του πειραματικού πρωτοκόλλου. Εν συντομία, τα παλιά 5-8 εβδομάδων θηλυκά ποντίκια C57BL /6 (10 ποντικοί /ομάδα) εγχύθηκαν με 5 × 10

4 TC-1 κύτταρα ενδοφλεβίως την ημέρα 0. Την ημέρα 3, οι ποντικοί εμβολιάστηκαν s.c. είτε με 6,25 μg /ποντικό του ΤΑ-CIN, ή τυποποιούνται με 50 μα GPI-0100, ή τυποποιούνται με 50 μα GPI-0100 σε 50,7 mg /mL μαννιτόλη και κατεψυγμένα /αποψυγμένα μία φορά. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ. ένεση. 1Α.