Αφηρημένο

Ιστορικό

προστάτη εξαρτάται από ανδρογόνα για την επιβίωση και τη λειτουργία. Στο (πρώιμη) καρκίνου του προστάτη (PCA) ανδρογόνα ρυθμίζουν επίσης την ανάπτυξη του όγκου, η οποία αξιοποιείται από ορμονικές θεραπείες στις μεταστατική νόσο. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να χαρακτηρίσει την απόκριση του υποδοχέα ανδρογόνων (AR) σε ορμονική θεραπεία-ανθεκτικά κύτταρα PC346 και τον εντοπισμό δυνητικών δείκτες της νόσου.

χρησιμοποιήθηκαν Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Ανθρώπινο 19Κ oligoarrays να καθοριστεί το προφίλ έκφρασης των ανδρογόνων-ρυθμίζεται των κυττάρων PC346C αποκρίνονται στο ανδρογόνο και παράγωγο θεραπεία-ανθεκτική sublines του: PC346DCC (υποτυπώδη επίπεδα AR), PC346Flu1 (AR υπερέκφραση) και PC346Flu2 (T877A AR μετάλλαξη). Συνολικά, 107 μεταγραφήματα διαφορικά-εκφρασμένα σε PC346C και παράγωγα μετά R1881 ή υδροξυφλουταμιδίου διεγέρσεις. Τα προφίλ έκφρασης AR-ρυθμίζεται αντανακλούσε τις τροποποιήσεις AR των αντίστοιχων θεραπεία-ανθεκτική sublines: AR υπερέκφραση οδήγησε σε ισχυρότερη και ευρύτερη μεταγραφική απόκριση σε R1881 διέγερση, AR κάτω ρύθμιση συσχετίζεται με ανεπαρκή ανταπόκριση των γονιδίων AR-στόχο και τη μετάλλαξη T877A οδήγησε σε μεταγραφικό απάντηση τόσο R1881 και υδροξυφλουταμίδιο. Αυτή η υπογραφή AR-στόχο συνδέεται με πολλαπλές διαθέσιμες στο κοινό κυτταρική γραμμή και τα παράγωγα του όγκου δεδομένων του προστάτη, αποκαλύπτοντας ότι διακριτές λειτουργικές συστάδες έχουν διαφορετικά διαμορφωμένο κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του προστάτη. Διαφοροποίηση και εκκριτικών λειτουργιών ήταν πάνω ρυθμισμένα στην πρωτοβάθμια προστάτη, αλλά καταστέλλεται στη μετάσταση, ενώ ο πολλαπλασιασμός, κυτταροσκελετού αναδιαμόρφωση και πρόσφυση ήταν υπερεκφράζεται σε μετάσταση. Τέλος, τα ανδρογόνα-ρυθμιζόμενων γονιδίων ENDOD1, MCCC2 και ACSL3 επιλέχθηκαν ως πιθανοί δείκτες της νόσου για την ποσοτικοποίηση RT-PCR σε ένα διακριτό σύνολο δειγμάτων ανθρώπινου προστάτη. ENDOD1 και ACSL3 έδειξε κάτω ρύθμιση σε υψηλής ποιότητας και μεταστατικό προστάτη, ενώ MCCC2 ήταν υπερεκφράζεται σε χαμηλής ποιότητας ΣΕΣ.

Συμπεράσματα /Σημασία

τροποποιήσεις AR αλλάξει την μεταγραφική απόκριση (αντι) ανδρογόνα σε κύτταρα θεραπεία ανθεκτικών. Επιπλέον, η επιλεκτική ρύθμιση προς τα κάτω των γονιδίων που εμπλέκονται στην διαφοροποίηση και πάνω ρύθμιση των γονιδίων προώθηση του πολλαπλασιασμού και της εισβολής υποδηλώνουν διαταραγμένη ισορροπία μεταξύ των λειτουργιών ανάπτυξη και διαφοροποίηση της οδού AR κατά την διάρκεια της εξέλιξης του προστάτη. Τα ευρήματα αυτά μπορεί να έχουν επιπτώσεις στην τρέχουσα θεραπεία και την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων για τη μεταστατική προστάτη

Παράθεση:. Marques RB, Dits NF, Erkens-Schulze S, van IJcken WFJ, van Weerden WM, Jenster G (2011 ) Διαμόρφωση των ανδρογόνων υποδοχέων Σηματοδοσίας σε ορμονική θεραπεία-ανθεκτική καρκίνου του προστάτη κυτταρικών γραμμών. PLoS ONE 6 (8): e23144. doi: 10.1371 /journal.pone.0023144

Επιμέλεια: Laszlo Tora, Ινστιτούτο Γενετικής και Μοριακής και Κυτταρικής Βιολογίας, Γαλλία

Ελήφθη: 8 του Δεκέμβρη του 2010? Αποδεκτές: 13 Ιουλ, 2011? Δημοσιεύθηκε: 4 Αυγούστου 2011

Copyright: © 2011 Marques et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο που παρουσιάζονται σε αυτό το χειρόγραφο υποστηρίζεται οικονομικά από την ολλανδική Οργάνωση Επιστημονικής Έρευνας (NWO), μέσω ZonMW επιχορήγηση 903-46-187, και από την ολλανδική Εταιρεία Καρκίνου (KWF), μέσω επιχορηγήσεων NKB97-1479 και DDHK 2001-2455. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται μη δερματική κακοήθεια στους άνδρες και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις δυτικές χώρες [1]. Ο καρκίνος του προστάτη είναι μια εξαιρετικά ετερογενής κατάσταση, που εμφανίζουν ένα ευρύ φάσμα βιολογικών και κλινικών εκδηλώσεων. Ενώ μερικοί ασθενείς αναπτύσσουν μια ασυμπτωματική πορεία της νόσου και μάλλον να πεθάνουν με τον καρκίνο παρά από τον καρκίνο, άλλοι παρόν με μια πιο επιθετική και /ή πιο προχωρημένη νόσο κατά το χρόνο της διάγνωσης [2]. Όταν ο όγκος περιορίζεται στον προστάτη, μπορεί να αντιμετωπιστεί αποτελεσματικά με ριζική χειρουργική επέμβαση ή /και ακτινοθεραπεία, αλλά μόλις έχει διαδοθεί ο όγκος, απαιτείται συστηματική θεραπεία. Δεδομένου ότι ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα απαιτούν ανδρογόνα για την επιβίωση και ανάπτυξη τους, το χρυσό πρότυπο για τη θεραπεία των όγκων του προστάτη αποφυγής είναι ανδρογόνων μέσω χημικών ή χειρουργικό ευνουχισμό, οι οποίες μπορούν να συνδυαστούν με την χορήγηση του υποδοχέα ανδρογόνου (AR) ανταγωνιστές [2]. Οι περισσότεροι ασθενείς θα ωφεληθούν από αυτή την ορμονική θεραπεία, οι όγκοι μπορεί να συρρικνωθεί και τα συμπτώματα βελτίωση. Ωστόσο, τελικά όλοι οι καρκίνοι του θα γίνουν πιο ανθεκτικά και να επαναληφθεί ως θεραπεία-ανθεκτική ή ευνουχισμός ανθεκτική νόσο, για την οποία προς το παρόν δεν υπάρχει θεραπευτική αγωγή [3], [4]. Η οδός AR είναι πολύ ευπροσάρμοστη, που εμπλέκονται σε πολλές βιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένων του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, ρύθμιση της απόπτωσης και διαφοροποίησης [5]. Η ισορροπία μεταξύ αυτών των διαφορετικών λειτουργιών υπαγορεύει την ομοιόσταση του αδένα του προστάτη. Ένα κρίσιμο ερώτημα είναι πώς προστάτη καρκινικά κύτταρα που εξαρτώνται αρχικά σε ανδρογόνα μπορεί να επαναλάβει ανάπτυξη σε μια ανδρογόνο-στερηθεί περιβάλλον. Μια πιθανότητα είναι ότι ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα επιτευχθεί αυτό με την προσαρμογή AR μονοπάτι τους προς τα χαμηλά επίπεδα ανδρογόνων /υψηλή αντιανδρογόνο, για παράδειγμα με μετάλλαξη, ενίσχυση ή κολόβωση σε ιδιοσυστατικά ενεργό AR, η απορρύθμιση του συμπαράγοντες AR ή /και την παραγωγή ενδοογκική ανδρογόνων [6] , [7]. Από την άλλη πλευρά, τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να ενεργοποιήσουν εναλλακτικές οδούς ανάπτυξης, ενώ κλείνοντας καταστολείς όγκων και αποπτωτικά σήματα [6], [7].

Στην παρούσα μελέτη, επικεντρώθηκε στο ρόλο του μονοπατιού AR σε εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη. ιδρύθηκε το πρότυπο έκφρασης των γονιδίων των ανδρογόνων-ρυθμίζονται σε κυτταρικές σειρές που αποκρίνονται στο ανδρογόνο και ο ευνουχισμός ανθεκτικό, με στόχο να: (i) να διαπιστωθεί εάν η οδός AR εξακολουθεί να είναι λειτουργικά ενεργά στην ορμονική θεραπεία-ανθεκτικά κύτταρα PC346? (Ii) τον προσδιορισμό του μηχανισμού (ων) με την οποία η οδός AR μπορεί να ρυθμιστεί σε χαμηλά επίπεδα ανδρογόνων /υψηλή αντι-ανδρογόνο? (Iii) την ταυτοποίηση γονιδίων ανδρογόνο ρυθμίζονται που θα μπορούσαν ενδεχομένως να χρησιμοποιηθούν στην διάγνωση /πρόγνωση του καρκίνου του προστάτη ή ως ένας θεραπευτικός στόχος. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε την τεχνολογία μικροσυστοιχίας για να χαρακτηρίσει την μεταγραφική πρόγραμμα ενεργοποιείται από το συνθετικό ανδρογόνο R1881 και το υδροξυφλουταμίδιο αντιανδρογόνο. Καθώς το σύστημα μοντέλο χρησιμοποιήθηκαν οι PC346 κυτταρικές σειρές (Πίνακας 1): το αποκρίνονται στο ανδρογόνο PC346C γονική κυτταρική γραμμή και παράγωγο sublines θεραπεία ανθεκτική του PC346DCC, PC346Flu1 και PC346Flu2 [8]. Αυτά ευνουχισμό ανθεκτικά sublines αναπαράγουν κοινή AR τροποποιήσεις που παρατηρούνται στη θεραπεία-ανθεκτική νόσο:. AR κάτω ρύθμιση (PC346DCC), AR μετάλλαξη (PC346Flu2) και AR υπερέκφραση (PC346Flu1), καθιστώντας το ένα μοναδικό και πολύτιμο μοντέλο για τη μελέτη αυτή

Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Κανονική και όγκου δείγματα από ασθενείς ελήφθησαν από την παγωμένη τράπεζα ιστών του Ιατρικού Κέντρου Erasmus (Rotterdam, Κάτω Χώρες). Τα δείγματα συλλέχθηκαν μεταξύ 1984 και 2001. Τα πειραματικά πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από την ιατρική επιτροπή Δεοντολογίας Erasmus MC, σύμφωνα με την ιατρική έρευνα σε ανθρώπους νόμου.

Αντιδραστήρια και κυτταρικές σειρές

Η βασική κουλτούρα μέσο που χρησιμοποιείται για τη διατήρηση των κυτταρικών σειρών PC346 αποτελείτο από μέσο DMEM-F12 (Cambrex BioWhitaker, Belgium) συμπληρωμένο με 2% ορό εμβρύου μόσχου (FCS? PAN Biotech GmbH, Aidenbach, Γερμανία), 1% ινσουλίνη-τρανσφερίνης-σεληνίου (Gibco BRL ), 0,01% λευκωματίνη βόειου ορού (Boehringer Mannheim, Γερμανία), 10 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (Sigma-Aldrich), πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη αντιβιοτικά (100 U /ml πενικιλλίνη, 100 mg /ml στρεπτομυκίνη? BioWhitaker, Βέλγιο)? συν τις ακόλουθες προσθήκες: 100 ng /ml ινονεκτίνης (Harbor Bio-Products, Tebu-bio, Ολλανδία), 20 mg /ml fetuine (ICN Biomedicals, Ολλανδία), 50 ng /ml τοξίνης χολέρας, 0,1 mM φωσφοαιθανολαμίνη, 0,6 ng /ml τριιωδοθυρονίνη και 500 ng /ml δεξαμετασόνη (όλα από την Sigma). κύτταρα PC346C διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια σε πλήρες μέσο που αναφέρθηκαν παραπάνω, συμπληρωμένο με 0,1 ηΜ 17-μεθυλοτριενολόνη (R1881? ΝΕΝ, Boston ΜΑ, USA). PC346DCC μέσο επιλογής συμπληρώθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω, αλλά εξαντλημένο από ανδρογόνα χρησιμοποιώντας ξυλάνθρακα επικαλυμμένο με δεξτράνη (DCC) κατεργάζεται FCS. PC346Flu1 και PC346Flu2 μέσο καλλιέργειας επίσης ανδρογόνων εξαντλημένο χρησιμοποιώντας 2% DCC-FCS, και συμπληρωμένο με 1 μΜ υδροξυφλουταμιδίου (ΟΗ-φλουταμίδιο, Schering-Plough Research Institute, New Jersey, USA). Για τους διεγέρσεις ορμόνη, μια απλοποιημένη εκδοχή του μέσου καλλιέργειας χρησιμοποιήθηκε, που περιέχει 2% FCS DCC- χωρίς τις προαναφερθείσες προσθήκες (ελάχιστο μέσο). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε φιάλες καλλιέργειας ιστών Τ25 Primaria ™ (BD Biosciences Benelux NV, Ολλανδία) στους 37 ° C υπό 5% CO

2 υγρή ατμόσφαιρα.

ερεθίσματα ορμόνη και ανάλυση μικροσυστοιχιών έκφραση

τα κύτταρα σπάρθηκαν στα αντίστοιχα μέσο επιλογής τους να φθάσει -50% συρροή και αφέθηκαν να προσκολληθούν για μία νύχτα. Την επόμενη ημέρα, το μέσο αντικαταστάθηκε με 2% DCC-FCS σε ελάχιστο μέσο και τα κύτταρα στερήθηκαν για 48 ώρες, για να φέρει δραστικότητα AR στα βασικά επίπεδα πριν από τις διεγέρσεις ορμόνη. Ακολούθως, τα κύτταρα διεγέρθηκαν με είτε όχημα, 1 ηΜ R1881 ή 1 μΜ ΟΗ-φλουταμίδιο για 4, 8 ή 16 ώρες. Μετά διεγέρσεις, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν δύο φορές με PBS και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C μέχρι την απομόνωση του RNA. Ολικό RNA απομονώθηκε με το αντιδραστήριο ΚΝΑζοΙ Β (Campro Scientific, Veenendaal, Ολλανδία) και καθαρίστηκε περαιτέρω μέσω στηλών RNeasy (Qiagen) με on-στήλη πέψη DNA, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. ποιότητα του RNA ελέγχθηκε σε πήκτωμα 1% αγαρόζης.

Cy3- ή Cy5-σημασμένους ανιχνευτές RNA παρήχθησαν με την ενσωμάτωση αμινο-αλλυλ UTP κατά την διάρκεια ενίσχυσης RNA, που ακολουθείται από σύζευξη προς Ν-υδροξυηλεκτριμίδιο τροποποιημένη χρωστική. Εν συντομία, 3 μα RNA χρησιμοποιήθηκε για ένα πρωτόκολλο γραμμικής ενίσχυσης mRNA Τ7-based, που περιγράφηκε προηγουμένως [9]. Αμινο-αλλυλο UTP, συν ίση ποσότητα μη τροποποιημένου rUTP, ενσωματώθηκε στο aRNA με Τ7 MEGAscript Kit (όλα από Ambion), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα ενισχυμένα RNA καθαρίστηκε και συμπυκνώθηκε με χρήση Microcon-ΥΜ 30 στήλες (Amicon®) για την έκπλυση τρεις φορές με 300 μΙ RNAse χωρίς νερό. Τέλος, 2 μg αμινοαλλυλ-τροποποιημένο RNA, σε ένα μέγιστο 3,33 μΙ RNAse ελεύθερο νερό, επωάζεται με 1.66 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος διττανθρακικού νατρίου (0,3 Μ, ρΗ 9) και 5 μΐ Cy3- ή Cy5-χρωστική (CyScribe Μετα-Labeling Kit, Amersham, NJ, USA), για 1 ώρα στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Η αντίδραση σταμάτησε με 5 μΐ 4 Μ υδροξυλαμίνη HCl (Sigma), αντενδείξεις ιχνηθετημένων ανιχνευτών ενώθηκαν και καθαρίστηκαν /συμπυκνώθηκαν χρησιμοποιώντας Microcon-ΥΜ 30 στήλες. Probe συλλέχθηκε σε 5-15 μl τελικό όγκο και επαναιωρείται σε 80 μl υβριδισμού Ambion αριθμό ρυθμιστικό 1.

Για την μικροσυστοιχιών χρησιμοποιήσαμε oligoarrays διπλό βαφής που εκπροσωπούν περίπου 15.000 ανθρώπινα γονίδια, στην οποία επισημαίνονται ορμόνη που διεγείρεται RNA ήταν cohybridized με contra-επισημασμένο χρόνο ταιριαστό όχημα (αιθανόλη) ελέγχου της. Δύο μικροσυστοιχίες πραγματοποιήθηκαν ανά κατάσταση: σε ένα πείραμα τα διεγερμένα δείγματα σημάνθηκαν με Cy3 και τη μη διεγερμένα αναφοράς με Cy5, στο άλλο πείραμα στο αντίστροφα (dye-swap)? Αυτό έγινε για να αποκλείσει dye-προτιμησιακή σύνδεση προς ολιγονουκλεοτίδια στη μικροσυστοιχία. Επιπλέον, δύο ανεξάρτητες διόδους κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν για κάθε ένα από αυτά τα πειράματα, να ληφθεί υπόψη η βιολογική μεταβλητότητα.

Οι oligoarrays χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη παρήχθησαν στο Κέντρο Erasmus για Biomics. Εν συντομία, ένα ανθρώπινο 18.584 ολιγονουκλεοτίδια βιβλιοθήκης (Compugen, Sigma-Genosys) εθεάθη σε αμινοσιλανίου διαφάνειες χρησιμοποιώντας ένα Virtek Chipwriter Professional arrayer (Virtek Vision International, Waterloo, Καναδάς). σημεία ελέγχου που περιλαμβάνονται ορόσημα, ρυθμιστικό κηλίδες αίματος, αλλοδαπός ολιγονουκλεοτίδια (SpotReport Alien Oligo Array, La Jolla, Stratagene), πολυ d [Α] 40-60, DNA σπέρματος σολομού, και την ανθρώπινη COT-1 DNA. Πριν από την υβριδοποίηση, τα πλακίδια μικροσυστοιχιών προϋβριδοποιήθηκαν σε 5 χ SSC, 0,05% SDS, 4% διάλυμα BSA για 30 λεπτά στους 45 ° C, πλύθηκαν δύο φορές με RNAse χωρίς νερό για 2 λεπτά, ξεπλύθηκε με ισοπροπανόλη και spin-ξηραίνεται επί 3 λεπτά σε 1500 g. υβριδοποιήσεις μικροσυστοιχιών διεξήχθησαν όλη τη νύχτα στους 45 ° C, με συνεχή ανάδευση, σε ένα σταθμό HS4800 Hybridization (Tecan Benelux BV). Τέλος, οι συστοιχίες εκπλύθηκαν αυτόματα στο Σταθμό υβριδοποίηση με τη χρήση: 2χ SSC /0.05% SDS (στους 45 ° C), 1 χ SSC και 0.2 Χ SSC (σε θερμοκρασία δωματίου), και ξηραίνεται υπό ρεύμα Ν

2, πριν από τη σάρωση.

εξόρυξη δεδομένων και η ανάλυση

Πίνακες σαρώθηκαν σε ένα ΗΤ σαρωτή ScanArray Express (Perkin Elmer, Nederland BV) και σημείο εντάσεις ποσοτικά με τη χρήση ImaGene λογισμικού (Bio Discovery Inc, Ελ Sequndo , CA, USA). Για την εξισορρόπηση Cy3 και Cy5 σημείο εντάσεις, Loewess ομαλοποίηση ανά υπο-συστοιχίας πραγματοποιήθηκε με τη χρήση limma-πακέτο (https://bioinf.wehi.edu.au/limma/) από Bioconductor (https://www.bioconductor.org) [10] , [11]. Σε κλίμακα μεταξύ συστοιχιών, η παγκόσμια μέση ένταση ανά συστοιχία ορίστηκε στο 1000. εντάσεις χρωστικής κάτω από 200 στη συνέχεια κατώφλι στα 200, για την ελαχιστοποίηση του θορύβου και να κάνετε πολλαπλή μεταβολή στο φάσμα χαμηλής έντασης πιο ισχυρή από ακραίες τιμές. Κηλίδες με εντάσεις κάτω από το όριο (200), τόσο για Cy3 και Cy5 κανάλια, σε περισσότερο από 50% (& gt? 3/6) των συστοιχιών για κάθε χρονική πορεία, αποκλείστηκαν από την ανάλυση. Δείγμα για αναλογίες του οχήματος-μάρτυρα υπολογίζεται στη συνέχεια και 2log μεταμορφωθεί. Σημεία που έδειξαν αντίθετα αποτελέσματα για την βαφή-ανταλλαγής /βιολογική αντίγραφα αποκλείστηκαν από την περαιτέρω ανάλυση? επιδράσεις που ονομάζεται αντίθετο εάν η μέση αναλογία 2log για τα τρία χρονικά σημεία που εξετάστηκαν ήταν ≥0,5 για μία χρωστική και κάτω ≤-0,5 για την βαφή-ανταλλαγής. Μετά την κανονικοποίηση και όλες τις προαναφερθείσες ποιοτικούς ελέγχους, οι 2log αναλογίες ένταση και από τις δύο επαναλήψεις κατά μέσο όρο για κάθε χρονικό σημείο. Τα στοιχεία αυτά αποθηκεύονται σε SRS7 (έκδοση Ακολουθία Σύστημα Ανάκτησης 7, Lion Bioscience AG, Heidenberg, Γερμανία) [12], η οποία χρησιμοποιείται επίσης για τις συγκρίσεις με άλλα προηγουμένως δημοσιευθεί /διαθέσιμες στο κοινό βάσεις δεδομένων [13], [14], [15 ], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24].

Ιεραρχική ομαδοποίηση και τα δεδομένα απεικόνισης ήταν πραγματοποιήθηκε με τη χρήση προγραμμάτων Cluster και TreeView (Eisen Labs: https://rana.lbl.gov), αντίστοιχα. Σημασία Ανάλυση των μικροσυστοιχιών (SAM? https://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM) χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί ποια γονίδια ήταν στατιστικά διαφορετικές μεταξύ διεγερμένα δείγματα και μη διεγερμένα αναφορές. Γονιδιακή οντολογία ομαδοποίηση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση βάσεων δεδομένων για το σχολιασμό, την απεικόνιση και την Ολοκληρωμένη Discovery (DAVID: https://david.abcc.ncifcrf.gov) [25], [26]. Το μονοπάτι και λειτουργικές αναλύσεις που δημιουργούνται μέσω της χρήσης των Ingenuity Pathways Ανάλυση (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

Όλα τα δεδομένα μικροσυστοιχιών είναι MIAMI συμβατό και έχει κατατεθεί στην έκφραση του γονιδίου Omnibus αποθετήριο ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), υπό τον αριθμό πρόσβασης GEO GSE22914.

σύνθεση cDNA και ανάλυση RT-PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε όπως περιγράφεται ανωτέρω και cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας MMLV-ανάστροφης μεταγραφάσης kit και ολίγο (dT)

12-18 εκκινητή (Invitrogen), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Δείγματα cDNA φυλάχθηκαν στους -20 ° C. Για την επικύρωση των αποτελεσμάτων μικροσυστοιχίας, ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ΑΒΙ Prism 7700 Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems, Foster City, CA). KLK2, PART1, TPD52, FKBP5, GPR88, STEAP1, TRIB1 και ID3 ήταν ποσοτικά με απόλυτη QPCR SYBR Green ΚΟΧ Mix (Thermo Scientific) και 330 nm του κάθε εκκινητή, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα υπολογιστή Software Ολίγο Primer Ανάλυση εκδοχή 6,22 (Molecular Biology Insights Inc, USA). ειδικότητα Gene ελέγχθηκε με BLAST και, όποτε ήταν δυνατό, εκκινητές ιντρονίου-εκτείνονται επιλέξει να αποφύγει ενίσχυση του μολυσματικού DNA. Οι Primer αλληλουχίες που περιγράφονται στον Πίνακα 2. TMPRSS2, PSA και GAPDH ποσοτικοποιήθηκαν με TaqMan πραγματικού χρόνου ανάλυση PCR, χρησιμοποιώντας απόλυτη QPCR ROX Mix (Thermo Scientific). TMPRSS2 (δοκιμασία ID Hs00237175_m1) και GAPDH (δοκιμασία ID Hs99999905_m1) Κιτ αγοράστηκαν από την Applied Biosystems και τρέξιμο ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. PSA ποσοτικοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Για κάθε γονίδιο, μια πρότυπη καμπύλη κατασκευάστηκε από σειριακές αραιώσεις ενός πισίνα PC346 RNA μεταγράφηκε αντίστροφα, το οποίο στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της ποσότητας του μηνύματος στόχου από τον κύκλο όριο αξίας (Ct). Το γονίδιο GAPDH housekeeping χρησιμοποιήθηκε σαν ενδογενής έλεγχος.

Η

Για την ποσοτική ανάλυση PCR του πάνελ ανθρώπινου ιστού, φυσιολογικών και καρκινικών δειγμάτων από ασθενείς ελήφθησαν από την κατεψυγμένη τράπεζα ιστών του Ιατρικού Κέντρου Erasmus (Rotterdam , Ολλανδία). Πρόσθετες πληροφορίες σχετικά με αυτά τα δείγματα παρασχέθηκαν προηγουμένως [27]. TaqMan πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση διεξήχθη σε ΑΒΙ Prism 7700 Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems, Foster City, CA), χρησιμοποιώντας AmpliTaq Gold ϋΝΑ πολυμεράση (Applied Biosystems), σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή. Επικυρωμένες εκκινητές και ανιχνευτές από TaqMan Gene Expression δοκιμασίες (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση του ACSL3 (Hs01071247_m1), MCCC2 (Hs00223257_m1), ENDOD1 (Hs00826684_m1) και GAPDH (Hs99999905_m1), σύμφωνα με τις ρυθμίσεις της PCR που παρέχονται από την Applied Biosystems. PBGD προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας 330 nm εκκινητών προς τα εμπρός: 5′-CAT GTC ΤΟΟ ΤΑΑ CGG CAA TG-3 ‘και να αντιστραφεί: 5′-GTA CGA GGC ΤΤΤ CAA TGT TG-3’ εναύσματα, στο κύριο μίγμα τροφοδοσίας SybrGreen PCR (Applied Biosystems ), σύμφωνα με το πρωτόκολλο θερμικού κύκλου που συνιστάται από τον κατασκευαστή. ποσότητες μεταγραφής για κάθε δείγμα κανονικοποιήθηκαν έναντι του μέσου όρου των δύο ενδογενών παραπομπές και σε σχέση με ένα βαθμονομητή. Τα δύο γονίδια καθαριότητας χρησιμοποιηθεί ως ενδογενής αναφορές ήταν PBGD και GAPDH? ένα μείγμα των cDNAs από ξενομοσχεύματα καρκίνου του προστάτη χρησιμοποιήθηκε σαν τον βαθμονομητή. Γραφήματα και στατιστικά στοιχεία έγιναν με GraphPad Prism (έκδοση 3.0). P-τιμές & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

πρότυπο γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων PC346 θεραπεία με R1881 και υδροξυφλουταμιδίου

Για να χαρακτηρίζουν το προφίλ έκφρασης των γονιδίων στόχων υποδοχέα ανδρογόνων στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη, χρησιμοποιήσαμε την ανάλυση μικροσυστοιχιών έκφραση στον πίνακα PC346 κυτταρική σειρά επωάζεται με το ανάλογο ανδρογόνων R1881 ή το αντι-ανδρογόνο ΟΗ-φλουταμίδιο. Το σύστημα μοντέλο PC346 αποτελείται από τέσσερις κυτταρικές σειρές: το ανδρογόνα-ευαίσθητο PC346C και τρεις ορμονική θεραπεία-ανθεκτική υποσειρές, που προέρχεται από την γονική PC346C από μακροχρόνια ανδρογόνων (PC346DCC), όπως συμπληρώθηκε με το αντιανδρογόνο ΟΗ-φλουταμίδιο (PC346Flu1 και PC346Flu2 ). Όλες αυτές οι υποσειρές εμφανίζουν διαφορετικές ιδιότητες σε σχέση με την κατάσταση και την ανταπόκριση AR (που συνοψίζονται στον Πίνακα 1) [8].

Για την ανάλυση της έκφρασης που διεγείρεται τα κύτταρα με 1 ηΜ R1881 ή 1 μΜ ΟΗ-φλουταμίδιο για 4, 8 ή 16 ώρες και cohybridized το σημασμένο RNA με το χρόνο-συμφωνημένα όχημα (αιθανόλη) ελέγχου της. Δύο μικροσυστοιχίες πραγματοποιήθηκαν ανά συνθήκη, με τη χρήση δύο ανεξάρτητων περάσματα των κυττάρων σε dye-swap, να λογοδοτήσουν για τη βιολογική ποικιλότητα και τις δυνατότητες βαφής προτιμησιακή αποτελέσματα. Νωρίς χρονικά σημεία επιλέχθηκαν με σκοπό να εμπλουτίσει για την πρωτοβάθμια στόχους AR, και την ελαχιστοποίηση των έμμεσων δευτερεύοντες στόχους.

Οι δύο επαναλήψεις ανά χρονικό σημείο κατά μέσο όρο και επιλέχθηκαν συνολικά 107 διαφορικά εκφρασμένο μεταγραφές να αποτελέσει η AR μονοπάτι υπογραφή: 74 επάνω ρυθμισμένη και 33 κάτω-ρυθμίζονται από R1881 και /ή ΟΗ-φλουταμίδιο (πίνακες 3, 4, 5, 6). Οι κηλίδες θεωρούνται ότι διαφορικά εκφρασμένο αν η απόλυτη 2log αναλογία ≥0.5 (αναλογία ≥1.42 ή ≤0.71) και για τα τρία χρονικά σημεία, για τουλάχιστον ένα κυτταρικό τύπο. Σημασία Ανάλυση των μικροσυστοιχιών (SAM) χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί ποια γονίδια ήταν στατιστικά διαφορετικές μεταξύ διεγερμένα δείγματα και μη διεγερμένα αναφορές. Στο πειραματικό σχεδιασμό, επιλέξαμε για την εκτέλεση των ορμονικών διεγέρσεων σε 3 διαφορετικά χρονικά σημεία, έτσι ώστε οι μεταγραφές με ένα πιο γρήγορο ή πιο αργό απάντηση δεν θα πρέπει να χάσετε. Ωστόσο, ο χρόνος αποτέλεσμα ήταν αμελητέα: οι περισσότερες μεταγραφές ανδρογόνο ρυθμίζονται εκφράστηκαν διαφορικά σε όλα τα χρονικά τρία χρονικά σημεία και για τη στατιστική ανάλυση, αποφασίσαμε να συγκεντρώσουν όλα τα 3 σημεία φορά ανά συνθήκη. Συνολικά, υπήρχαν 253 SAM σημαντικά γονίδια, με ένα ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR), ορίζεται σε 0,05 (Πίνακες S1, S2, S3, S4). Από 107 μεταγραφές υπογραφή μας, θεωρούνται διαφορικά εκφράζονται σύμφωνα με τα προαναφερθέντα κριτήρια επιλογής, 77 ήταν στατιστικά σημαντικές με SAM. Πράγματι, η έκφραση των υπολοίπων 30 (28%) μεταγραφές της υπογραφής AR-στόχος μας ποίκιλαν ανάλογα με τα 3 χρονικά σημεία, έτσι ώστε αυτά δεν ήταν στατιστικά σημαντική στην συγκεντρωτική ανάλυση SAM. Αυτή η παραλλαγή δεν μπορεί να εξηγηθεί από μια φαινομενικά κυρίαρχη κινητική μοτίβο, ούτε μπορεί να αποδοθεί σε χρονικό σημείο 4 ώρες ειδικότερα. Επειδή παρατηρήθηκε χρονική ρύθμιση για τέτοιες λίγες μεταγραφές, δεν ανάλυση πραγματοποιήθηκε από τη δυναμική της διακύμανσης έκφρασης των γονιδίων σε όλη την ώρα. Οι αναλογίες έκφραση που παρουσιάζονται στους πίνακες και το Σχήμα 4 είναι από το μέσο όρο των τριών χρονικά σημεία ανά συνθήκη. Τέλος, το γεγονός ότι ένας σημαντικός αριθμός SAM σημαντικές μεταγραφές που δεν είχαν συμπεριληφθεί στο AR-ρυθμίζονται υπογραφή μας οφειλόταν στην επιλογή μας να θέσει το όριο αναλογίας 2log σε 0,5.

Η

Η ανδρογόνα-ευαίσθητο PC346C υπογραμμή ανταποκρίθηκαν στην διέγερση R1881 με αυξημένη έκφραση του 18 γονιδίων, ενώ 2 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω. Ανάμεσα σε αυτά είναι μερικά γνωστά AR ρυθμιζόμενα γονίδια, όπως KLK2, STEAP1, TMPRSS2 και FKBP5. Οι sublines θεραπεία-ανθεκτική έδειξε διακριτές απαντήσεις σε R1881 και ΟΗ-φλουταμίδιο. PC346Flu1, που εκφράζει 4 φορές υψηλότερα επίπεδα AR από την γονική κυτταρική γραμμή, έδειξαν μια «υπερ-ενεργοποίηση» της οδού AR με R1881, όχι μόνο στο μέγεθος της γονιδιακής έκφρασης, αλλά και στον αριθμό των ρυθμιζόμενων γονιδίων (20 ανδρογόνων -regulated γονίδια στο γονική PC346C έναντι 91 στην PC346Flu1). Αντιστρόφως, η υπογραμμή PC346DCC, η οποία εκφράζει επίπεδα υπολειμματικού του AR πρωτεΐνης, δεν έδειξε ανιχνεύσιμες αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση μετά τις ορμονικές θεραπείες. Ούτε PC346C, PC346DCC ούτε PC346Flu1 έδειξε σημαντικές αλλαγές στο μεταγραφικό προφίλ σε απάντηση ΟΗ-φλουταμίδιο. Σε αντίθεση, τα κύτταρα PC346Flu2, τα οποία εκφράζουν το T877A μεταλλαγμένο AR, έχει απαντήσει σε τόσο R1881 και αυτή αντιανδρογόνο, αν και η απόκριση στο τελευταίο ήταν ασθενέστερη (14 γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω από R1881 έναντι 8 πάνω ρυθμισμένα με ΟΗ-φλουταμίδιο? Πίνακες 3 και 5, αντίστοιχα)

Επικύρωση της

δεδομένων μικροσυστοιχιών

Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών επικυρώθηκε από δύο προσεγγίσεις:. μια πειραματική προσέγγιση, χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR, και μια προσέγγιση βιοπληροφορικής που συνδέει το γονίδιο υπογραφή μας σε μια το σύνολο των διαθέσιμων στο κοινό βάσεις δεδομένων για ανδρογόνων απάντηση. Έχουμε επιλέξει 10 γονίδια ανδρογόνων-ρυθμίζεται να αξιολογηθούν περαιτέρω με ποσοτική RT-PCR: PSA, KLK2, PART1, TPD52, GPR88, FKBP5, TMPRSS2, STEAP1, ID3 και TRIB1. Αξίζει να σημειωθεί ότι η ανάλυση μικροσυστοιχιών μας δεν ανίχνευσε ρύθμιση της έκφρασης PSA σε απάντηση των ορμονικές θεραπείες, αλλά δεδομένου ότι αυτό είναι ένα σημαντικό γονίδιο στόχος AR, περιελήφθη στο στάδιο επικύρωσης RT-PCR. Η ποσοτική ανάλυση PCR επιβεβαίωσε τη διαφορική έκφραση όλων των επιλεγμένων γονιδίων στην ίδια κατεύθυνση προβλέψει η ανάλυση μικροσυστοιχιών (Εικ. 1). Επιπλέον, η RT-PCR έδειξε επίσης μια ισχυρότερη επίδραση της ορμόνης-θεραπεία στην κυτταρική γραμμή PC346Flu1, σε αντίθεση με την σχεδόν απούσα επαγωγή κυττάρων PC346DCC, όταν συγκρίνεται με το γονικό PC346C, για τα περισσότερα γονίδια που αναλύθηκαν. Όπως παρατηρήθηκε στην δοκιμασία μικροσυστοιχία, PC346Flu2 έδειξαν ισοδύναμες αποκρίσεις σε R1881 και ΟΗ-φλουταμίδιο για πολλά ρυθμιζόμενα γονίδια (Εικ. 1, πίνακες 3, 4, 5, 6).

ποσοτική ανάλυση RT-PCR από ένα σύνολο 10 γονίδια ανδρογόνων-ρυθμίζονται σε κυτταρικές σειρές PC346. Τα κύτταρα διεγέρθηκαν με 1 ηΜ R1881 (R1881), 1 mM ΟΗ-φλουταμίδιο (Flut) ή ελέγχου του οχήματος (DCC-FCS) για 16 ώρες. Τα γραφήματα δείχνουν την μέση (± SE) του κανονικοποιημένου γονιδιακής έκφρασης (n.g.e.) σε σχέση με το γονίδιο GAPDH οικοκυρική, για δύο ανεξάρτητες διόδους κυττάρων. ID3 και TRIB1 ήταν ανδρογόνων-κατασταλεί στις δοκιμασίες μικροσυστοιχιών, ενώ τα άλλα γονίδια ήταν up-ρυθμίζεται από ανδρογόνα.

Η

Η

Κατά τα τελευταία χρόνια, μια σειρά μελετών έχουν δημοσιευθεί και αναλύθηκαν έκφραση γονιδίου σε απόκριση προς διέγερση ανδρογόνων σε κυτταρικές γραμμές και ξενομοσχεύματα (Πίνακας 7). Από τους 107 μεταγραφές στην υπογραφή μας, 73 ήταν παρούσα σε τουλάχιστον 3 από τα 5 βάσεων δεδομένων και συμπεριλήφθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Περισσότερο από το 90% των συνδεδεμένων γονιδίων επικαλύπτεται με προηγουμένως αναφερθεί ανδρογόνο ρυθμίζεται στόχους. Γονίδια με τα ισχυρότερα επαγωγές στη σημερινή εργασία μας έδειξε επίσης σταθερά υψηλή επαγωγές σε πολλαπλές προηγούμενες εκθέσεις, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα προϊόντα αυτών των γονιδίων μπορεί να παίζει ένα βασικό ρόλο στη βιολογική λειτουργία του προστάτη (Σχ. 2). Χρησιμοποιώντας το μοναδικό πίνακα κυτταρική σειρά μας, ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει νέα γονίδια που αποκρίνονται στο ανδρογόνο όπως MAFB, KLF9, NFIB, STBD1, BIK και HLX.

Στην αριστερή πλευρά, PC346C, PC346Flu1 και PC34Flu2 εκτέθηκαν σε 1 ηΜ R1881 ή 1 μΜ ΟΗ-φλουταμίδιο για 4, 8 και 16 ώρες, ενώ PC346DCC διεγέρθηκε με μόνο 1 ηΜ R1881. Στη δεξιά πλευρά, η γονιδιακή υπογραφή μας εκτιμήθηκε στις βάσεις δεδομένων από DePrimo

et al.

, Νέλσον

et al.

, Nickols

et al.

, Wang

et al.

και Hendriksen

et al.

(βλέπε πίνακα 7 για λεπτομέρειες της βάσης δεδομένων). Θερμότητα χάρτη παρουσιάζεται για 2log αναλογία έκφρασης μεταξύ των δειγμάτων με ορμόνες και τα αντίστοιχα χειριστήρια του οχήματος χρόνο-συμφωνημένα. Κόκκινα και πράσινα χρώματα αντιπροσωπεύουν επαγωγής και καταστολής, αντίστοιχα, ενώ το μαύρο υποδηλώνει καμία ρύθμιση. Γκρι τετράγωνα δείχνουν τα στοιχεία που λείπουν λόγω της χαμηλής έκφρασης, η κακή ποιότητα των δεδομένων ή την απουσία των ανιχνευτών για την αντίστοιχη μεταγραφή στην πλατφόρμα σειρά χρησιμοποιείται για τη μελέτη.

Η

Η

Βιολογικές διεργασίες που συντονίζεται από το AR μονοπάτι

Τα γονίδια υπογραφή ανδρογόνο ρυθμίζονται ταξινομήθηκαν σύμφωνα με την οντολογία γονιδίων (GO) βιολογικών διεργασιών με τη χρήση της βάσης δεδομένων για το σχολιασμό, την απεικόνιση και την Ολοκληρωμένη Discovery (DAVID: https://david.abcc.ncifcrf.gov) [25], [26].

Σύμφωνα με τις φυσιολογικών ρόλων των ανδρογόνων, η προσέγγιση αυτή αποκάλυψε ότι τα γονίδια-στόχους AR επιλέγονται στην παρούσα μελέτη λειτουργούν στη ρύθμιση της μεταγραφής και οδών ενδοκυτταρικής σηματοδότησης, το μεταβολισμό των πρωτεϊνών , λιπίδια και υδατάνθρακες, καθώς και η ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης (Εικ. 3Α) κυττάρων. Η μεγαλύτερη κατηγορία περιλαμβάνει γονίδια που κωδικοποιούν για μεταγραφικούς παράγοντες και ρυθμιστές της μεταγραφής, όπως NFIB, KLF9, HIF1A, MAFB, EHF, NCOR1, NCOR2, PIAS1 και αρκετές δακτύλου ψευδαργύρου πρωτεΐνες (ZNF189, ZBTB10, ZBTB16 και CASZ1). Αυτό ακολουθήθηκε από γονίδια που εμπλέκονται στην ενδοκυτταρική μεταγωγή σήματος, συμπεριλαμβανομένου του συζευγμένου με πρωτεΐνη Ο υποδοχέων οδού (GPR88, RGS2, GNAI1), μικρά GTPases της οικογένειας Ras (RhoB, RHOU), που ενεργοποιείται από μιτογόνο καταρράκτη κινάσης πρωτεΐνης (MAP2K4, MKNK2, TRIB1) και άλλων πρωτεϊνικών κινασών /φωσφατάσες (PPM1A, PPP2CB, PIK3R3, SGK1). Άλλες AR ανταποκρίνεται γονίδια έχουν επίπτωση επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού μέσω της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου και αποπτωτικών διεργασιών (π.χ. RCC1, BBX, BIK, TP53INP1). Η ταυτόχρονη με το ρόλο των ανδρογόνων για την ανάπτυξη του προστάτη και την ωρίμανση, ένα άλλο σημαντικό γονίδια συμπλέγματος περιλαμβάνονται εμπλέκονται στην κυτταρική διαφοροποίηση, όπως TPD52, TWSG1, NDRG1, ID 1 και ID3. Τέλος, ανδρογόνων που προκαλείται από το μεταβολισμό των πρωτεϊνών, των υδατανθράκων και των λιπιδίων που συμβάλλουν στην παραγωγή και έκκριση του προστατικού υγρού. Τέτοια γονίδια-στόχους R1881 περιλαμβάνονται MTHFD1, PSPH, PSAT1 και MCCC2, που κωδικοποιούν ένζυμα στο μεταβολισμό της μεθειονίνης, σερίνη και λευκίνη αμινοξέα, αντίστοιχα. Επιπλέον, προς τα πάνω ρύθμιση του παράγοντα EIF2C3 έναρξης μετάφρασης δυνητικά προάγει τη σύνθεση πεπτιδίων. Επιπλέον, τα γονίδια που συμμετέχουν στην πρωτεϊνική αναδίπλωση (PDIAS5, FKBP5), γλυκοζυλίωση (FUT8, GALNT1) και της εμπορίας (DMN1L, KDELR2) επίσης ρυθμίζεται από R1881. Εκτός από τις πρωτεΐνες και αμινοξέα, προστατικό υγρό είναι επίσης πλούσια σε λιπίδια, πολυαμίνες, σορβιτόλη και διάφορα μεταλλικά ιόντα. Πράγματι, R1881 διεγείρεται επίσης έκφραση του ACSL3 και ELOVL5, τα οποία συμμετέχουν στην επιμήκυνση του λιπαρά οξέα, σπερμίνη συνθάσης (SMS), μέρος της πολυαμίνης συνθετικής οδού, αφυδρογονάση σορβιτόλης (Sord), που εκκρίνεται από τον προστάτη στο σπερματικό υγρό, και τα κανάλια ιόντων ACCN4 και KCNJ10.

γονίδια (Α) πίτα-γράφημα που αντιπροσωπεύει κατηγοριοποιούνται σύμφωνα με τα πιο εξέχοντα βιολογική λειτουργία. σχολιασμούς γονίδιο οντολογίας εξήχθησαν χρησιμοποιώντας DAVID [25], [26]. (Β) Συμμετοχή των γονιδίων AR οδού στη νόσο του προσδιοριζόμενου με Ingenuity Διαδρομή Ανάλυση (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

Η

Για να αυτοματοποιήσει τη λειτουργική ταξινόμηση, την ποσοτικοποίηση του βαθμού εμπλουτισμού του καθενός σύμπλεγμα και επιλέξτε στατιστικά σημαντικές λειτουργικές κατηγορίες χρησιμοποιήσαμε το εργαλείο λειτουργική Σχολιασμός Clustering DAVID. Αυτό το εργαλείο που προσδιορίζονται 6 στατιστικά σημαντική Clusters σχολιασμού, η οποία σχετίζεται με το μεταβολισμό των οργανικών οξέων (λιπίδια και αμινοξέα), απόπτωση, κυτταρική διαφοροποίηση, αναπτυξιακές διαδικασίες, ρύθμιση της μεταγραφής και της ρύθμισης των κυτταρικών διαδικασιών (Πίνακας 8).

Η συμμετοχή των γονιδίων ανδρογόνο ρυθμίζονται σε παθολογικές καταστάσεις ερευνήθηκε περαιτέρω με τη χρήση της βάσης δεδομένων Ingenuity (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com). Οι ισχυρότερες συσχετίσεις βρέθηκαν για τον καρκίνο, το αναπαραγωγικό σύστημα, δερματολογικών και καρδιαγγειακών νοσημάτων (Εικ. 3Β).

Το μονοπάτι AR στην ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη και την εξέλιξη

Για να διερευνήσουν πώς η οδός AR είναι διαμορφωμένο κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη που συνδέεται ανδρογόνα ρυθμίζονται μας γονίδιο υπογραφή σε επτά ανεξάρτητες προστάτη βάσεις δεδομένων καρκίνο μικροσυστοιχίας. Αυτές οι μελέτες περιελάμβαναν δείγματα του «κανονικού προστάτη» και όγκους του προστάτη από διαφορετικές στάδια της νόσου, της οποίας τα κύρια χαρακτηριστικά συνοψίζονται στον Πίνακα 7. Ένα σύνολο 89 ορμόνη αποκρίνονται γονίδια ήταν παρούσα σε τουλάχιστον 4 από τις 7 βάσεων δεδομένων, και επιλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Στο σχήμα 4, δείχνουμε την ιεραρχική συσταδοποίηση των R1881 αποκρίνονται γονίδια (πρώτο μπλοκ του 4 στήλες), δίπλα στην πρωτογενή καρκίνο έναντι κανονικό προστάτη (δεύτερο μπλοκ), η μετάσταση έναντι πρωτογενούς καρκίνου (τρίτο μπλοκ), και, τέλος, επαναλαμβανόμενες έναντι μη επαναλαμβανόμενες και η ορμονική θεραπεία-ανθεκτική έναντι ορμόνες αφελείς νόσο (τέταρτο μπλοκ).