Αφηρημένο

Ιστορικό

Η θεραπεία για τους ασθενείς με προχωρημένο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) καθορίζεται συχνά από την παρουσία των βιοδεικτών που προβλέπουν την απόκριση σε παράγοντες στόχευσης συγκεκριμένων μοριακών οδών. Οι απαιτήσεις για πολλαπλή ανάλυση των γονιδίων που εμπλέκονται στην παθογένεια της NSCLC αύξηση.

Μέθοδοι

Εμείς επικυρωθεί το σύστημα Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) με τη χρήση του Ion AmpliSeq Καρκίνου Hotspot Panel και σύγκριση τα αποτελέσματα με εκείνα που ελήφθησαν με τη χρήση των τυπικών μεθόδων του χρυσού, συμβατική PCR και αλληλούχιση Sanger. Η μέθοδος PCR cycleave χρησιμοποιήθηκε για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων.

Αποτελέσματα και Συμπέρασμα

Ο Ion Torrent PGM οδήγησε σε παρόμοιο επίπεδο ακρίβειας στον εντοπισμό πολλαπλές γενετικές μεταλλάξεις, παράλληλα, σε σύγκριση με τα συμβατικά PCR και αλληλουχίας Sanger? Ωστόσο, ο Ion Torrent PGM ήταν ανώτερη από τις άλλες μεθόδους προσδιορισμού αλληλουχίας όσον αφορά την αυξημένη ευκολία χρήσης, ακόμη και όταν λαμβάνεται υπόψη η μικρή ποσότητα του DNA που ελήφθη από σταθεροποιημένο με φορμαλίνη ενσωματωμένα σε παραφίνη (FFPE) δείγματα βιοψίας.

Παράθεση: Fujita S, Masago Κ, Takeshita J, Okuda C, Otsuka Κ, Hata A, et al. (2015) Επικύρωση του Ion Torrent αλληλουχίας Πλατφόρμα για την ανίχνευση γονιδιακών μεταλλάξεων σε δείγματα βιοψίας από ασθενείς με μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 10 (6): e0130219. doi: 10.1371 /journal.pone.0130219

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Αντώνης W. Ι Lo, Queen Mary Hospital, ΧΟΝΓΚ ΚΟΝΓΚ

Ελήφθη: 28 του Δεκ 2014? Αποδεκτές: 17 Μάη, 2015? Δημοσιεύθηκε: 15 Ιουνίου του 2015

Copyright: © 2015 Fujita et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Τα δεδομένα είναι διαθέσιμα από το Θεσμικό Access /Επιτροπή Δεοντολογίας δεδομένων Ibri εξαιτίας ηθικών περιορισμών που σχετίζονται με την προστασία της ιδιωτικής ζωής του ασθενούς. Σε περιπτώσεις αίτησης δεδομένων, τα μέλη του Διοικητικού Συμβουλίου θα αποφασίσει αν πρέπει ή όχι να απελευθερώσει τις πληροφορίες

Χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

η θεραπεία για ασθενείς με προχωρημένο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) καθορίζεται συχνά, όπως συμβαίνει και για άλλους καρκίνους επί ανθρώπων, με την παρουσία του βιοδείκτες που προβλέπουν την απόκριση σε παράγοντες που στοχεύουν συγκεκριμένες μοριακών οδών σε κακοήθη κύτταρα. Ευνοϊκές απόκριση σε κινάσης τυροσίνης (ΤΚ) αναστολείς που στοχεύουν τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), σε περιπτώσεις NSCLC στις οποίες οι μεταλλάξεις είναι παρόντα στο γονίδιο EGFR, απεικονίζουν τη σημασία του προσδιορισμού του μοριακού βιοδείκτες, και αρκετές τέτοιες ογκογόνο μεταβολές ήταν αναφερθεί μέχρι σήμερα [1-3]. Αυτές οι μοριακές αλλαγές μπορούν να χωριστούν σε δύο κατηγορίες? γενετικές ανακατατάξεις που απαιτούν ανάλυση ή /και φθορισμό RNA-based in situ υβριδισμού για την αναγνώρισή τους, και οι μεταλλάξεις του γονιδίου (συμπεριλαμβανομένων των μικρών εισαγωγή ή διαγραφή εκδηλώσεις) που διερευνώνται χρησιμοποιώντας ανάλυση με βάση το DNA. Οι μεταλλάξεις έχουν ανακαλυφθεί σε αρκετά γονίδια εκτός από

EGFR

που εμπλέκονται στην παθογένεση του NSCLC (δηλαδή

KRAS

,

NRAS

,

HER2

,

ΑΚΤ1

,

BRAF

,

PIC3CA

) και η ζήτηση για πολλαπλή ανάλυση αυτών των γονιδίων αυξάνεται.

Τα μόνα δείγματα ιστού που είναι συνήθως διαθέσιμα για ανάλυση μεταλλάξεων στο κλινικό περιβάλλον είναι δείγματα βιοψίας που ελήφθη transbronchially ή διαδερμικά. Τα δείγματα αυτά τείνουν να είναι μικρές και υποβάλλονται στην διαδικασία φορμαλίνη στερέωσης. Ανίχνευση μεταλλάξεων εκτελώντας PCR και αλληλούχιση Sanger παράλληλα είναι χρονοβόρα και απαιτεί ένα σημαντικό ποσό του DNA, η οποία είναι συχνά διαθέσιμο λόγω του μικρού μεγέθους του δείγματος. Μια πρόσφατα αναπτυχθείσα τεχνική, μαζικά παράλληλων αλληλουχίας του DNA, επιτρέπει τη γρήγορη, ευαίσθητη και εξαιρετικά ειδική ανίχνευση των μεταλλάξεων του γονιδίου σε μια μόνο ανάλυση, σε λογικό κόστος.

Εδώ, χρησιμοποιήσαμε το σύστημα Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) (Thermo Fisher Scientific) σε συνδυασμό με το Ion AmpliSeq Καρκίνου Hotspot Panel, έκδοση 2 και συνέκριναν τα αποτελέσματα με εκείνα που λαμβάνονται από τις χρυσές πρότυπες μεθόδους για την ανάλυση μεταλλάξεων, συμβατική PCR και Sanger αλληλούχισης. Επιπλέον, μια ιδιαίτερα ευαίσθητη μέθοδο PCR, η cycleave μέθοδο PCR, χρησιμοποιήθηκε, εστιάζοντας σε μεταλλάξεις του γονιδίου EGFR και KRAS συγκεκριμένα, για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται τόσο από συμβατική PCR και το σύστημα Ion Torrent PGM.

Μέθοδοι

Ηθική

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από το Ινστιτούτο Βιοϊατρικής Έρευνας και το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review Νοσοκομείου Καινοτομίας. Όλοι οι ασθενείς που παρέχονται γραπτές, ενημερωμένη συγκατάθεση. Η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις ηθικές αρχές της Διακήρυξης του Ελσίνκι.

Πληροφορίες για τον ασθενή

δείγματα όγκων που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη συλλέχθηκαν από το Ινστιτούτο Βιοϊατρικής Έρευνας και Καινοτομίας Νοσοκομείο, Ιαπωνία. Σύμφωνα με τις ισχύουσες κατευθυντήριες γραμμές, όλα τα δείγματα όγκων FFPE από ασθενείς με καρκίνο μη μικροκυτταρικό πνεύμονα με άγνωστο γονότυπο (

EGFR

και

KRAS

) αναλύθηκαν με συμβατική αλληλουχίας PCR και Sanger για να καθορίσει περαιτέρω επεξεργασία. Ως σύγκριση, συνολικά δείγματα όγκων 21 αναλύθηκε με το σύστημα Ion PGM και τη μέθοδο PCR cycleave

Αναλύονται γονίδια

EGFR

:. Εξόνιο 19 διαγραφή (συμπεριλαμβανομένων Ε746 -A750), εξόνιο 21 L858R, εξόνιο 21 L861Q

KRAS

: εξόνιο 2 G12X

δείγματα ιστών και DNA Μονώσεις

Μόνο οι δειγμάτων βιοψίας η οποία αποκάλυψε NSCLC παθολογικά αναλύθηκαν. Σε όλες τις περιπτώσεις, βρογχοσκόπηση βιοψία ή πυρήνα βελόνα βιοψίας διεξήχθη (Σχήμα 1Α και 1Β). Ένα ειδικό βελόνα 21-gauge χρησιμοποιήθηκε για την απόκτηση ιστολογική πυρήνα. Ιστολογική πυρήνες σταθεροποιήθηκαν με φορμαλίνη και χρησιμοποιήθηκαν για παθολογική διάγνωση. Μετά ιστοπαθολογικές διάγνωση, τα δείγματα FFPE (1 έως 3 δείγματα από 5-μm πάχους τμήμα) αποπαραφινοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ξυλόλιο. DNA απομονώθηκε από τα τμήματα με τη χρήση της QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εμείς μετρούμενη συγκέντρωση DNA με NanoDrop Lite Φασματοφωτόμετρο (Thermo Fisher Scientific).

(Α) φορμόλη-σταθερές τομές παραφίνης δείγμα. (Β) ένα δείγμα 5-μm πάχους τμήμα.

Η

Συμβατικά PCR και αλληλούχιση Sanger

Τα εξώνια 18 έως 21 ενισχύθηκαν με PCR και αναλύθηκαν. Οι εκκινητές και οι συνθήκες ποδηλασίας για PCR ενίσχυση τροποποιήθηκαν από τις μεθόδους που δημοσιεύτηκαν προηγουμένως [4]. Οι αντιδράσεις προσδιορισμού αλληλουχίας υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε ένα ΑΒΙ PRISM 3100 (Thermo Fisher Scientific). Η άμεση ανάλυση αλληλουχίας των προϊόντων PCR διεξήχθη σε δύο κατευθύνσεις νόημα και αντινόημα.

Η μέθοδος PCR cycleave

Χρησιμοποιήσαμε ένα χιμαιρικό DNA-RNA-DNA ανιχνευτή σημασμένο με φθορίζουσα χρωστική και απόσβεσης σε κάθε άκρο [5]. Μια αλληλουχία RNA των ανιχνευτών αντιστοιχεί σε εκείνη του άγριου τύπου και σημειακή μετάλλαξη (εξόνιο 21 L858R, εξόνιο 21 L861Q) επισημασμένο με FMA και ROX, αντίστοιχα. Όταν μεταλλαγμένα μόρια είναι παρόντα στο δείγμα και ΡΟΚ-ενισχυμένο DNA δημιουργεί ένα πλήρες υβρίδιο με το τμήμα RNA του μεταλλαγμένου ανιχνευτή, RNase-Η χωνεύει τον καθετήρα στο ετεροδιπλό RNA-DNA σε δύο κομμάτια, που οδηγεί σε σημαντική αύξηση στην ένταση φθορισμού με διαχωρισμό της φθορίζουσας χρωστικής από την αποσβέστη.

Για την ανίχνευση της διαγραφής στο εξόνιο 19 του γονιδίου EGFR, χρησιμοποιήθηκε κοινή ανάλυση θραύσμα. Δείγμα DNA ενισχύθηκε με έναν εκκινητή σετ FAM σημασμένο και τα προϊόντα της PCR υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση. PCR ενισχυμένο το μικρότερο τμήμα του DNA, δημιουργώντας ένα νέο ανώτατο όριο σε μια ηλεκτροφόρημα όταν μια μετάλλαξη διαγραφής ήταν παρούσα [5].

Ion Torrent PGM Βιβλιοθήκη Προετοιμασία και αλληλουχίας

Ένα Ion Torrent προσαρμογέα-προσδέθηκε βιβλιοθήκη παρήχθη εξής Ion AmpliSeq βιβλιοθήκη Kit 2.0 πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Thermo Fisher Scientific, Rev. 5? MAN0006735). Εν συντομία, 50 ng συγκεντρώνονται αμπλικόνια ήταν στο τέλος επισκευάστηκε, και Ion Torrent προσαρμογείς Ρ1 και Α συνδέθηκαν με DNA λιγάση. Μετά τον καθαρισμό χάντρα AMPure (Beckman Coulter), τη συγκέντρωση και το μέγεθος της βιβλιοθήκης προσδιορίστηκαν με τη χρήση του συστήματος Life Technologies StepOne (Thermo Fisher Scientific) και Ion Βιβλιοθήκη TaqMan της μεθόδου ποσοτικού προσδιορισμού Kit (Thermo Fisher Scientific).

γαλάκτωμα Δείγμα PCR, διάσπαση του γαλακτώματος, και τον εμπλουτισμό διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το Ion PGM IC 200 Kit (Thermo Fisher Scientific), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, μια συγκέντρωση εισόδου του ένα αντίγραφο εκμαγείου DNA /Ίων Sphere Σωματίδια (ISP) προστέθηκε στο γαλάκτωμα PCR μάστερ μιξ και το γαλάκτωμα που παράγεται με τη χρήση του Ion Chef (Thermo Fisher Scientific). Πρότυπο θετικά ISPs εμπλουτίστηκαν και αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 314 μάρκες π.Χ. στον Ion Torrent PGM για 65 κύκλους και barcoding πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Ion DNA Barcoding (Thermo Fisher Scientific).

Variant καλώντας

τα στοιχεία από τα τρεξίματα PGM αρχικά σε επεξεργασία με τη χρήση του Ion Torrent συγκεκριμένη πλατφόρμα λογισμικού αγωγού, Torrent Suite, για να δημιουργήσει ακολουθία διαβάζει, κόψτε ακολουθίες μετασχηματιστή, φίλτρο, και αφαιρέστε φτωχό σήμα-προφίλ διαβάζει. Αρχική παραλλαγή ζητώντας από τα δεδομένα αλληλουχίας Ion AmpliSeq δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας v4.0 Torrent σουίτα λογισμικού με ένα plug-in » παραλλαγή του καλούντος προγράμματος «. Για την εξάλειψη εσφαλμένη βάση calling, τρία βήματα φιλτράρισμα χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργήσουν την τελική παραλλαγή κλήση. Το πρώτο φίλτρο καθορίστηκε σε ένα μέσο βάθος της συνολικής κάλυψης των & gt? 100, η ​​κάθε παραλλαγή κάλυψη & gt? 20 και P-value & lt? 0,01. Το δεύτερο φίλτρο είχε προσληφθεί από την οπτική εξέταση των μεταλλάξεων με τη χρήση του λογισμικού Ολοκληρωμένες Genomics Viewer (https://www.broadinstitute.org/igv) ή CLC Workbench Genomics έκδοση 7.5.1 (Qiagen), καθώς και φιλτράροντας τις πιθανές σκέλος, συγκεκριμένα σφάλματα ? δηλαδή, μια μετάλλαξη ανιχνεύθηκε μόνο σε είτε το » συν «ή » μείον» κλώνο, αλλά όχι και στα δύο σκέλη του DNA.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Ένα σύνολο δειγμάτων όγκων 21 (10 από βρογχοσκοπικών διαβρογχική βιοψία, 6 βιοψία του όγκου CT-καθοδηγούμενη και 5 του πυρήνα-βελόνα βιοψίας επιφανειακό λεμφαδένα) αναλύθηκαν. Μια μέση τιμή εξάγεται συγκέντρωση DNA ήταν 115.2 ng /μl (ελάχιστο 29.3, μέγιστη 786.1) και μια κατάλληλη ποσότητα DNA χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1 και το Σχήμα 2, τα αποτελέσματα της γονιδιακής μετάλλαξης αναλύσεων που λαμβάνεται με προσδιορισμό αλληλουχίας Sanger ήταν ταυτόσημα σε όλες τις περιπτώσεις με εκείνες που προέρχονται από αναλύσεις με χρήση του συστήματος Ion PGM. Όσον αφορά την EGFR, τα αναλυτικά αποτελέσματα που λαμβάνονται με ανάλυση αλληλουχίας Sanger συμφωνημένα εντελώς εκείνα που λαμβάνονται με την μέθοδο cycleave και του συστήματος Ion PGM. Κανένας από τους όγκους που εξετάστηκαν είχαν μεταλλάξεις σε τόσο στον τομέα του EGFR ΤΚ και το γονίδιο KRAS.

(Α) μετάλλαξη KRAS (G12V) που προσδιορίζονται από cycleave τεχνολογία. (Β) μετάλλαξης του EGFR (εξόνιο 19 διαγραφή) που προσδιορίζονται από την ανάλυση θραύσμα (C) KRAS μετάλλαξη (G12V) ανιχνεύθηκε με τεχνολογία ιόντων PGM. C σε Α μεταστροφής ταυτοποιήθηκε. (D) μετάλλαξη EGFR (εξόνιο 19 διαγραφή) ανιχνεύθηκε με τεχνολογία ιόντων PGM.

Η

Μια δεύτερη μετάλλαξη EGFR στον οποίο η μεθειονίνη έχει αντικαταστήσει τη θρεονίνη στη θέση 790 (Τ790Μ) συσχετίζεται με επίκτητη αντίσταση για αναστολείς κινάσης τυροσίνης EGFR [6]. Στη σειρά μας, 3 ασθενείς υποβλήθηκαν σε μια δεύτερη βιοψία μετά την εξέλιξη για την αντιμετώπιση των αναστολέων της τυροσινικής κινάσης του EGFR. αλληλουχία DNA αυτών των δειγμάτων βιοψίας με συμβατικές αλληλούχιση Sanger έδειξε μετάλλαξη Τ790Μ σε δύο περιπτώσεις. Ανάλυση ακολουθίας χρησιμοποιώντας την Ion PGM αποκάλυψε Τ790Μ μετάλλαξη επίσης σε δύο περιπτώσεις. Επιπλέον, μεταξύ 900 διαβάζει ληφθεί, η μετάλλαξη Τ790Μ παρατηρήθηκε σε 53 διαβάζει (5,9%) στην τρίτη ασθενή. Αν και ο αριθμός των ανιχνευθεί διαβάζει ήταν κάτω από το επίπεδο κατωφλίου, είναι πιθανό ότι η εμφάνιση του Τ790Μ είναι η κύρια αιτία της αντίστασης στην EGFR θεραπεία αναστολέα κινάσης τυροσίνης σε αυτή την περίπτωση.

Παρά το μικρό αριθμό περιπτώσεων που αναλύθηκαν, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το ιόν Torrent PGM είναι εφικτό και ευαίσθητη διαδικασία που θα ήταν κατάλληλο στην κλινική πρακτική, όταν μόνο μια μικρή ποσότητα του κακοήθους ιστού είναι διαθέσιμη και πολυπλεξίας αναλύσεις γονίδια είναι απαραίτητα για το σχεδιασμό της θεραπείας. Εκτός από την έρευνα των μεταλλάξεων του γονιδίου που εκτελούνται εδώ, περαιτέρω πληροφορίες σχετικά με τη γενετική ανακατατάξεις θα πρέπει να ενσωματωθεί στις υπάρχουσες γνώσεις για τη βελτίωση της μεταχείρισης των NSCLC και να διευκολυνθεί η περαιτέρω μελέτη.