Αφηρημένο

Ιστορικό και Στόχοι

ενεργοποίηση του EGFR και της έκφρασης PKM2 συμβάλλουν στην ογκογένεση. ενεργοποίηση EGFR ρυθμίζει τις λειτουργίες PKM2 σε ένα υποκυτταρικό διαμέρισμα-εξαρτώμενο τρόπο και προωθεί τη μεταγραφή γονιδίων και την ανάπτυξη του όγκου. Επιπλέον, PKM2 είναι αυξορρυθμίζεται EGFR επαγόμενη οδών σε κακοήθειες γλοιώματος. Ωστόσο, βρήκαμε ότι PKM2 θα μπορούσε επίσης να ρυθμίζουν τη δραστηριότητα του /EGFR οδό σηματοδότησης EGF σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα. Έχουμε ως στόχο να καθορίσει τις βιολογικών μηχανισμών για PKM2 στη ρύθμιση την κινητικότητα των κυττάρων και εισβολή.

Μέθοδοι

Εμείς απασχολούνται σταθερή επιμόλυνση με μικρή φουρκέτα RNA να φιμώσουν σταθερά την έκφραση της PKM2 στο BGC823, SGC7901 και AGS γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Τα αποτελέσματα της PKM2 in vitro προσδιορίσθηκαν με την αξιολόγηση της μετανάστευσης των κυττάρων και εισβολή. Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε για να διερευνήσει τη σχέση μεταξύ PKM2 και άλλων πρωτεϊνών.

Αποτελέσματα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η εξουδετέρωση της PKM2 μείωσε τη δραστηριότητα της E-cadherin και ενίσχυσε την /EGFR μονοπάτι σηματοδότησης ΕΤΠ στα γαστρικά κυτταρικές γραμμές BGC823 και SGC7901 που ήταν θετικά για την έκφραση Ε-καδερίνης. Ωστόσο, στην αδιαφοροποίητο κυτταρική γραμμή γαστρικού καρκινώματος AGS, το οποίο στερείται την έκφραση Ε-καδερίνης, PKM2 προωθείται μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή. Ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις έδειξαν ότι τα επίπεδα της έκφρασης Ε-καδερίνης, /2 φωσφορυλίωση ERK1 και κυτταροπλασματική έκφραση PKM2 συσχετίστηκαν με κάθε άλλο

Συμπέρασμα:.

PKM2 μπορεί να παίζει διαφορετικούς ρόλους σε διαφορετικά διαφοροποιημένο γαστρικό καρκίνος τύπους κυττάρων, και αυτό το εύρημα θα ήταν συνεπής με την προηγούμενη κλινική έρευνα. Τα αποτελέσματα της μελέτης μας δείχνουν μια σημαντική σχέση μεταξύ PKM2 και E-cadherin κατά τη διάρκεια του EGFR-διεγείρονται γαστρικού καρκίνου κυτταρική κινητικότητα και την εισβολή

Παράθεση:. Wang LY, Liu YP, Τσεν LG, Τσεν YL, Tan L, Λιου JJ, et al. (2013) πυροσταφυλική κινάση M2 Παίζει ένα διπλό ρόλο σχετικά με τον κανονισμό του /EGFR σηματοδότηση EGF μέσω Ε-καντερίνη-εξαρτώμενο τρόπο σε κύτταρα γαστρικού καρκίνου. PLoS ONE 8 (6): e67542. doi: 10.1371 /journal.pone.0067542

Επιμέλεια: Hiromu Suzuki, Σαπόρο Ιατρικό Πανεπιστήμιο, την Ιαπωνία

Ελήφθη: 7 Φεβρουαρίου 2013? Αποδεκτές: 20 Μαΐου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 28 Ιούνη 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30971362, 81072013 & amp? 91229201), Θεμελιωδών Κονδυλίων Έρευνας για τις Κεντρικές πανεπιστήμια στην Κίνα (Νο 2010111082) και το Υπουργείο Υγείας του Ιδρύματος για τις κρατικές Key Κλινικής. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

πυροσταφυλικής κινάσης (ΡΚ) μεσολαβεί στην περιοριστικό του ρυθμού στάδιο τελικό της γλυκόλυσης καταλύοντας την αποφωσφορυλίωση φωσφοενολοπυροσταφυλικό (PEP) για να δώσει πυρουβικό ένα μόριο ΑΤΡ. Τα κύτταρα θηλαστικών έχουν τέσσερις πυροσταφυλική κινάση ισοένζυμα (Μ1, Μ2, L, και το R), που εκφράζονται επιλεκτικά σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων και ιστών [1]. Στα θηλαστικά, η ισομορφή Μ1 (PKM1) εκφράζεται στους περισσότερους ιστούς ενηλίκων. Η ισομορφή Μ2 (PKM2), εναλλακτικά ματισμένη παραλλαγή του Μ1, εκφράζεται κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης [2]. Μελέτες έχουν δείξει ότι τα καρκινικά κύτταρα εκφράζουν αποκλειστικά PKM2 [3], [4]. PKM2 έχει αποδειχθεί ότι είναι απαραίτητη για την αερόβια γλυκόλυση σε όγκους (Warburg αποτέλεσμα). Με τα χρόνια, έχουν σημαντικές εξελίξεις έχουν γίνει στην κατανόηση της λειτουργίας και τη ρύθμιση των PKM2 ως πυροσταφυλική κινάση και κινάση πρωτεΐνης στα καρκινικά κύτταρα [5]. Μια πρόσφατη μελέτη επιβεβαίωσε ότι η PKM2 που επάγεται από τον επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF) μετατοπίζεται στον πυρήνα των κυττάρων γλοιοβλαστώματος, αλληλεπιδρά με β-κατενίνης και οδηγεί σε έκφραση cyclinD1, το οποίο προωθεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την καρκινογένεση [6]. Τα ευρήματα αποκαλύπτουν ένα νέο ρόλο για PKM2 ως μεταγραφικός συνενεργοποιητή. Ωστόσο, υπάρχουν κάποιες διαμάχες σχετικά με την εξειδίκευση και το δυναμικό του PKM2 ως στόχο αντικαρκινική στη θεραπεία του καρκίνου. Ένα πρόσφατο εύρημα αποκάλυψε ότι η έκφραση PKM2 συσχετίζεται έντονα με γαστρικό καρκίνο διαφοροποίηση. Διαφοροποιημένες μορφές καρκίνου εκφράζουν περισσότερο PKM2 πρωτεΐνης από ό, τι τα αδιαφοροποίητα αυτά. PKM2 ήταν μια δυσμενή προγνωστικό παράγοντα στο γαστρικό καρκίνο κυττάρων σφραγιστικό δαχτυλίδι [7]. Ο βιολογικός ρόλος των PKM2 σε διαφορετικές φάσεις της διαφοροποίησης και της ανάπτυξης του καρκίνου του στομάχου πρέπει να διαλευκανθεί περαιτέρω.

Προηγούμενες μελέτες σχετικά PKM2 έχουν επικεντρωθεί επί του μεταβολισμού του όγκου και την ανάπτυξη του όγκου. Υπήρξαν μόνο μερικές αναφορές σε μετάσταση όγκου. Ε-καδερίνη διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση της επιθηλιακής ακεραιότητας, και η απώλεια της Ε-καδερίνης επηρεάζει την συγκολλητική ρεπερτόριο ενός κυττάρου [8]. Προηγούμενες μελέτες [9] in vitro έχουν δείξει ότι η απώλεια της Ε-καδερίνης σε ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκινώματος συνδέεται με κακή διαφοροποίηση και ινοβλαστοειδή μορφολογία. Το EGF-εξαρτώμενη ενεργοποίηση του EGFR έχει αναφερθεί ότι αναστέλλεται σε ένα E-cadherin προσκόλληση-εξαρτώμενο τρόπο, το οποίο αναστέλλει την εξαρτώμενη από συνδετήρα ενεργοποίηση των ποικίλων υποδοχέων κινασών τυροσίνης [10]. Η έρευνά μας απέδειξε ότι η knockdown του PKM2 μείωσε την δραστηριότητα της Ε-καδερίνης και ενίσχυσε την /EGFR σηματοδοτικό μονοπάτι EGF στις κυτταρικές γραμμές BGC823 και SGC7901 που ήταν θετικά για την έκφραση Ε-καδερίνης. Ωστόσο, στην αδιαφοροποίητο κυτταρική γραμμή γαστρικού καρκινώματος AGS, το οποίο στερείται την έκφραση Ε-καδερίνης, PKM2 προωθείται μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διευκρινιστεί η λειτουργία και το μηχανισμό της PKM2 όσον αφορά την κινητικότητα των κυττάρων σε διαφορετικά διαφοροποιημένες κυτταρικές σειρές.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture, Προϋποθέσεις και διαμόλυνση

Οι ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου BGC823 (ανεπαρκώς διαφοροποιημένο, ανάλογα με τον πάροχο) και SGC7901 (μετρίως διαφοροποιημένο) καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (HyClone, Logan, UT, USA). Η κυτταρική σειρά AGS (αδιαφοροποίητη) καλλιεργήθηκε σε μέσο F12K. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Gibco, Detroit, ΜΙ, USA) και 100 IU /mL πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 υγροποιημένη ατμόσφαιρα. Η ανθρώπινη γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή AGS διατάχθηκε από την American Type Culture Collection (ATCC, USA), και τις ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου SGC7901 και BGC823 ελήφθησαν από την Κίνα Κέντρο Type Culture Collection (Shanghai, Κίνα). SGC7901, BGC823 και AGS κύτταρα επιμολύνθηκαν με την siPKM2 (pcPUR + U6-siPKM2) ή η PU6 πλασμίδιο (pcPUR + U6-siRenilla) χρησιμοποιώντας FuGENE HD (Roche, Indianapolis, ΙΝ). Πουρομυκίνη (0,1 μg /ml) χρησιμοποιήθηκε για τη διαλογή σταθερά επιμολυσμένων κλώνων. Η έκφραση της πρωτεΐνης PKM2 εξετάστηκε με ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας αντίσωμα εναντίον PKM2 να επικυρώσει την ικανότητα των κατασκευασμάτων να αναστέλλουν την έκφραση του γονιδίου-στόχου? Αυτά τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Οι κυτταρικές καλλιέργειες καθίστανται αδρανείς με ανάπτυξή τους σε συρροή, και το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει 0,5% ορό για 1 ημέρα. EGF με 100 ng /ml τελική συγκέντρωση χρησιμοποιήθηκε για διέγερση των κυττάρων. EGF λήφθηκε από την Cell Signaling Technology.

Σταθερή Νοκ ντάουν της PKM2 και υπερέκφραση του PKM2

Ένα πλασμίδιο που περιέχει μια ακολουθία παρεμβολής RNA που στοχεύουν το γονίδιο PKM2 στο BGC823, SGC7901 και AGS κύτταρα ήταν κατασκευάστηκε. Το ολίγο αίσθηση για την αλληλουχία siPKM2 ήταν 5′-CACCGCGGCAAGATTTATGTGGAACGTGTGCTGTCCGTTCCACGTAGATCTTGCTGCTTTTT-3 ‘, και το αντιπληροφοριακό ολίγο ήταν 5′-GCATAAAAAGCAGCAAGATCTACGTGGAACGGACAGCACACGTTCCACATAAATCTTGCCGC-3’. Η BGC-823, SGC-7901 και AGS κύτταρα επιμολύνθηκαν με pcPUR + U6-siPKM2 ή pcPUR + U6-siRenilla (έλεγχος) και επιλέγονται ως πουρομυκίνη-ανθεκτικών κλώνων. Η ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε για να επιβεβαιώσει την καταστολή PKM2. Ένα πλασμίδιο που περιέχει αλληλουχία PKM2 cDNA ελήφθη από την Invitrogen. Η BGC-823, SGC-7901 και τα κύτταρα AGS επιμολύνθηκαν με pcDNA6.0-PKM2 ή pcDNA6.0-mock (έλεγχος) και επιλέγονται ως blasticidin-ανθεκτικών κλώνων. Η ανάλυση στυπώματος Western έγινε για να επιβεβαιωθεί η έκφραση PKM2.

Protein Εκχύλιση και Ανάλυση Western Blot

Τα κύτταρα επανα-εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης, και οι πρωτεΐνες εκχυλίζονται διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας 8-10% πηκτές SDS-PAGE. β-τουβουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Αντισώματα έναντι Ε-καδερίνη και ρ-Ε-καδερίνης ελήφθησαν από Epitomics. Η φωσφο-EGFR (Tyr1068), φωσφο-PLCγ1 (Tyr783), φωσφο-ΑΚΤ (Ser473), φωσφο-Gab1 (Tyr627), φωσφο-c-CBL (Tyr700), και φωσφο-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) αντισωμάτων ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology.

RNA Extraction, αντίστροφη μεταγραφή και PCR πραγματικού χρόνου

Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, CA, USA). Τα δείγματα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με DNase για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και το RNA καθαρίστηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας κιτ καθαρισμού RNA (Qiagen, CA, USA). Η αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής (RT) για την σύνθεση του πρώτου κλώνου cDNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ανάστροφης μεταγραφάσης (Bio-Rad) με 2 μg ολικού RNA. Ποσοτική ανάλυση RT-PCR εκτελέστηκε με το ΑΒΙ 7500 (Applied Biosystems), και τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης για κάθε επιμέρους δείγμα κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH. Η μέση έκφραση γονιδίου σε σχέση προσδιορίστηκε και διαφορές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCt μέθοδος ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης. Οι αλληλουχίες εκκινητή RT-PCR ήταν ως εξής: νοηματικό 5′- TGTGGGAATCCGACGAATG-3 ‘και 5′-αντινόημα GTCATATGGTGGAGCTGTGGG-3′ για την Ν-καδερίνη? νόημα 5’- CGGGAATGCAGTTGAGGATC-3 ‘και 5′-αντινόημα AGGATGGTGTAAGCGATGGC-3′ για Ε-καδερίνης? νόημα 5’- TGTATGGGGAACTGCTGACA-3 ‘και 5′-αντινόημα GCGTTCATCCTCATCGAAGT-3′ για ΜΜΡ7? αίσθηση 5’-CGACAGTCAGCCGCATCTT-3 ‘και αντιπληροφοριακό 5’-CCCCATGGTGTCTGAGCG-3 »για GAPDH.

κυτταρικού πολλαπλασιασμού Δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το κινητό Μετρώντας Kit-8 (Dojindo, Kamimashiki -gun, Kumamoto, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα εμβολιάστηκαν σε τέσσερις πλάκες των 96 φρεατίων σε πυκνότητα 2 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο. Μία πλάκα λήφθηκε κατά την ίδια ώρα κάθε μέρα μετά τα κύτταρα είχαν προσκολληθεί στα φρεάτια. Η απορρόφηση μετρήθηκε με μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας σε μήκος κύματος 450 nm. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Transwell εισβολή και Επούλωση Δοκιμασίες

Ο Transwell δοκιμασίες εισβολή πραγματοποιήθηκαν με ένθετα 8,0-μm-πόρου σε μια 24 φρεατίων πλάκα Transwell. Η βασική μεμβράνη ενυδατώθηκε με 500 μί μέσου χωρίς ορό RPMI 1640 ή Ρ12Κ 30 λεπτά πριν από τη χρήση. Για τη δοκιμασία εισβολή, οι κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου προστέθηκαν στον ανώτερο θάλαμο ενός transwell με 0,5 mg /mL κολλαγόνου τύπου Ι (BD Bioscience, San Jose, CA) -επικαλυμμένα φίλτρα. RPMI 1640 ή F12K μέσο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό και 1% κάθε αντιβιοτικό προστέθηκαν στο κατώτερο θάλαμο. Η BGC και 7901 τα κύτταρα επωάστηκαν για 36 ώρες. Τα κύτταρα AGS επωάστηκαν για 24 ώρες. Οι εισβάλλοντας κύτταρα ποσοτικά μετά γεντιανή χρώση βιολετί. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν και τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσες τιμές. Η δοκιμασία επούλωση της πληγής διεξήχθη σε πλάκες 6 φρεατίων. Όγκου κύτταρα σε μέσο που περιέχει 10% FBS σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (Corning, CA). Οι κυτταρικές καλλιέργειες καθίστανται αδρανείς με ανάπτυξή τους σε συρροή, και το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει 0,5% ορό για 1 ημέρα. Πληγές στη μονοστιβάδα έγιναν με αποστειρωμένα ρύγχη πιπετών. Στη συνέχεια, EGF με 100 ng /ml τελική συγκέντρωση χρησιμοποιήθηκε για διέγερση των κυττάρων. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και ανανεώνονται με μέσο που περιέχει 10% FBS. Οι φωτογραφίες ελήφθησαν στις 0 και 24 ώρες. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας (αριθ: 20.081.012). Στο Νοσοκομείο Zhongshan συνδεδεμένες με το Πανεπιστήμιο Xiamen, Xiamen, Fujian Province, Κίνα, και μας δόθηκαν γραπτές δηλώσεις συγκατάθεση από όλους τους συμμετέχοντες που εμπλέκονται σε αυτή τη μελέτη.

Προετοιμασία των δειγμάτων ιστού

καρκινικά δείγματα ιστού συλλέχθηκαν από 15 διαφορετικούς ασθενείς με γαστρικό καρκίνο που υποβλήθηκαν σε θεραπευτική εκτομή στο Νοσοκομείο Zhongshan, Πανεπιστήμιο Xiamen, Xiamen, Κίνα. Μια ανεξάρτητη σειρά των αντίστοιχων γειτονικών noncancerous ιστούς από 15 τους ίδιους ασθενείς συλλέχθηκε ταυτόχρονα. Όλα τα δείγματα ιστού συλλέχθηκαν και χωρίζεται σε δύο μέρη αμέσως μετά την εκτομή του όγκου. Ένα μέρος συλλέχθηκε σε υγρό άζωτο και αποθηκεύονται στους -80 ° C μέχρι RNA και πρωτεΐνης εκχύλισης. Το άλλο μέρος σταθεροποιήθηκε σε 4% φορμαλδεΰδη και εμβαπτίστηκαν σε παραφίνη για ιστολογική ανάλυση (αιματοξυλίνη ηωσίνη και χρώση IHC). Όλα τα δείγματα επιβεβαιώθηκαν από παθολογική διάγνωση (η ιστοπαθολογική διάγνωση βασίστηκε σε κριτήρια ΠΟΥ). Όλες οι πειραματικές περιπτώσεις ομαδοποιήθηκαν συμφωνία-σης της Διεθνούς Ένωσης κατά των όγκων-Node-Μετάσταση (TNM) σύστημα Καρκίνος στάσης (αναθεωρημένο το 2002).

Η ανοσοϊστοχημεία

τμήματα Four-micron-παχύ παραφίνη είτε χρωματίσθηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (η &? Ε) ή αναλύονται για PKM2, ρ-ERK1 /2 και Ε-καδερίνης έκφραση με ανοσοϊστοχημεία. Ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε σύμφωνα με τις διαδικασίες που συνιστώνται από τον κατασκευαστή. Οι αντιδράσεις έγιναν ορατά χρησιμοποιώντας διαμινοβενζιδίνη ως χρωμογόνο υπόστρωμα. Οι Ακολούθησε χρώση χρησιμοποιώντας αιματοξυλίνη και, στη συνέχεια, εκκαθαρίζονται και να τοποθετηθεί. Η μέση πυκνότητα (IOD /περιοχή) ανιχνεύθηκε σε διαφορετικές θετικές περιοχές από τα 15 δείγματα ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου χρησιμοποιώντας Image-Pro Plus λογισμικό.

Στατιστικές Αναλύσεις

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS V13. 0 (SPSS, Inc.) του λογισμικού. Οι Ανεξάρτητοι t-test και ανάλυση συσχέτισης χρησιμοποιήθηκαν για να συγκρίνουν τα δεδομένα. Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέσο ± SD. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Η εξάντληση των PKM2 Προώθησε μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή στην BGC823 και SGC7901 κύτταρα με EGF διέγερση

Η έκφραση της πρωτεΐνης PKM2 στις κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου BGC823, SGC7901 και AGS αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές έδειξαν υψηλό επίπεδο έκφρασης PKM2. Στη συνέχεια, σταθερή γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές με μια αλλοιωμένη έκφραση PKM2 καθορίστηκαν χρησιμοποιώντας παρεμβολή RNA (PKM2 knockdown) στα κύτταρα BGC823, SGC7901 και AGS. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, καθορίστηκαν οι κυτταρικές σειρές BGC823, SGC7901 και AGS με PKM2 νοκ ντάουν. Παρατηρήσαμε ότι ο πολλαπλασιασμός μειώθηκε στα κύτταρα BGC823 και AGS μετά PKM2 ήταν εξαντλημένο (Εικ. 1Β). Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες.

(Α) BGC823, SGC7901 και AGS κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με shRNA στρέφεται κατά PKM2. Η ειδική knockdown του PKM2 παρακολουθήθηκε με ανοσοστύπωμα (κάτω). Τα κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με pcPUR + U6-siPKM2 αναφέρονται ως siPK, και εκείνοι που μορφομετατρέπονται με pcPUR + U6-siRenilla αναφέρονται ως pu6. (Β) Ο πολλαπλασιασμός των σταθερώς επιμολυσμένων κυττάρων. Ο αριθμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία CCK-8, και ο σχετικός αριθμός των κυττάρων εμφανίζεται. (C, D) Ένα σχήμα σταυρού πληγή δημιουργήθηκε στην μονοστιβάδα, και το BGC823 και SGC7901 σταθερώς επιμολυσμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για άλλες 24 ώρες με EGF (100 ng /ml). Αντιπροσωπευτικές εικόνες των τραυματιών περιοχή που φαίνεται. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας μετανάστευσης δείχνονται επίσης ως γραφικές παραστάσεις (* ρ & lt? 0,05). (Ε, F) Η πιθανή εισβολή του BGC823 και SGC7901 σταθερός κύτταρα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία θαλάμου transwell BD με 100 ng /ml EGF στον κάτω θάλαμο για 36 ώρες. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν στην κάτω πλευρά του φίλτρου χρωματίστηκαν, φωτογραφήθηκαν και μετρήθηκαν. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα (* ρ & lt? 0,05).

Η

Για να εξεταστεί το αποτέλεσμα PKM2 στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή, εμείς απασχολουμένων καθιερωμένη επούλωση της πληγής και Transwell προσδιορισμοί για τον χαρακτηρισμό της απόκρισης κυτταρική κινητικότητα στο BGC823 και SGC7901 κύτταρα. Ένα στρώμα συρροή των κυττάρων επωάστηκε πρώτα όλη τη νύκτα σε μέσο, ​​ένα τραύμα γρατσουνιά εισήχθη, μέσο το οποίο περιέχει την πιο κατάλληλη δόση του EGF (100 ng /ml) προστέθηκε για την τόνωση της μετανάστευσης, και το ποσοστό του σφραγίσματος πληγή παρατηρήθηκε μετά από 24 h ( Εικόνα S1). Τα εισβάλλοντα κύτταρα ποσοτικοποιήθηκαν 36 ώρες μετά EGF (100 ng /ml) προστέθηκε στο κατώτερο θάλαμο. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η θεραπεία της BGC823-sipk και SGC7901-sipk κυττάρων με EGF μετά από τραύμα μηδέν και στο transwell αύξησε σημαντικά την ταχύτητα επούλωσης του τραύματος (Εικ. 1 C, D) και εισβολή (Εικ. 1 Ε, F) σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων ελέγχου.

η εξάντληση των PKM2 μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης και ενίσχυσε τις δραστηριότητες του ΕΤΠ /EGFR μεταγενέστεροι μονοπατιών σηματοδότησης PLC-γ1 και ERK1 /2

Για να διερευνηθεί η μηχανισμός των αλλαγών στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή μετά την knockdown του PKM2, αναλύσαμε την έκφραση των μελών της Ca

2 + -εξαρτώμενη κύτταρο προσκόλληση μορίων οικογένεια και μεταλλοπρωτεϊνασών. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης Ε-καδερίνης μειώθηκαν σε BGC823 και SGC7901 κυττάρων όταν η έκφραση PKM2 μειώθηκε (Σχ. 2Α)

(Α) Ε-καδερίνης, φωσφο-Ε-καδερίνης και Ν-cadherin έκφρασης. επίπεδα αναλύθηκαν με ανάλυση ανοσοστυπώματος στο BGC823 και SGC7901 σταθερά κύτταρα. Ε-καδερίνη και Ν-καδερίνης επίπεδα έκφρασης (Β) αναλύθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR σε BGC823 και SGC7901 σταθερά κύτταρα. (Γ) BGC823 και SGC7901 σταθερή κύτταρα εκτέθηκαν σε EGF (100 ng /ml) για διαφορετικούς χρόνους. Οι κηλίδες Western των προϊόντων λύσης κυττάρου που φαίνεται. Η φωσφο-EGFR (Tyr1068), φωσφο-PLCγ1 (Tyr783), φωσφο-ΑΚΤ (Ser473) και φωσφο-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) επίπεδα πρωτεΐνης δείχνονται όπως υποδεικνύεται. επίπεδα έκφρασης ΜΜΡ7 (D) αναλύθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR σε BGC823 και SGC7901 σταθερά κύτταρα. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD πειραμάτων εις τριπλούν (* ρ & lt? 0,05).

Η

Το επίπεδο Ε-καδερίνης mRNA και την φωσφορυλίωση της Ε-καδερίνης προσδιορίστηκαν σε BGC823 και SGC7901 κυττάρων με εξάντληση PKM2 να εκτιμηθεί κατά πόσον η παρατηρούμενη διαφορά στην έκφραση Ε-καδερίνης συνέβη προ- ή μετα-μεταφραστικά. Παρατηρήσαμε την προς τα κάτω ρύθμιση της Ε-καδερίνης mRNA και αυξημένη φωσφορυλίωση, η οποία επάγει την ενδοκυττάρωση του Ε-καδερίνης, σε PKM2-εξαντλημένο κύτταρα (Σχ. 2Α, Β). Βρήκαμε επίσης ότι το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης Ν-καντερίνης αυξήθηκε στις κυτταρικές γραμμές BGC823 και SGC7901 όταν PKM2 ήταν εξαντλημένο (Εικ. 2Α).

μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή ρυθμίζονται σε μεγάλο βαθμό από τη δράση του EGFR. Για να αναλυθεί αν η EGFR εμπλέκεται στην μετανάστευση και εισβολή του BGC823 και SGC7901 κύτταρα, αυτά τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με EGF, η οποία συνδέεται με το EGFR και ενεργοποιεί τις οδούς σηματοδότησης καθοδικά. Η αγωγή με EGF είχε ως αποτέλεσμα την φωσφορυλίωση του EGFR και την επακόλουθη ενεργοποίηση του PLCγ1, ΑΚΤ και ERK1 /2 οδούς (Εικ. 2C). Βρήκαμε ότι PLC γ1 είχαν υψηλότερο επίπεδο δραστηριότητας στα κύτταρα PKM2 εξαντλημένο από ό, τι στα κύτταρα un-εξαντλημένο μετά είτε σε μικρό ή μεγάλο (24 ώρες) επώαση με EGF. Ωστόσο, δεν υπήρξε καμία σημαντική διαφορά στη δραστικότητα μεταξύ των ΑΚΤ PKM2 εξαντλημένο κύτταρα και un-εξαντλημένο κύτταρα. ΡΙ_Ογ είναι ένας βασικός ρυθμιστής της κυτταρικής μετανάστευσης κατάντη του RTK σηματοδότησης [11]. Η φωσφορυλίωση στην τυροσίνη κατάλοιπο 783 του PLCγ1 είναι κρίσιμης σημασίας για την ενεργοποίησή του [12]. ενεργοποίηση PLCγ1 ενισχυμένη κυτταρική κινητικότητα, και αυτό το αποτέλεσμα παρατηρήθηκε στις δοκιμασίες μηδέν πληγή και Transwell, όπως παρατηρείται στο σχ. 1Γ.

Στη συνέχεια ερευνήσαμε την επίδραση ενός συνδέτη EGFR στην έκφραση των MMPs χρήση RT-PCR σε BGC823-sipk και SGC7901-sipk κυττάρων σε σύγκριση με αντίστοιχα κύτταρα ελέγχου τους. Η θεραπεία με τον συνδέτη EGFR, EGF, ενίσχυσε την έκφραση των ΜΜΡ στο επίπεδο της μεταγραφής σε BGC823 και SGC7901 κύτταρα. Ωστόσο, δεν υπήρχαν προφανείς διαφορές στα επίπεδα έκφρασης του ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 μεταξύ κυττάρων PKM2 εξαντλημένο και κύτταρα ελέγχου τους (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). έκφραση ΜΜΡ7 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε PKM2-εξαντλημένο κυττάρων με αγωγή με EGF (Σχ. 2D). Οι οδοί ERK /ΜΑΡΚ παίζουν κρίσιμους ρόλους στην έκφραση ΜΜΡ7 που επάγεται με συνδέτη EGFR. Επιπλέον, μια προφανής αύξηση στην δραστικότητα ERK1 /2 παρατηρήθηκε μετά από 0 ώρες και 24 ώρες αγωγής με EGF σε κύτταρα PKM2-εξαντλημένο.

Η εξάντληση των PKM2 εξασθενημένα της κινητικότητας του AGS κυττάρων και των λειτουργικών αλλαγών μετά τη διάσωση PKM2 στο γαστρικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές

Η έκφραση της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης στις κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου BGC823, SGC7901 και AGS αξιολογήθηκε με ανάλυση Western blot. Οι κυτταρικές σειρές BGC823 και SGC7901 εκφράζουν E-cadherin. Σε αντίθεση, AGS κύτταρα στερούνται έκφρασης Ε-καδερίνης (Εικ. 3Α).

επίπεδα έκφρασης Ε-καδερίνης (Α) ανιχνεύθηκαν με ανάλυση ανοσοστυπώματος σε κύτταρα BGC823, SGC7901 και AGS. (Β) Ένα σχήμα σταυρού πληγή δημιουργήθηκε στην μονοστιβάδα, και τα σταθερά κύτταρα AGS καλλιεργήθηκαν για επιπλέον 24 ώρες με EGF (100 ng /ml). Αντιπροσωπευτικές εικόνες των τραυματιών περιοχή που φαίνεται. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας μετανάστευσης δείχνονται επίσης ως γραφικές παραστάσεις (* ρ & lt? 0,05). (Γ) Η πιθανή εισβολή των σταθερών κυττάρων AGS εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία θαλάμου transwell BD με 100 ng /ml EGF στον κάτω θάλαμο για 24 ώρες. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν στην κάτω πλευρά του φίλτρου χρωματίστηκαν, φωτογραφήθηκαν και μετρήθηκαν. (Δ) Η έκφραση της p-EGFR, E-cadherin στο PKM2 διάσωση πειράματα με σταθερά επιμολυσμένα μέθοδος με τη χρήση υπερ-έκφραση πλασμιδιακό φορέα pcDNA6.0-παρωδία και pcDNA6.0-PKM2 στην BGC823 και AGS κύτταρα τα οποία σταθερά νοκ ντάουν PKM2. (Ε) Οι λειτουργικές αλλαγές της κυτταρικής μετανάστευσης και εισβολής μετά PKM2 διάσωσης. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα (* ρ & lt? 0,05).

Η

Για να εξεταστεί το αποτέλεσμα PKM2 knockdown στην κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε AGS κύτταρα χρησιμοποιήσαμε καθιερωμένη επούλωση πληγών και προσδιορισμούς transwell να χαρακτηρίσει την κυτταρική κινητικότητα. Ένα στρώμα συρροή των κυττάρων επωάστηκε πρώτα όλη τη νύκτα σε μέσο, ​​μια γρατσουνιά πληγή εισήχθη, μέσο που περιείχε EGF (100 ng /ml) προστέθηκε για την τόνωση της μετανάστευσης, και το ποσοστό του σφραγίσματος πληγή παρατηρήθηκε μετά από 24 ώρες. Τα εισβάλλοντα κύτταρα εις τον ποσοτικό προσδιορισμό Transwell ποσοστώθηκαν 24 ώρες μετά EGF (100 ng /ml) προστέθηκε στο κατώτερο θάλαμο. Προς έκπληξή μας, βρήκαμε ότι η επεξεργασία των κυττάρων AGS-sipk με EGF μετά την γρατσουνιά πληγή και στο transwell μειώθηκε σημαντικά το ρυθμό της σφράγισης τραύματος και εισβολής σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων ελέγχου (Σχ. 3Β, C). Υπήρχαν εμφανή διαφορές μεταξύ των BGC823 /SGC7901 και AGS κύτταρα.

Για την περαιτέρω επεξήγηση του ρόλου της PKM2 στην κυτταρική κινητικότητα, κάναμε το PKM2 διάσωση πειράματα. Εμείς taked σταθερά επιμολυσμένα μέθοδος με τη χρήση υπερ-έκφραση πλασμιδιακό φορέα pcDNA6.0-παρωδία και pcDNA6.0-PKM2 να ασχοληθεί με BGC823 και AGS κύτταρα τα οποία σταθερά νοκ ντάουν PKM2. Η έκφραση του ρ-EGFR, Ε-καδερίνης παρουσιάστηκαν στα πειράματα PKM2 διάσωση (Σχ. 3D). Παρατηρήσαμε ότι όταν ανακτηθεί η έκφραση PKM2, η φωσφορυλίωση του EGFR έχει μειωθεί σημαντικά σε BGC823 κύτταρα και αυξήθηκε το AGS κύτταρα. Επιπλέον, κυτταρική κινητικότητα των BGC823 κυττάρων μειώθηκε και AGS κύτταρα μειώθηκε μετά PKM2 διάσωση (Σχ. 3Ε). Για να αποσαφηνιστεί ο μηχανισμός αυτών των διαφορών, που στη συνέχεια ανέλυσε τη δραστηριότητα του /μονοπατιού σηματοδότησης EGFR EGF.

PKM2 Ενισχυμένη τις δραστηριότητες του ΕΤΠ /EGFR Pathways μεταγενέστεροι Σηματοδότησης στο AGS κύτταρα και συσχετίστηκε με την ERK Δραστηριότητα στο γαστρικό Καρκίνος τα δείγματα

για να αναλυθεί αν η EGFR μπορεί να εμπλέκεται στη μετανάστευση και την εισβολή του AGS κυττάρων, αυτά τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με EGF, η οποία συνδέεται με το EGFR και ενεργοποιεί τις οδούς σηματοδότησης καθοδικά. αγωγή με EGF είχε ως αποτέλεσμα την φωσφορυλίωση του EGFR και την επακόλουθη ενεργοποίηση των καθοδικών πορειών EGFR, συμπεριλαμβανομένης της PLCγ1 και ERK1 /2 οδούς (Εικ. 4Α). Βρήκαμε ότι οι δραστηριότητες της PLCγ1 και ERK1 /2 ήταν μεγαλύτερη στα κύτταρα όπου PKM2 δεν είχε εξαντληθεί από στα κύτταρα PKM2 εξαντλημένο μετά είτε μικρό ή μεγάλο (24 ώρες) επώαση με EGF. Αυτό το αποτέλεσμα είναι το αντίθετο από αυτό που παρατηρήθηκε με την BGC823 και SGC7901 κύτταρα? στα AGS κύτταρα, PKM2 ήρθε στο προσκήνιο ως ερέθισμα και προωθείται μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή. Στη συνέχεια ερευνήσαμε την έκφραση ΜΜΡ7 χρησιμοποιώντας RT-PCR σε κύτταρα AGS-sipk και τα κύτταρα ελέγχου. Η θεραπεία με EGF ενισχυμένη έκφραση ΜΜΡ7 στο επίπεδο της μεταγραφής στα κύτταρα AGS-pu6 αλλά όχι σε AGS-sipk κύτταρα (Εικ. 4Β). Η δραστηριότητα των ERK1 /2 ήταν προφανώς υψηλότερο σε κύτταρα AGS-pu6 σύγκριση με AGS-sipk κύτταρα μετά από 0 ώρες και 24 ώρες αγωγή με EGF (Σχ. 4Α).

(Α) AGS σταθερός κύτταρα εκτέθηκαν σε EGF (100 ng /ml) για διαφορετικούς χρόνους. Διεξήχθησαν κηλίδες Western των προϊόντων λύσης κυττάρου. Η φωσφο-EGFR (Tyr1068), φωσφο-PLCγ1 (Tyr783), φωσφο-Gab1 (Tyr627), φώσφορο-c-CBL (Tyr700), και φωσφο-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) επίπεδα πρωτεΐνης δείχνονται όπως υποδεικνύεται. επίπεδα έκφρασης ΜΜΡ7 (Β) αναλύθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR σε σταθερά κύτταρα AGS. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα (* ρ & lt? 0,05). (Γ) IHC χρώση με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα εκτελέστηκε σε 15 δείγματα ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου. Αντιπροσωπευτικά φωτογραφίες του όγκου, τα οποία ελήφθησαν στο ίδιο τμήμα του το ίδιο κομμάτι του ιστού, φαίνονται. (Δ) Η ανάλυση συσχέτισης μεταξύ PKM2, E-cadherin και P-ERK1 /2 ολοκληρώθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Image-Pro Plus. Η μέση πυκνότητα (IOD /περιοχή) ανιχνεύθηκε σε διαφορετικές θετικές περιοχές της 15ης ανθρώπινου γαστρικού δείγματα καρκίνου. Η ανάλυση συσχέτισης μεταξύ PKM2 και Ε-καδερίνης προσδιορίστηκε σε ένα E-cadherin θετική περιοχή. Η ανάλυση συσχέτισης μεταξύ PKM2 και p-ERK1 /2 προσδιορίσθηκε σε αρνητική περιοχή E-cadherin.

Η

επόμενο πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημική (IHC) αναλύσεις για την εξέταση της έκφρασης Ε-καδερίνης, PKM2 εντοπισμό και ERK1 /2 φωσφορυλίωση σε διαδοχικές τομές των 15 ανθρώπινου γαστρικού δείγματα καρκίνου χρησιμοποιώντας αντισώματα με επικυρωμένες ειδικότητες. Το Σχήμα 4Γ δείχνει ότι τα επίπεδα έκφρασης Ε-καδερίνης, /2 φωσφορυλίωση ERK1 και κυτοπλασμική έκφραση PKM2 συσχετίστηκαν με το άλλο. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ένα υψηλό επίπεδο /2 φωσφορυλίωση ERK1 στον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων χωρίς έκφραση Ε-καδερίνης. Σε περιοχές του /2 φωσφορυλίωση ERK1 βρήκαμε επίσης υψηλότερα επίπεδα έκφρασης PKM2. Ωστόσο, δεν βρήκαμε τη φωσφορυλίωση της ERK1 /2 σε περιοχές θετικά για έκφραση Ε-καδερίνης (Εικ. 4C). Μια ανάλυση συσχέτισης μεταξύ PKM2, Ε-καδερίνης και P-ERK1 /2 διεξήχθη χρησιμοποιώντας Image-Pro Plus λογισμικό (Εικ. 4D). Η μέση πυκνότητα (IOD /περιοχή) καταγράφηκε σε διαφορετικές θετικές τομείς της 15ης ανθρώπινου γαστρικού δείγματα καρκίνου. Βρήκαμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ PKM2 και Ε-καδερίνης σε περιοχές Ε-καδερίνης-θετική. Επιπλέον, υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ PKM2 και p-ERK1 /2 στο E-cadherin-αρνητικών περιοχές.

Συζήτηση

Η επεμβατική και μεταστατικό στάδιο της εξέλιξης του καρκίνου συσχετίζεται με κακή κλινική πρόγνωση και αντιπροσωπεύει την πιο τρομερή εμπόδιο στην επιτυχή θεραπεία. Η κυτταρική κινητικότητα και διεισδυτικότητα είναι τα καθοριστικά χαρακτηριστικά των κακοήθων όγκων, τα οποία επιτρέπουν τα καρκινικά κύτταρα να μεταναστεύσουν στο παρακείμενους ιστούς ή μέσω του περιορισμού μεμβράνες και εξωκυτταρικές μήτρες. Η κυτταρική κινητικότητα απαιτείται για τις φυσιολογικές διεργασίες επισκευής τραύματος και οργανογένεσης και για την παθολογική διεργασία της εισβολής όγκου [13]. Τα επεκτατικά καρκινικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από απορυθμισμένη κυτταρική κινητικότητα σε απόκριση προς εξωκυτταρικά σήματα από αυξητικούς παράγοντες και κυτοκίνες. Οι ανθρώπινοι όγκοι εκφράζουν υψηλά επίπεδα των αυξητικών παραγόντων και των υποδοχέων τους, και πολλοί τύποι κακοήθων κυττάρων εμφανίζονται να παρουσιάζουν autocrine- ή παρακρινή διεγείρεται ανάπτυξη. Ανάμεσα στα πιο καλά μελετημένα συστήματα υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα είναι η οικογένεια του υποδοχέα EGF [14]. Τα σήματα από το εξωκυτταρικό περιβάλλον υπαγορεύσει κυτταρική κινητικότητα. Πολλοί παράγοντες ανάπτυξης, συμπεριλαμβανομένων των συνδετών που δρουν μέσω του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), την ενίσχυση της κυτταρικής κινητικότητας [15]. Τουλάχιστον δύο διακριτών οδών ενδοκυτταρικής σηματοδότησης που απαιτούνται για EGFR μεσολάβηση κυτταρική κινητικότητα: τα μονοπάτια χρησιμοποιώντας PLC γ και την οδό της ΜΑΡ κινάσης. δραστηριότητα γ PLC έχει προταθεί για την ενίσχυση της κινητικότητας των κυττάρων μέσω της κινητοποίησης των πρωτεϊνών ακτίνης τροποποίησης από μία αδρανή μεμβράνη που σχετίζεται εντοπισμός σε ένα ενεργό locale κυτταροσκελετική υπο-μεμβράνη [16]. Οι ΜΑΡ κινάσες Erk μεταδίδουν σήματα προς τον πυρήνα, καθώς και τα σήματα που ρυθμίζουν συνδέσεις κυττάρου-μήτρας.

καντερίνες περιλαμβάνουν μία μεγάλη οικογένεια μορίων προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου που περιλαμβάνουν την κλασική, δεσμοσωμάτων, και άτυπα καδερίνες. E-cadherin, η οποία εκφράζεται κυρίως σε επιθηλιακά κύτταρα, είναι μία πρωτεΐνη προσκόλλησης που κωδικοποιείται από το γονίδιο και τις λειτουργίες Cdh1 σε πολλαπλές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης, της ακεραιότητας ιστού, κυτταρική μετανάστευση, τη μορφολογία, και την πολικότητα [17], [18], [19]. E-cadherin είναι επίσης ένα ογκοκατασταλτικό των οποίων η έκφραση συχνά μειώνεται ή σιγήσει, και επανέκφραση του μπορεί να επάγει μορφολογικές αναστροφής [20], [21]. Το EGF-εξαρτώμενη ενεργοποίηση του EGFR έχει αναφερθεί ότι αναστέλλεται σε ένα E-cadherin προσκόλληση-εξαρτώμενο τρόπο, το οποίο αναστέλλει την εξαρτώμενη από συνδετήρα ενεργοποίηση των ποικίλων κινασών τυροσίνης υποδοχέα. Ν-cadherin, ως υποκινητής εισβολή, συχνά ρυθμίζεται αυξητικά. Η έκφραση του Ν-καδερίνης σε επιθηλιακά κύτταρα προκαλεί αλλαγές στη μορφολογία σε ένα φαινότυπο ινοβλαστική, καθιστώντας τα κύτταρα πιο κινητικά και επεμβατική. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι τα καρκινικά κύτταρα έχουν πάνω ρυθμισμένα Ν-cadherin εκτός από την απώλεια της Ε-καδερίνης. Αυτή η αλλαγή στην έκφραση καδερίνης ονομάζεται «διακόπτης καντερίνης».

Παρατηρήσαμε μια ρύθμιση προς τα κάτω του Ε-καδερίνης mRNA και αυξημένη φωσφορυλίωση, η οποία επάγει την ενδοκυττάρωση του Ε-καδερίνης, σε κύτταρα PKM2-εξαντλημένο. Βρήκαμε επίσης ότι το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης Ν-cadherin αυξήθηκε στην κυτταρική σειρά BGC823 όταν PKM2 είχε εξαντληθεί. Το νοκ ντάουν της PKM2 προωθείται μετανάστευση των κυττάρων και την εισβολή στην BGC823 και SGC7901 κύτταρα με διέγερση EGF. Μια αυξημένη δραστηριότητα του EGFR είναι ο κρίσιμος παράγοντας για τον προσδιορισμό της κινητικότητας των κυττάρων και εισβολής των κυττάρων BGC823 και SGC7901. Υποθέσαμε ότι η προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης Ε-καδερίνης ενίσχυσε την φωσφορυλίωση του EGFR και ενεργοποίησαν την κατάντη μονοπάτια σηματοδότησης, οι οποίες περιλαμβάνουν PLCγ1 και ERK1 /2. ενεργοποίηση γ PLC ενισχύει κυτταρική κινητικότητα, και 2 δραστικότητα ERK1 /διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην έκφραση ΜΜΡ7.

έχουν μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs) έχουν εμπλακεί στην εισβολή καρκίνου και μετάσταση, λόγω της εξωκυττάριας μήτρας τους (ECM) -proteolytic δραστηριότητα [22].