Αφηρημένο

Για να δημιουργήσετε γονιδιωματικής σήματα, ο υποδοχέας των ανδρογόνων (AR), πρέπει να είναι μεταφέρονται εντός του πυρήνα κατά την ανδρογόνο ερεθίσματα. Ωστόσο, υπάρχουν αποδεικτικά στοιχεία από

in vitro

πειράματα ότι στα κύτταρα ευνουχισμός ανθεκτικά καρκίνου του προστάτη (CRPC) το AR είναι σε θέση να μετατοπίζεται στον πυρήνα σε ένα πρόσδεμα-ανεξάρτητο τρόπο. Η πρόσφατη ανακάλυψη ότι η αναστολή των γλυκογόνου-συνθάσης κινάσης 3β (GSK-3β) επάγει ταχεία πυρηνική εξαγωγή του AR σε ανδρογόνο διεγερμένα κύτταρα καρκίνου προστάτη μας ώθησε να αναλύσουμε τα αποτελέσματα μιας αναστολής GSK-3β εις τον ευνουχισμό ανθεκτικά sublines LNCaP C4-2 και LNCaP-SSR. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές επιδεικνύουν υψηλά επίπεδα πυρηνικής AR απουσία ανδρογόνο ερεθισμάτων. Η έκθεση αυτών των κυττάρων με το μηλεϊμίδιο SB216763, ενός ισχυρού αναστολέα της GSK-3β, οδήγησε σε ταχεία πυρηνική εξαγωγή του AR ακόμη και κάτω από συνθήκες ανδρογόνο στερούνται. Επιπλέον, η ικανότητα των C4-2 και LNCaP κύτταρα-ΜΤΑ να αναπτύσσονται απουσία ανδρογόνων ελαττώθηκε μετά φαρμακολογική αναστολή της GSK-3β

in vitro

. Η ικανότητα των SB216763 να διαμορφώνει σηματοδότηση AR και λειτουργία σε CRPC

in vivo

επιπροσθέτως καταδειχθεί σε μία δοκιμασία ξενομοσχεύματος χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης νεοσσού τροποποιημένα μετά συστημική χορήγηση SB216763. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η αναστολή της GSK-3β βοηθά στόχο το AR για εξαγωγή από τον πυρήνα περιορίζοντας έτσι τις επιπτώσεις της εσφαλμένα τοποθετημένος AR σε CRPC κύτταρα. Ως εκ τούτου, η αναστολή της GSK-3β θα μπορούσε να είναι μια ενδιαφέρουσα νέα στρατηγική για την αντιμετώπιση της CRPC

Παράθεση:. Schütz SV, Schrader AJ, Zengerling F, Genze F, Cronauer MV, Schrader Μ (2011) Αναστολή του γλυκογόνου συνθάσης κινάσης-3β εξουδετερώνει Ligand-ανεξάρτητη δράση του υποδοχέα ανδρογόνων σε Ευνουχισμός Ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 6 (9): e25341. doi: 10.1371 /journal.pone.0025341

Επιμέλεια: Vladislav V. Glinsky, University of Missouri-Columbia, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Μάρτη 2011? Δεκτές: 1 του Σεπτέμβρη 2011? Δημοσιεύθηκε: 29 Σεπτέμβρη 2011

Copyright: © 2011 Schütz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση ήταν που παρέχονται από την δράση Lions Vaincre le Καρκίνο, το Λουξεμβούργο (με MVC). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή ρύθμιση

Μεταγραφική από πυρηνικούς υποδοχείς παίζει ένα κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη και την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη (PC) κύτταρα. Αυτό εξηγείται από το ρόλο του υποδοχέα ανδρογόνων (AR), έναν παράγοντα μεταγραφής ενεργοποιούμενοι από συνδέτες που ανήκουν στην υπεροικογένεια στεροειδούς υποδοχέα. Σε περίπτωση απουσίας των ανδρογόνων, το AR είναι κατά κύριο λόγο βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα σταθεροποιημένο από ένα σύμπλοκο multichaperone [1]. Κατά την δέσμευση των ανδρογόνων, το AR πιστεύεται να υποβληθεί σε μια διαμορφωτική αλλαγή που οδηγεί σε μια ομοδιμερισμό με άλλη πρωτεΐνη AR μετά διαχωρισμό από τμήματα της multichaperone-σύμπλοκο [2]. Στη συνέχεια, το AR μεταφέρεται ενεργά μέσα στον πυρήνα όπου δεσμεύεται με ειδικές αλληλουχίες DNA ονομάζονται στοιχεία απόκρισης ανδρογόνων (ARE) βρέθηκε μέσα στις περιοχές προαγωγέα ή ενισχυτή των γονιδίων στόχων AR [3] ενεργοποιώντας έτσι τη συσκευή γενική μεταγραφή [4].

η αρχική ανδρογόνων εξάρτησης των καρκινικών κυττάρων του προστάτη είναι ο λόγος για τον οποίο οι περισσότεροι PC ανταποκρίνονται σε θεραπεία απόσπασης ανδρογόνων. Δυστυχώς, το όφελος των ανδρογόνων είναι παροδική μόνο. Μετά από μια περίοδο περίπου δύο χρόνια, Τ.Κ. σχεδόν πάντοτε να εξελιχθεί σε μια κατάσταση ασθένειας που ονομάζεται ευνουχισμό ανθεκτικά καρκίνου του προστάτη (CRPC) όπου τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να αναπτυχθούν και να επιβιώσουν υπό επίπεδα ευνουχισμού των κυκλοφορούντων ανδρογόνων. Αν και το

in vitro

ανάπτυξη ενός ανεξάρτητου από ανδρογόνο φαινότυπο βασίζεται κυρίως στην απώλεια του AR σε κύτταρα του όγκου, υπάρχουν αποδεικτικά στοιχεία από αρκετές κλινικές μελέτες που το AR είναι σπάνια χάνεται στα CRPC κύτταρα

στο vivo

[5], [6]. Επιπλέον, αυτές οι μελέτες υποδεικνύουν ότι η αντίσταση στην συμβατική ορμονοθεραπεία δεν οφείλεται στην απώλεια της ευαισθησίας των ανδρογόνων αλλά μάλλον μπορεί να είναι συνέπεια ενός απορυθμισμένη άξονα AR-σηματοδότηση [7].

Για να δημιουργηθούν γονιδιωματική σήματα εξαρτώμενων από ορμόνες κύτταρα PC το AR πρέπει να μεταφέρονται μέσα στον πυρήνα κατά την ανδρογόνο ερεθίσματα. Υπάρχουν πειστικές αποδείξεις από

in vitro

πειράματα ότι σε ένα υποσύνολο των CRPC κυττάρων, το AR αποκτά την ικανότητα να υποβληθούν σε ανεξάρτητη συνδεσμικού μετακινούνται από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα [8]. Τα περισσότερα ενδιαφέροντα, σε αυτά τα κύτταρα το AR εμφανίζει ένα υψηλό επίπεδο συστατικής, ανδρογόνο-ανεξάρτητες δραστηριότητα [9]. Δεδομένου ότι η πυρηνική παρουσία του υποδοχέα αποτελεί προϋπόθεση για τη σηματοδότηση AR, τη ρύθμιση της πυρηνικής μετατόπισης θα μπορούσε να αποκαλύψει νέες στρατηγικές για τη θεραπεία και των δύο εξαρτώμενων από ανδρογόνα υπολογιστή, καθώς και CRPC.

Διάφορες μελέτες έχουν προσφέρει γνώσεις σχετικά με το πυρηνικό εισαγωγή του AR. Μια διμερής αλληλουχία πυρηνικής εντόπισης (NLS) έχει ταυτοποιηθεί στον τομέα δέσμευσης DNA (DBD) και την περιοχή αρθρώσεως της AR [10]. Αυτό NLS χρησιμοποιεί την κλασική οδό importin για τη μεταφορά μέσω του συμπλέγματος πυρηνικού πόρου [11], [12]. Επιπλέον, ένα λιγότερο συγκεκριμένες NLS είναι παρόν στο πεδίο σύνδεσης συνδετήρα (LBD) του AR [13], [14]. Σε αντίθεση με την πυρηνική εισαγωγή του AR, οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην AR πυρηνική εξαγωγή είναι ελάχιστα κατανοητές. Τα πεδία σύνδεσης DNA (DBD) διαφορετικών υποδοχέων στεροειδών έχουν προταθεί για να λειτουργήσει ως σήματα πυρηνικού εξαγωγή (NES) για ένα Καλρετικουλίνης μεσολάβηση πυρηνική εξαγωγή [15]. Ωστόσο, για την AR τα δεδομένα αυτά έχουν συζητηθεί με αμφιλεγόμενο τρόπο [16], [17]. Πρόσφατα, Saporita et al. ανέφεραν την ταυτοποίηση ενός νέου NES (αμινοξέα 743-817) που βρίσκεται στο LBD της AR [18]. Η αναγνώριση ενός NES στην LBD του AR είναι σε συμφωνία με τα προηγούμενα ευρήματα της ομάδας μας, μελετώντας την πυρηνική εξαγωγή του AR σε κύτταρα PC ανδρογόνων που διεγείρεται μετά την αναστολή των γλυκογόνου-συνθάσης-κινάση 3β (GSK-3β) [19 ].

το εύρημα ότι η αναστολή της GSK-3β προκαλεί ταχεία πυρηνική εξαγωγή του AR σε κύτταρα PC ανδρογόνων που διεγείρονται μας ώθησε να αναλύσει τις επιπτώσεις της GSK-3β αναστολή σε ευνουχισμό ανθεκτικά sublines LNCaP C4-2 και LNCaP-ΜΤΑ [20], [21], και οι δύο είναι γνωστό ότι παρουσιάζουν υψηλά επίπεδα πυρηνικής AR απουσία ανδρογόνο ερεθισμάτων. Τόσο

in vitro

καθώς και

in vivo

δεδομένα που παρουσιάζονται σε αυτή τη μελέτη δείχνουν ότι η επαγωγή πυρηνοκυτταροπλασματικής εξαγωγή AR θα μπορούσε να είναι μια χρήσιμη στρατηγική για να μειώσει σηματοδότηση AR, ειδικά σε προηγμένες CRPC.

Αποτελέσματα

AR και GSK-3β είναι up-ρυθμίζονται CRPC κυτταρικές σειρές

για να αναλυθούν οι επιπτώσεις της GSK-3β αναστολέων για AR-δραστηριότητα CRPC κύτταρα που προσδιορίζεται πρώτη ενδογενής AR ή GSK-3β επίπεδα σε ολόκληρο κυτταρικά εκχυλίσματα των κυττάρων PC αναπτύχθηκαν απουσία του DHT. Οι AR-θετικά sublines LNCaP C4-2 και LNCaP-SSR, είναι γνωστό ότι πολλαπλασιάζονται σε απουσία ανδρογόνων, υπηρέτησε ως μοντέλα για CRPC [20], [21]. Το ευαίσθητο σε ανδρογόνο LNCaP καθώς και τα AR-αρνητικά κύτταρα PC3 χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1Α, το AR ήταν ανιχνεύσιμη σε όλες τις γραμμές LNCaP που αναπτύχθηκαν απουσία του AR-σταθεροποιητικό ανδρογόνων DHT. ενδοκυτταρικά επίπεδα AR ήταν σημαντικά αυξημένα στα κύτταρα CRPC AR-θετικό (C4-2 + 177%, LNCaP-SSR + 126%) (Πίνακας 1). Η αύξηση του AR-πρωτεΐνης σε ευνουχισμό ανθεκτικά sublines LNCaP ήταν παράλληλη με την αύξηση του PSA (C4-2 + 337% και LNCaP-SSR + 110%, αντίστοιχα), το τελευταίο γεγονός που υποδηλώνει ότι η AR είναι ιδιαίτερα ενεργή σε αυτά τα κύτταρα ( Σχήμα 1Α, Β? Πίνακας 1). ανάλυση Western blot της ενδοκυτταρικής GSK-3β πρωτεΐνη αποκάλυψαν σημαντικά υψηλότερη ενδοκυτταρική GSK-3β επίπεδα σε C4-2 (+ 361%) και LNCaP-SSR (+ 150%) των κυττάρων σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα LNCaP (Σχήμα 1Α, Πίνακας 1) .

(Α) Ενδοκυτταρικά AR και τα επίπεδα GSK-3β-πρωτεΐνης σε κυτταρικές σειρές PC αναπτύχθηκαν απουσία ανδρογόνων. Η AR-θετικά LNCaP, κύτταρα LNCaP C4-2-SSR και καθώς και οι AR-αρνητικά κύτταρα PC3 αναπτύχθηκαν επί 48 ώρες υπό συνθήκες ανδρογόνο στερούνται. Ακολούθως, τα κύτταρα λύθηκαν και τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με κηλίδωση Western για AR και GSK-3β. β-ακτίνη ζώνες χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) ενδοκυτταρικά επίπεδα PSA σε κύτταρα CPRC αναπτύσσονται κάτω από συνθήκες ανδρογόνων-στερηθεί. AR-θετικά LNCaP, LNCaP-SSR και τα κύτταρα C4-2 αναπτύχθηκαν και κατεργάστηκαν όπως περιγράφεται. Σχετικά επίπεδα PSA προσδιορίστηκαν στα αντίστοιχα κυτταρολύματα με στύπωση Western, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. β-ακτίνη μπάντες χρησίμευσαν ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Η μηλεϊμιδίου SB216763 μειώνει GSK-3β-ενεργοποιώντας φωσφορυλίωση τυροσίνης σε 216

Αρκετές μελέτες ανέφεραν ότι η πλειοψηφία της GSK- 3β μόρια είναι ανενεργές σε κύτταρα LNCaP ως αποτέλεσμα μιας φωσφορυλίωσης στην σερίνη 9 (S9) [26], [27]. Ωστόσο, υπάρχει πειραματική απόδειξη ότι η δραστικότητα της GSK-3β δεν αναστέλλεται πλήρως στα κύτταρα LNCaP [28], [29], [30], [31], [32]. Μετά τη θεραπεία DHT, η φωσφορυλίωση της GSK-3β εις τυροσίνη 216 (GSK-3β

Y216), ένα GSK-3β-ενεργοποίησης θέση φωσφορυλίωσης, αυξήθηκε σε κύτταρα LNCaP και C4-2 (Εικ. 2). Προκειμένου να αναστέλλουν υπολειμματική GSK-3β δραστικότητα σε κύτταρα LNCaP και C4-2, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το μηλεϊμίδιο SB216763, ένας αναστολέας της GSK-3β δείχνεται πρόσφατα να αναστέλλουν τη φωσφορυλίωση της GSK-3β

Y216 [33]. Επιπλέον, η ικανότητα των SB216763 να αναστέλλουν δραστικότητα GSK-3β σε κύτταρα C4-2 πιστοποιήθηκε με μεταβολές στην κατάσταση φωσφορυλίωσης της β-κατενίνης, μια πρωτότυπη κατάντη στόχος της GSK-3β (Σχήμα S1).

LNCaP κύτταρα και κύτταρα C4-2 σπάρθηκαν σε φιάλες Τ25 και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Μετά από αυτό, το μέσο αντικαταστάθηκε με στεροειδή μέσο ελεύθερο και τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για άλλες 24 ώρες. Στη συνέχεια, SB216763 (τελική συγκέντρωση 5 μΜ) προστέθηκαν 30 λεπτά πριν από την DHT (10 ηΜ) θεραπεία. Μετά από 4 ώρες, κυτταρολύματα αναλύθηκαν για GSK-3β

Y216 και GSK-3β

S9 φωσφορυλίωση, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι.

Η

Όπως αναμενόταν, επώαση με SB216763 ανέστειλε την φωσφορυλίωση της GSK-3β

Y216 στις δύο κυτταρικές σειρές, που πιο έντονη στα ανδρογόνα ανεξάρτητο C4-2 κύτταρα (Εικ. 2). Πιο ενδιαφέρον είναι, μια προκαλούμενη SB216763 μείωση της GSK-3 φωσφορυλίωσης

Y216 σε DHT-επεξεργασμένα κύτταρα C4-2 έγινε παράλληλα με την αύξηση της φωσφορυλίωσης S9 (Εικ. 2).

Unliganded AR εντοπίζεται στην πυρήνα σε CRPC LNCaP-sublines

η πυρηνική εντόπιση του AR αποτελεί προϋπόθεση για γονιδιωματική σηματοδότησης. Όπως φαίνεται στο σχήμα 3, οι CRPC sublines LNCaP-SSR και C4-2 επιδεικνύουν υψηλή πυρηνικής AR απουσία ανδρογόνο ερεθισμάτων. Όταν έλαβαν θεραπεία με DHT, η πυρηνική AR αυξήθηκε δραματικά στις ορμόνες που εξαρτώνται από τα κύτταρα LNCaP, ενώ η αύξηση των πυρηνικών AR σε LNCaP-SSR και C4-2 παρέμεινε περιθωριακή (Εικ. 3, Πίνακας 2). Για να αναλυθεί περαιτέρω η ανεξάρτητη από συνδέτη πυρηνική εισαγωγή του AR σε LNCaP και ευνουχισμός ανθεκτικά C4-2, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με μια κατασκευή έκφρασης που κωδικοποιεί την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη AR άγριου τύπου Ηώ σύντηξης (AR-EosFP) [19]. Σε αντίθεση με τα κύτταρα LNCaP στα οποία AR-EosFP ήταν πυρηνική μόνο με την παρουσία του DHT, AR-EosFP ήταν ανιχνεύσιμη στους πυρήνες των κυττάρων C4-2 απουσία ανδρογόνων (Εικ. 4). Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι η επικρατούσα πυρηνικό εντοπισμό του AR σε κύτταρα C4-2 δεν οφείλεται στην αυτόνομη λειτουργία του μορίου του υποδοχέα, αλλά εξαρτάται από την απορύθμιση των κυτταρικών παραγόντων σε κύτταρα C4-2.

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν υπό στεροειδούς-free συνθήκες για 24 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 10 ηΜ DHT και επωάστηκαν για άλλα 30 λεπτά. Ακολούθως, SB216763 προστέθηκε (τελική συγκέντρωση 5 μΜ) και τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν για μια άλλη 210 λεπτά. Μετά από αυτή τη θεραπεία, πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν για AR και λαμίνη Α όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. AR και λαμίνη επίπεδα Α ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία. επίπεδα AR εκφράστηκαν σε πολλαπλή μεταβολή AR /Lamin των κυττάρων που αναπτύσσονται κατά την απουσία του DHT και SB216763, το οποίο ορίστηκε σε 1

Η

LNCaP κύτταρα και τα κύτταρα C4-2 επιμολύνονται με PAR-t1EosFP και αναπτύχθηκαν για 24 ώρες απουσία ανδρογόνων. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με /χωρίς DHT (τελική συγκέντρωση 10 ηΜ). Μετά από 4 ώρες πυρηνικό ή κυτταροπλασματικό εντοπισμό του AR-EosFP παρακολουθήθηκε με μικροσκοπία φθορισμού.

Η

Θεραπεία του ευνουχισμού ανθεκτικών υποσειρές LNCaP με SB216763 ενεργοποιεί ένα CRM1 μεσολάβηση πυρηνική εξαγωγή του AR στην απουσία ανδρογόνων

Στα κύτταρα PC ανδρογονο-διεγερμένα, βραχυπρόθεσμη αναστολή της δραστηριότητας GSK-3β με διάφορους αναστολείς μικρού μορίου έχει δειχθεί ότι επάγει ταχεία CRM1 εξαρτώμενη πυρηνοκυτταροπλασματικής παλινδρόμηση του AR. Η πυρηνική εξαγωγή ήταν ανεξάρτητη από τον τρόπο δράσης του αναστολέα που χρησιμοποιούνται στις διάφορες μελέτες [32], [19]. Για να αναλυθούν τα αποτελέσματα μιας GSK-3β-αναστολής για την ανδρογόνο ανεξάρτητη πυρηνική συσσώρευση του AR, CRPC κυτταρικές σειρές LNCaP-SSR και C4-2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με τον αναστολέα SB216763 GSK-3β. Γονικά κύτταρα LNCaP εξαρτώμενων από ανδρογόνα χρησίμευσαν ως μάρτυρες (Σχήμα 3). Η επεξεργασία των κυττάρων με C4-2 SB216763 προκάλεσε μία ταχεία πυρηνική εξαγωγή του AR απουσία /παρουσία των ανδρογόνων, όπως φαίνεται με πυκνομετρία των τριών ανεξάρτητων κηλίδων Western (ρυθμός AR-εξαγωγή απουσία DHT = 64%? Παρουσία DHT = 75%) (Πίνακας 2). Ανεξάρτητου από ανδρογόνα πυρηνική συσσώρευση του AR στον ευνουχισμό ανθεκτικό LNCaP-SSR υπογραμμή επίσης μειώθηκε μετά τη θεραπεία SB216763: ωστόσο, τα αποτελέσματα είναι λιγότερο έντονα από ό, τι τα κύτταρα C4-2 (41% σε περίπτωση απουσίας του DHT? 46% σε παρουσία DHT) (Πίνακας 2). Η πυρηνική εξαγωγή του AR σε κύτταρα LNCaP αναπτύσσονται απουσία ανδρογόνων παρέμεινε οριακός αλλά ήταν ακόμα ανιχνεύσιμο (17% σε περίπτωση απουσίας του DHT? 7% σε παρουσία του DHT) (Πίνακας 3). Είναι ενδιαφέρον ότι η πυρηνική εξαγωγή της πρωτεΐνης AR σε κύτταρα C4-2 αναπτύχθηκαν απουσία του DHT μετά τη θεραπεία SB216763 μπορούσε να ανασταλεί από leptomycin Β επιβεβαιώνοντας CRM1 εξαρτώμενη μηχανισμός εξαγωγής (Εικ. 5).

C4- 2 κύτταρα αναπτύχθηκαν απουσία ανδρογόνων επωάστηκαν με /χωρίς τον αναστολέα CRM1 leptomycin Β (ΕΜΒ) 30 λεπτά πριν από τη θεραπεία SB216763. Μετά από 4 ώρες, πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν για AR και λαμίνη Α όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι.

Η

Αποσιώπηση και μακροπρόθεσμη αναστολή της GSK-3β σε κύτταρα C4-2

Χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό επικυρωθεί shRNA κατευθύνονται εναντίον GSΚ-3β (32), ήμασταν σε θέση να μειώσει δραστικά τα ενδοκυτταρικά επίπεδα GSK-3β σε κύτταρα C4-2 (Σχ. 6Α). Αυτή η ρύθμιση προς τα κάτω ήταν παράλληλα με εξάντληση της πρωτεΐνης πυρηνικής AR σε κύτταρα C4-2. Πυρηνική εξάντληση του AR πρωτεΐνης ήταν λιγότερο έντονη όταν τα κύτταρα C4-2 αναπτύχθηκαν σε παρουσία του AR-σταθεροποιητικό ορμόνη DHT (Σχ. 6Α). Μακροχρόνια θεραπεία του ανδρογονο-διεγερμένα LNCaP και 22Rv1 κυττάρων με διαφορετικές φαρμακολογικές GSK-3β αναστολέων έχει επανειλημμένα δείξει ότι η GSK-3β εμπλέκεται σε σταθερότητα AR [27], [32]. Το γεγονός ότι τα κύτταρα C4-2 εκφράζουν υψηλά επίπεδα κυτταροπλασματικής καθώς και στην πυρηνική AR απουσία ανδρογόνων μας ώθησε να αναλυθούν τα αποτελέσματα των SB216763 επί της ενδοκυτταρικής AR επίπεδα. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Β, η μακροχρόνια θεραπεία με SB216763 οδηγεί σε μια προς τα κάτω ρύθμιση της πρωτεΐνης σε κύτταρα AR C4-2 αναπτύχθηκαν απουσία ανδρογόνων.

(Α) Η σίγαση της GSK-3β σε κύτταρα C4-2. κύτταρα C4-2 επιμολύνθηκαν παροδικά με pKD-GSK-3β-v1 ή pKD-NegCon-v1. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, 10 ηΜ DHT προστέθηκε, όπου ενδείκνυται. Μετά από άλλες 24 ώρες, πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. (Β) Μακροπρόθεσμες αναστολή της GSK-3β χρησιμοποιώντας SB216763. C4-2 κύτταρα AR-θετικά υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες ποσότητες SB216763 για 48 ώρες απουσία ανδρογόνων. Τα κύτταρα λύθηκαν και τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με κηλίδωση Western για AR. β-ακτίνη μπάντες χρησίμευσαν ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

AR-θετικά κύτταρα CRPC C4-2 και LNCaP-SSR είναι πιο ευαίσθητα στις ανασταλτικές της ανάπτυξης επιδράσεις του αναστολέα SB21676 GSK-3β από κύτταρα LNCaP ή το AR -αρνητική κύτταρα PC3

Αναστολή της GSK-3β έχει δειχθεί ότι αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των AR-θετικών κυττάρων αναπτύχθηκαν σε παρουσία φυσιολογικών επιπέδων των ανδρογόνων [27], [32]. Με επίκεντρο την CRPC κύτταρα, εξετάσαμε τις επιδράσεις της SB216763 στον πολλαπλασιασμό των κυτταρικών σειρών PC καλλιεργούνται υπό συνθήκες ανδρογόνων-στερηθεί. Όπως φαίνεται στο σχήμα 7Α, AR-θετικών CRPC κύτταρα που αναπτύσσονται απουσία ανδρογόνων ήταν πιο ευαίσθητα στις ανασταλτικές δράσεις ανάπτυξης του SB216763 (C4-2 & gt? LNCaP-ΜΤΑ & gt? LNCaP). Σε ένα πείραμα χρονικής πορείας (Εικ. 7Β), ο πολλαπλασιασμός των AR-θετικών CRPC κυτταρικές σειρές LNCaP-SSR και C4-2 καλλιεργούνται για 96 ώρες με την παρουσία 1 μΜ SB216763 αναστάλθηκε κατά 26% και 35% αντίστοιχα. Αντίθετα, ο ρυθμός πολλαπλασιασμού του γονικού LNCaP και την AR-αρνητικών PC3 μειώθηκε μόνο κατά 19% και 8%, όταν καλλιεργείται υπό τις ίδιες συνθήκες. Συνοπτικά, οι AR-θετικά κύτταρα LNCaP ήταν περισσότερο ευαίσθητα στη θεραπεία SB216763 από τα AR-αρνητικά κύτταρα PC3. Η επίδραση της SB216763 επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού των κυττάρων PC αναπτύσσονται κάτω από συνθήκες ανδρογόνο στερηθεί ήταν η πιο έντονη σε CRPC κύτταρα AR-θετικό (C4-2 & gt? LNCaP-ΜΤΑ & gt? LNCaP & gt? PC3). (Εικ. 7Α, Β)

AR-θετικών LNCaP, LNCaP-SSR και C4-2 κύτταρα καθώς και τα AR-αρνητικά κύτταρα PC3, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες ποσότητες SB216763 για 48 ώρες (Α) ή με /χωρίς 1 μΜ SB216763 για 0, 24 και 96 ώρες (Β). Ο πολλαπλασιασμός μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ΜΤΤ όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο (Α) εκφράζεται ως% του χωρίς αγωγή ελέγχων ± τυπική απόκλιση. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο (Β) που εκφράζεται σε ποσοστό του SB216763-θεραπεία /χωρίς θεραπεία ελέγχου που ορίστηκε στο 100% για το χρονικό σημείο μηδέν ± τυπική απόκλιση.

Η

Η αναστολή της GSK-3β ρυθμίζει AR-σηματοδότηση διαμορφώνοντας τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό του AR

in vivo

η

για να προσομοιώσει τα αποτελέσματα μιας GSK-3β αναστολή

in vivo

, χρησιμοποιήσαμε μία τροποποιημένη χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης ( CAM) μοντέλο [25]. SB216763 εγχύθηκε σε ένα CAM φλεβική επιτρέπει την συστημική εξάπλωση της ένωσης στο σύστημα του εμβρύου όρνιθας-CAM. Οι επιδράσεις των SB216763 στις μεταμοσχευμένα οζίδια όγκου παρακολουθούνταν μετά από 48 ώρες με ανοσοϊστοχημεία. Σε αντίθεση με τις

in vitro

παρατηρήσεις όχι μόνο C4-2, αλλά και LNCaP εξέφρασαν υψηλά επίπεδα πυρηνικής AR

in vivo

(πυρηνική AR: LNCaP: 74,6 ± 25,8%, C4-2: 63,4 ± 10%). Μετά τη θεραπεία SB216763 επιπέδων πυρηνικής AR σε κύτταρα C4-2 μειώθηκαν κατά 57% από το 63,3% να 27,1 μετά από 48 ώρες (Σχ. 8, Πίνακας 1). των επιπέδων πυρηνικής AR σε LNCaP παρέμεινε σχεδόν ανεπηρέαστη από SB216763 (LNCaP: χωρίς αγωγή 74.6 ± 25.8%? SB216763 επεξεργασμένο 76,5 ± 18%) (Πίνακας 3). Το ποσοστό των PSA-θετικών κυττάρων ήταν υψηλότερη στην κυτταρική γραμμή C4-2 συγκριτικά με την γονική κυτταρική σειρά LNCaP (% των κυττάρων χρώση για PSA: LNCaP 3 ± 3,3% έναντι 16,8 ± C4-2 10,6%), γεγονός που υποδηλώνει ότι η AR σε C4-2 είναι ενεργή. Μετά την κατεργασία SB216763 η μείωση των πυρηνικών AR σε C4-2 έγινε παράλληλα με τη μείωση της PSA-θετικά κύτταρα (χωρίς θεραπεία C4-2: 16,8 ± 10,6% έναντι 3,8 ± 4,7% σε επεξεργασμένο SB216763 C4-2). (Εικόνα 8, Πίνακας 3).

Ο προσδιορισμός CAM έγινε με κύτταρα C4-2. Στη συνέχεια, πυρηνικό εντοπισμό του AR και ενδοκυτταρική διανομή PSA σε μη επεξεργασμένα και επεξεργασμένα SB216763 όγκο-οζίδια (μεγέθυνση 400χ) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Οι AR-θετικά κύτταρα σημειώνονται με αστέρια.

Η

Συζήτηση

Στις δυτικές βιομηχανικές χώρες, PC παρουσιάζει ένα σοβαρό πρόβλημα υγείας και είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σε ηλικιωμένους άνδρες. Παρά το γεγονός ότι το PC είναι πολύ ετερογενής στην αιτιολογία της, ανδρογόνων σηματοδότησης αποτελεί βασικό στοιχείο για την ανάπτυξη και την εξέλιξη των PC. Αρχικά, τα κύτταρα PC εξαρτώνται από ανδρογόνα για την ανάπτυξη και την επιβίωση σε μεγάλο βαθμό. Κατά συνέπεια, ενδοκρινική θεραπεία που περιλαμβάνει ανδρογόνων εξάντληση από χειρουργική ή ιατρικό ευνουχισμό, καθώς επίσης και τον αποκλεισμό της υποδοχέα ανδρογόνων με αντι-ανδρογόνα, έχει γίνει μια πρότυπη θεραπεία για προχωρημένη ή μεταστατική νόσο. Ωστόσο, το όφελος από την ενδοκρινική θεραπεία του προχωρημένου PC είναι παροδική μόνο. Μέσα σε μια περίοδο περίπου 2 χρόνια, σχεδόν όλοι οι καρκίνοι του προστάτη εξελιχθεί σε ευνουχισμό-ανθεκτική κατάσταση της νόσου, όπου έχουν πάψει να ανταποκρίνονται με το πρότυπο ενδοκρινικές θεραπείες. Στο παρελθόν, έχει υποτεθεί ότι η κατάσταση των CRPC οφειλόταν σε κλωνική επιλογή του AR-αρνητικών κυττάρων. Αυτή η υπόθεση βασίστηκε κυρίως στο μοντέλο όγκου αρουραίου Dunning όπου η ανάπτυξη μιας ανδρογονο-αναίσθητη κατάσταση συνδέεται με την απώλεια του AR σε κύτταρα όγκου κατά τη διάρκεια της απόσυρσης ανδρογόνων. Ωστόσο, κλινικές μελέτες έδειξαν ότι η AR είναι σπάνια χάνεται αλλά συχνά αυξάνεται σε CRPC δείγματα όγκου και των μεταστάσεων τους [5], [6], [34], [35]. Το γεγονός ότι σε περίπτωση απουσίας των ανδρογόνων ερεθίσματα πολλά από τα ίδια γονίδια που αυξάνονται από ανδρογόνα σε εξαρτώμενη από ανδρογόνο PC γίνει αυξημένα σε CRPC υποστηρίζει την έννοια της συστατικώς δραστικής AR πρωτεϊνών σε κύτταρα CRPC [36]. Η υπόθεση αυτή υποστηρίζεται επίσης από την παρατήρηση ότι η διακοπή της λειτουργίας του AR αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των CRPC κύτταρα που αναπτύσσονται απουσία των ανδρογόνων [37].

Στην έκθεση αυτή θα χρησιμοποιηθούν τα AR-θετικά sublines LNCaP C4-2 και LNCaP-SSR που είναι τόσο γνωστό να αναπτυχθούν και να επιβιώσουν υπό συνθήκες ανδρογόνων-στερηθεί ως

in vitro

μοντέλο όγκου για CRPC [21], [20]. Μπορέσαμε να δείξουμε ότι, σε αντίθεση με τα γονικά κύτταρα LNCaP εξαρτώμενων από ανδρογόνα, ευνουχισμός ανθεκτικά υποσειρές LNCaP C4-2 και LNCaR-SSR εμφάνισαν υψηλά επίπεδα AR και PSA όταν αναπτύχθηκαν απουσία ανδρογόνων. Πιο ενδιαφέροντα, η αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης ενδοκυτταρική AR ήταν παράλληλη με την αύξηση της GSK-3β, ένα πανταχού παρόν κινάση σερίνης θρεονίνης αποδειχθεί ότι είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της σταθερότητας AR

in vitro

[32], [27]. Παρά το γεγονός ότι αυτή τη στιγμή δεν είμαστε σε θέση να πούμε ότι η απορύθμιση της GSK-3β επίπεδα είναι υπεύθυνη για την τάση των κυττάρων PC για την αύξηση της ενδοκυτταρικής AR-επίπεδα, ενώ όλο και ευνουχισμού ανθεκτικά, μας

in vitro

παρατηρήσεις είναι σύμφωνες με μια πρόσφατη κλινική μελέτη που δείχνει μια συσσώρευση της GSK-3β σε κύτταρα του ευνουχισμού ανθεκτικών όγκων [38]. Η ανίχνευση υψηλών ενδοκυτταρικά επίπεδα PSA σε C4-2 και LNCaP-SSR στερείται ανδρογόνα ερεθίσματα υποδηλώνει ότι η AR είναι λειτουργικά ενεργά σε αυτά τα κύτταρα, ακόμη και κάτω από ανδρογόνα υποβαθμισμένες συνθήκες.

Για να δημιουργήσετε γονιδιωματικής σήματα, τα AR πρέπει να μεταφερθεί στον πυρήνα. Σε αυτή τη μελέτη, το AR βρέθηκε να είναι κατά κύριο λόγο στον πυρηνικό τομέα σε LNCaP-SSR κύτταρα και κύτταρα C4-2 απουσία ανδρογόνων. Ο λόγος για την ανδρογόνο ανεξάρτητη πυρηνική συσσώρευση του πλήρους μήκους AR σε CRPC κύτταρα παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος. Υπό κανονικές συνθήκες, η πυρηνική μετατόπιση του AR αυξάνεται δραματικά μετά από δέσμευση όπως αποδεικνύεται για LNCaP ορμόνη. Πρόσφατα ευρήματα υποδεικνύουν ότι, προκειμένου να εισέλθει στον πυρήνα, το AR πρέπει να υποβάλλεται σε αλλαγή ενδο-μοριακή διαμόρφωση που φέρνει το Ν- και C-άκρα του μορίου σε στενή εγγύτητα. Αυτό ενδο-μοριακών διαμορφωτική μεταβολή που επιτρέπει την ενεργοποίηση και την πυρηνική μετατόπιση του ενός μονομερούς AR, πριν από την AR διμερισμού, συνήθως επάγεται από δέσμευση συνδέτη και εμφανίζεται μόνο σε ζωντανά κύτταρα, όχι στα κυτταρολύματα [39], [40], το οποίο υποδηλώνει ότι αυτή η ενδο-μοριακών αναδιοργάνωση του AR δεν είναι πρωτεΐνη-αυτόνομο, αλλά εξαρτάται από κυτταρικούς παράγοντες. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, έχουμε μεταγενέστερα επιμολυσμένα κύτταρα C4-2 και LNCaP με ένα κατασκεύασμα έκφρασης που κωδικοποιεί μία άγριου τύπου AR συγχωνευμένο με ένα πράσινο Eos φθορίζουσα πρωτεΐνη (EosFP) [41]. Με την παρουσία του DHT AR-EosFP ήταν ανιχνεύσιμη στους πυρήνες των δύο LNCaP και C4-2. Όταν αναπτύχθηκαν απουσία του DHT, AR-EosFP ήταν ανιχνεύσιμη μόνο στους πυρήνες των κυττάρων C4-2 ευνουχισμού ανθεκτικά αλλά όχι στους πυρήνες των κυττάρων LNCaP ανδρογόνο-εξαρτώμενη. Αυτή η παρατήρηση είναι συνεπής με ένα παρόμοιο πείραμα που αποδεικνύει μια ισχυρή πυρηνική εντόπιση ενός GFP-tagged AR επιμολύνθηκε σε κύτταρα C4-2 [42]. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η πυρηνική εντόπιση της πλήρους μήκους AR στο CRPC δεν απαιτεί απαραίτητα ορμόνη δεσμευτική και μπορεί αντίθετα να ρυθμίζεται από άλλους παράγοντες.

Όπως φαίνεται πρόσφατα από την ομάδα μας, βραχυπρόθεσμα αναστολή της σερίνης /θρεονίνης κινάσης GSK-3β με αναστολείς μικρού μορίου που προκαλείται από μια ταχεία, CRM1 εξαρτώμενη πυρηνοκυτταροπλασματικής παλινδρόμηση του AR σε κύτταρα ανδρογονο-αγωγή [19]. Όπως GSK-3β υπερεκφράζεται σε κύτταρα CRPC

in vivo και in vitro

, υποθέσαμε ότι το ένζυμο μπορεί επίσης να είναι μέρος ενός υποθετικού συμπλόκου πρωτεΐνης που εμπλέκεται στην πυρηνική συσσώρευση του AR. Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται από ένα προηγούμενο εύρημα που δείχνει ότι η GSK-3β είναι εξαιρετικά φωσφορυλιώνεται σε τυροσίνη 216 (Y216), η λειτουργία ενεργοποίηση του ενζύμου, στα κύτταρα C4-2 [30]. Η αύξηση της GSK-3β

Y216 φωσφορυλίωση σε κύτταρα LNCaP μετά από θεραπεία DHT (Εικ. 2) υποδηλώνει εξάλλου ένα σημαντικό ρόλο για την GSK-3β σε σηματοδότηση AR υπό κανονικές συνθήκες. Σε μια προσπάθεια να διαταράξει την επικρατούσα πυρηνικό εντοπισμό του AR στους CRPC κύτταρα, υποβάλλαμε σε αγωγή ευνουχισμός ανθεκτικά C4-2 και LNCaP-SSR καθώς και η γονική LNCaP με το μηλεϊμίδιο SB216763. Αυτή η εξαιρετικά ισχυρή ένωση είναι γνωστό ότι αναστέλλει ενδομοριακή δράση κινάσης τυροσίνης του μορίου GSK-3β, τα οποία είναι αρμόδια για την αυτοφωσφορυλίωση του κατά Y216 [33]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, ο αναστολέας GSK-3β SB216763 είναι σε θέση να μειώσει Y216-φωσφορυλίωση της GSK-3β σε LNCaP, καθώς και σε κύτταρα C4-2. Μετά τη θεραπεία με SB216763, την πυρηνική συσσώρευση του AR στα ανθεκτικά castration- sublines LNCaP C4-2 και LNCaP-SSR μειώθηκε δραματικά με την παρουσία, και το πιο σημαντικό με την απουσία, της DHT, που πιο έντονη στα κύτταρα C4-2 (Πίνακας 2). Πυρηνοκυτταροπλασματικής παλινδρόμηση του AR μετά GSK-3β-αναστολής σε κύτταρα C4-2 αναπτύχθηκαν απουσία του DHT μπορούσε να αναστραφεί με leptomycin Β (ΕΜΒ), γεγονός που υποδηλώνει CRM1 εξαρτώμενη μηχανισμός εξαγωγής (Εικ. 5). Σε προηγούμενη μελέτη, αναγνωρίσαμε μια θέση δέσμευσης CRM1 στο C-άκρο του AR [19]. Επειδή βρίσκεται πολύ κοντά στην περιοχή σύνδεσης συνδετήρα, υποθέσαμε ότι η πρόσδεση της ορμόνης μπορεί να ρυθμίζει την προσβασιμότητα της περιοχής δέσμευσης CRM1, διαμορφώνοντας έτσι την πυρηνική εξαγωγή του AR. Η παρατήρηση ότι το AR μπορεί να εξαχθεί από τους πυρήνες των CRPC κύτταρα που αναπτύσσονται απουσία ανδρογόνων είναι ένα σημαντικό νέο εύρημα, καταδεικνύοντας σαφώς ότι η πυρηνική εξαγωγή του AR εξής GSK-3β αναστολή δεν οφείλεται σε μια διαμόρφωση των ιδιοτήτων πρόσδεσης ορμόνης του υποδοχέα.

το γεγονός ότι η βραχυπρόθεσμη αναστολή της GSK-3β (μεγ. 4 ώρες) οδηγεί σε ταχεία εξαγωγή του AR μας ώθησε να αναλυθούν τα αποτελέσματα μιας μακροπρόθεσμης αναστολή του ενζύμου σε AR -θετικό CRPC-κύτταρα. Αποσιώπηση της GSK-3β χρησιμοποιώντας συγκεκριμένες shRNA οδήγησε σε εξάντληση των πυρηνικών AR σε κύτταρα C4-2. Πυρηνική εξάντληση του AR πρωτεΐνης ήταν λιγότερο έντονη σε κύτταρα C4-2 αναπτύσσονται παρουσία του AR-σταθεροποιητικό ορμόνη DHT. Παρά το γεγονός ότι τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η αναστολή της GSK-3β πυροδοτεί την πυρηνοκυτταροπλασματικής παλινδρόμηση του AR, τα στοιχεία που προέρχονται από τις μακροπρόθεσμες shRNA-πειράματα πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή. Βραχυπρόθεσμες αναστολή της δραστηριότητας GSK-3β από μικρά μόρια όπως SB216763 επανειλημμένα αποδειχθεί ότι επάγει μια ταχεία, CRM1 εξαρτώμενη πυρηνική εξαγωγή του AR σε κύτταρα PC [19], [32]. Σε αντίθεση με αυτά τα ευρήματα, η μακροπρόθεσμη αναστολή της GSK-3β προκάλεσε αποικοδόμηση του πρωτεασώματος της πρωτεΐνης AR [32]. Επειδή GSK-3β πυροδοτεί AR εντοπισμού, καθώς και σταθερότητα AR, υποθέτουμε ότι η δραματική μείωση των πυρηνικών AR σε κύτταρα C4-2 εξής GSK-3β σίγησης οφείλεται σε ένα συνδυασμό της πυρηνικής εξαγωγής και της υποβάθμισης του πρωτεασώματος του μορίου υποδοχέα.

το γεγονός ότι η αναστολή της GSK-3β επηρεάζει τη λειτουργία AR καθώς και η σταθερότητα AR μας ώθησε να αναλύσει τα αποτελέσματα της αναστολής της GSK-3β στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC

in vitro

. Ανταπόκριση στη θεραπεία των PC κυττάρων με SB216763 ήταν πιο έντονη σε CRPC κύτταρα AR-θετικό (αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης: C4-2 & gt? LNCaP-ΜΤΑ & gt? LNCaP & gt? PC3). Η ικανότητα των SB216763 να αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ήταν παράλληλη με την ικανότητά της να επάγει μία εξαρτώμενη CRM1 εξαγωγής του AR σε κύτταρα PC.

Προκειμένου να ελεγχθεί η αποτελεσματικότητα της GSK-3β αναστολέων ως πιθανοί θεραπευτικοί παράγοντες, εμείς επεκταθεί μελέτες μας σε ένα CAM-ξενομοσχεύματος μοντέλο. Προς έκπληξή μας, το AR ήταν κατά κύριο λόγο στον πυρηνικό τομέα σε LNCaP ξενομοσχεύματα, καθώς και σε C4-2 ξενομοσχεύματα. Μια πιθανή εξήγηση για αυτό θα μπορούσε να είναι η παραγωγή των ανδρογόνων από τον οργανισμό ξενιστή. Επιπλέον, το AR των LNCaP και τα παράγωγά του είναι εφοδιασμένο με σημειακή μετάλλαξη (T877A) που οδηγεί σε ένα promiscuous AR που μπορεί, τουλάχιστον εν μέρει, να ενεργοποιούνται από διάφορα μη-ανδρογόνα στεροειδή [43], [44]. Παρ ‘όλα αυτά, το AR των C4-2 σε σύγκριση με την AR της γονικής LNCaP είναι πιο ενεργός στην CAM-μοντέλο ξενομοσχεύματος, όπως τεκμηριώνεται από τα ενδοκυτταρικά επίπεδα PSA (κύτταρα θετικά για PSA: LNCaP 3,1% και 16,8% C4-2 ). Μετά από μια θεραπεία 48 ωρών με SB216763, πυρηνική AR επίπεδα των κυττάρων C4-2 μειώθηκαν σημαντικά, η οποία συνοδεύτηκε από μία σημαντική μείωση στα επίπεδα ενδοκυτταρικού PSA. Σε αντίθεση με τα αποτελέσματα σε κύτταρα C4-2 οι επιπτώσεις στην AR και PSA σε κύτταρα LNCaP παρέμεινε ασήμαντη.

Στο σύνολό τους μελέτη μας δείχνει ότι (1) υπερέκφραση του AR σε κύτταρα CPRC παραλληλίζεται με μία αύξηση του ενδοκυτταρικού GSK-3β, (2) τα αποτελέσματα της GSK-3β σε σηματοδότηση AR δεν οφείλονται σε διαφοροποίηση της DHT δέσμευση στον AR, (3) πυρηνική συσσώρευση του AR σε CRPC κύτταρα δεν είναι ένα αυτόνομο λειτουργίας ενός μεταλλαγμένου υποδοχέα AR αλλά διαμεσολαβείται από απορρυθμισμένο κυτταρικούς παράγοντες, όπως GSK-3β, (4) GSK-3β και CRM1 αποτελούν μέρος ενός υποθετικού συμπλόκου έλεγχο της πυρηνικό εντοπισμό του AR σε CRPC κύτταρα, και (5) η αναστολή της GSK-3β δραστηριότητα αναστολείς μικρού μορίου προκαλεί ταχεία πυρηνική εξαγωγή του AR σε κύτταρα CRPC

in vitro

και

in vivo

διαμορφώνοντας έτσι την σηματοδότηση AR.

Η εξάρτηση της CRPC σε μεταγραφικά ενεργή AR έχει ορθώθηκαν ξανά το ενδιαφέρον για την ανάπτυξη αναστολέων με στόχο τον άξονα AR ή ανδρογόνων. ορμονικές θεραπείες επόμενης γενιάς αναγνωρίζουν το γεγονός ότι σε CRPC το AR μπορεί να ενεργοποιηθεί με την εγγενή παραγωγή ανδρογόνων ιστών, καθώς και από πεπτιδικούς αυξητικούς παράγοντες. Μεταξύ των ορμονικών παραγόντων δοκιμάζονται σήμερα είναι αναστολείς CYP17 όπως abiraterone, ΤΑΚ-700 και ΤΟΚ-001 ή αντι-ανδρογόνα MDV 3100 δεύτερης γενιάς [45]. Αναστολείς μικρά μόρια όπως η ΕΡΙ-001 και sintokamide στόχευση του τομέα διενεργοποίησης στο Ν-τελικό άκρο του AR έχουν δείξει ενθαρρυντικά αποτελέσματα in vitro όσο και σε πειραματικά μοντέλα ζώων [46], [47].