Αφηρημένο

Τα microRNAs είναι μικρά μη-κωδικοποίησης RNA που ρυθμίζουν φυσιολογικά έκφραση πρωτεϊνών, και ρυθμίζουν πολλές κυτταρικούς μηχανισμούς. Η αλλοίωση της εκφράσεως microRNA έχει περιγραφεί σε καρκίνο και συνδέεται με την έναρξη και την εξέλιξη του όγκου. Η microRNA 148α (MIR-148a) είναι συχνά κάτω-ρυθμίζονται σε καρκίνο. Έχουμε προηγουμένως αποδείξει ότι τα κάτω ρύθμιση της από DNA υπερμεθυλίωση είναι ένα πρώιμο γεγονός στην παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) καρκινογένεση, υποδηλώνοντας μια λειτουργία καταστολής όγκου. Εδώ, θα διερευνήσει τον πιθανό ρόλο του miR-148a υπερ-έκφραση σε PDAC ως θεραπευτικό εργαλείο. Εμείς πρώτα αναφέρουν τις συνέπειες των miR-148a υπερ-έκφραση σε κυτταρικές σειρές PDAC. Έχουμε αποδείξει ότι miR-148a υπερ-έκφραση δεν έχει δραματική επίδραση επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της κυτταρικής χημειο-ευαισθησία σε τέσσερις περιγράφονται καλά κυτταρικές σειρές PDAC. Διερευνούμε επίσης τη διαμόρφωση της έκφρασης της πρωτεΐνης από μια παγκόσμια πρωτεομική προσέγγιση (2D-ΨΗΦΟ). Δείχνουμε ότι παρά τις μαζικές της υπερ-έκφρασης, miR-148a διαμορφώνει ασθενώς έκφραση πρωτεΐνης, αποτρέποντας έτσι την ταυτοποίηση των πρωτεϊνικών στόχων σε κυτταρικές γραμμές PDAC. Το πιο σημαντικό,

in vivo

δεδομένα καταδεικνύουν ότι ρύθμιση έκφρασης miR-148a, είτε στα κύτταρα επιθήλια όγκου ή /και στο μικροπεριβάλλον του όγκου δεν εμποδίζει την ανάπτυξη του όγκου. Στο σύνολό τους, έχουμε αποδείξει στο παρόν ότι το miR-148a δεν επηρεάζει PDAC πολλαπλασιασμό τόσο

in vitro

και

in vivo

προτείνοντας έτσι μια μικρή πιθανότητα ως θεραπευτικό εργαλείο.

Παράθεση : Delpu Υ, Lulka Η, Sicard F, Saint-Laurent Ν, Lopez F, Χανούν Ν, et al. (2013) Η διάσωση της έκφρασης miR-148a σε καρκίνο του παγκρέατος: μια ακατάλληλη θεραπευτικό εργαλείο. PLoS ONE 8 (1): e55513. doi: 10.1371 /journal.pone.0055513

Επιμέλεια: Γκύντερ Schneider, Τεχνικό Πανεπιστήμιο του Μονάχου, Γερμανία

Ελήφθη: 6 Γενάρη του 2012? Δεκτές: 2, Γενάρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 31, Ιανουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Delpu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Institut National de la Santee et de la Recherche Medicale (INSERM, www.inserm.fr) και την Ένωση pour la Recherche sur le Καρκίνο (ARC, www.arc-cancer.net). Πρωτεομική μελέτες που υποστηρίζονται από την υποδομή Τουλούζη πρωτεομική με την οικονομική υποστήριξη του «Συλλόγου pour la Recherche sur le Καρκίνου» (ARC- Areca Program). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα του πόρου (PDAC) είναι η τέταρτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις δυτικές χώρες, ενώ αντιπροσωπεύει μόνο το 3% των νέων περιπτώσεων κάθε χρόνο [1]. PDAC πρόγνωση συχνά εξηγείται από την έλλειψη έγκαιρης ειδικών διαγνωστικών δεικτών και από την απουσία αποτελεσματικών θεραπειών. Μέχρι σήμερα, η χειρουργική επέμβαση αποτελεί τη μόνη θεραπευτική προσέγγιση για τη διαχείριση PDAC αλλά αφορά ένα μικρό υποσύνολο των ασθενών λόγω PDAC επιθετικότητα και επεμβατική φαινότυπο. Για τους υπόλοιπους ασθενείς που διαγιγνώσκονται με τοπικά προχωρημένο ή μεταστατικό PDAC, γεμσιταμπίνη χημειοθεραπεία είναι η τυπική παρηγορητική αγωγή με μέτρια επίδραση στην επιβίωση [2]. Κατά συνέπεια, έχουν αξιόλογες μελέτες που έχουν διεξαχθεί για τη διαλεύκανση των βασικών γεγονότων οδήγησης του παγκρέατος καρκινογένεση, για τον εντοπισμό νέων στόχων και για την ανάπτυξη θεραπειών όγκου στοχευμένες [3], [4]. Γενετικές και επιγενετικές μεταβολές έχουν περιγραφεί ως ένα πρώιμο συμβάν στην ανάπτυξη PDAC [5]. Κατά την τελευταία δεκαετία, σημαντικά έργα υπογράμμισε τον αντίκτυπο αυτών των μοριακών μεταβολών στην έκφραση microRNAs στο PDAC. Τα microRNAs είναι μικρά μη κωδικοποίησης RNAs που αναστέλλουν την μετάφραση των mRNA στόχο τους. Αυτοί παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου, της διεισδυτικότητας και αντίσταση σε χημειοθεραπείες [6].

προηγουμένως έδειξαν ότι η έκφραση microRNA-148a (MIR-148a) ρυθμίζεται προς τα κάτω κατά τη διάρκεια της πρόωρης ανάπτυξης PDAC με υπερμεθυλίωση του γενωμικού DNA του αλληλουχία [7]. Άλλες μελέτες ανέφεραν την προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης miR-148a σε άλλους καρκίνους (

δηλ

:. Ορθοκολικού, οισοφαγικού, γαστρικού καρκίνου και μετάστασης καρκίνου) [8], [9], [10], [11]. Αρκετές στόχους mRNA miR-148a περιγράφηκαν σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου. Οι στόχοι αυτοί ανασυντάσσονται του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση ή μεθυλίωση του DNA τελεστές.

Προηγούμενες μελέτες προκάλεσε ένα φαινόμενο επακόλουθη κατασταλτική του όγκου σε μια υπερ-έκφραση του miR-148a σε παχέος εντέρου και του γαστρικού καρκίνου που προέρχεται από κυτταρικές σειρές [8], [10 ]. Κατά συνέπεια, η παρούσα μελέτη είχε ως σκοπό να καθορίσει εάν η αποκατάσταση των επιπτώσεων έκφραση του miR-148a PDAC πολλαπλασιασμό τόσο

in vitro

και

in vivo

και ως εκ τούτου θα μπορούσε να προταθεί ως θεραπευτικό εργαλείο.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια

PDAC κυτταρικές σειρές ανθρώπινου Capan-2 και IMIM-PC2 αναπτύχθηκε σε μέσο RPMI συμπληρωμένο με 100 mL /L ορού εμβρύου μόσχου, L-γλουταμίνη (2 mM ) (Life Technologies), αντιβιοτικά και αντιμυκητιασικό κοκτέιλ (Life Technologies) και Plasmocin® (5 μg /mL) (InvivoGen). ΜΙΑ PaCa-2 και PANC-1 κύτταρα PDAC και ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα ΗΕΚ-293FT αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιείχε 4,5 g /L γλυκόζη (Life Technologies), 100 mL /L ορού εμβρύου μόσχου, L-γλουταμίνη, αντιβιοτικά, Fungizone® και Plasmocin® (InvivoGen). Ανθρώπινη PDAC προερχόμενα κύτταρα BxPC-3 αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 1 g /L γλυκόζη (Life Technologies), 100 mL /L ορού εμβρύου μόσχου, L-γλουταμίνη, αντιβιοτικά και αντιμυκητιασικό κοκτέιλ. Ανθρώπινη παγκρεατική νεστίνη θετικά επιθηλιακά κύτταρα (HPNE) αναπτύχθηκαν σε 75% ϋΜΕΜ 4,5 g /L γλυκόζη (Life Technologies), 25% M3 Base Medium (Incell Corp.), ορό εμβρύου μόσχου 5%, 10 ng /mL ανθρώπινης ανασυνδυασμένης EGF ( Sigma-Aldrich) και 750 ng /mL γενταμυκίνη (Life Technologies). Όλες οι κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC) εξαιρούμενο για κύτταρα HPDE και τα κύτταρα τα οποία είναι HPNE είδος δώρα από Dr M.S. Τσάο (Πανεπιστήμιο του Τορόντο, Καναδάς) και Δρ Μ Ouellette (Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Omaha, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής), αντίστοιχα [12], [13]. κύτταρα IMIM-PC2 ελήφθησαν από τον Δρ FX Ρεάλ (Ισπανικό Εθνικό Κέντρο Έρευνας Καρκίνου, Μαδρίτη, Ισπανία).

τηλέφωνα επιμόλυνση

Για όλους

in vitro

πειράματα, ΜΙΚ 148a προ-miR προδρόμων ™ miRNA (Ambion) στους 25 ηΜ και 50 ηΜ επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας siPORT ™ NeoFX ™ Transfection Agent (Ambion) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Cy ™ 3 χρωστική-σημασμένο προ-miR χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος και επιμολύνθηκε χρησιμοποιώντας τις ίδιες συνθήκες.

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής

επιμολυσμένα κύτταρα Capan-2 συλλέχθηκαν, ξεπλύθηκαν μία φορά σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και σταθεροποιήθηκαν σε παγωμένο 70% αιθανόλη όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 1.000 g και ξεπλένονται με PBS. Τα κύτταρα σημάνθηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (Life Technologies) ακολουθώντας τις συστάσεις του κατασκευαστή. κατανομή του κυτταρικού κύκλου αξιολογήθηκε με τη χρήση συσκευής BD FACS Calibur (Beckton Dickinson) και Cell Quest Pro λογισμικού (Beckton Dickinson) όπως περιγράφεται από Χανούν

et al.

[14].

2D-ΨΗΦΟ ηλεκτροφόρηση

η λύση των κυττάρων έγινε σε ουρία 8Μ, Θειουρία 2Μ, CHAPS 4%, pH 8,5. Μετά απορρύπανση κατακρήμνιση (2D Clean Up kit, GE Healthcare), πρωτεΐνες επαναιωρηματοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό 2D-ΨΗΦΟ δείγμα (ουρία 8Μ, Θειουρία 2Μ, CHAPS 4%, ρΗ 8,5). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με το κιτ 2D Quant (GE-Healthcare). Πενήντα μικρογραμμάρια πρωτεϊνών σημάνθηκαν με 400 pmol του CyDye ΨΗΦΟ Fluor Minimal χρωστικές (GE Healthcare) και επωάζεται επί πάγου στο σκοτάδι για 30 λεπτά σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η αντίδραση σταμάτησε με την προσθήκη 1 μΙ 10 mM λυσίνη και επωάζονται επί πάγου για 10 λεπτά. Διαφορικά Cy-3 και Cy-5 επισημασμένο δείγματα αναμίχθηκαν με το Cy-2 επισημασμένο εσωτερικό πρότυπο (δείγμα που αποτελείται από ίσες ποσότητες από κάθε δείγμα του πειράματος) και ισοηλεκτρική εστίαση ρυθμιστικό (IEF) εκ νέου ενυδάτωση (ουρία 8Μ, Θειουρία 2Μ , CHAPS 2%, 10 mM DTT, 1,2% ρυθμιστικό IPG (ακινητοποιημένη ρΗ Gradient), ρΗ 4-7, GE Healthcare) προστέθηκε έως 350 μL. Για την ανάλυση 2D-ΨΗΦΟ, IEF διεξήχθη χρησιμοποιώντας μία συσκευή IPGPhor 2 (GE Healthcare) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή με ακινητοποιημένη διαβάθμιση ρΗ (IPG) ρΗ 4-7, 18 εκατοστά. Λωρίδες επωάστηκαν πρώτα σε ρυθμιστικό διάλυμα εξισορρόπησης (ουρία 6 Μ, SDS 2%, Τρις-ΗΟΙ 50 mM ρΗ 8,6, γλυκερόλη 30%, κυανούν βρωμοφαινόλης ίχνος) που περιέχει 1% DTT επί 15 λεπτά και στην συνέχεια στο ίδιο ρυθμιστικό με 4,5% ιωδοακεταμίδιο, για 15 λεπτά, στο σκοτάδι. Οι λωρίδες φορτώθηκαν στην κορυφή των πηκτωμάτων ακρυλαμιδίου 12,5% και έτρεξε σε 1 W /h για 1,5 ώρες και σε 15 W /h μέχρις ότου το μπλε βρωμοφαινόλης φθάσει το πυθμένα-άκρο της γέλης. Τα πηκτώματα σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Typhoon τρίο Imager (GE Healthcare) στα 100 μm ψήφισμα με λεχ /em των 488/520, 532/580, 633/670 και nm για Cy-2, Cy-3 και Cy-5, αντίστοιχα. ανάλυση εικόνας πραγματοποιήθηκε με τη χρήση DeCyder 6.5 του λογισμικού (GE Healthcare).

πλασμίδια

Το πλασμίδιο pLVMND-SLuc κωδικοποιεί το εκκρίνονται Gaussia λουσιφεράση (Gluc) παρασχέθηκε ευγενώς από Cayla-InVivoGen (Τουλούζη, Γαλλία ). Λεντοϊού φορέα έκφρασης που κωδικοποιεί miR-148a και το copGFP (pMIRNA1-miR148a) ή copGFP μόνο (pMIRNA1-GFP) ελήφθησαν από Biovalley (Marne-la-Vallée, Γαλλία). PLenti6-TR, που κωδικοποιεί την καταστολέα tet, ελήφθη από τη Life Technologies. Για την επαγώγιμη έκφραση του miR-148, δύο μερικώς συμπληρωματικών ολιγονουκλεοτιδίων που αντιστοιχούν σε ώριμα miR-148a ή όργανα ελέγχου κωδικοποιημένο miR (MIR-CT) υβριδοποιήθηκαν και κλωνοποιήθηκαν σε φορέα pcDNA6.2-GW /emGFP-miR (Life Technologies) προ ανασυνδυασμού σε pLenti4 /ΤΟ /φορέα V5 DEST (Life Technologies) χρησιμοποιώντας στρατηγική Gateway®. Για την παραγωγή lentivectors, πλασμίδια συσκευασία pHCMV-G, που κωδικοποιεί VSV-G πρωτεΐνης, και pCMVΔ8.91, που κωδικοποιεί για τις πρωτεΐνες του HIV-1 αξεσουάρ, είχαν ευγενική δωρεά από Dr Α Dubart-Kupperschmitt (Παρίσι, Γαλλία).

φορέα λεντοϊού

παραγωγής

Όλα τα ελαττωματικός αντιγραφής, αυτο-αδρανοποίηση φορείς λεντοϊών παράχθηκαν σε εγκαταστάσεις BSL-3 (πλατφόρμα Vectorology, INSERM U1037 Cancer Research Center της Τουλούζης, Τουλούζη, Γαλλία) όπως περιγράφηκε προηγουμένως από Torrisani

et al.

[15]. Εν συντομία, η παροδική επιμόλυνση των κυττάρων ΗΕΚ-293FT με τη συσκευασία και λεντοϊού πλασμίδια φορέα πραγματοποιήθηκαν με χρήση καταβύθισης φωσφορικού ασβεστίου. pLenti4 /ΝΑ /GFP-miR-148a, pLenti4 /ΝΑ /GFP miR-CT χρησιμοποιήθηκαν για την απόκτηση λεντοϊού σωματίδια που κωδικοποιούν επαγώγιμους miR-148a ή miR-CT (δηλαδή, LV-TO-miR-148a ή LV-TO-ΜΙΚ CT, αντίστοιχα). Από την άλλη πλευρά, pMIRNA1-miR148a και pMIRNA1-GFP χρησιμοποιήθηκαν για την απόκτηση λεντοϊού σωματίδια συστατικά που κωδικοποιεί miR-148a ή miR-CT (LV-miR-148a ή LV-GFP, αντίστοιχα). PLenti6-TR και pLVMND-SLuc πλασμίδια χρησιμοποιήθηκαν για να ληφθούν σωματίδια λεντοϊού που κωδικοποιεί τον καταστολέα Tet ή την εκκρινόμενη λουσιφεράσης (LV-TR ή LV-Gluc, αντίστοιχα). Όλες οι παρτίδες επαληθεύτηκαν αναπαραγόμενου ιού-free. Οι ιικοί τίτλοι προσδιορίστηκαν σε κύτταρα ΗΤ-1080 και εκφράστηκε σε μεταγωγή μονάδα /ml (TU /ml) όπως περιγράφεται αλλού. Επιπλέον, οι συγκεντρώσεις φορέα ήταν ποσοτικά με ρ24 ELISA (Innotest, Ingen, Παρίσι).

Δημιουργία του PACA-2 σταθερή κυτταρική γραμμή miR-148a

κύτταρα ΜΙΑ υπερεκφράζουν ΜΙΑ PaCa-2 επωάστηκαν με τα λεντοϊού σωματίδια LV-TR (πολλαπλότητα μόλυνσης = 5) για 24 ώρες και στη συνέχεια επιλέγονται με βλαστισιδίνη (Invivogen, Τουλούζη, Γαλλία) στα 100 μg /mL για 2 εβδομάδες και κλωνοποιήθηκε με σειριακή αραίωση για να ληφθεί ΜΙΑ PaCa-2 κύτταρα TR. ΜΙΑ PaCa-2 TR κύτταρα περαιτέρω transducted με LV-Gluc (πολλαπλότητα μόλυνσης = 5) και κλωνοποιήθηκε με σειριακή αραίωση για να δώσει κύτταρα MIA PAC-2 TR-Gluc. Τα τελευταία κύτταρα επωάστηκαν με LV-TO-miR-148a ή LV-TO-miR-CT (πολλαπλότητα μόλυνσης = 5) για 24 ώρες και επιλεγμένα με ζεοκίνη (Invivogen) στα 100 μg /mL για 3 εβδομάδες και κλωνοποιήθηκε με σειριακή αραίωση για να δημιουργήσει ΜΙΑ PaCa-2 TR-Gluc miR-148a και PaCa-2 TR-Gluc κυτταρικές σειρές miR-CT MIA, αντίστοιχα. Μία βέλτιστη συγκέντρωση δοξυκυκλίνης του 1 μg /mL προσδιορίστηκε να επάγει μέγιστη έκφραση του miR-148a. Οι διαφορετικές σταθερές κυτταρικές σειρές αναπτύχθηκαν τότε συνεχώς με την παρουσία ή την απουσία δοξυκυκλίνης.

Μέτρηση της έκφρασης miR-148a με qRT-PCR

Τα κύτταρα πρώτα επιμολύνθηκαν παροδικά ή σταθερά transducted όπως περιγράφεται πάνω από. Ολικό RNA απομονώθηκε από κυτταρικές σειρές με ΤΚΙζοΙ αντιδραστήριο (ϋίβ Technologies) σύμφωνα με τις οδηγίες του προμηθευτή. Η συγκέντρωση του RNA μετρήθηκε με NanoDrop ND-1000 φασματοφωτόμετρο (Thermo Scientific). Η PCR System miScript (Qiagen) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή για να ποσοτικοποιηθεί ώριμη microRNAs από 1 μg του ολικού RNA. U6 και 5S RNA που χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι. Δείγματα cDNA αραιώθηκαν 1 σε 100 για την ανίχνευση ή U6 microRNA και 1 σε 10.000 για ανίχνευση 5S RNA. προσδιορισμοί εις διπλούν qRT-PCR διεξήχθησαν σε ένα StepOnePlus ™ PCR Πραγματικού χρόνου System (Applied Biosystems) με SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen). Σχετική ποσά των miRNA υπολογίστηκαν με τη μέθοδο συγκριτικής κύκλο κατωφλίου (CT) και 2-ΔΟΙ, όπου ΔCt = CTmiRNA -. CT γεωμετρικός μέσος των U6 και 5S

Διάδοση δοκιμασία

MiR-148a πρόδρομος ή Cy ™ 3 αρνητικού ελέγχου πρόδρομα επιμολυσμένα κύτταρα χρωστικής σημασμένα σπάρθηκαν σε 6 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο ενός καλά πιάτο 96 και αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο. Αριθμός των βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκε με χρωματομετρική μέθοδο χρησιμοποιώντας CellTiter 96® Υδατικό μη ραδιενεργού Κυττάρου Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή κατά την ημέρα 4. Για τη μέτρηση του πολλαπλασιασμού, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 5 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο ένα 35 πιάτα mm. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο συμπληρωμένο με 1 μg /mL δοξυκυκλίνης. Πεντακόσια νανογραμμάρια δοξυκυκλίνης προστέθηκαν σε 48 ώρες για να αποτρέψει την αποσύνθεση του στο μέσο καλλιέργειας. Τα κύτταρα μετρήθηκαν με μετρητή μοντέλο Coulter ΖΜ (Beckman Coulter) μετά από 24 ώρες, 48 ώρες, 72 ώρες και 96 ώρες καλλιέργειας.

ευαισθησία Γεμσιταβίνη δοκιμασία

Είκοσι πέντε χιλιάδες εκθετικά αυξανόμενη ΜΙΑ PaCa -2 κύτταρα που εκφράζουν σταθερώς miR-148a ή ελέγχουν microRNA καλλιεργούνται με ή χωρίς δοξυκυκλίνη απλώθηκαν σε δίσκους 35 mm. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με γεμκιταβίνη (Eli Lilly) σε διαφορετικές δόσεις που κυμαίνονται από 1 × 10

-9 Μ έως 1 χ 10

-4 Μ Μετά από 72 ώρες αγωγής, τα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας Coulter μετρητή μοντέλο ΖΜ (Beckman Coulter). Η γεμσιταβίνη «Θανατηφόρος Συγκέντρωση 50» (LC

50) είναι η συγκέντρωση της γεμσιταβίνης, για τα οποία το 50% των επεξεργασμένων κυττάρων πέθαναν συγκριτικά με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα σε 96 ώρες. Για τη μέτρηση της ευαισθησίας gemcitabine σε κύτταρο παροδικά υπερεκφράζουν miR-148a, 1000 των εκθετικά αυξανόμενης PDAC κύτταρα παροδικά υπερεκφράζουν miR-148a ή ένα microRNA ελέγχου (MIR-CT) επιστρώθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαφορετικές δόσεις γεμσιταβίνης που κυμαίνονται από 1 × 10

-9 Μ έως 1 χ 10

-4 Μ για 72 ώρες. Για κάθε κυτταρική σειρά, η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με χρωματομετρική μέθοδο, σε σύγκριση με τη βιωσιμότητα μετράται σε 1 × 10

-9 Μ αντιμετωπίζονται φρεάτια και παριστάνεται ως ένα ποσοστό των κυττάρων που επιβιώνουν.

Μετανάστευση και προσδιορισμούς εισβολής

εκατό χιλιάδες εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα που υπερεκφράζουν miR-148a ή η πρωτεΐνη αναφοράς GFP είχαν τον ορό επί 24 ώρες και σπάρθηκαν μέσα σε 24 μεγέθους ένθετα καλά-πλάκα (8 μm πορώδους 24 ένθετα φρεατίων για δοκιμασίες μετανάστευσης και Biocat Matrigel θάλαμοι εισβολής για δοκιμασίες εισβολή, BD Falcon) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 15 ώρες, μετανάστευσαν κύτταρα χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες 1% σε διάλυμα 20% μεθανόλη, λύθηκαν και η κυτταρική πυκνότητα προσδιορίστηκε με μέτρο την οπτική πυκνότητα των κυτταρολυμάτων στα 560 nm. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστό των αποδημητικών ή εισβάλλουν miR-148a υπερεκφράζουν κυττάρων σε σύγκριση με GFP κύτταρα που εκφράζουν.

ορθοτοπική μόσχευμα κυττάρων

Οκτώ εβδομάδων SCID /μπεζ CB 17 διαρροής ποντίκια ( TAKONIC) χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα κυτταρικού μοσχεύματος. Κάθε ποντικός έλαβε 12 × 10

6 του εκθετικά αυξανόμενης MIA κύτταρα PaCa-2 που υπερεκφράζουν σταθερά miR-148a σε 100 μL PBS εγχέονται στην ουρά του παγκρέατος. Οι ενέσεις έγιναν με έναν καθετήρα λεμφαγγειογραφίας 29 gauge που με βελόνα ινσουλίνης 29 gauge. Τα ποντίκια μπολιασμένα με miR-148a κύτταρα που εκφράζουν λάβει νερού

κατά βούληση

συμπληρώνεται με σακχαρόζη (25 g /L) και δοξυκυκλίνη (2 g /L). Τα ποντίκια ελέγχου έλαβαν νερό

ad libitum

συμπληρωμένο με σακχαρόζη μόνο (25 g /L). Τριάντα ημέρες μετά ξενομοσχεύματος, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και οι όγκοι αφαιρέθηκαν, ζυγίστηκαν και μετρήθηκαν. Ο όγκος του όγκου προσδιορίστηκε από τον τύπο ((Tumor Μήκος) × (Tumor Πλάτος

2)) /2. Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στο διάγραμμα για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου του INSERM. Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις έγινε υπό αναισθησία με ισοφλουράνιο, και έγινε κάθε δυνατή προσπάθεια για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Όλα τα πρωτόκολλα συμπεριλαμβανομένων των ζώων εγκρίθηκαν από την ηθική επιτροπή ANEXPLO. Μακροσκοπική παρατήρηση των όγκων διεξήχθη από έναν έμπειρο παθολόγο.

In vivo

μεταγωγή του όγκου του ΜΙΑ PaCa-2 όγκους

ορθοτοπική όγκοι εγκατεστημένες σε SCID CB17 πάγκρεας ποντικών με ένεση 12 × 10

6 του εκθετικά αυξανόμενης ΜΙΑ PaCa-2-Gluc (όπως περιγράφεται παραπάνω). Οι όγκοι αναπτύχθηκαν για 15 ημέρες πριν από την ένεση 250 ng ρ24 του LV-miR148a lentivector χρήση καθετήρα λεμφαγγειογραφίας 29 gauge που με βελόνα ινσουλίνης 29 gauge. LV-GFP εγχύθηκε σε ποντικούς ελέγχου. Η πρόοδος του όγκου πριν και μετά την μεταγωγή παρακολουθήθηκε με measurment του επιπέδου Gluc σε ποντικούς ορού (όπως περιγράφεται παρακάτω) και με κοιλιακή ψηλάφηση.

δραστικότητα λουσιφεράσης σε ποντίκια

ορού

Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε από ποντικούς ορό . Το αίμα συλλέχθηκε από οπισθο-κογχική δειγματοληψίας χρησιμοποιώντας Pasteur τριχοειδή πιπέτα (VWR) προγεμισμένες με 10 μι ενός διαλύματος EDTA 20%. Τα δείγματα αίματος διατηρήθηκαν σε πάγο μέχρι τη φυγοκέντρηση. Τα δείγματα περιστράφηκαν 3.000 g για 15 λεπτά στους 4 ° C και ορού συλλέγονται και αποθηκεύονται -20 ° C μέχρι τη χρήση. Η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε από 5 μL ορού και 45 μι ενός διαλύματος 50 μΜ συνελεντεραζίνης (Fluka αναλυτική) σε μια συσκευή ανάβαση Luminoskan (Thermo Scientific).

Στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως η μέση ± τυπικό σφάλμα. Η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μετρήθηκε με τη δοκιμή μη παραμετρικό Mann-Whitney, με ένα

σ

αξία & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Το σύμβολο * υποδηλώνει μια

σ

αξία & lt? 0,05, ** δείχνει ένα

σ

αξία & lt? 0,01 και *** δείχνει ένα

σ

αξία & lt?. 0.005

Αποτελέσματα

Επίδραση της παροδικής miR-148a υπερ-έκφραση στο PDAC κυτταρική γραμμή ανάπτυξης

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι η έκφραση του miR-148a καταστέλλεται από το DNA υπερμεθυλίωση της γονιδιωματικής αλληλουχίας του στο PDAC κυττάρων γραμμές και όγκους [7]. Θα μπορούσε κανείς να υποθέσει ότι η απώλεια της έκφρασης miR-148a είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη PDAC. Για την εκτίμηση του όγκου κατασταλτικά αποτελέσματα του miR-148a σε PDAC, Capan-2, PANC-1, ΜΙΑ PaCa-2 και BxPC-3 κυτταρικές γραμμές PDAC επιμολύνθηκαν με έναν πρόδρομο miR-148a ολιγονουκλεοτίδιο (MIR-148a) ή ένα πρόδρομο ελέγχου ( miR-CT). κύτταρα HPNE τα οποία είναι ανθρώπινα παγκρεατικά κύτταρα που εμφανίζουν ένα κανονικό φαινότυπο χρησιμοποιήθηκαν ως «μη-καρκινικές» κύτταρα ελέγχου. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με χρωματομετρική μέθοδο 4 ημέρες μετά την επιμόλυνση. MiR-CT επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερική αναφορά για κάθε κυτταρική γραμμή (Σχήμα 1Α). Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης αξιολογήθηκε για κάθε κυτταρική σειρά με μέτρηση του φθορισμού Cy3 και έφθασε 90-100% (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Με αποτέλεσμα την έκφραση του miR-148a μετρήθηκε με qRT-PCR (Σχήμα S1 Α). MiR-148a υπερ-έκφραση σε HPNE παγκρεατικά φυσιολογικά κύτταρα δεν προκάλεσε σημαντικές αλλαγές στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Παρομοίως, καμία σημαντική αλλαγή στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων παρατηρήθηκε στα τέσσερα PDAC κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου επιμολύνθηκαν Cy3. Παράλληλα, η κατανομή του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα Capan-2 προσδιορίστηκε με ανάλυση FACS (Σχήμα 1Β). Σύμφωνα με την απουσία του αποτελέσματος όσον αφορά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, καμία μεταβολή στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου παρατηρήθηκε σε miR-148a επιμολυσμένα κύτταρα συγκριτικά με κύτταρα miR-CT. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι παροδικές miR-148a υπερ-έκφραση δεν έχει καμία ιδιαίτερη επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων τέσσερις PDAC κυτταρικών σειρών.

(Α) Capan-2, PANC-1, ΜΙΑ PaCa-2 και BxPC-3 PDAC προερχόμενο κυτταρικές σειρές και μη-καρκινικές HPNE κυτταρική γραμμή επιμολύνθηκαν παροδικά με miR-CT ή προδρόμων miR-148a. Τέσσερις ημέρες μετά την επιμόλυνση, η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με χρωματομετρικές μεθόδους. Για κάθε κυτταρική σειρά, η βιωσιμότητα miR-148a-κυττάρων σε σύγκριση με τη βιωσιμότητα των κυττάρων miR-CT (100%). Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (± SEM) και εκφράζονται ως ποσοστό της κυτταρικής βιωσιμότητας των κυττάρων ελέγχου. (Β), διανομή κύκλος των κυττάρων μετρήθηκε με χρώση ιωδιούχου προπιδίου που ακολουθείται από ανάλυση FACS 72 ώρες μετά την επιμόλυνση των κυττάρων Capan-2 με miR-CT ή προδρόμων miR-148a.

Η

Επίδραση σταθερών ΜΙΚ 148α υπερ-έκφραση στο PDAC κυτταρική γραμμή συμπεριφοράς

Εκτός από πειράματα παροδικής επιμόλυνσης, δημιουργήσαμε λεντοϊού σωματίδια Tet-ON-βάση για σταθερή έκφραση του miR-148a να αποφευχθεί η ταχεία ολιγονουκλεοτιδίων φθορά και να επιτρέψει μια μακροπρόθεσμη παρακολούθηση -up των κυτταρικών γεγονότων σε κυτταρικές σειρές PDAC. Εμείς transducted ΜΙΑ PaCa-2 κύτταρα λόγω του χαμηλού επιπέδου έκφραση των ενδογενών miR-148a [7]. Σε αυτά τα κύτταρα, η θεραπεία με δοξυκυκλίνη οδηγεί σε πενταπλάσια αύξηση στην έκφραση miR-148a, σε σύγκριση με miR-CT υπερεκφράζουν κύτταρα (Σχήμα S1B). Ωστόσο, σταθερή έκφραση του miR-148a δεν οδηγεί σε σημαντικές αλλαγές στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε αυτά τα κύτταρα, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 2). Επιπρόσθετα, η μετανάστευση και το δυναμικό εισβολής των κυττάρων που υπερεκφράζουν miR-148a μετρήθηκε και συγκρίθηκε με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα S2). Εδώ, παρατηρήσαμε ότι το miR-148a υπερ-έκφραση δεν τροποποιεί αυτές τις δύο κυτταρικές λειτουργίες σε ΜΙΑ PACA-2 μοντέλο κυτταρική γραμμή μας. Στο σύνολό τους, έχουμε αποδείξει ότι παρόμοια με παροδική υπερέκφραση, μακράς διάρκειας εκφράσεις του miR-148a είναι αναποτελεσματική για την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων PDAC και δεν επηρεάζει τη συμπεριφορά των κυττάρων

in vitro

.

κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 επωάστηκαν με επαγώγιμων φορείς λεντοϊού που κωδικοποιεί για αγωνίζομαι microRNA (του miR-CT) ή miR-148a (miR-148a). ΜΙΑ PaCa-2 miR-CT ή το ρυθμό πολλαπλασιασμού των miR-148a αξιολογήθηκε με την παρουσία ή την απουσία δοξυκυκλίνη σε μέσο καλλιέργειας. Για κάθε συνθήκη, μέτρηση κυττάρων εκτελέστηκε κάθε 24 ώρες και σε σύγκριση με τον αριθμό των προσφυόμενων κυττάρων την ημέρα 1. Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (± SEM).

Η

ευαισθησία γεμσιταβίνη του PDAC κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν το miR-148a

έχει προταθεί στο παρελθόν ότι microRNAs μπορεί να επηρεάσει χημειοευαισθησία στοχεύοντας μεταφορείς ναρκωτικών ή αλλοιώνοντας κυτταρικό μονοπάτι ζωτικής σημασίας για το μεταβολισμό του φαρμάκου ή την επιβίωση των κυττάρων [16]. Όπως περιγράφεται παραπάνω, gemcitabine είναι η χημειοθεραπεία αναφοράς για PDAC. Έχουμε αξιολογηθεί κατά πόσο miR-148a συμμετέχει σε PDAC κύτταρα ευαισθησία έναντι αυτού του φαρμάκου. Παρατηρήσαμε πρώτα καμία σημαντική συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου miR-148a ενδογενείς (Σχήμα 3Α) και η ευαισθησία γεμσιταβίνη σε αρκετές κυτταρικές σειρές PDAC (Σχήμα 3Β). Παράλληλα, αξιολογήσαμε την ευαισθησία γεμσιταβίνη στα κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 σταθερά υπερεκφράζουν το miR-148a ή miR-CT (Σχήμα 3C). Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από τρεις ανεξάρτητους προσδιορισμούς δείχνουν μια μη σημαντική μείωση στη θανατηφόρος συγκέντρωση 50 αξία (LC50) της γεμσιταβίνης παρουσία miR-148a σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν μετά από παροδική επιμόλυνση του miR-148a σε διάφορους PDAC κυτταρικές σειρές (Σχήμα S3). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι miR-148a δεν επηρεάζει δραματικά PDAC κυτταρικές σειρές ευαισθησία έναντι γεμσιταβίνης.

(Α) miR-148a ενδογενές επίπεδο έκφρασης μετρήθηκε με qRT-PCR σε αρκετές κυτταρικές σειρές PDAC και HPDE και hPNE κανονική παγκρεατική κυτταρικές σειρές. (Β) την ευαισθησία των κυττάρων σε γεμσιταβίνη μετρήθηκε μετά από 72 ώρες θεραπείας σε αρκετές PDAC κυτταρικές σειρές και σε φυσιολογικά hPNE παγκρεατικά κύτταρα. Επιβίωση κλάσμα κυττάρων αντιπροσωπεύει τον αριθμό των κατεργασμένων κυττάρων κατά την διάρκεια 72 h σε σύγκριση με τον αριθμό των μη κατεργασμένων κυττάρων (που απεικονίζεται ως 100%). Η θανατηφόρος συγκέντρωση 50 (LC50) αντιπροσωπεύει την δόση gemcitabine επαρκής για να ληφθεί το 50% των επιζώντων κυττάρων σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (± SEM). (C) Cell ευαισθησία σε gemcitabine μετρήθηκε σε κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 σταθερώς υπερεκφράζουν miR-148a (LV-TO-miR-148a) ή ένας έλεγχος miR (LV-TO-miR-CT) σε γεμσιταβίνη σε παρουσία δοξυκυκλίνης μετά από 72 ώρες θεραπείας. Επιβίωση κλάσμα κυττάρων αντιπροσωπεύει τον αριθμό των κατεργασμένων κυττάρων κατά την διάρκεια 72 h σε σύγκριση με τον αριθμό των μη κατεργασμένων κυττάρων (που απεικονίζεται ως 100%). Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (± SEM).

Η

Ανάλυση πρωτεΐνης προφίλ έκφρασης μετά από παροδική miR-148a υπερέκφραση

Κάθε microRNA μπορεί ενδεχομένως να επηρεάσουν τη μετάφραση των δεκάδων των στόχων mRNA σύμφωνα με την διατήρηση της αλληλουχίας-στόχου του [6]. Η απουσία κυτταρικών επιδράσεων μετά miR-148a υπερ-έκφραση θα μπορούσε να εξηγηθεί τόσο από ένα ασθενές αλλαγή στο προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης, ανεπαρκής για να παραχθεί ένα κυτταρικό αποτέλεσμα, ή από την αυξητική ρύθμιση ενός διάσωση μοριακής οδού, συνεπεία στόχος miR-148a φθορά. Κατά συνέπεια, πραγματοποιήσαμε μια κλίμακα ανάλυση του προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης μεγάλο με 2D-ΨΗΦΟ μετά από παροδική miR-148a υπερ-έκφραση σε κύτταρα Capan-2. κύτταρα Capan-2 επιμολυσμένα με miR-CT χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. ανάλυση φθορισμού του 2D-γελών αποκάλυψε ότι miR-148a υπερ-έκφραση οδηγεί μόνο σε μια αμυδρή διαμόρφωση της έκφρασης περίπου 2,200 πρωτεΐνης σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα S4). Καμία από αυτές τις παραλλαγές φθάσει την τιμή αποκοπής (1,5 φορές αλλαγή σε σύγκριση με τον έλεγχο επιμολυσμένα κύτταρα), παρά την τεράστια υπερ-έκφραση του miR-148a (Σχήμα S1 Α). Κατά συνέπεια, κανένα είδος πρωτεΐνης ταυτοποιήθηκαν με φασματομετρία μάζας.

Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι miR-148a δεν επηρεάζει δραματικά προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης σε κύτταρα Capan-2 που μπορεί να ευθύνεται για την απουσία βιολογικά αποτελέσματα συνεπεία της επί -έκφραση.

In vivo

αποτελέσματα των miR-148a υπερέκφραση

Για να προσδιορίσετε αν το miR-148a μπορεί να επηρεάσει την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

, δημιουργήσαμε ορθοτοπική όγκων PDAC σε ποντίκια SCID CB17 χρησιμοποιώντας κύτταρα ΜΙΑ PaCa-2 σταθερώς υπερεκφράζουν miR-148a κατά 5 φορές (Σχήμα S1B). Αυτά τα κύτταρα εκφράζουν ιδιοσυστατικά Gaussia λουσιφεράσης (Gluc) για μη επεμβατική παρακολούθηση της ανάπτυξης του όγκου. Όπως περιγράφεται από τους Chung και συνεργάτες, Gluc ποσοτικό προσδιορισμό σε ορό αντικατοπτρίζει με ακρίβεια την ποσότητα των βιώσιμων καρκινικών κυττάρων σε όγκους ξενομοσχεύματος [17]. Για

in vivo

μελέτες, Gluc έγινε δειγματοληψία κάθε 5 ημέρες και τα ποντίκια θυσιάστηκαν μετά από 33 ημέρες, ανάλογα με το μέγεθος του όγκου υπολογίζεται από κοιλιακή ψηλάφηση. Η συσχέτιση μεταξύ του βάρους του όγκου και το σήμα Gluc (R

2 = 0.79) επιβεβαιώθηκε μετά την εκτομή του όγκου και σύγκριση με Gluc δοσολογία στον ορό του δείγματος την ημέρα της χειρουργικής επέμβασης (Σχήμα S5).

Κατά τη διάρκεια αυτής της πείραμα, βρήκαμε ότι τα επίπεδα Gluc δεν μεταβλήθηκαν με έκφραση miR-148a υποδεικνύοντας ότι miR-148a δεν αναστέλλει την εξέλιξη του όγκου PDAC

in vivo

(Σχήμα 4Α). Σε συμφωνία με τα ευρήματα αυτά, η ανάλυση των όγκων μετά από χειρουργική επέμβαση απέτυχε να αποκαλύψει ανασταλτικά αποτελέσματα miR-148a επί του βάρους του όγκου (Dox: 0,368 g ± 0,16 g

vs

Ανεπεξέργαστα: 0,348 g ± 0,22 g) (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, η ιστολογική μελέτη των όγκων υποδεικνύει καμία διαφορά στην οργάνωση ιστού μεταξύ των διαφόρων ομάδων (Σχήμα S6). Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι δεν υπάρχει δραματική επίδραση της έκφρασης miR-148a στην ανάπτυξη του όγκου ή την ανάπτυξη του ιστού του όγκου

in vivo

Η

(Α)

In vivo

παρακολούθηση της εξέλιξης ξενομοσχεύματος όγκου.: ΜΙΑ κύτταρα PaCa-2 που εκφράζουν miR-148a και εκκρίνεται Gaussia λουσιφεράσης (Gluc) εγχύθηκαν στο πάγκρεας των ποντικών SCID. Οι ποντικοί έλαβαν κανονικό νερό (χωρίς θεραπεία, η = 10) ή νερό συμπληρωμένο με δοξυκυκλίνη (δοξυκυκλίνη, η = 12) για την επαγωγή της έκφρασης miR-148a μέχρι τη θυσία. Gluc επίπεδα μετρήθηκαν σε ποντίκια ορό. Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος των δραστηριοτήτων Gluc (± SEM) και εκφράζονται ως Light Unit Αυθαίρετες (A.L.U.). (Β) Οι όγκοι αφαιρέθηκαν και σταθμίζονται από την ημέρα της χειρουργικής επέμβασης. Τα αποτελέσματα είναι μέσες τιμές (± SEM) του βάρους του όγκου στην ομάδα χωρίς αγωγή (n = 10) και η ομάδα που έλαβε αγωγή δοξυκυκλίνη (n = 12) (C)

In vivo

παρακολούθηση της εξέλιξης του όγκου ξενομοσχεύματος: ΜΙΑ PaCa-2 κύτταρα που εκφράζουν λουσιφεράση εκκρίνεται Gaussia εγχύθηκαν στο πάγκρεας ποντικών SCID (n = 10). Δεκαπέντε ημέρες αργότερα, οι φορείς λεντοϊών που κωδικοποιούν miR-148a (MIR-148α, η = 7) ή μόνο GFP (GFP, η = 3) εγχύθηκαν στους όγκους (το βέλος υποδεικνύει την ένεση βραδέος ιού σωματιδίων). Η ποσότητα του Gluc μετρήθηκε σε ποντικούς ορό και συγκρίνεται με την ποσότητα Gluc μετράται την ημέρα της ένεσης lentivector (Ημέρα 0). Τα αποτελέσματα είναι η μέση τιμή του δείκτη επιπέδου Gluc σε κάθε ομάδα (± SEM) και εκφράζονται ως αναλογία αυθαίρετη μονάδα φωτός. (Δ) όγκοι που λαμβάνουν miR-148 (MIR-148α, η = 7) ή GFP (GFP, η = 3) απομακρύνθηκαν 10 ημέρες μετά την ένεση και βραδέος ιού σταθμίστηκαν. Η γραφική παράσταση αντιπροσωπεύει την σύγκριση του βάρους του όγκου που εκφράζουν miR-148a (n = 7) ή GFP (n = 3). Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος των βάρος του όγκου σε κάθε ομάδα (± SEM).

Η

In vivo

μέτρηση του miR-148a θεραπευτικό δυναμικό

Για να αξιολογηθεί ένα αντι -tumor δυναμικό μιας οξείας miR-148a υπερ-έκφραση στα δύο καρκινικών κυττάρων και μικροπεριβάλλοντος, ενέθηκε λεντοϊού σωματίδια που κωδικοποιεί miR-148a (LV-miR-148a) σε προκαθορισμένες μΙΑ PaCa-2-Gluc όγκοι εμφυτεύτηκαν στο πάγκρεας των ποντικών SCID CB17. Λεντοϊών σωματίδια που κωδικοποιεί πρωτεΐνη αναφοράς GFP (LV-GFP) χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. MiR-148a υπερ-έκφραση σε LV-miR-148a-ένεση όγκων επαληθεύτηκε από qRT-PCR (Σχήμα S7). Η πρόοδος του όγκου παρακολουθήθηκε με δειγματοληψία Gluc σε ποντικούς ορό. Μια μείωση στο σήμα Gluc παρατηρήθηκε εντός 5 ημερών μετά την μεταγωγή του όγκου και για τα δύο σωματίδια (σχήμα 4C). Από την ημέρα 5 έως την ημέρα 10, τα επίπεδα Gluc ήταν απολύτως όμοια με miR-148a και όγκων ελέγχου transducted, που δείχνουν καμία διαφορά στη βιωσιμότητα του όγκου μετά από λεντοϊού ένεση φορείς. Σύμφωνα με Gluc δοσολογία, εκτομή βάρη όγκου κατά την ημέρα 10 είναι παρόμοια σε LV-miR-148a και-GFP-transducted LV ομάδες (LV-miR-148a: 1,77 g ± 0,30 g

vs

LV-GFP: 1,97 g ± 0,63 g) (Εικόνα 4D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μεταφορά γονιδίων miR-148a τόσο ιστό του όγκου και μικροπεριβάλλον δεν επηρεάζει τη βιωσιμότητα του όγκου και αποκαλύπτει καμία ιδιαίτερη θεραπευτικές δυνατότητες.

Συζήτηση

έκφραση MiR-148a μεταβάλλεται σε διάφορους τύπους καρκίνο και προς τα κάτω ρύθμιση του περιγράφεται καλά σε διάφορους συμπαγείς όγκους όπως του παχέος εντέρου, των ωοθηκών, του προστάτη και γαστρικούς καρκίνους [8], [11], [18], [19].