Αφηρημένο

Ένας σύνδεσμος πολλαπλασιασμό επαγωγής (Απρίλιος) εκφράζεται έντονα σε καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) σε ιστούς και κυτταρικές γραμμές. Ωστόσο, οι βιολογικές λειτουργίες και ακριβή σήματα που προκαλούνται από Απρίλιο στο CRC δεν έχουν κατανοηθεί πλήρως. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε μικρά παρεμβαλλόμενα RNA να καταστρέφουν επιλεκτικά Απρίλιο και να καθορίσει ογκογόνο τα αποτελέσματά της σε μια κυτταρική γραμμή CRC SW480 τόσο

in vitro

και

in vivo

. Νοκ ντάουν του Απριλίου στα κύτταρα SW480 συνδέθηκε με διαμόρφωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, καθώς και η μείωση της κυτταρικής μετανάστευσης και εισβολής

in vitro

. Επιπλέον ΑΠΡΙΛΙΟΣ-knockdown κυττάρων SW480 εμφανίζεται σημαντικά ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου και μειωμένη μετάσταση στο ήπαρ σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια με υποδόρια ένεση. Είναι σημαντικό ότι, παρατηρήσαμε ότι μειορρύθμιση του Απριλίου σε κύτταρα SW480 οδήγησε σε σημαντικά μειωμένη δραστηριότητα του φωσφοϊνοσιτιδίου 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) /Akt μονοπάτι. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη Απρίλιο διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι σε κύτταρα CRC καταλήγοντας σε επαγόμενη έκφραση σημαντικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου και μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας σε ένα ΡΙ3Κ /Akt εξαρτώμενο τρόπο. Αυτό ήταν ταυτόχρονη με σημαντική βιωσιμότητα της κυτταρικής ανάπτυξης καθώς και αυξημένη κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Μαζί, αυτά τα αναγκάζοντας τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι ΑΠΡΙΛΙΟΣ-προκαλούμενη ογκογένεση και τη μετάσταση των κυττάρων CRC μπορεί να επιτευχθεί μέσω της ενεργοποίησης του ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι. Τα ευρήματα αυτά μπορεί να οδηγήσει σε καλύτερη κατανόηση των βιολογικών επιδράσεων του Απριλίου και μπορεί να παρέχει ενδείξεις για τον εντοπισμό νέων θεραπευτικών και προληπτικών μοριακών δεικτών για CRC

Παράθεση:. Wang G, Wang F, Ding W, Wang J, Jing R, Li H, et al. (2013) Απρ Προκαλεί ογκογένεση και τη μετάσταση των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου μέσω ενεργοποίησης του PI3K /AKT οδό. PLoS ONE 8 (1): e55298. doi: 10.1371 /journal.pone.0055298

Επιμέλεια: Claudio M. Costa-Neto, Πανεπιστήμιο του Σάο Πάολο, Βραζιλία

Ελήφθη: 19 Σεπ, 2012? Αποδεκτές: 20 του Δεκέμβρη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 29 Ιαν 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (αριθμούς 81201351 και 81201350). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι ένα μείζον πρόβλημα δημόσιας υγείας στις Ηνωμένες Πολιτείες και σε παγκόσμιο επίπεδο. Στις Ηνωμένες Πολιτείες, είναι η τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου και η τρίτη κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο, αν οι άνδρες και οι γυναίκες θεωρούνται χωριστά [1]. Η εμφάνιση μεταστάσεων οφείλεται στην εξέλιξη του όγκου είναι η αιτία της πλειοψηφίας των θανάτων από καρκίνο σχετίζονται. Παρά τη σημαντική πρόοδο στην διαγνωστικές και θεραπευτικές μεθοδολογία, η πρόγνωση για τους ασθενείς CRC παραμένει φτωχή. Πρόσφατα, πρόοδοι στη μοριακή βιολογία έχουν οδηγήσει σε αυξημένη γνώση των μηχανισμών που διέπουν την ανάπτυξη CRC. Πρόσφατες αλληλούχιση μεγάλης κλίμακας και άλλες γονιδιωματικές αναλύσεις των ανθρώπινων ορθοκολικών όγκων υποδεικνύουν ότι υπάρχουν μέχρι 80 nonsilent μεταλλάξεις σε κάθε όγκο και ότι οι μεμονωμένοι όγκοι έχουν διαφορετικές μεταλλάξεις. Παρά το γεγονός ότι οι μεταλλάξεις είναι πολλές και ποικίλες, ταξινόμηση των κοινών και σπάνιων μεταλλάξεων αποκάλυψαν ότι τα 38 μονοπάτια διαταράσσεται με συγκεκριμένη συχνότητα, και πολλά από αυτά τα μονοπάτια διασταυρώνονται με φωσφοϊνοσιτίδη 3-κινάση (PI3K) σηματοδότησης [2]. Το μονοπάτι σηματοδότησης ΡΙ3Κ παίζει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, την επιβίωση, τον μεταβολισμό, την κινητικότητα και την εισβολή. Είναι συχνά απορυθμισμένη σε κύτταρα CRC, γεγονός που το καθιστά ελκυστικό θεραπευτικό στόχο [2], [3], [4]. Προς τα πάνω ρυθμισμένη κυτοκίνες, αυξητικούς παράγοντες, και οι υποδοχείς τους που παρατηρούνται σε κύτταρα CRC μέσω ΡΙ3Κ πιθανώς αντιπροσωπεύουν μία κύρια συνεισφορά στην ογκογένεση.

Απρίλιος (α πολλαπλασιασμός-συνδέτη που επάγει, επίσης γνωστή ως TRDL-1, TALL-2, και TNFSF13 ), είναι ένα μέλος της υπεροικογένειας παράγοντα νέκρωσης όγκων (TNF), με ομόλογο δομή και λειτουργία με πολλές άλλες κυτοκίνες σε αυτή την οικογένεια. Ανακαλύφθηκε ως μία κυτοκίνη υπερ-εκφράζονται από μετασχηματισμένα κύτταρα και θα μπορούσαν να διεγείρουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό [5], [6]. Το APRIL είναι κυρίως εκφράζεται από ιστούς όγκου όπως καρκίνωμα κόλον, καρκίνο του παγκρέατος, καρκίνο του στομάχου, και από φυσιολογικά κύτταρα του ανοσοποιητικού όπως Β κύτταρα, μονοκύτταρα, μακροφάγα, δενδριτικά κύτταρα, ουδετερόφιλα, επιθηλιακά κύτταρα, Τ-κύτταρα και από ορισμένα μη ανοσοκύτταρα όπως οστεοκλάστες. Πρόσφατες μελέτες έχουν αναλύσει τον ρόλο ογκοπροάγουσες Απριλίου σε ασθενείς με αιματολογικές κακοήθειες ή με συμπαγείς όγκους. Ανώμαλη έκφραση του Απριλίου και η επακόλουθη ενεργοποίηση των μονοπατιών προ-επιβίωσης μπορεί να επιτρέψει την επιβίωση πολλών αιματολογικών κακοηθειών [6], [7], [8], [9]. Σε στερεά καρκινικά κύτταρα, οι μελέτες έχουν περιοριστεί με τη δραστηριότητα του πολλαπλασιασμού ή επιβίωσης εμπλέκονται στην φυσική ανάπτυξη των όγκων, η οποία είναι συνεπής με την τρέχουσα έννοια ότι φλεγμονώδεις αντιδράσεις αποτελούν ένα σημαντικό μέρος της ανάπτυξης του όγκου [5], [10], [11 ]. Υπάρχουν διαφορετικές απόψεις σχετικά με την έκκριση του Απριλίου που παράγονται από τα καρκινικά κύτταρα ή από τα καρκινικά κύτταρα που διηθούν. Mhawech-Fauceglia et al [10] έδειξαν ότι τα ουδετερόφιλα που διηθούν όγκο που υπάρχουν στο στόμα και όχι τα κύτταρα του όγκου, ήταν η κύρια πηγή του Απριλίου. Αυτό είναι σε αντίθεση με πρόσφατη μελέτη από V Lascano κ.ά. [12], ο οποίος απέδειξε ότι ο Απρίλιος που παράγεται από τα δύο καρκινικά κύτταρα και μη νεοπλασματικά είχε σαφή όγκου αποτέλεσμα προαγωγής σε ορθοκολικό ογκογένεση. Ωστόσο, οι μεταγενέστεροι καταρράκτες σηματοδότησης ενεργοποιούνται από τον Απρίλιο του που ενδέχεται να εμπλέκονται στο σχηματισμό όγκων δεν έχουν ακόμη χαρακτηριστεί. Επιβεβαιώσαμε πρόσφατα ότι ο Απρίλιος υπερεκφράζεται σε καρκινώματα του πεπτικού συστήματος, ειδικά στο παχύ έντερο και το πάγκρεας [13], [14], [15]. Το APRIL είναι περισσότερο εντόνως εκφρασμένο σε όγκους σε σύγκριση με φυσιολογικό κόλον, και τον Απρίλιο-knockdown ανέστειλε την μετανάστευση και την εισβολή του ορθοκολικού καρκίνου κυττάρων in vitro [16]. Επιπλέον, ο ορός επίπεδα Απρίλιος μετρήθηκαν με ELISA σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος πρότεινε ότι ο Απρίλιος έχει μια θετική διάγνωση και πρόγνωση αξία για τον καρκίνο του παγκρέατος [15]. Αυτές οι προκαταρκτικές μελέτες δείχνουν ότι ο Απρίλιος μπορούν να έχουν έναν σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση και την εξέλιξη του όγκου.

Η παρούσα μελέτη διερευνήθηκε ο ρόλος του Απριλίου του παχέος καρκινογένεση και χαρακτηρίζεται ΑΠΡΙΛΙΟΣ-μεσολάβηση μεταγωγής σήματος. Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC και ανοσοανεπάρκεια ποντίκια χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση των επιπτώσεων των νοκ ντάουν του Απριλίου για τα βασικά χαρακτηριστικά της καρκινογένεσης και της μεταστατικής διαδικασίας. Εκτιμήσαμε το ρόλο του Απριλίου στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, του κυτταρικού κύκλου, τη μετανάστευση και την εισβολή σε κυτταρικές σειρές CRC και προσδιόρισε τις σχετικές μοριακών και κυτταρικών συστατικών. Χρησιμοποιώντας αυτά τα CRC κύτταρα και το μοντέλο ξενομοσχεύματος ιστοί, προτείνουμε ότι ο Απρίλιος θα μπορούσαν να σχετίζονται με ογκογένεση και τη μετάσταση. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι ο Απρίλιος διέγερση με τη μεσολάβηση σήματα μονοπάτι PI3K /Akt που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Η πρωτόκολλα μελέτης εγκρίθηκαν από τη Φροντίδα των ζώων και Έρευνας Επιτροπή Ηθικής, College of Medicine, University Ναντόνγκ. Όλες οι εργασίες των ζώων έγινε σύμφωνα με τις σχετικές κατευθυντήριες γραμμές (Συμβόλαιο 2.010 έως 0.089). Όλοι οι ασθενείς έδωσαν γραπτή συγκατάθεση τους να συμμετάσχουν στη μελέτη.

Ασθενείς και δείγματα ιστών

CRC ιστοί συλλέχθηκαν από χειρουργική εκτομή δειγμάτων από οκτώ ασθενείς που δεν είχαν υποβληθεί σε ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία στο Ενταγμένο Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου της Ναντόνγκ από τον Απρίλιο του 2008 και τον Μάιο του 2009. Οι ηλικίες τους ήταν από 45 έως 71 ετών, με μέση ηλικία τα 56,9 χρόνια. Το αρσενικό: θηλέων ήταν 5: 3. Η διάγνωση επιβεβαιώθηκε ιστολογικά σε όλες τις περιπτώσεις. δείγματα ιστού αμέσως σε επεξεργασία μετά από χειρουργική αφαίρεση. Η πρωτεΐνη αναλύθηκε σε οκτώ οιδηματώδης και παρακείμενα δείγματα nontumorous ιστού καταψύχθηκαν που αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C.

Κυτταρική καλλιέργεια και αντιδραστήρια

Όλα ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC (SW480, ΗΤ-29 , Colo-205, HCT-116) λήφθηκαν από την Ακαδημία Life Science, Σαγκάη, Κίνα και διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ? Invitrogen, San Diego, CA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS? Hyclone , Logan, USA) και αντιβιοτικά (100 mg /ml στρεπτομυκίνη και 100 U /ml πενικιλίνη) στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή που περιέχει 5% CO

2. Ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVEC) ελήφθησαν από Fmgbio, Σαγκάη, Κίνα και διατηρήθηκαν σε DMEM /F12 (Gibco). GM6001, LY294002 αγοράστηκαν από Chemicon (Temecula, CA, USA). Η ραπαμυκίνη ελήφθη από την Sigma. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη Απρίλιο (rhAPRIL) αγοράστηκε από την PeproTech Inc. (USA).

Ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) για την ανίχνευση της εκκρινόμενης Απριλίου

κυτταρικές γραμμές CRC καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2 σε ϋΜΕΜ με 0,5% FBS για 72 ώρες. υπερκείμενα καλλιέργειας κυττάρων συλλέχθηκαν και η συγκέντρωση του Απριλίου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μια ανθρώπινη κιτ Απρίλιο ELISA (R &? D, ΜΝ, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συγκέντρωση του Απριλίου ήταν βαθμονομημένη από μια καμπύλη δόσης-απόκρισης με βάση τα πρότυπα αναφοράς. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές.

Επιμόλυνση και δημιουργία σταθερών κυτταρικών γραμμών

κύτταρα Knockdown SW480 παρήχθησαν χρησιμοποιώντας σύντομο RNA φουρκέτας κατευθύνεται έναντι του ανθρώπινου γονιδίου Απρίλιο (shAPRIL) κατασκευασμένη pGCsi /H1 /Neo /GFP πλασμίδιο φορέα (Genechem, Σαγκάη, Κίνα). Δύο ζευγάρια χημικά συνθετικά shAPRIL σημάνθηκαν ως sh637 και sh1750 [17]. Ένα πλασμίδιο που φέρει ένα nontargeting ελέγχου (NTC) αλληλουχία χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος shRNA (shNTC). Παροδικές επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]. Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία πολλαπλασιασμού, ανάλυση κυτταρικού κύκλου, προσδιορισμούς εισβολή και τη μετανάστευση και τα επίπεδα mRNA Απρίλιο προσδιορίστηκαν με αντίστροφης-μεταγραφής (RT) -PCR. Για σταθερές επιμολύνσεις, οι ανασυνδυασμένοι φορείς επιμολύνθηκαν με λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) και σταθερά προϊόντα επιμόλυνσης επιλέχθηκαν με 600 μg /ml G418. G418-ανθεκτικές μορφομετατροπείς κλωνοποιήθηκαν να δημιουργεί κυτταρικές σειρές και αναλύθηκαν με RT-PCR για την έκφραση mRNA Απρίλιο. Σταθερό επιμολυσμένα κύτταρα SW480 προετοιμάστηκαν για ζωικά πειράματα.

ποσοτικαί RT-PCR

Σύνολο απομόνωση RNA από καλλιεργημένα κύτταρα σε 80% συρροή χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Invitrogen), δημιουργία cDNA χρησιμοποιώντας SuperScript ™ III ( Fermentas, USA) σύμφωνα με πρότυπα πρωτόκολλα και επακόλουθη PCR διεξήχθη με τα ακόλουθα ζεύγη εκκινητών (5′-3 ‘): Απρίλιος ACTCTCAGTTGCCCTCTGGTTG και GGAACTCTGCTCCGGGAGACTC? ΜΜΡ-2, GATGCCGCCTTTAACTGG και TCAGCAGCCTAGCCAGTCG? ΜΜΡ-9, GCACCACCACAACATCACCTAT και CACAACTCGTCATCGTCGAAA? TIMP-1, CAGAAGTCAACCAGACCACCT και ATTCCTCACAGCCAACAGTG? GAPDH, ACGCATTTGGTCGTATTGGG και TGATTTTGGAGGGATCTCGC. GAPDH προβλήθηκε ως το γονίδιο καθαριότητας ελέγχου. Τα προϊόντα PCR έτρεξαν σε ένα πήκτωμα αγαρόζης 1,5%, χρωματίστηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο και κατέστησαν ορατά με φωτισμό υν. Συγκροτήματα ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ (https://rsb.info.nih.gov/ij/).

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού κυττάρων in vitro διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Κυττάρου Μετρώντας Kit-8 (CCK-8? Donjindo, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. κύτταρα shAPRIL SW480, κύτταρα shNTC SW480 και μη επιμολυσμένα κύτταρα SW480 σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε ϋΜΕΜ με 0,5% FBS σε πυκνότητα 4 Χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο. ΑΠΡΙΛΙΟΣ-διεγερμένα κύτταρα HCT-116 σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε ϋΜΕΜ που περιείχε 0,5% FBS με την παρουσία 100 ng /ml rhAPRIL, 400 ng /ml rhAPRIL, 800 ng /ml rhAPRIL ή PBS (ομάδα ελέγχου). Τα κύτταρα σε κάθε ομάδα καλλιεργήθηκαν εις τριπλούν. Στις 24, 48, 72 και 96 ώρες, η οπτική πυκνότητα σε μήκος κύματος 450 nm, που συσχετίζεται με τον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων μετρήθηκε και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέσος όρος του A450 ± SEM.

Ανάλυση

κυτταρικού κύκλου

για την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, ΑΠΡΙΛΙΟΣ-διεγερμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με rhAPRIL για 24 ώρες, και τα κύτταρα shAPRIL συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS, σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη για μία ώρα στους 4 ° C και στη συνέχεια επωάστηκαν με 1 mg /ml RNase Α για 30 λεπτά στους 37 ° C. Ακολούθως, τα κύτταρα βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ, 50 μg /ml) (Becton Dickinson, San Jose, CA) σε PBS, 0,5% Tween-20, και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ροής Becton Dickinson κυτταρόμετρο BD FACScan (San Jose, CA) και Quest προγράμματα απόκτησης και ανάλυσης Cell.

Western ανάλυση κηλίδος

προϊόντα λύσης πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με TBS που περιέχει 0.1% Triton Χ-100 και 5% άπαχο γάλα επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα. Τα πρωτογενή αντισώματα ήταν αντι-ανθρώπινο Απρίλιο (BD, NJ, USA), αντι-pAkt, αντι-Akt, αντι-mTOR, αντί-ρ-mTOR (Cell Signaling), αντι-c-myc, αντι-κυκλίνης D1, αντι -CDK4, αντι-ρ-Rb αντι-β-ακτίνης (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Συζευγμένο με HRP ανοσοσφαιρίνη ποντικού χρησιμοποιήθηκε ως δευτερεύον αντίσωμα. ανίχνευση σήματος διεξήχθη με σύστημα ECL (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). Συγκροτήματα ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρία χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ. Ολοκληρωμένη τιμές πυκνότητας φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών κανονικοποιήθηκαν για ολική πρωτεΐνη για κάθε δείγμα. Μη διεγερμένα ή μη επιμολυσμένα κύτταρα δόθηκε μια τιμή 1,0, και το επίπεδο της φωσφορυλίωσης σε όλα τα άλλα δείγματα ομαλοποιήθηκε σε αυτήν την τιμή.

εισβολή και τη μετανάστευση δοκιμασίες

εισβολή των καρκινικών κυττάρων μετρήθηκε με την εξέταση των κυττάρων εισβολή μέσω Matrigel (BD, ΗΠΑ) -επικαλυμμένα πολυανθρακικά φίλτρα (8-μm μέγεθος πόρου) χρησιμοποιώντας θαλάμους Transwell εισβολή (Costar, VWR Albertslaund, Δανία). Εν συντομία, μετά από 48 ώρες από την επιμόλυνση, SW480 κυττάρων συμπεριλαμβανομένων shAPRIL επιμολυσμένα κύτταρα και shNTC επιμολυσμένα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, και 10

5 κύτταρα αιωρούνται σε 100 μΐ DMEM με 0.5% FBS απλώθηκαν στον άνω θάλαμο. Για τον Απρίλιο διεγείρεται κυτταρική δοκιμασία εισβολής HCT-116, παράλληλα πειράματα διεξήχθησαν με την παρουσία rhAPRIL σε μια συγκέντρωση 100 ng /ml σε 0.5% FBS μέσου στο άνω θάλαμο. Το κάτω θάλαμος περιείχε 600 μΙ μέσου ϋΜΕΜ με 10% FBS. Μετά από επώαση στους 37 ° C σε

2 επωαστήρα για 72 ώρες 5% CO, τα κύτταρα επί της άνω επιφάνειας του φίλτρου απομακρύνθηκαν με σκούπισμα με ένα βαμβάκι. δοκιμασίες μετανάστευση με 10

6 κύτταρα ανά πηγάδι επωάζονται για 48 ώρες πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της ίδιας διαδικασίας αλλά με μη επικαλυμμένα φίλτρα πολυανθρακικό. Όπου υποδεικνύεται, τα κύτταρα επιστρώθηκαν πάνω στα ένθετα με GM6001, ή ο ίδιος όγκος DMSO (Sigma). GM6001 σε συγκέντρωση 10 μΜ σε 0.5% FBS media διαλυμένο σε DMSO προστέθηκαν στα μέσα μαζικής ενημέρωσης για την αναστολή MMPs σε δοκιμασίες κύτταρο εισβολή. Τα κύτταρα που συνδέονται με την κάτω επιφάνεια της μεμβράνης βάφτηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες και στη συνέχεια μετρήθηκαν με μικροσκόπιο. Τα κύτταρα εξετάστηκαν, μετρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν σε 100 × μεγέθυνση κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Πέντε διαφορετικά πεδία μετρήθηκαν ανά φίλτρο σε κάθε ομάδα και κάθε πείραμα επαναλήφθηκε εις τριπλούν. Τα μέσα πέντε επιμέρους πεδίων που επιλέγονται τυχαία ελήφθησαν για κάθε φρεάτιο.

Μέτρηση της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 παραγωγή

ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 δραστηριότητες προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μια ποσοτική ενζύμου σάντουιτς τεχνική ανοσοπροσδιορισμού. κύτταρα CRC σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε συγκέντρωση 4 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε ϋΜΕΜ με 0,5% FBS για τρεις ημέρες. Τα επίπεδα των εκκρινόμενων ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 στα υπερκείμενα καλλιέργειας προσδιορίστηκαν με ELISA. Η δοκιμασία διεξήχθη με τη χρήση των Quantikine ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 κιτ (R &? D, ΜΝ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες χρήσης. Τα επίπεδα ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 προσδιορίστηκαν ποσοτικά από πρότυπες καμπύλες. Η δοκιμασία επιτρέπει την ποσοτικοποίηση του ενεργού καθώς επίσης και την συνολική πρωτεΐνη. Κάθε δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν. Αυτή η μέθοδος έχει επικυρωθεί κατά zymography από το R & amp? D Systems

Τα πειράματα σε ζώα

Όλα τα ζωικά πειράματα διεξήχθησαν με nu ποντίκια οκτώ εβδομάδων αθυμικά θηλυκά BALB /c nu /.. Τα ζώα χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες, η = 10 ανά ομάδα. Μη επιμολυσμένα κύτταρα SW480, shNTC σταθερά επιμολυσμένα SW480 κύτταρα και shAPRIL (sh637) σταθερά επιμολυσμένα SW480 κύτταρα (2 χ 10

6 σε 100 μΙ PBS) εγχύθηκαν υποδορίως στην δεξιά πλευρά κάθε ποντικού. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε εξωτερικά χρησιμοποιώντας μία καλίμπρα βερνιέρου κάθε πέντε ημέρες, μέχρι 40 ημέρες μετά την ένεση. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε με τον ακόλουθο τύπο: π /6 × μήκος × πλάτος

2. Επτά εβδομάδες μετά την ένεση, τα ποντίκια θυσιάστηκαν με αυχενική εξάρθρωση. Οι όγκοι αφαιρέθηκαν και τον Απρίλιο έκφραση καρκινικών ιστών αναλύθηκε με κηλίδα western και ανοσοϊστοχημεία. Τα ήπατα και οι πνεύμονες αποκόπηκαν και μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 24 ώρες. Μεταστατικές εστίες στην ηπατική επιφάνεια μετρήθηκαν μακροσκοπικά βοηθούμενη από μια χειρουργική τηλεσκόπιο και επιβεβαιώθηκε μικροσκοπικά. Στη συνέχεια, οι ιστοί του όγκου και των μεταστατικών ιστών μονιμοποιήθηκαν παραφορμαλδεΰδη, εμβαπτισμένες σε παραφίνη και κόπηκαν σε φέτες. Οι τομές χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη ή με ανοσοϊστοχημική χρώση. Πρωτογενή αντισώματα ήταν κατά της ανθρώπινης ΑΠΡΙΛΙΟΥ ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9 (BD, NJ, USA), Κί-67, η κυκλίνη D1, CDK4, ρ-Rb (Santa Cruz Biotechnology), ρ-Akt, ρ-mTOR (κυτταρική σηματοδότηση ) και Ki-67 (Abcam, Cambridge, UK) για μελέτες ανοσοϊστοχημείας.

Στατιστική ανάλυση

τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM. Η στατιστική ανάλυση έγινε με ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA). Ήπαρ ανάλυση δεδομένων μετάσταση διεξήχθη χρησιμοποιώντας Poisson δοκιμή εκδηλώσεις διανομής. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές όταν

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Η έκφραση του Απριλίου υπερεκφράζεται σε ιστούς CRC και κυτταρικές σειρές

Ερευνήσαμε εάν η έκφραση ρυθμίζεται αυξητικά Απρίλιο ήταν σε ιστούς με εξέταση δειγμάτων από οκτώ ασθενείς με καρκίνο CRC χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western. έκφραση Απριλίου στο πρωτεϊνικό επίπεδο ήταν ιδιαίτερα αυξημένα σε όλους τους ιστούς CRC ελέγχθηκαν σε σύγκριση με παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς (Σχ. 1Α). Αυτό υποδηλώνει έναν πιθανό ρόλο για τον Απρίλιο στην ανάπτυξη καρκίνου ή την πρόοδο στο κόλον. Απρίλιος mRNA ανιχνεύθηκε σε σχετικά υψηλότερα επίπεδα σε μια ποικιλία ανθρώπινων κυτταρικών γραμμών CRC σε σύγκριση με ανθρώπινης ομφάλιας φλέβας ενδοθηλιακά κύτταρα, αν και τα επίπεδα του Απριλίου διέφεραν. Απρίλιο ήταν ανιχνεύθηκε σε σχετικά υψηλότερα επίπεδα σε SW480 και κύτταρα ΗΤ-29 και ενδιαμέσως εκφράζεται σε Colo-205 κύτταρα. έκφραση Απρίλιο ήταν ασθενώς ανιχνεύθηκε σε HCT-116 κύτταρα (Σχ. 1Β). Οι ανθρώπινες καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές HCT-116 και SW480 επιλέχθηκαν ως ένα σύστημα μοντέλου για την έρευνα μας. Για τη μείωση της έκφρασης Απρίλη, αναπτύξαμε δύο σύντομες RNAs φουρκέτα (shRNA) ονομάζεται sh637 και sh1750 [17], η οποία στρέφονταν κατά του ανθρώπινου Απρίλιο γονίδιο (shAPRIL) και προκάλεσε σημαντική μείωση της έκφρασης Απρίλιο σε σύγκριση με nontargeting ελέγχου επιμολυσμένα (shNTC) και μη επιμολυσμένα κύτταρα . Μετά shRNA επιμόλυνση, ουσιαστική knockdown της μεταγραφής Απρίλιο ήταν παρατηρήθηκε σε κύτταρα SW480 σε επίπεδα (1D Σχ.) Τόσο το mRNA (Εικ. 1C) και σε πρωτεΐνες. Απρίλιος έκφραση μετρήθηκε με ELISA σε CRC υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας έδειξε ότι οι κυτταρικές σειρές που εκκρίνονται διαφορετικά επίπεδα διαλυτών ΑΠΡΙΛΙΟΥ η οποία επιβεβαίωσε ότι ο Απρίλιος είναι μία εκκρινόμενη πρωτεΐνη (Εικ. 1 Ε).

(Α) ανάλυση κηλίδας Western των Απριλίου οκτώ ζεύγη των όγκων παχέος εντέρου (Τ) και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών (Ν). # 1-8 δείχνει αριθμούς ασθενών. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. (Β) ημι-ποσοτική ανάλυση RT-PCR της έκφρασης Απριλίου τέσσερις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC (SW480, ΗΤ-29, Colo-205 και HCT-116). HUVECs χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος και GAPDH ήταν ένας εσωτερικός έλεγχος. (C) κύτταρα SW480 επιμολύνθηκαν με shRNA κατευθύνεται εναντίον nontargeting ελέγχου (shNTC) ή ανθρώπινο γονίδιο Απρίλιο (sh637, sh1750), και μετά από 48 ώρες, το επίπεδο του mRNA Απρίλιο προσδιορίστηκε με ημιποσοτική RT-PCR. GAPDH ήταν ένα εσωτερικό έλεγχο. (D) κύτταρα SW480 επιμολύνθηκαν με shNTC ή shAPRIL, και μετά από 48 ώρες, τα επίπεδα της πρωτεΐνης του Απριλίου ήταν προσδιορίστηκε με κηλίδα western. β-ακτίνη ήταν ένας εσωτερικός έλεγχος. κυτταρικές σειρές (Ε) CRC και shAPRIL-επιμολυσμένα SW480 κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες, και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και αξιολογήθηκαν για εκκρίνεται ΑΠΡΙΛΙΟΥ με ELISA.

Η

Η βιολογική επίδραση του Απριλίου για καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα

για να αναλύσει τις δραστηριότητες του Απριλίου για CRC, εξετάσαμε τα αποτελέσματα του Απριλίου νοκ ντάουν και τον Απρίλιο διέγερση σε κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των ανθρώπινων κυτταρικών σειρών CRC HCT-116 και SW480. CCK-8 δοκιμασία βιωσιμότητας της κυτταρικής ανάπτυξης προσδιορίστηκε 24, 48, 72 και 96 h μετά την επιμόλυνση και τον Απρίλιο διέγερση. Παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση στη βιωσιμότητα ανάπτυξης κυττάρου σε sh637 επιμολυσμένα SW480 κύτταρα (

P

& lt? 0,05? Εικ. 2Α), και μια σημαντικά αυξημένη βιωσιμότητα κυτταρικής ανάπτυξης σε rhAPRIL (400 ng /ml, 800 ng /ml ) διεγερμένα HCT-116 κύτταρα (

P

& lt? 0,05? Εικ. 2Β) σε σύγκριση με τους αντίστοιχους ελέγχους. Για να διερευνήσουν το ρόλο του Απριλίου στην εισβολή CRC κυττάρων και τη μετάσταση, πραγματοποιήσαμε μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή δοκιμασίες, οι οποίες θεωρούνται σημαντικές

in vitro

ιδιότητες που σχετίζονται με την κακοήθεια των κυττάρων. κύτταρα επιμολυσμένα με CRC sh637 ή διεγείρονται με rhAPRIL (100 ng /ml) επηρέασε σημαντικά τον αριθμό των μεταναστεύουν και εισβάλλουν κύτταρα που συνδέονται με την κάτω επιφάνεια της μεμβράνης, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (

P

& lt? 0,05? Σχ . 2D και Ε). Knockdown Απριλίου είχε ως αποτέλεσμα σημαντική καταστολή της μετανάστευσης κυττάρων και κυτταρικών εισβολή ενός ανασυσταθέντος βασικής μεμβράνης (Matrigel), ενώ rhAPRIL (100 ng /ml) η κατεργασία αύξησε δραματικά μετανάστευση CRC κυττάρων και εισβολή. προσδιορισμοί ΜΤΤ μας έδειξαν ότι η θεραπεία με 100 ng /ml rhAPRIL δεν αισθητά να αυξήσουν τον πολλαπλασιασμό των HCT-116 κύτταρα (Εικ. 2C), γεγονός που υποδηλώνει ότι ο Απρίλιος επαγόμενη μετανάστευση των κυττάρων δεν συσχετίστηκε με αυξημένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Αναλύσεις πολλαπλασιασμού και εισβολή πραγματοποιήθηκαν επίσης σε sh1750 επιμολυσμένα κύτταρα SW480, και τα αποτελέσματα ήταν συνεπή με sh637 επιμολυσμένα κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι ο Απρίλιος παίζει σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση και τη μετάσταση των κυττάρων του CRC.

(Α) shAPRIL διαμόλυνση μείωσε σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με CCK-8 σε κύτταρα SW480 σε σύγκριση με την μη επιμολυσμένων και shNTC επιμολυσμένα ελέγχους. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SEM? *

P

& lt? 0,05 σε σύγκριση με shNTC. (Β) rhAPRIL (400 ng /ml ή 800 ng /ml) διέγερση σημαντικά ενισχυμένη κυτταρική βιωσιμότητα σε HCT-116 κύτταρα σε σύγκριση με μη-διεγερμένα κύτταρα? *

P

& lt? 0,05. (Γ) Η θεραπεία με 100 ng /ml rhAPRIL δεν αυξάνουν σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των HCT-116 κυττάρων. (D και Ε) Η κυτταρική κινητικότητα μέσω μη επιστρωμένο φίλτρων (μετανάστευση) και μέσω Matrigel επικαλυμμένα φίλτρα (εισβολή) στις shAPRIL-επιμολυσμένα κύτταρα SW480, rhAPRIL διεγερμένα HCT-116 κύτταρα και τους αντίστοιχους ελέγχους τους. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες, εμφανιζόμενα με μικροσκοπία, και μετρήθηκαν. (Δ) Ο αριθμός των κυττάρων που είχαν εισβάλει μετρήθηκε σε πέντε αντιπροσωπευτικές χαμηλής ισχύος (× 100) πεδία (ΦΔΧ) ανά Transwell εισάγετε. Όλοι οι προσδιορισμοί διεξήχθησαν τουλάχιστον εις τριπλούν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν μέσες ± SEM. *

P

& lt? 0,05 έναντι των ελέγχων. (Ε) Αντιπροσωπευτικό παράδειγμα bar Κλίμακα Δ, 40 μm.

Η

ΑΠΡΙΛΙΟΣ-νοκ ντάουν αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση των κυττάρων SW480 in vivo

Όπως Απρίλιο επηρεάζεται η ανάπτυξη του όγκου των κυττάρων και εισβολής

in vitro

, εξετάσαμε έπειτα αν Απρίλιο επηρέασε την συμπεριφορά των όγκων

in vivo

σε γυμνούς ποντικούς BALB /c, τα οποία είναι ανοσοανεπαρκή και ευπαθή σε σχηματισμό όγκου και τη μετάσταση. Τα ποντίκια ενέθηκαν υποδορίως στο δεξιό πλευρό με μη επιμολυσμένα SW480, shAPRIL (sh637) επιμολυσμένα SW480 ή shNTC επιμολυσμένα SW480 κύτταρα. Η ανάπτυξη του όγκου ήταν σημαντικά μειωμένη σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με κύτταρα ΑΠΡΙΛΙΟΣ-knockdown (shAPRIL) SW480 (

P

& lt? 0,05) σε σύγκριση με ποντίκια που ενέθηκαν με έλεγχο siRNA (shNTC) και μη-επιμολυσμένα κύτταρα (έλεγχος) (εικ. 3Α, Β και C). Συνολικός αριθμός των μεταστατικών οζιδίων ήπατος (& gt? 0,5 ​​mm) σε μεμονωμένους ποντικούς μετρήθηκαν κάτω από ένα χειρουργικό τηλεσκόπιο. Οι συνολικοί αριθμοί των μεταστατικών οζιδίων φαίνονται στον Πίνακα 1. Οι μεταστατικοί συκώτι οζίδια επιβεβαιώθηκαν ιστολογικά και αντιπροσωπευτικές αιματοξυλίνη και εοσίνη χρωματισμένο εικόνες φαίνονται στο Σχ. 3D. Δεν πνευμονικών μεταστάσεων βρέθηκαν σε οποιαδήποτε από τις τρεις ομάδες. Σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα και επιμολυσμένα SW480 shNTC κύτταρα, ΑΠΡΙΛΙΟΣ-knockdown SW480 κύτταρα έδειξαν μειωμένη μετάσταση στο ήπαρ σε γυμνούς ποντικούς (Πίνακας 1, Σχ. 3D). Ήπαρ μεταστατικά οζίδια παρατηρήθηκαν στην ομάδα μη διαμολυνθέν SW480 (n = 89) και ομάδα shNTC SW480 (n = 78), ενώ τρία οζίδια βρέθηκαν στην ομάδα ΑΠΡΙΛΙΟΣ-knockdown SW480 (

P

& lt? 0,05) ( Τραπέζι 1). Αν και η ομάδα shNTC σχηματίζονται λιγότερα μεταστατικά οζίδια από μη επιμολυσμένα ομάδα, αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική (

P

& gt? 0,05). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο Απρίλιος διαδραματίζει βασικό ρόλο στην καρκινογόνο και μεταστατική διαδικασία SW480 κυττάρων

in vivo

.

(Α) Γυμνοί ποντικοί εγχύθηκαν υποδορίως στο δεξιό πλευρό με κύτταρα ελέγχου, shNTC επιμολυσμένα κύτταρα και shAPRIL (sh637) επιμολυσμένων κυττάρων. (Β) Ένας όγκος δείγματος από κάθε ομάδα παρουσιάζεται. (Γ) Τάση της αύξησης του όγκου μετά την ένεση σε γυμνά ποντίκια σε διαφορετικές ομάδες. Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο βερνιέρου σε cm

3. (D) Σύνολο των μεταστατικών οζιδίων ήπατος (& gt? 0,5 ​​mm) σε μεμονωμένους ποντικούς μετρήθηκαν κάτω από ένα χειρουργικό τηλεσκόπιο. Εκπρόσωπος αιματοξυλίνη και ηωσίνη των τμημάτων 4-μm των συκωτιών από shAPRIL και shNTC ομάδες φαίνονται. Βέλος δείχνει οζίδια όγκου. μπαρ κλίμακα, 100 μm. (Ε) στύπωμα Western και ανοσοϊστοχημεία Απριλίου σε όγκους γυμνών ποντικών από κάθε ομάδα. (F) Ανοσοϊστοχημική ανάλυση ρ-Akt, ρ-mTOR, Ki-67, η κυκλίνη D1, CDK4, ρ-Rb, ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 σε όγκους από γυμνά ποντίκια ενέθηκαν με κύτταρα shNTC ή shAPRIL SW480. μπαρ κλίμακα, 40 μm.

Η

Απρίλιος διεγείρει το PI3K /Akt μονοπατιού στα κύτταρα CRC

Η PI3K /AKT οδό έχει αναφερθεί ότι παίζουν κρίσιμο ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων , τη μετανάστευση και την εισβολή των διαφόρων τύπων καρκίνου. Επιπλέον, οι TNF υπεροικογένειας μέλη Απρίλιο και Β-κυττάρων-παράγοντα ενεργοποίησης (BAFF), κατά την εμπλοκή με τους υποδοχείς τους, έχουν πρόσφατα δειχθεί να ενεργοποιούν το ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι σε κακοήθη Β κύτταρα [18], [19]. Έτσι, προσδιορίζεται εάν η οδός ΡΙ3Κ /Akt συμμετείχε στον Απρίλιο-προκαλούμενης κυτταρικής απόκρισης σε στερεά καρκινικά κύτταρα. Akt είναι ένα υπόστρωμα για ΡΙ3Κ, και ο στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) είναι ένα σημαντικό καθοδικός τελεστής της Akt. Αξιολογήσαμε την επίδραση του Απριλίου-knockdown στο ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι σε κύτταρα SW480 με μέτρηση του προφίλ φωσφορυλίωσης της Akt και mTOR. ΑΠΡΙΛΙΟΣ-νοκ ντάουν μείωσε την φωσφορυλίωση της Akt και mTOR στα SW480 κύτταρα με κηλίδα western (Σχ. 4Α). Εξετάσαμε επίσης το κατά πόσον Απρίλιο επηρέασε τη φωσφορυλίωση της Akt και mTOR

in vivo

. Στο ποντίκι ιστούς όγκων με Απρίλιο γκρεμίζω, μειώθηκε p-Akt και περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη mTOR π-παρατηρήθηκε με ανοσοϊστοχημεία (Εικ. 3F, άνω φωτογραφία). Είμαστε δίπλα ερεύνησε τις επιπτώσεις του Απριλίου διέγερσης για την PI3K /Akt μονοπατιού σε HCT-116 κύτταρα. Αυξανόμενες συγκεντρώσεις rhAPRIL σε HCT-116 κύτταρα διέγειρε την φωσφορυλίωση της Akt και mTOR, ανιχνεύονται 3 ώρες μετά τον Απρίλιο διέγερση με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 4Β). Στη συνέχεια, προεπεξεργασία με LY294002, ένας αναστολέας συνθετικό του P110 καταλυτική υπομονάδα της PI3K, χρησιμοποιήθηκε για να ερευνήσει την πιθανή συμμετοχή της PI3K Τον Απρίλιο μεσολάβηση Akt και φωσφορυλίωση mTOR στα κύτταρα CRC. Προεπεξεργασία των HCT-116 κυττάρων με LY294002 ανέστειλε σημαντικά ΑΠΡΙΛΙΟΣ-επαγόμενη Akt και mTOR δραστηριότητα, υποδηλώνοντας ότι Akt και mTOR φωσφορυλίωση σε απόκριση Απρίλιο ήταν ΡΙ3Κ εξαρτώμενη (Εικ. 4C).

(Α) SW480 κύτταρα επιμολύνθηκαν με shAPRIL (sh637) και shNTC για 48 ώρες και αναλύθηκαν για Akt και φωσφορυλίωση m-TOR με κηλίδα western. (Β) HCT-116 κύτταρα κατεργάστηκαν με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις rhAPRIL για τρεις ώρες και αναλύθηκαν για έκφραση της φωσφορυλίωσης της Akt και mTOR. (C) HCT-116 κύτταρα κατεργάστηκαν με τις υποδεικνυόμενες δόσεις LY294002 για 24 ώρες, και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με rhAPRIL (400 ng /ml) για τρεις ώρες, και αναλύθηκαν για την φωσφορυλίωση της Akt και mTOR. Η φωσφορυλίωση της Akt και mTOR προσδιορίστηκε με SDS-PAGE και κηλίδωση Western. Οι πυκνομετρικές τιμές που αναγράφονται κάτω από κάθε κηλίδα.

Η

Απρίλιος μεσολάβηση κυτταρικό πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRC με την πρόκληση Akt και ενεργοποίηση του mTOR μέσω του PI3K /Akt μονοπατιού

Λόγω του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων ρυθμίζεται από το κυτταρικό κύκλο, είμαστε δίπλα προσδιοριστεί ποια φάση του κυτταρικού κύκλου μεταβλήθηκε σε ΑΠΡΙΛΙΟΣ-νοκ ντάουν κυττάρων με κυτταρομετρία ροής με χρώση ΡΙ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, ΑΠΡΙΛΙΟΣ-knockdown κυττάρων SW480 συνελήφθησαν στη φάση G1 48 ώρες μετά την επιμόλυνση και το ποσοστό των G0 /κύτταρα φάσης Gl αυξηθεί σημαντικά, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο Απρίλιος-knockdown εμπόδισε την είσοδο των κυττάρων από G1 προς S φάση του κυτταρικού κύκλου. Για να κατανοήσουμε πώς περαιτέρω ΑΠΡΙΛΙΟΣ-knockdown εμπόδισε την είσοδο S-φάση των κυττάρων, εξετάσαμε την επίδραση της shAPRIL μορφομετατροπής επί της έκφρασης του c-myc, κυκλίνη D1, CDK4 (κρίσιμη ρυθμιστές της G1 /S μετάβαση) και ρ-Rb. Παρατηρήσαμε μια μείωση του c-myc, κυκλίνη D1, CDK4 και ρ-Rb από knockdown Απριλίου (Σχ. 5C), η οποία πρότεινε ότι οι παράγοντες αυτοί θα μπορούσαν να εμπλέκονται στη ρύθμιση Απριλίου του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Στο ποντίκι όγκους με γκρεμίσει Απριλίου, παρατηρήθηκε μειωμένη περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες Απρίλιο με ανοσοϊστοχημεία και κηλίδα western (Σχ. 3Ε), και μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων (κυκλίνη D1, CDK4, π-Rb και Ki-67) (Εικ. 3F, χαμηλότερο πίνακα), γεγονός που υποδηλώνει ότι η μειωμένη ανάπτυξη του όγκου παρατηρήθηκε από τον Απρίλιο του νοκ ντάουν θα μπορούσε να είναι το αποτέλεσμα της ρύθμισης Απρίλιο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Επειδή ΡΙ3Κ /Akt ενεργοποίηση σε φάση G1 απαιτείται για τη σταθεροποίηση του c-myc και την είσοδο στη φάση S των κυττάρων [20], προσδιορίσαμε αν ΑΠΡΙΛΙΟΣ-μεσολαβούμενη ρύθμιση των ρυθμιστικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου ήταν ΡΙ3Κ και Akt εξαρτάται. Επιβεβαιώσαμε rhAPRIL θα μπορούσε να επάγει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου με τη σημαντική αύξηση του ποσοστού των κυττάρων στη φάση S, G2M και την έκφραση του c-myc, κυκλίνη D1, CDK4, ρ-Rb πρωτεΐνες σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 5Β και Δ) . Ταυτόχρονα, διερευνήθηκε η επίδραση της αναστολής ΡΙ3Κ /Akt τον Απρίλιο επαγόμενη εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων SW480, τα οποία υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με τον αναστολέα της ΡΙ3Κ, LY294002, πριν από τον Απρίλιο διέγερση. Βρήκαμε ότι η ενεργοποίηση του π-Akt και ρ-mTOR μέχρι τον Απρίλιο του μπλοκαρίστηκε εντελώς από τον αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002, που συνοδεύεται με σημαντική αναστολή του c-myc, κυκλίνη D1, CDK4 και ρ-Rb έκφραση (Σχ. 5Ε). Αυτό υποδηλώνει ότι ο Απρίλιος που προκαλείται Akt και η δραστηριότητα του mTOR είναι άμεσα ρυθμίζεται μέσω του PI3K /Akt μονοπατιού. Σύκο. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ.