Αφηρημένο

microRNA έχει πρόσφατα αναγνωριστεί ως παίζουν εξέχοντα ρόλο στην ογκογένεση και τη μετάσταση. Εδώ, αναφέρουμε ότι το miR-338-3p ήταν επιγενετικώς σιγήσει σε καρκίνο του στομάχου και κάτω ρύθμιση της συσχετίστηκε σημαντικά με γαστρικό καρκίνο κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά. Εντυπωσιακά, αποκαθιστώντας miR-338-3p έκφραση σε ΓΓΕ-7901 γαστρικά καρκινικά κύτταρα ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση, την εισβολή και ογκογενετικότητας

in vitro

και

in vivo

, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω της επαγωγής της απόπτωσης. Επιπλέον, έχουμε αποδείξει η SSX2IP ογκογονίδιο είναι ο στόχος του miR-338-3p. Προτείνουμε ότι το miR-338-3p λειτουργεί ως καταστολέας των όγκων σε καρκίνο του στομάχου, και την κατάσταση μεθυλίωσης του νησιού της CpG θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μια πιθανή διαγνωστικός δείκτης για καρκίνο του στομάχου

Παράθεση:. Λι P, Chen X, Su L, Li C, Zhi Q, Yu B, et al. (2013) Επιγενετική κατασιγάσει του miR-338-3p Συμβάλλει στην Ογκογονικότητα στο γαστρικό καρκίνο από Στόχευση SSX2IP. PLoS ONE 8 (6): e66782. doi: 10.1371 /journal.pone.0066782

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 17 Γενάρη του 2013? Αποδεκτές: 10 Μαΐου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 24, Ιουνίου 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (αριθμούς 30872476, 81072012, 81172324, 91229106, 30900670 και 81272749), Επιστήμης και Τεχνολογίας της Επιτροπής του Δήμου Σαγκάης (αριθμοί 10jc1411100, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 11jc1407602 και 101.409.042.000), Σαγκάη Key πειθαρχία ( S30204), και τα βασικά σχέδια στο Εθνικό Επιστημονικό & amp? Τεχνολογία Πρόγραμμα πυλώνα της Κίνας (αριθμοί 2008BA152B03 και 2011BA203191), η Κίνα Ίδρυμα Μεταδιδακτορικός Science (αριθμός 2011M500796). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

Γαστρικό καρκίνο είναι μια κακοήθεια με υψηλή συχνότητα και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως [1]. Η πρώιμη διαγνωστική ποσοστό του γαστρικού καρκίνου είναι χαμηλή, και οι ασθενείς είναι συνήθως δύσκολο να διαγνωστούν μέχρι έχει εξελιχθεί σε προχωρημένο στάδιο ή μετάστασης του καρκίνου. Έτσι, έχει μεγάλη σημασία για τη διεξαγωγή σε βάθος μελέτη σχετικά με την παθογένεση του καρκίνου του στομάχου και να ψάξουν για νέες μοριακές κατασκευαστές και θεραπευτικών στόχων.

Τα microRNAs είναι μικρά RNA που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων, και εμπλέκονται

σε μια ποικιλία από μονοπάτια σηματοδότησης βιολογικών [2]. Πολλαπλές μελέτες έχουν αποκαλύψει σημαντική διαφορά από microRNAs έκφρασης προφίλ μεταξύ κυττάρων όγκου και κύτταρα που προέρχονται από φυσιολογικούς ιστούς, που δείχνει ότι microRNAs έχουν παίξει σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση [3], [4]. Έτσι, Τα microRNAs έχει γίνει πρόσφατα ένα hotspot της γενετικής διάγνωσης και στόχος της θεραπείας ως νέα ογκογονίδια ή γονίδια καταστολής [5], [6]. Ανώμαλη έκφραση του microRNAs σε ιστούς ή ορό συνδέεται στενά με πολλαπλούς ανθρώπινων κακοηθειών περιλαμβανομένων γαστρικού καρκίνου [7], [8], και αρκετά κάτω ρυθμισμένα microRNAs σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς διαθέτουν λειτουργίες καταστολής όγκων. Για παράδειγμα, η οικογένεια microRNA Let-7 για πρώτη φορά βρέθηκε ως καταστολέας της RAS, καταστολή RAS και c-myc έκφρασης σε μεταφραστικό επίπεδο [9]. Το επίπεδο έκφρασης του let-7a είναι σημαντικά μειωμένη σε γαστρικών όγκων, ενώ Ras πρωτεΐνη είναι σημαντικά υψηλότερη σε γαστρικού όγκου [10]. Επιπλέον, miR-15b, miR-16 και miR-21 κλπ έχουν συνδεθεί με την ανάπτυξη και την κλινική διάγνωση του καρκίνου του στομάχου [11], [12]. Η ομάδα μας έχει αναφερθεί, επίσης, την αντικαρκινική ρόλο του miR-126, miR-409-3p και miR-155 στο γαστρικό καρκίνο [13] – [15]

microRNA μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε για την ανίχνευση των προφίλ miRNA σε γαστρική. καρκίνο, και βρήκαμε ότι το miR-338-3p ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται (αδημοσίευτα δεδομένα). miR-338-3p, που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 17q25.3 με μήκος 22 nt, ήταν για πρώτη φορά το πριόν επαγόμενη νευροεκφυλισμού όπως η έκφραση του miR-338-3p μειώνεται στους εγκεφάλους των ποντικών που μολύνθηκαν με το ποντίκι προσαρμοσμένο ξύνω [ ,,,0],16]. miR-338-3p θα μπορούσε να ρυθμίσει το επίπεδο του mRNA του γονιδίου ξενιστή απόπτωση που σχετίζεται τυροσίνης κινάσης (AATK) σε νευρώνες αρουραίου [17]. Από την άλλη πλευρά, miR-338-3p ήταν ρυθμισμένη σε ασθενείς με σποραδική αμυοτροφική πλευρική σκλήρυνση (SALS), ένα άλλο είδος των βλαβών του νευρικού συστήματος [18]. Είναι σημαντικό ότι, ένας ρόλος του miR-338-3p στην ογκογένεση έχει προηγουμένως προταθεί, ως miR-338-3p ρυθμίζεται προς τα κάτω σε καρκίνο του ορθού [19], και ρυθμίζεται από τον ιό Χ πρωτεΐνη ηπατίτιδας Β (HBx) να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και την εισβολή των κυττάρων ηπατώματος με σύνδεση προς στόχευση γονιδίων CyclinD1 και smoothened στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [20] – [22]. Ωστόσο, ο ρόλος του miR-338-3p σε GC είναι ακόμα άγνωστη.

Στην παρούσα μελέτη, αναλύσαμε περαιτέρω την προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης του miR-338-3p σε ιστούς GC σε σχέση με τον ασθενή-συμφωνημένα κανονική ιστούς, και διαπίστωσε ότι το επίπεδο έκφρασης του miR-338-3p ήταν στενά συνδεδεμένα με τις κλινικοπαθολογική μεταβλητές του GC. Η έκτοπη έκφραση του miR-338-3p αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και τη μετάσταση των γαστρικών καρκινικών κυττάρων, μειώνει την ογκογόνο ικανότητα του γαστρικού καρκίνου κυττάρων σε γυμνά ποντίκια, και προωθεί την απόπτωση. Δείχνουμε επίσης ότι το miR-338-3p μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολέας των όγκων με την άμεση στόχευση SSX2IP. Έτσι, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το miR-338-3p είναι ένας δυνητικός διαγνωστικός δείκτης και θεραπευτικός στόχος του καρκίνου του στομάχου.

Υλικά και Μέθοδοι

1. Γραμμές κυττάρων και Πολιτισμού

Οι ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου SGC-7901, NCI-Ν87, BGC-823 και AGS αγοράστηκαν από τη Σαγκάη Ινστιτούτα Βιολογικών Επιστημών, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών [23] – [26]. ΚΑΤΩ-ΙΙΙ και SNU-1 αγοράστηκαν από την ATCC (American Type Culture Collection) [24], [27], ΜΚΝ28 και ΜΚΝ45 ελήφθησαν από την ιαπωνική Cancer Research Τράπεζα πόρους [28], η αθανατοποιημένη γαστρικού επιθηλιακή κυτταρική γραμμή, GES -1, ήταν ένα δώρο από τον καθηγητή Feng Bi (Huaxi Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Sichuan, Chengdu, επαρχία Σιτσουάν, ΛΔ της Κίνας) [29], [30]. ΗΕΚ293Τ, ανθρώπινων εμβρυϊκών κυττάρων νεφρού γραμμή, διατηρήθηκε στο ινστιτούτο μας. Οι γαστρικού κυτταρικές σειρές καρκίνου καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% FBS (ορός εμβρύου μόσχου) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2. κύτταρα ΗΕΚ293Τ καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (τροποποιημένο μέσο Eagle κατά Dulbecco) συμπληρωμένο με τον ίδιο καλλιεργημένο προϋπόθεση ανωτέρω.

2. Ηθική Δήλωση

Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση στη μελέτη ελήφθη από όλους τους συμμετέχοντες. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας της Ruijin Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή, Shanghai Jiao Tong University.

3. Δείγματα ιστού

Πρωτοβάθμια γαστρικό καρκινικούς ιστούς και τα συμφωνημένα μη καρκινικούς ιστούς συλλέχθηκαν από 66 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε ριζική γαστροστομίας στο Τμήμα Χειρουργικής, Ruijin Νοσοκομείο, Σαγκάη Jiao Tong University School of Medicine. Κανένας από τους ασθενείς έλαβαν προεγχειρητική θεραπεία. Όλα τα δείγματα ιστών συλλέχθηκαν με ενημερωμένη συγκατάθεση των ασθενών και επιβεβαιώθηκε από την παθολογική εξέταση, και η ιστολογική πληκτρολογώντας βασίστηκε στην κατάταξη της Lauren του. Οι ορισμοί ταξινόμησης ΤΝΜ ήταν σύμφωνα με τη Διεθνή Ένωση κατά του Καρκίνου (2002).

4. Απομόνωση RNA και qPCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από κυτταρικές γραμμές και δείγματα ιστού από

Mir

κιτ απομόνωσης Βάνα ™ miRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ποιότητα και η ποσότητα των δειγμάτων RNA εκτιμήθηκαν με πρότυπο ηλεκτροφόρησης και φασματοφωτομετρικές μεθόδους. Το επίπεδο έκφρασης του miR-338-3p σε κυτταρικές γραμμές και δείγματα ιστών μετρήθηκε με qPCR και υπολογίζεται όπως περιγράφεται [13]. Το επίπεδο έκφρασης του mRNA SSX2IP μετρήθηκε με qPCR σύμφωνα με το πρωτόκολλο TaqMan® Gene Expression Δοκιμασίες (Applied Biosystems). Το επίπεδο GAPDH mRNA χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση.

5. Απομόνωση DNA και Ανάλυση μεθυλίωσης

Γονιδιωματικό DNA από δείγματα ιστού καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας DNazol (Invitrogen). Όξινο θειώδες νάτριο μετατροπή διεξήχθη χρησιμοποιώντας το Qiagen Epitect Bisulfite Kit (Qiagen) σύμφωνα με τον κατασκευαστή. Τα αγάλματα μεθυλίωση διεξήχθη από ειδικούς μεθυλίωσης PCR (MSP). Οι εκκινητές για μεθυλιωμένο ή μη μεθυλιωμένο DNA σχεδιάστηκαν από το λογισμικό Primer Express Methyl v1.0 (ΑΒΙ) .Το μεθυλίωση πρόσθιος εκκινητής για την CpG του miR-338-3p: 5′-GGCGGAGTTTATGGTTTTC-3 ‘και τον ανάστροφο εκκινητή: 5’ -AAACCTAACCGATCCTCG-3 ‘, ο unmethylation πρόσθιος εκκινητής για την CpG του miR-338-3p: 5′-TGGTGGAGTTTATGGTTTTT-3′ και τον αντίστροφο εκκινητή: 5’-AAACCTAACCAATCCTCACAA-3 ‘

6.. Παροδική διαμόλυνση των miRNA Μιμείται

miRNA-338-3p μιμείται και αρνητικού ελέγχου μιμείται αγοράστηκαν από GenePharma (Σαγκάη, Κίνα) .Cells σπάρθηκαν σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας 20 ώρες πριν από την επιμόλυνση για να εξασφαλιστεί το 70% συρροή κυττάρων κατά τη στιγμή της επιμόλυνσης. Η επιμόλυνση του μιμείται miRNA σε κύτταρα διεξήχθη με τη χρήση Lipofectamine2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τη διαδικασία του κατασκευαστή. Οι μιμείται miRNA εργάστηκε στην τελική συγκέντρωση 100 nM. Στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, qPCR και κηλίδα Western διεξήχθησαν.

7. Δοκιμασία Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με WST (υδατοδιαλυτό άλας τετραζολίου) δοκιμασίας χρησιμοποιώντας ένα κιτ-8 μέτρηση κυττάρων (Dojindo) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με miRNA μιμείται, κύτταρα (2 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) ήταν σπόρος σε πλάκες 96 φρεατίων. Οι πλάκες επωάστηκαν για 5 ημέρες. Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων αξιολογήθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 450 nm.

8. Αποικίας μαλακού άγαρ Δοκιμασία Σχηματισμού

κύτταρα επιμολυσμένα με GC miRNA μιμείται επαναιωρήθηκαν με 0,3% μαλακό άγαρ σε ΚΡΜΙ1640 που περιείχε 10% FBS και επιστρώθηκαν επάνω σε 0,6% στερεοποιήθηκε άγαρ σε ΚΡΜΙ1640 που περιείχε 10% FBS σε πλάκες των 6-φρεατίων (1 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο). Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2. Αποικίες που περιέχουν τουλάχιστον 50 κύτταρα μετρήθηκαν.

9. Κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή Δοκιμασία

Η μετανάστευση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση QCM

TM24-Καλά Χρωματομετρική Μετανάστευση Assay Kit (Millipore) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για τη δοκιμασία εισβολής, Cell Δοκιμασία Invasion Kit (Millipore) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κύτταρα (1 χ 10

5) σε 300 μΙ μέσου χωρίς ορό προστέθηκαν στα άνω θαλάμους και καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες. Μη μεταναστεύοντα ή μη εισβάλλοντα κύτταρα απομακρύνθηκαν με βαμβακερά μάκτρα, τα κύτταρα που μετανάστευσαν ή εισέβαλαν στο κάτω μέρος της μεμβράνης βάφτηκαν με το ρυθμιστικό διάλυμα κυττάρων λεκέ που παρέχονται στο κιτ δοκιμασίας και μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο και φωτογραφήθηκαν. Τρία ανεξάρτητα πειράματα για τις ίδιες συνθήκες.

10. Η απόπτωση Ανάλυση

ανάλυση κυτταρικής απόπτωσης προσχηματίστηκε με Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit Ι (BD) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κάθε δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές ανεξάρτητα. Το χαρακτηριστικό γνώρισμα των πυρηνικών συρρίκνωση που σχετίζονται με απόπτωση έδειξε από την Hoechst 33342 (Beyotime) σύμφωνα με τη μορφολογία protocol.The οπτικοποιήθηκε με μικροσκόπιο φθορισμού που διεγείρεται σε μήκος κύματος 350 nm και μετράται σε 460 nm.

11. Κατασκευή των πλασμιδίων και δοκιμασία λουσιφεράσης Δραστηριότητα

Το θραύσμα του άγριου τύπου (wt) 3’UTR του SSX2IP ή χώρων μεταλλαγμένου (mut) 3’UTR της SSX2IP περιέχει το υποθετικές θέσεις πρόσδεσης miR-338-3p συνετέθησαν . Τα θραύσματα κλωνοποιήθηκαν στον φορέα pMIR-Έκθεση λουσιφεράσης (Ambion) που περιέχει

Firefly

και ονομάζεται pMIR /SSX2IP-3’UTR

κβ και pMIR /SSX2IP-3’UTR

mut.Cells ήταν σπόρος μέσα στις πλάκες 24 φρεατίων 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση. 500 ng pMIR /SSX2IP-3’UTR

κ.β. ή pMIR /SSX2IP-3’UTR

mut επιμολύνθηκαν σε κάθε φρεάτιο, μαζί με 20 ng του φορέα ρΚί-ΤΚ (Promega) που περιέχει

Renilla

λουσιφεράσης και 60 pmol των miR-338-3p ή τον έλεγχο μιμείται. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 48 ώρες διαμόλυνσης.

Firefly

και

Renilla

δραστηριότητες λουσιφεράσης μετρήθηκαν με τη χρήση ανιχνεύσεως Dual-λουσιφεράσης (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

12. Σταθερή επιμόλυνση των miR-338-3p φορέα έκφρασης

pSilencer-miR-338-3p φορέα και pSilencer-miR-φορέα ελέγχου μετασκευάστηκε σε SGC-7901 κυττάρων, αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας Lipofectamine2000 (Invitrogen), και επιλέγονται με 100 μg /ml υγρομυκίνης Β (Invitrogen) για 4 εβδομάδες. Σταθερά επιμολυσμένα κυτταρικοί κλώνοι επιλέχθηκαν και διατηρήθηκαν σε μισό της συγκέντρωσης επιλογής.

13. Μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου

SGC-7901 κύτταρα (2 χ 10

6 κύτταρα /ποντικό) σταθερά επιμολυσμένα με pSilencer-miR-338-3p ή φορέα pSilencer ελέγχου εγχύθηκαν υποδορίως σε 4-εβδομάδων αρσενικών γυμνά ποντίκια (Ινστιτούτο Ζωολογίας, κινεζική Ακαδημία Επιστημών, Σαγκάη, Κίνα) .Τα ποντίκια ελέγχθηκαν κάθε εβδομάδα, τα οζίδια του όγκου μετρήθηκαν με ένα παχύμετρο. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία 4 εβδομάδες μετά την ένεση, και οι όγκοι αφαιρέθηκαν και ζυγίστηκαν. Ο όγκος του όγκου αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο:. Όγκος = (πλάτος + μήκος) /2 × πλάτος μήκος × υπολογίστηκαν × 0.5236.Tumor καμπύλες ανάπτυξης

14. Ανοσοϊστοχημεία

Ανίχνευση SSX2IP πραγματοποιήθηκε σε τομές παραφίνης με το αντι-SSX2IP αντίσωμα (Abcam, αραίωση 1:1000). Το ανοσολογικό σύμπλοκο οπτικοποιήθηκε με την Dako REAL

TMEnVision Σύστημα Ανίχνευσης ™, Peroxidase /DAB, Κουνέλι /ποντίκι (Dako), σύμφωνα με τη διαδικασία του κατασκευαστή. Οι πυρήνες με αιματοξυλίνη.

15. Στατιστική Ανάλυση

Η σχέση μεταξύ του επιπέδου miR-338-3p έκφρασης και κλινικοπαθολογική παραμέτρους αναλύθηκε από το πρόσωπο

X

2 τεστ. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Student

t

δοκιμής. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SPSS 13.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA), και

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

1. . Η έκφραση του miR-338-3p ρυθμίζεται προς τα κάτω στις γραμμές κυττάρων GC και ιστών

Για να διερευνήσουν το ρόλο του miR-338-3p σε GC, συγκρίναμε πρώτα το επίπεδο έκφρασης του miR-338-3p στην οκτώ κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου με αθανατοποιημένη κανονική γαστρικού βλεννογόνου επιθηλιακή κυτταρική σειρά (GES-1). Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, miR-338-3p ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε κυτταρικές σειρές GC σε σύγκριση με GES-1. Για να επιβεβαιώσετε αυτό το αποτέλεσμα, συγκρίναμε επίσης τις εκφράσεις του miR-338-3p σε ιστούς GC και των παρακείμενων ιστών μη-όγκου. 66 GC ζευγαρωμένα δείγματα συμπεριλήφθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το μέσο επίπεδο έκφρασης του miR-338-3p ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω σε ιστούς όγκων σε σύγκριση με τα γειτονικά μη καρκινικούς ιστούς (Σχ. 1Β). Επιπλέον, θα διευκρινιστεί η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του miR-338-3p και κλινικοπαθολογική παράγοντες. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1. 59,1% (39/66) των δειγμάτων GC έδειξε τα κάτω ρύθμιση του miR-338-3p κάτω δύο φορές cut-off (σχετική αναλογία έκφραση & lt? 0,5), η κατάσταση αυτή θεωρήθηκε ότι είναι σημαντικά κάτω -regulated. Με βάση αυτό το cut-off, οι 66 κλινικές περιπτώσεις χωρίστηκαν σε δύο ομάδες: miR-338-3p κατώτερη ομάδα έκφρασης (n = 39) και miR-338-3p υψηλότερη έκφραση (n = 27). Η κατώτερη ομάδα έκφραση έδειξε κλίση προς μεγαλύτερο μέγεθος του όγκου, περισσότερο μετάσταση λεμφαδένα, βαθύτερη τοπική εισβολή και πιο προχωρημένο στάδιο TNM, αλλά χωρίς σημαντική συσχέτιση με την ηλικία, το φύλο ή ιστολογικό τύπο (Πίνακας 1).

(Α) Σχετική έκφραση του miR-338-3p σε γαστρικό κυτταρικές σειρές και την αθανατοποιημένη κανονική γαστρικού βλεννογόνου επιθηλιακή κυτταρική σειρά (GES-1) (*

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0.01) ανιχνεύθηκαν με qPCR. (Β) qPCR για έκφραση miR-338-3p διεξήχθη χρησιμοποιώντας 66 περιπτώσεις γαστρικό καρκινικούς ιστούς και συμφωνημένα γειτονικούς ιστούς. Η μέση τιμή και η τυπική απόκλιση έδειξαν (**

P

& lt? 0,01).

Η

2. miR-338-3p είναι επιγενετικώς Σίγαση στο γαστρικός καρκίνος

Όπως επιγενετική αποσιώπηση αποτελεί κοινό μέσο για την προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης των miRNAs [31], [32], αποφασίσαμε να αναλύσουμε την κατανομή νησί CpG στον υποκινητή περιοχή του miR-338-3p από το λογισμικό v1.0 Methyl Primer Express. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπάρχουν νησίδες CpG στο τμήμα (-690 να -241) ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής (TSS). Εξετάσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης των CpG νησίδων στην περιοχή του υποκινητή με μεθυλίωση-ειδική PCR (MSP), που καλύπτει την περιοχή του -366 -576 να (Εικ. 2Α). Με τη χρήση MSP, διαπιστώσαμε ότι το miR-338-3p CpG νησίδα εκτενώς μεθυλιωμένα στις κυτταρικές γραμμές GC σε σχέση με το γαστρικού βλεννογόνου επιθηλιακή κυτταρική σειρά (GES-1). Όπως ήταν αναμενόμενο, η θεραπεία με 5-ΑΖΑ επάγεται σημαντική απομεθυλίωση (Σχ. 2Β). Τα αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα από MSP ανάλυση του miR-338-3p σε ιστούς όγκων GC και συμφωνημένα παρακείμενους ιστούς μη-όγκου που φαίνεται στο Σχ. 2C. Τα ποσοστά μεθυλίωση του miR-338-3p νησιών CpG σε ιστούς όγκων και των παρακείμενων ιστών μη-όγκου από ασθενείς 66 GC ήταν 78,79% και 24,24%, αντίστοιχα (**

P

& lt?. 0.01, Σχήμα 2D) . Όταν υπολογίζεται η καμπύλη Receiver Operating Χαρακτηριστικά και η περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) για μεθυλιωμένα κατάσταση του miR-338-3p σε GC, η AUC ήταν 0,773 ± 0,042, σημαντικά υψηλότερο από εκείνο της μηδενικής υπόθεσης (

P & lt?

0.001), και το διάστημα εμπιστοσύνης 95% ήταν 0,690 να 0.856 (Σχ. 2Ε). Έτσι, η κατάσταση μεθυλίωσης του miR-338-3p νησί CpG θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μια πιθανή μοριακό δείκτη για GC.

(Α) Σχηματική θέσεις των τόπων CpG εντός των CpG νησίδες που περιβάλλουν το miR-338-3p υποκινητή περιοχή. (Β) Ανάλυση MSP για miR-338-3p μεθυλίωση σε κυτταρικές σειρές GC. M: MSP μεθυλίωσης-ειδικών εκκινητών? U: MSP μη μεθυλίωσης-ειδικών εναρκτήρων (C) Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα της MSP ανάλυση του miR-338-3p σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς (Τ) και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών (Ν). (D) επίπεδα μεθυλίωσης του miR-338-3p νησί CpG σε ιστούς όγκων GC και συμφωνημένα παρακείμενες μη καρκινικούς ιστούς σε 66 ασθενείς (78,79% και 24,24%, **

P

& lt? 0,01). (Ε) Η καμπύλη λειτουργικών χαρακτηριστικών δέκτη της κατάστασης μεθυλίωσης του miR-338-3p. Η AUC ήταν 0,773 ± 0,042 (

P

& lt? 0.001), 95% διάστημα εμπιστοσύνης ήταν (0,690, 0,856)

Η

3.. miR-338-3p Αναστέλλει Καρκίνος γαστρικά κύτταρα διάδοσης

Από το miR-338-3p είναι σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε GC, όπως φαίνεται από τα παραπάνω, μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολέας των όγκων. Ως εκ τούτου, είμαστε δίπλα καθοριστεί αν η υπερέκφραση του miR-338-3p στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ανάπτυξη των κυττάρων. Συνθετικό miR-338-3p μιμείται ή αρνητικό μιμείται ελέγχου επιμολύνθηκαν σε SGC-7901 κύτταρα στα οποία το επίπεδο έκφρασης του miR-338-3p είναι το χαμηλότερο, που ακολουθείται από δοκιμασία WST για την παρακολούθηση της ανάπτυξης των κυττάρων.

Η έκτοπη έκφραση του miR-338-3p σε SGC-7901 κύτταρα επιβεβαιώθηκε με qPCR και SGC-7901 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-338-3p μιμείται αυξήθηκε σημαντικά βραδύτερη από ό, τι στην ομάδα ελέγχου (Εικ. 3Α) (*

P

& lt? 0,05, **

P & lt?

0.01). Για να χαρακτηριστεί περαιτέρω η επίδραση του miR-338-3p στην κυτταρική ανάπτυξη, δοκιμασία σχηματισμού αποικίας μαλακού Ager διεξήχθη. Βρήκαμε ότι ο αριθμός των αποικιών από SGC-7901 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-338-3p μιμείται ήταν σημαντικά λιγότερες από εκείνη της ομάδας ελέγχου (Εικόνα 3Β-C.) (**

P

& lt? 0,01) . Συνέπεια, η αναστολή του miR-338 που προκαλείται από τον πολλαπλασιασμό της ΓΓΕ-7901 (Σχ S2 στο αρχείο S1, *

P

& lt?. 0.05). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στην GES-1 κύτταρα ελέγχου (Σχήμα S1 Α-Β στο αρχείο S1, *

P

& lt?. 0.05). Συνοπτικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το miR-338-3p καταστέλλει το ρυθμό ανάπτυξης των δύο κυττάρων GC και γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα

στο

vitro.

Η

(Α) ΓΓΕ- 7901 κύτταρα πολλαπλασιασμού εκτελέστηκαν με την δοκιμασία WST. SGC-7901 κύτταρα επιμολύνθηκαν με miR-338-3p μιμείται ή μιμείται τον έλεγχο σε μια τελική συγκέντρωση 100 δοκιμασίας nM.The WST εκτελέστηκε κάθε 24 ώρες για 4 ημέρες. Τα αποτελέσματα είναι μέσα από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± Τ.Α (*

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01).. (Β-Γ) Η επίδραση του miR-338-3p για SGC-7901 πολλαπλασιασμό των κυττάρων εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. SGC-7901 κύτταρα επιμολυσμένα με 100 ηΜ miR-338-3p μιμείται ή μιμείται τον έλεγχο σπάρθηκαν πάνω σε πλάκες 6 φρεατίων. Ο αριθμός των αποικιών μετρήθηκε σε 14

ης ημέρας μετά την σπορά. (Β) Εκπρόσωπος φωτογραφίες των αποικιών. (Γ) Οι αποικίες μετρήθηκαν. Τα αποτελέσματα ήταν μέσω τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ± S.D. (**

P

& lt? 0,01).

Η

4. miR-338-3p Αναστέλλει τη Μετανάστευση και την εισβολή του GC Cells

in vitro

Η

Με βάση την ιδέα ότι το miR-338-3p χρησιμεύει ως καταστολέας των όγκων του GC, ερευνήσαμε περαιτέρω επιπτώσεις της στην κύτταρο μετανάστευση και εισβολή, μια κρίσιμη καθορισμένη από κακοήθη πρόοδο και μετάσταση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, ο αριθμός των μεταναστευτικών SGC-7901 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-338-3p μιμείται ήταν σημαντικά μικρότερη από ό, τι στην ομάδα ελέγχου (105.00 ± 11.16 vs 145.00 ± 7.00, **

P

& lt?.. 0.01 Σχ 4 Α-Β), και ο αριθμός των επεκτατικών SGC-7901 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-338-3p ήταν σημαντικά μικρότερη σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (41,33 ± 4,04 έναντι 76 ± 10,54, **

P

& lt? 0,01. Σχ. 4 C-D). Συνέπεια, η αναστολή της επαγόμενης miR-338-3p μετανάστευση και την εισβολή του SGC-7901 κύτταρα (Σχ S3 στο αρχείο S1, *

P

& lt?. 0.05). Αντίθετα, miR-338-3p δεν είχε καμία επίδραση στη μετανάστευση των GES-1 (Εικ. S1 Ε στο αρχείο S1), πιθανόν επειδή τα κύτταρα GES-1 δεν έχουν την μετανάστευση και την επεμβατική φύση των καρκινικών κυττάρων. Τα αποτελέσματα αυτά εμφανίζονται ρόλο του miR-338-3p στην αναστολή τόσο της μετανάστευσης και της εισβολής των κυττάρων GC.

(Α) Εκπρόσωπος φωτογραφίες των μεταναστευτικών κυττάρων στη μεμβράνη (μεγέθυνση 100 ×). (Β) Μέση μεταναστευτικών κυττάρων αριθμός τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ± SD (**

P

& lt? 0,01). (C) Εκπρόσωπος φωτογραφίες των μεταστατικών κυττάρων στη μεμβράνη (μεγέθυνση 100 ×). (Δ) Μέσος επεμβατική αριθμό των κυττάρων από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± δ.ϋ. (**

P

& lt? 0,01).

Η

5. miR-338-3p μπορεί να προκαλέσει καρκίνο γαστρικά κύτταρα απόπτωση

Για να διαλευκανθεί ο μηχανισμός του miR-338-3p για ανασταλτική δράση ανάπτυξης GC κυττάρων, ελέγξαμε την ανάλυση της απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αποπτωτική ρυθμός ήταν σημαντικά αυξημένη σε miR-338-3p μιμείται επιμολυσμένα ομάδα σε σύγκριση με τον έλεγχο μιμείται επιμολυσμένα ομάδα (**

P

& lt? 0,01) (Εικ. 5Α-Β). Εξετάσαμε περαιτέρω τα χαρακτηριστικά μορφολογικά απόπτωσης συμπεριλαμβανομένης συμπυκνωμένη χρωματίνη και της πυρηνικής κατακερματισμό της Hoechst χρώση 33342, και επιβεβαίωσε ότι η αποπτωτική ποσοστό αυξήθηκε στο miR-338-3p μιμείται επιμολυσμένα κύτταρα (Εικ. 5C). Συνέπεια, η αναστολή του miR-338 ανέστειλε την απόπτωση των SGC-7901 κύτταρα (Εικ S4 στο αρχείο S1, *

P

& lt?. 0.05). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στους GES-1 κύτταρα ελέγχου (Σχ S1 C-D στο αρχείο S1, **

P

& lt?. 0.01). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υπερέκφραση του miR-338-3p προκαλεί απόπτωση σε κύτταρα GC, τα οποία θα μπορούσαν να συμβάλουν με τις ανασταλτικές ιδιότητες της ανάπτυξης του miR-338-3p.

(Α) Εκπρόσωπος ιστογράμματα που απεικονίζουν την απόπτωση των ΓΓΕ-7901 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με miR-338-3p μιμείται ή μιμείται τον έλεγχο. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΙ και αννεξίνης V-FITC στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. (Β) Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± δ.ϋ. εμφανίζονται (**

P

& lt? 0,01). (C) Εκπρόσωπος ιστογράμματα που απεικονίζουν την πυρηνική μορφολογία της ΓΓΕ-7901 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με miR-338-3p μιμείται ή μιμείται κύτταρα ελέγχου με Hoechst33342 (μεγέθυνση 200 ×).

Η

6. miR-338-3p Αναστέλλει Ογκογονικότητα και αυξάνει την απόπτωση

in vivo

Η

Είμαστε δίπλα ελεγχθεί αν έκτοπη έκφραση του miR-338-3p θα μπορούσε να επηρεάσει την ανάπτυξη και την απόπτωση των γαστρικών όγκων

in vivo .

SGC-7901 κύτταρα επιμολυσμένα με το miR-338-3p φορέα έκφρασης (p

σιλανσιέ

-miR-338-3p) ή ο φορέας ελέγχου (p

σιλανσιέ

-miR -έλεγχος). Οι σταθεροί κλώνοι είτε με p

Silencer

-miR-338-3p ή p

Silencer

επιλέχθηκαν -miR-ελέγχου και ενέθηκαν υποδορίως σε γυμνά ποντίκια, και ο σχηματισμός όγκων παρακολουθήθηκε. SGC-7901 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-ελέγχου έδειξε προοδευτική αύξηση, αλλά ανεστάλησαν όταν έκτοπη έκφραση του miR-338-3p. Μετά από 28 ημέρες, οι γυμνοί ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία, και μετρήθηκαν τα βάρη των όγκων και τον όγκο (Σχ. 6 Α-Ε). Το μέσο βάρος των όγκων που προκύπτουν από pSil ομάδα

encer

-miR-338-3p κυττάρων ήταν σημαντικά μικρότερη από ό, τι οι όγκοι από p

ομάδα σιλανσιέ

της κύτταρα -miR ελέγχου (1200 ± 193,26 mg vs 1800 ± 229,52 mg, **

P

& lt?. 0.01)

(Α-Γ) Οι φωτογραφίες των όγκων που προκύπτουν για pSilencer-miR-338-3p ή pSilencer-φορέα ελέγχου σταθερά επιμολυσμένα ΓΓΕ- 7901 κύτταρα σε γυμνούς ποντικούς. κινητική (D) ανάπτυξη όγκων σε γυμνούς ποντικούς. Οι διάμετροι των όγκων μετρήθηκαν κάθε 7 ημέρες (**

P

& lt? 0,01). (Ε) Μέσο βάρος των όγκων σε γυμνούς ποντικούς. Μέσα ± S.D. είχαν δείξει (**

P

& lt? 0,01). (F) Εκπρόσωπος φωτογραφίες του TUNEL ανάλυση των δειγμάτων όγκου από γυμνά ποντίκια (μεγέθυνση, 200 ×). (G) Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων μετρήθηκε. Μέσοι όροι ± SD (**

P

& lt? 0,01).

Η

Για να εξεταστεί αν η απόπτωση συμβάλλει σε αυτό που παρατηρείται

in vivo

ανάπτυξης όγκου αναστολή κατά miR-338 -3p υπερέκφραση, δοκιμασία TUNEL διεξήχθη στους ιστούς του όγκου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ιστοί όγκου από p

σιλανσιέ

-miR-338-3p περιείχε σημαντικά περισσότερα θετικά κύτταρα χρώση σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (**

P

& lt?. 0.01, Σχήμα 6F-G ). Έτσι, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι miR-338-3p αναστέλλει γαστρική ογκογένεση

in vivo

, τουλάχιστον εν μέρει, με την επαγωγή της απόπτωσης σε situ.

7. miR-338-3p Στόχοι η 3′-UTR του ογκογονιδίου

SSX2IP

Η

Όπως miRNAs συχνά ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων στόχων, ψάξαμε πιθανούς στόχους του miR-338-3p χρησιμοποιώντας online εργαλεία αναζήτησης (π.χ. TargetScan, Microrna.org και PicTar). Τα γονίδια που προβλέπεται από όλα τα προγράμματα που χρησιμοποιούνται θεωρήθηκαν υποψήφιων στόχων του miR-338-3p. Ανάμεσα σε όλες τις επισκέψεις, SSX2IP προκάλεσε την προσοχή μας, προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι SSX2IP είναι μια οξεία μυελοειδή λευχαιμία αντιγόνο που σχετίζεται και ένας πιθανός στόχος ανοσοθεραπεία για λευχαιμία [33] – [35] και την προηγούμενη εργασία μας έδειξε ότι SSX2IP προωθεί την εισβολή και τη μετανάστευση των κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος και συμβάλλει στην αντίσταση χημειοθεραπεία [36].

Μια πιθανή miR-338-3p θέση σύνδεσης είχε προβλεφθεί κατά την 3’UTR του SSX2IP (Εικ. 7Α). Για την επικύρωση αυτή την αλληλεπίδραση, βάζουμε ένα άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο θραύσμα 3’UTR της SSX2IP στον φορέα λουσιφεράσης pMIR-ΕΚΘΕΣΗ. Τα προκύπτοντα κατασκευάσματα συν-επιμολύνθηκαν με miR-338-3p μιμείται ή μιμείται τον έλεγχο σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ, που ακολουθείται από δοκιμασία λουσιφεράσης ανταποκριτή. Η σχετική δραστηριότητα λουσιφεράσης της pMIR /SSX2IP-3’UTR

κ.β., αλλά δεν pMIR /SSX2IP-3’UTR

mut, ήταν σημαντικά καταστέλλεται από miR-338-3p (**

P

& lt?.. 0.01) σε σύγκριση με εκείνη των μιμείται ελέγχου (Σχήμα 7Β), υποδεικνύοντας ότι miR-338-3p συνδέεται άμεσα με την 3’UTR της SSX2IP να λειτουργήσει ως καταστολέας

(Α) Σχηματική γράφημα των υποθετικών θέσεων πρόσδεσης του miR-338-3p στόχο το 3’UTR της SSX2IP. (Β) miR-338-3p μιμείται μειωτικά λουσιφεράσης δραστηριότητες που ελέγχονται από άγριου τύπου 3’UTR του SSX2IP (**

P

& lt? 0.01), αλλά δεν επηρέασε λουσιφεράσης δραστηριότητα ελέγχεται από μεταλλαγμένο 3’UTR της SSX2IP. Τα αποτελέσματα είναι μέσα από τρία ανεξάρτητα πειράματα ± δ.ϋ. (Γ) SSX2IP, κασπάση-3 και Pro-casepase-3 ανιχνεύθηκαν με στύπωμα Western στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με miR-338-3p και ελέγχου μιμείται. (D) SSX2IP mRNA σε ΓΓΕ-7901 κύτταρα αναλύονται με qPCR σε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με miR-338-3p και ελέγχου μιμείται.

Η

Στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση του miR-338-3p για η έκφραση της SSX2IP, μετρώντας τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης SSX2IP μετά την επιμόλυνση SGC-7901 κυττάρων με miR-338-3p ή τον έλεγχο μιμείται. Όπως φαίνεται στο Σχ. 7C-D, miR-338-3p δεν είχε καμία επίδραση στο

SSX2IP

επίπεδο mRNA, όπως μετράται με qPCR, αλλά προκάλεσε σημαντική μείωση του επιπέδου της πρωτεΐνης SSX2IP σε σύγκριση με τον έλεγχο-επιμολυσμένα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-338-3p καταστέλλει την έκφραση του SSX2IP στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο, πιθανόν μέσω της σύνδεσης με την 3’UTR της SSX2IP. Αξίζει να σημειωθεί ότι, βρήκαμε επίσης ότι Capase-3 και procasepase-3, δύο γονίδια σημαντικά την απόπτωση, έχουν μειωθεί αναλόγως (Εικ. 7C).

8. Η έκφραση του miR-338-3p συσχετίζεται αντίστροφα με το επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης στα SSX2IP γαστρικός καρκίνος

miR-338-3p ρυθμίζεται προς τα κάτω σε γαστρικό καρκίνο και SSX2IP υποστηρίζεται σε ένα γονίδιο στόχο του miR-338 -3p, μας προωθείται να εικάζουν ότι SSX2IP θα μπορούσε να είναι η υπερέκφραση του γαστρικού καρκινικούς ιστούς και σε σχέση με συμφωνημένα μη καρκινικούς ιστούς.

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση αντιγόνου SSX2IP αποκάλυψε την κατάσταση της χρώσης για SSX2IP πρωτεΐνη σε ιστούς όγκων και συμφωνημένα μη καρκινικούς ιστούς σε 66 γαστρικό καρκίνο samples.65% (43/66) των γαστρικών καρκινικών ιστών εμφανίζονται αυξημένα immuostaining για SSX2IP πρωτεΐνη σε σύγκριση με συμφωνημένα μη καρκινικούς ιστούς. Συγκεκριμένα, το 84% (31/37) των γαστρικών ιστών καρκίνου εμφανίζονται αυξημένα ανοσοχρώση σε δείγματα GC του miR-338-3p ομάδα χαμηλής έκφρασης, ενώ τα δεδομένα είναι 41% (12/29) στην miR-338-3p ομάδα υψηλού έκφρασης. Έτσι, η ανάλυση της έκφρασης του miR-338-3p και SSX2IP στο γαστρικό καρκινικούς ιστούς επιβεβαίωσε την ύπαρξη αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του miR-338-3p και γονίδιο στόχο SSX2IP του (Πρόσωπο Chi-square test:

P

& lt? 0.001, Spearman Συσχέτιση:.. r = -0,442,

P

& lt? 0.001, Εικόνα 8)

(Α) Ανοσοϊστοχημική ανάλυση έδειξε ότι η αυξημένη έκφραση του SSX2IP ήταν πιο συχνά παρατηρείται σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς στο miR-338-3p ομάδα χαμηλής έκφρασης και αντίστροφα. Όγκου & gt? Μη-όγκου (SSX2IP) σημαίνει υπερέκφραση του SSX2IP στον ιστό του όγκου GC σε σχέση με συμφωνημένα μη καρκινικό ιστό, και το αντίστροφο. (Β) Εκπρόσωπος φωτογραφίες του ανοσοϊστοχημική ανάλυση των SSX2IP σε ζεύγη καρκινικών ιστών GC /μη-όγκου (μεγέθυνση, 200 ×).

Η

9. Έκτοπη έκφραση της SSX2IP Διασώζει φαινοτύπων που προκαλούνται από την υπερβολική παραγωγή miR-338-3p στο GC κύτταρα

Αν SSX2IP είναι ένας κύριος στόχος καταστέλλεται από miR-338-3p σε GC, έκτοπη έκφραση της SSX2IP θα πρέπει να διασώσει τους φαινοτύπους που προκαλείται από miR-338-3p πάνω σε κύτταρα GC. Για να δοκιμαστεί αυτή η ιδέα, και φορέα έκφρασης SSX2IP ή κενό φορέα ήταν μεμονωμένα επιμολύνθηκε σε SGC-7901, που ακολουθείται από κυτταρολογική δοκιμασίες για να μετρηθεί ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, μετανάστευση, εισβολή και την απόπτωση. Όπως ήταν αναμενόμενο, η υπερέκφραση του SSX2IP μερικώς ή πλήρως αναστρέφει την ανασταλτική δράση των miR-338-3p σε κύτταρα GC κάθε πτυχή εξετάσαμε (Εικ. 9 Α-Δ). Από την άλλη πλευρά, SSX2IP δεν έχει καμία επίδραση στην έκφραση του miR-338-3p (Εικ. S5 σε File S1). Έτσι, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η λειτουργία του καρκίνου του καταστολέα του miR-338-3p σε GC είναι τουλάχιστον εν μέρει μέσω της καταστολής του γονιδίου-στόχου SSX2IP του.

πολλαπλασιασμού (Α) SGC-7901 κυττάρων πραγματοποιήθηκε με τη δοκιμασία WST.

Υποστήριξη στοιχεία πληροφοριών. Εικόνα S1. Εικόνα S2. Εικόνα S3. Εικόνα S4. Εικόνα S5.