Αφηρημένο

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ), ένα σπάνιο πληθυσμό σε οποιοδήποτε τύπο καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου, είναι ογκογόνο. Έχει θεωρηθεί ότι ΚΕΠ είναι υπεύθυνοι για υποτροπή του καρκίνου, της μετάστασης, και της αντίστασης στα φάρμακα. Απομόνωση ΚΕΠ σε καρκίνους του παχέος εντέρου είναι δύσκολο, και ως εκ τούτου ο μοριακός μηχανισμός που ρυθμίζει την αυτο-ανανέωση και διαφοροποίηση των ΚΕΠ παραμένει άγνωστη. Καλλιεργήσαμε DLD-1 κύτταρα, μία από τους τύπους κυττάρων που προέρχονται από καρκίνους του παχέος εντέρου, σε μέσο ελεύθερο ορού για τη λήψη κυττάρων σφαιροειδής. Αυτά τα κύτταρα κατείχαν τα χαρακτηριστικά των ΚΕΠ, με την έκφραση του CD133, CD166, Lgr5, και ΑΙ_ϋΗ1, υψηλότερες ικανότητες του χημειο-αντίσταση, η μετανάστευση, εισβολή, και ογκογονικότητα

in vitro

και

in vivo

από τα προσκολλημένα κύτταρα DLD-1. Krüppel-όπως παράγοντα 4 (KLF4) αποτελεί ουσιαστικό παράγοντα για τη διατήρηση της αυτο-ανανέωσης των ενήλικων και των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων. Έχει χρησιμοποιηθεί για την επαγωγή πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα (iPS) από σωματικά κύτταρα. Από KLF4 εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα κόλου, διερευνήσαμε το ρόλο της στην σφαιροειδές κύτταρα που απομονώθηκαν από κύτταρα DLD-1 και διαπίστωσαν ότι KLF4 υπερεκφράστηκε μόνο σε σφαιροειδές κύτταρα και μειώνοντας την έκφραση του KLF4 με βραχεία φουρκέτα RNA μειώθηκε σημαντικά τις ικανότητες των κυττάρων αυτών να αντισταθούν στις χημικές ουσίες, μεταναστεύουν, εισβάλλουν και δημιουργούν όγκους

in vitro

και

in vivo

. Τα κύτταρα σφαιροειδές με μειωμένη έκφραση KLF4 είχε επίσης μειωμένη έκφραση των ΚΕΠ δείκτες και δείκτες μεσεγχυματικών. Στο σύνολό τους, καλλιεργώντας DLD-1 κύτταρα σε μέσο χωρίς ορό εμπλουτίζει ΚΕΠ και η έκφραση του KLF4 είναι απαραίτητη για τα χαρακτηριστικά των ΚΕΠ σε DLD-1? έτσι KLF4 μπορεί να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Leng Z, Τάο Κ, Xia Q, Tan J, Yue Ζ, Chen J, et al. (2013) Krüppel-όπως Παράγοντας 4 Ενεργεί ως ογκογονίδιο στον Καρκίνο του παχέος εντέρου Βλαστικών Κυττάρων-Εμπλουτισμένο σφαιροειδές κύτταρα. PLoS ONE 8 (2): e56082. doi: 10.1371 /journal.pone.0056082

Επιμέλεια: Xin Yuan-Γκουάν, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 7, Δεκεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: 3 Ιαν. 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Leng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα κρατικών για τις Φυσικές Επιστήμες της Λαϊκής Δημοκρατίας της Κίνας 81071541 /άστρο H1504 (για να HZ) [https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm]. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και την ανάλυση ημερομηνία, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η κοινή αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο [1], [2]. Οι τρέχουσες θεραπείες, συμπεριλαμβανομένης της χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία, έχουν σχεδιαστεί να στοχεύουν όλα τα κύτταρα του όγκου. Η επιτυχία αυτών των θεραπειών παρεμποδίζεται σοβαρά κυρίως λόγω της ύπαρξης των καρκινικών κυττάρων θεραπεία ανθεκτικών, οι οποίες είναι σε θέση να αναπτύξουν σε ολόκληρο τον καρκίνο του παχέος εντέρου μετά θεραπείες [3]. Έχει θεωρηθεί ότι αυτά τα κύτταρα είναι καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ), τα οποία έχουν την ικανότητα να αυτο-ανανέωση και διαφοροποιούνται σε όλους τους τύπους κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου [4]. CSCs υπάρχουν σε διάφορους τύπους καρκίνων. Είναι σπάνια σε καρκίνους, αλλά πολύ ογκογόνα και επίσης υπεύθυνη για την εξέλιξη του καρκίνου. Όταν μεταμοσχεύθηκαν σε ποντίκια με ανοσοανεπάρκεια, ΚΕΠ δείχνουν υψηλή tumorigenecity. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι τα ΚΕΠ είναι κύτταρα υπεύθυνα για υποτροπή του καρκίνου, της μετάστασης, και της αντίστασης στα φάρμακα [5], [6]. Ως εκ τούτου, μια αποτελεσματική θεραπεία για τη θεραπεία του καρκίνου απαιτεί να στοχεύσετε αποτελεσματικά ΚΕΠ στον καρκίνο [7].

ΚΕΠ σε διάφορους τύπους καρκίνων διαθέτουν ειδικούς δείκτες επιφάνειας που επιτρέπουν στους επιστήμονες να τα απομονώσουν. Στον καρκίνο του παχέος εντέρου, ΚΕΠ είναι θετικές για CD133 +, CD44 +, CD166, Lgr5, ΑΙ_ϋΗ1, και του ESA. ΚΕΠ του παχέος εντέρου έχουν επίσης την ικανότητα να απελάσει χρωστική Hoechst 33342 [8] – [19]. Ωστόσο, οι ΚΕΠ είναι πολύ σπάνιες, και σε πολλές περιπτώσεις, δεν μπορούν να ανιχνευθούν. Έτσι, η απομόνωση των ΚΕΠ σε καρκίνους του παχέος εντέρου βασίζεται σε δείκτες επιφάνειας τους καθίσταται εξαιρετικά δύσκολη [20].

ΚΕΠ σε μερικές καρκινικές κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του παχέος εντέρου, μπορεί να απομονωθεί με καλλιέργεια κυττάρων σε μέσο άνευ ορού για να σχηματίσουν σφαίρες. Σε αυτή την κατάσταση, σφαιροειδές κύτταρα, τα οποία εκφράζουν «βλαστική ικανότητα» που σχετίζονται με τα γονίδια και έχουν υψηλή ικανότητα να μεταναστεύουν, εισβάλλουν και δημιουργούν όγκους [20], [21], [22], [23]. Στο μέσο χωρίς ορό, πολλοί ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων HCT116, ΗΤ29, LOVO, SW480 και DLD-1 κυτταρική γραμμή, μπορεί να σχηματίσει σφαίρες [22].

Οι μηχανισμοί με τους οποίους ΚΕΠ από διάφορους τύπους των καρκίνων διατηρήσει «βλαστική ικανότητα» τους έχουν μελετηθεί εκτενώς. Η ικανότητα της αυτο-ανανέωση είναι ζωτικής σημασίας για την ΚΕΠ διατήρηση και την υποτροπή του καρκίνου [12], [23], [24], [25], [26], [27] KLF4 είναι απαραίτητο να διατηρηθεί το χαρακτηριστικό των ΚΕΠ και που απαιτούνται για την η ικανότητα να μεταναστεύουν και να εισβάλλουν στον καρκίνο του μαστού [28]. Πολλές ομάδες ανέφεραν ότι η KLF4 εκφράζεται και λειτουργεί ως καταστολέας όγκων σε καρκίνο του παχέος εντέρου [29], [30], [31], [32]. Ωστόσο, όπως αναφέρθηκε, το μεγαλύτερο μέρος των κυττάρων του όγκου δεν είναι σε θέση να παράγουν νέα κύτταρα. Ενώ ΚΕΠ μπορούν να αναγεννηθούν όλα τα είδη κυττάρων του όγκου μέσω των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με τη συμπεριφορά τους και να προκαλέσει το υποτροπή του καρκίνου [6]. Έτσι, ΚΕΠ και το μεγαλύτερο μέρος των καρκινικών κυττάρων είναι εξαιρετικά ετερογενής. Αυτές οι μελέτες δεν έκανε διάκριση ΚΕΠ του παχέος εντέρου από τα χύμα καρκινικά κύτταρα.

KLF4 είναι ένας παράγοντας δάκτυλο ψευδαργύρου μεταγραφής. Έχει αποδειχθεί ότι KLF4 ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση, και το μεταβολισμό των κυττάρων και thymocyto λαγηνοειδών κόλον, αντίστοιχα [33], [34]. Σε ποντικού, KLF4 είναι απαραίτητη για την αυτο-ανανέωση των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων [35]. KLF4 χρησιμοποιείται επίσης για να επαναπρογραμματίσει ινοβλάστες ποντικού για πολυδύναμα βλαστοκύτταρα, υπονοώντας το ρόλο της KLF4 στη διατήρηση των χαρακτηριστικών των βλαστικών κυττάρων [36]. Σημαντικά, τα φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα επιδεικνύουν κοινά χαρακτηριστικά με τον καρκίνο βλαστικά κύτταρα, θα είναι επίσης σημαντικό να καθοριστεί εάν παρόμοια ρύθμιση συμβαίνει σε βλαστικά κύτταρα και καρκινικά βλαστικά κύτταρα. Έτσι, αν KLF4 εκφράζεται σε ΚΕΠ του παχέος εντέρου και των λειτουργιών της KLF4 στον καρκίνο του παχέος εντέρου θα πρέπει να αντιμετωπιστούν.

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε τις πιθανές ρόλους των KLF4 στο ΚΕΠ εμπλουτισμένα κύτταρα σφαιροειδές. Πρέπει πρώτα καλλιεργημένα κύτταρα DLD-1 σε μέσο άνευ ορού για να πάρετε σφαιροειδής κυττάρων που έχουν τα χαρακτηριστικά των ΚΕΠ, και στη συνέχεια ζητήσαμε αν KLF4 είχαν υπερεκφράζεται σε κύτταρα σφαιροειδές και κατά πόσον μειωμένη έκφραση KLF4 σε σφαιροειδή κύτταρα θα διαταράξει τα χαρακτηριστικά τους.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα του Πανεπιστημίου της Huazhong Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας (Αριθμός Άδειας: S255). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις διεξήχθη κάτω από ένα μίγμα κεταμίνης και χλωροπρομαζίνη αναισθησία, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

τηλέφωνα Γραμμές

Ανθρώπινο καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές DLD-1, SW480, SW620, LOVO και ανθρώπινου κόλου φυσιολογικό επιθήλιο FHC κυτταρική γραμμή ήταν εμπορικές πηγές, και το μέσο από κάθε κυτταρική σειρά αποφασίσθηκε σύμφωνα με την Αμερικανική συλλογή τύπου καλλιέργειας (ATCC) ή με τη δημοσιευμένη αναφορά. DLD-1, SW620 και SW480 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 (Hyclone) πλήρες μέσο [37]. Άλλες κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου, HCT116 και ΗΤ29 προσεφέρθησαν ευγενώς από τον Dr LIU και καλλιεργήθηκαν σε McCoy 5Α (Sigma) πλήρες μέσο [38]. Ανθρώπινα κύτταρα κόλου FHC φυσιολογικό επιθήλιο αναπτύχθηκαν σε DMEM /F12 (Hyclone) πλήρες μέσο. κύτταρα LOVO καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Hyclone) πλήρες μέσο [39].

Η καλλιέργεια σφαίρα διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Εν συντομία, η κάθε γραμμή κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου αναπτύχθηκαν σε μια πυκνότητα 2 χ 10

6 κύτταρα /ml σε DMEM μέσο ελεύθερο ορού /F12 που περιέχει 20 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF, PeproTech), 10 ng /ml βασικού αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (bFGF, PeproTech), 5 μg /ml ινσουλίνη (Sigma), 0.4% αλβουμίνη βόειου ορού (Amresco), και 2% Β27 (Invitrogen). Για να σφαίρες πέρασμα, τις συλλέξαμε από φυγοκέντρηση τους σε 73 g για 5 λεπτά. Σφαίρες διαχωρίστηκαν σε μονά κύτταρα χρησιμοποιώντας πέψη με θρυψίνη. Μεμονωμένα κύτταρα σφαιροειδή αναπτύχθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C και 5% CO2.

Απομόνωση CD133 + και CD133- Cells

CD133 + και τα κύτταρα CD133- απομονώθηκαν από καλλιέργεια κυττάρων με μαγνητική διαλογή σφαιριδίων χρησιμοποιώντας το σύστημα MACS (Miltenyi Biotech) ή με FACS [12], [40]. Και για τις δύο διαχωρισμούς, τα κύτταρα επωάστηκαν με το μονοκλωνικό CD133 /2-ΡΕ (Miltenyi Biotech) επί 15 λεπτά στους 4 ° C. Για μαγνητικό διαχωρισμό, τα κύτταρα επιλέγονται από τις στήλες MS (Miltenyi Biotech), η οποία διατήρησε θετικά κύτταρα συνδέονται με σφαιρίδια. Για το διαχωρισμό FACS, CD133 /2-ΡΕ χρωματισμένα κύτταρα ταξινομήθηκαν με το όργανο BD FACSCanto II κυτταρομετρητή ροής (BD Bioscience), και ο ισότυπος IgG2b (Miltenyi Biotech) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

λεντοϊών Λοίμωξη του σφαιροειδούς κύτταρα

Οι φορείς λεντοϊών που φέρουν KLF4 shRNA (NM004235.3, 1582-1610) ή ένα κωδικοποιημένο μη στόχους shRNA αγοράστηκαν από τη Σαγκάη GeneChem Co., Ltd. Τα κύτταρα μολύνθηκαν σφαιροειδή σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Real-time PCR

Σύνολο mRNAs εκχυλίστηκαν από τα κύτταρα και στη συνέχεια αντίστροφα μεταγράφονται σε cDNAs με PrimeScript RT Master Mix (Takara, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για τη μέτρηση των επιπέδων του mRNA των γονιδίων σε κάθε δείγμα, χρησιμοποιήθηκε παρεμβολής που βασίζεται σε πραγματικού χρόνου PCR. Αφυδρογονάση 3-phpsphate-αφυδρογονάση (GAPDH) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Η PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε με SYBR Green Master Mix (Takara, Ιαπωνία) στο σύστημα ™ PCR πραγματικού χρόνου StepOnePlus (Applied Biosystems, USA). PCR ενίσχυση των γονιδίων διεξήχθη κάτω από τις συνθήκες: μετουσίωση στους 95 ° C για 30 s, ανόπτηση στους 60 ° C για 60 s, και επεκτάθηκε στους 95 ° C για 5 s? αντιδράσεις διεξήχθησαν επί 45 κύκλους. Για κάθε δείγμα, οι αντιδράσεις αναπαραχθεί και το μέσο επίπεδο του mRNA του κάθε γονιδίου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCt μέθοδο. Τα ζεύγη εκκινητών για τη μέτρηση των επιπέδων του κάθε γονιδίου παρατίθενται στον Πίνακα S1.

ανοσοφθορισμού χρώσης

Εκφράσεις του CD133, KLF4, Ε-καδερίνης, και βιμεντίνης σε κύτταρα μονοστιβάδας και σφαίρες ήταν επίσης αναλύθηκαν με την τεχνική ανοσοφθορισμού. Για τη διεξαγωγή ανάλυση ανοσοφθορισμού, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε κατάλληλο μέσο σε γυάλινες καλυπτρίδες-για 16 ώρες πριν σταθεροποιήθηκαν με 2% παραφορμαλδεΰδη στους 37 ° C για 15 λεπτά. Σταθερή κύτταρα στη συνέχεια διαπερατά με 0,1% Triton Χ-100 σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά ακολουθούμενη από επώαση στους 4 ° C για όλη τη νύχτα με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: CD133 /2 (Miltenyi Biotec), Ε-καδερίνης (Santa Cruz Biotec), βιμεντίνης (Cell Signaling Technology), και KLF4 (Santa Cruz Biotec), αντίστοιχα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με ΡΕ- ή ΡΙΤΟ-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (Boster) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Αυτές οι πλάκες στη συνέχεια τοποθετείται με Prolong Χρυσό με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλιο (ϋΑΡΙ, Invitrogen). Φθορισμού εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας την Olympus IX71 επιφθορισμού (Olympus, Japan).

Ανάλυση Western Blot

εκχυλίσματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε διάφορες συγκεντρώσεις πήγματα SDS-πολυακρυλαμιδίου, ανάλογα με τα αναμενόμενα μεγέθη των μετρούμενων πρωτεΐνες και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Millipore, USA). Μετά αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα και 0,1% Tween 20 σε TBS επί 1 ώρα, η μεμβράνη στη συνέχεια επωάστηκε στους 4 ° C για όλη τη νύχτα με τα πρωτεύοντα αντισώματα ακολουθούμενη από επώαση με δευτερογενή αντισώματα κατσίκας αντι-κουνελιού. Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιούνται στην παρούσα ανάλυση είναι: αντι-Ε-καδερίνης κουνέλι, κουνέλι αντι-βιμεντίνης, κουνελιού αντι-ΖΟ-1, και κουνελιού αντι-Σαλιγκάρι (Cell Signaling Technology)? κουνελιού αντι-KLF4 και κουνελιού αντι-Lgr5 (Santa Cruz Biotec).

Χημειοθεραπεία Ευαισθησία και Αντίσταση Δοκιμασία

Η ευαισθησία του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα σε 5-FU αναλύθηκε χρησιμοποιώντας CCK-8 κιτ δοκιμασίας (Dojindo, μοριακή technolonies, Inc, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 2.000 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο πλακών 96 φρεατίων που περιέχουν μέσο ανάπτυξης συμπληρωμένο με διάφορες συγκεντρώσεις της 5-FU (Sigma) και επωάστηκαν στους 37 ° C και 5% CO

2 σε υγροποιημένη κατάσταση επί 48 ώρες. Η απορρόφηση εκάστου φρεατίου αναγνώσθηκε στα 450 nm σε μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας. Το ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων υπολογίστηκε ως εξής: α. Η απορρόφηση του πειράματος /απορρόφησης του ελέγχου χ 100%

Annexin-V APC /ΡΙ Διπλό Επισήμανση

κυττάρων συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα (PBS) και χρωματίστηκαν με αννεξίνη V-APC (Keygen, Κίνα) και ΡΙ (Sigma) και τα δύο για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλα τα χρωματισμένα κύτταρα εξετάστηκαν στη συνέχεια με τη χρήση οργάνου BD FACSCanto II κυτταρομετρητή ροής (BD Bioscience).

Soft Agar Δοκιμασία

Soft δοκιμασία άγαρ διεξήχθη για σφαιροειδές κύτταρα όπως περιγράφεται προηγουμένως [41]. Εν συντομία, κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 6-φρεατίων φορτώθηκε με 2 mL 0.5% άγαρ (β /ο) σε RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% FBS ως βάση. Μετά τον πολυμερισμό του άγαρ βάσης, 1 × 10

4 κύτταρα που αναμίχθηκαν σε 2 mL 0.375% άγαρ (β /ο) προστέθηκαν σε RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% FBS. Οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν σε ένα υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C και 5% CO

2 για 2 εβδομάδες πριν από αποικίες μετρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν.

Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

δοκιμασία σχηματισμού αποικίας διεξήχθη για προσκολλημένα κύτταρα DLD-1 όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27]. Εν συντομία, απλά κύτταρα (2000 κύτταρα ανά φρεάτιο) επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 2 εβδομάδες. Μετά από χρώση με ιώδες, τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν και αναλύθηκαν για πολλαπλασιασμό και αποικία αποτελεσματικότητα σχηματισμού τους. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον τρεις φορές.

κυτταρική μετανάστευση και εισβολή Δοκιμασία

Μετανάστευση και δοκιμασία εισβολής διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [42]. Εν συντομία, 10

6 κύτταρα απλώθηκαν σε καλλιέργεια κυττάρων ένθετα με 8 μm μικροπορώδη φίλτρα (BD Bioscience) επικαλύπτονται με (εισβολή) ή χωρίς (μετανάστευση) matrigel (Sigma) και επωάστηκαν για 20 ώρες, αντίστοιχα. Οι μετανάστευσαν ή εισέβαλαν κύτταρα βάφτηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν σε πέντε τυχαία πεδία. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

In vivo

Ογκογένεση

Τα κύτταρα ελήφθησαν από κατεργασία με θρυψίνη συγκομίζονται σφαίρες. Διάφορες ποσότητες κυττάρων (1 × 10

4, 5 × 10

4, 1 × 10

5, 5 × 10

5, ή 1 × 10

6 κύτταρα) σε 200 μl PBS υποδορίως μεταμοσχευθεί σε 4- έως 6-εβδομάδων αθυμικοί γυναίκα, Balb /c ηυ /ηυ ποντίκια (Πεκίνο HFK Bioscience). Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε κάθε 4 ημέρες χρησιμοποιώντας παχύμετρο. Ο όγκος κάθε όγκου καθορίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο: μήκος Χ πλάτος

2 χ 0,5. Όλες οι εργασίες ζώο είχε διεξαχθεί σύμφωνα με την guidline της Επιτροπής Δεοντολογίας της Huazhong Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας (S255). Οι ποντικοί στεγάστηκαν σε ένα συγκεκριμένο παθογόνο-free, περιβαλλοντικά ελεγχόμενες εγκατάσταση. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν με ένεση πεντοβαρβιτάλης ενδοπεριτοναϊκή νάτριο και τα μοσχεύματα απομακρύνθηκαν όταν οι όγκοι έφθασαν σε μήκος 2,0 cm, ή 60 ημέρες μετά την ένεση, κάθε φορά που ήταν η πρώτη [41]. Συγκομιδής όγκοι παρασκευάστηκαν για ιστοπαθολογική ανάλυση.

Ιστοπαθολογική Ανάλυση

Οι όγκοι συλλέχθηκαν και μονιμοποιήθηκαν σε 4% φορμαλίνη για 24 ώρες πριν από ενσωματωμένα σε παραφίνες. Ελήφθησαν τμήματα (2,5 μm) και χρωματίστηκαν με Η &? Ε. Εικόνες ελήφθησαν με την Olympus IX71 (Όλυμπος, Ιαπωνία).

Στατιστική Ανάλυση

Κάθε πείραμα διεξήχθη τουλάχιστον τρεις ανεξάρτητες μελέτες. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός μαθητή

t-test

, όπου

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Δημιουργία σφαιροειδές κύτταρα από καρκίνο του παχέος εντέρου Κυτταρικές Γραμμές

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν HCT116 και τον καρκίνο του κόλου ΗΤ29 κύτταρα σχηματίζουν σφαίρες όταν καλλιεργούνται σε μέσο άνευ ορού και τα κύτταρα σφαιροειδείς διαθέτει τα χαρακτηριστικά του ΚΕΠ [22], [43], [44]. Ζητήσαμε αν HCT116, τα κύτταρα ΗΤ29, SW620, SW480, LOVO, και DLD-1 θα μπορούσε να σχηματίσει σφαίρες όταν καλλιεργούνται σε μέσο χωρίς ορό, αντίστοιχα. Κύτταρα από κάθε κυτταρική γραμμή καλλιεργήθηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

6 /ml σε μέσο χωρίς ορό. Την ημέρα 3, θα μπορούσαμε να δούμε σχηματισμός σφαίρα από HCT116, ΗΤ29, SW620, LOVO, και DLD-1, αλλά όχι από SW480 (σχήμα 1 και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι σφαίρες αυξηθεί σε μέγεθος κατά μήκος του χρόνου. Επιπλέον, τα κύτταρα σφαιροειδές στους τομείς θα μπορούσαν να περνιούνται για περισσότερο από 25 φορές χωρίς απώλεια οποιωνδήποτε χαρακτηριστικών δοκιμαστεί κάτω, υποδεικνύοντας ότι θα μπορούσαν να έχουν την ικανότητα να αυτο-ανανέωση. Επειδή τα κύτταρα DLD-1 σχηματίζουν σφαίρες πιο εύκολα από άλλες γραμμές του καρκίνου του παχέος εντέρου δοκιμάστηκαν παραπάνω, χρησιμοποιήσαμε επικεντρώθηκε μόνο στις DLD-1 κυττάρων σε πειράματα που ακολουθούν. Για βολικό μας περιγραφή, έχουμε ορίσει τα κύτταρα σφαιροειδές από DLD-1 ως DLD-S.

ΗΤ29, HCT116, SW620, LoVo, και τα κύτταρα DLD-1 θα μπορούσε να αποτελέσει μεγάλο στρογγυλό, ασύνδετος κυμαινόμενο colonsphere 50-100 μm όταν καλλιεργείται σε SFM (όπως φαίνεται στην ομάδα DLD-1). Ενώ SW480 δεν μπορούσε.

Η

Χαρακτηρισμός σφαιροειδές κύτταρα

Ζητήσαμε πρώτα αν DLD-S εξέφρασε τις επιφανειακές δείκτες των ΚΕΠ του καρκίνου του παχέος εντέρου και του πυρήνα των κυττάρων γονίδια του στελέχους. Βρήκαμε ότι η έκφραση των βασικών βλαστικών κυττάρων γονίδια όπως Oct4 /3, Sox2 και Nanog και τα γονίδια σήμανσης της ΚΕΠ του παχέος εντέρου, όπως CD133, CD166, Lgr5, και ΑΙ_ϋΗ1 αυξήθηκαν σε κύτταρα DLD-S σε σύγκριση με την έκφραση τους επίπεδα σε DLD-1 (Εικόνα 2Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι τα κύτταρα σφαιροειδές μπορεί να έχουν υψηλό ποσοστό των ΚΕΠ.

(Α) Η έκφραση του CD133, CD166, Lgr5, ΑΙ_ϋΗ1 και βλαστικών κυττάρων πυρήνα γονίδια Oct4 /3, Sox2 και Nanog σε σφαιροειδή κύτταρα ρυθμίστηκαν προς τα πάνω σε σύγκριση με DLD 1-προσκολλημένα κύτταρα. (Β) Περισσότερο κύτταρα σφαιροειδή ήταν προφανώς παρατηρήθηκαν σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα τους DLD-1, αναλύθηκε χρησιμοποιώντας μετανάστευση transwell και δοκιμασία εισβολής, αντίστοιχα. (Γ) όπως αξιολογήθηκε με δοκιμασία μαλακού άγαρ και προσδιορισμό σχηματισμού αποικίας, τα σφαιροειδή κύτταρα εμφανίζουν μεγαλύτερη ικανότητα σχηματισμού αποικίας. (D), όπως αξιολογείται με την δοκιμασία CCK8, ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων σφαιροειδούς αυξάνεται σε σύγκριση με προσκολλημένα κύτταρα σε διάφορες συγκεντρώσεις της 5-FU. (Ε) όπως αξιολογήθηκε με το μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού, τα κύτταρα σφαιροειδές είχαν υψηλότερη ογκογόνο ικανότητα από ό, τι η μητρική τους κύτταρα DLD-1. * P & lt?. 0.05

Η

Στη συνέχεια διερευνήθηκε η κακοήθη προφίλ των κυττάρων DLD-S, περιλαμβανομένης της ικανότητάς τους να μεταναστεύουν και να εισβάλλουν, να σχηματίσουν αποικίες, να ανταποκριθεί σε 5-FU, και να δημιουργήσει όγκους σε ποντίκια ανοσοανεπάρκειας. Χρησιμοποιώντας φρεατίων δοκιμασία μετανάστευση /την εισβολή, βρήκαμε ότι τα κύτταρα DLD-S είχαν σημαντικά μεγαλύτερη ικανότητα να μεταναστεύουν και να εισβάλλουν Matrigel επικαλυμμένα με ένθετα από τις μητρικές τους κύτταρα, DLD-1, το έκανε (Εικόνα 2Β).

Χρησιμοποιώντας μαλακό άγαρ δοκιμασία και δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, βρήκαμε ότι η DLD-S είχαν σημαντικά υψηλότερο ικανότητα σχηματισμού αποικιών από τις μητρικές τους κύτταρα, DLD-1 (Σχήμα 2C).

για να ελέγξετε την ευαισθησία της DLD-S σε χημειοθεραπεία, θα αντιμετωπίζονται κυττάρων με 5-FU σε διάφορες συγκεντρώσεις. Τα ποσοστά επιβίωσης των DLD-S και DLD-1 σε μέσο ανάπτυξης με ίδια συγκέντρωση 5-FU συγκρίθηκαν, και βρήκαμε ότι DLD-S είχαν σημαντικά υψηλότερο ποσοστό επιβίωσης σε δοκιμή συγκεντρώσεις 5-FU από τις μητρικές τους κύτταρα, DLD- 1 κύτταρα έκαναν, υποδεικνύοντας ότι DLD-S ήταν πιο ανθεκτικά στην χημειοθεραπεία (Σχήμα 2D).

Τέλος, διερευνήθηκε η ογκογονική ικανότητα των κυττάρων DLD-S

in vivo

. Διάφορα ποσό της DLD-S ή DLD-1 (1 × 10

4, 5 × 10

4, 1 × 10

5, 5 × 10

5, ή 1 × 10

6 κύτταρα) εγχύθηκαν υποδόρια σε Balb /c ποντίκια ηυ /ηυ και ποντίκια με σχηματισμό όγκου μετρήθηκαν στις 60 ημέρες μετά τη μεταμόσχευση των κυττάρων. Βρήκαμε ότι τα κύτταρα DLD-S είχαν υψηλότερα ογκογόνο ικανότητά από τις μητρικές τους κύτταρα, DLD-1 (Πίνακας S2). Ένα ποντίκι που μεταμοσχεύονται με 1 × 10

5DLD-S ή κυττάρων σε 60 ημέρες 1 DLD-δείχθηκε στο Σχήμα 2Ε.

Έκφραση KLF4 σε καρκίνο παχέος εντέρου Κύτταρα και ΚΕΠ εμπλουτισμένο Πληθυσμοί

Πρέπει πρώτα προσπάθησε να επιβεβαιώσει ότι οι εκφράσεις του KLF4 σε διάφορες καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές ήταν χαμηλότερα από τα φυσιολογικά επιθηλιακά παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές, όπως έχει ήδη αναφερθεί [45]. Τα επίπεδα έκφρασης του KLF4 σε SW620, ΗΤ29, SW480, HCT116, DLD-1, και κυτταρικές σειρές καρκίνου ανθρώπινου κόλον LOVO, καθώς και FHC, ένα φυσιολογικό κύτταρο γραμμή επιθηλιακού κόλον, αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου και ανάλυση Western blotting. Όπως αναμενόταν, η KLF4 εκφράστηκε σε όλες τις εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές και τα επίπεδα του mRNA (Σχήμα 3Α) και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 3Β και 3C) σε αυτές τις κυτταρικές σειρές καρκίνου ήταν σημαντικά χαμηλότερες από την κυτταρική γραμμή FHC.

(Α) όπως αξιολογήθηκε με πραγματικού χρόνου PCR, η έκφραση του KLF4 σε αρκετές κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου ήταν σημαντικά χαμηλότερη από την κανονική κυτταρική σειρά επιθηλιακών κόλον. (Β και Γ) όπως εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western, η έκφραση του KLF4 σε αρκετές κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου ήταν σημαντικά χαμηλότερη από την κανονική κυτταρική σειρά επιθηλιακών κόλον. (D) Η έκφραση του KLF4 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σφαιροειδές κύτταρα από ό, τι σε DLD-1, ΗΤ29, HCT116 προσκολλημένα κύτταρα όπως εκτιμήθηκε με πραγματικού χρόνου PCR και Western blot-, αντίστοιχα (όπως φαίνεται στην ομάδα DLD-1). (Ε), όπως αξιολογείται με πραγματικού χρόνου PCR, η έκφραση του KLF4 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε κύτταρα CD133 + από ό, τι σε CD133-κύτταρα από DLD-1. * Ρ & lt?. 0.05

Η

Στη συνέχεια συνέκριναν τα επίπεδα έκφρασης του KLF4 σε σφαιροειδές κύτταρα και προσκολλημένα κύτταρα του DLD-1, ΗΤ29 και κύτταρα HCT116, και διαπιστώθηκε ότι τα επίπεδα του mRNA και η πρωτεΐνη του KLF4 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σφαιροειδές κύτταρα από ό, τι σε προσκολλημένα κύτταρα (Σχήμα 3D και ημερομηνία δεν παρουσιάζεται). Εμείς ταξινομούνται περαιτέρω CD133 + και κυττάρων CD133- από τα κύτταρα DLD-1 από την τεχνολογία MACS διαχωρισμού και μετρήθηκαν τα επίπεδα mRNA σε δύο υποομάδες των κυττάρων DLD-1 χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου. Παρατηρήσαμε ότι το επίπεδο mRNA του KLF4 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε κύτταρα CD133 + από ό, τι CD133- κύτταρα (Σχήμα 3Ε). Η έκφραση του CD133 και KLF4 σε κύτταρα DLD-S επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με ανοσοφθορισμού χρώση (Σχήμα 4). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι KLF4 είναι πολύ πιθανό να εκφράζεται σε CD133 + υποπληθυσμό και DLD-1 κύτταρα προερχόμενα από σφαιροειδές, η οποία εμπλουτίζεται ΚΕΠ, προκαλώντας την προηγούμενη σύναψη που λειτουργεί KLF4 ως καταστολέας όγκων σε εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου.

ανάλυση ανοσοφθορισμού επιβεβαιώνει την παρουσία του CD133 και KLF4 σε κύτταρα DLD-1 και DLD-S, πυρήνας χρωματίζεται με DAPI.

η

Νοκ ντάουν της Εκδήλωσης KLF4 σε σφαιροειδή κύτταρα Altered βλαστική ικανότητα τους

Στη συνέχεια ρώτησε αν KLF4 είναι απαραίτητη για την αυτο-ανανέωση ή /και την κακοήθη προφίλ του σφαιροειδούς κυττάρων από DLD-1. Για το σκοπό αυτό, δημιουργήσαμε DLD-S siKLF4 με μόλυνση κυττάρων DLD-S με KLF4-shRNA φορέα λεντοϊού και το DLD-S SICON με μόλυνση κυττάρων DLD-S με την μη-στόχου shRNA φορέα λεντοϊού. Εξετάσαμε πρώτα την απόπτωση των κυττάρων DLD-S SICON και DLD-S siKLF4 να αποκλειστεί η πιθανότητα ότι η μειωμένη ικανότητα της χημειο-αντίσταση, τη μετανάστευση, την εισβολή και την ογκογονικότητα των κυττάρων siKLF4 DLD-S οφείλεται σε αυξημένη απόπτωση με να χτυπήσει κάτω την έκφραση KLF4 και διαπίστωσε ότι το ποσοστό επιβίωσης ήταν παρόμοια μεταξύ των δύο DLD-S SICON και των κυττάρων DLD-S siKLF4 (Εικόνα 5Α). Στη συνέχεια, μελετήσαμε το mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης KLF4 σε αυτά τα ιογενή μολυσμένα κύτταρα DLD-S και βρήκαν ότι τα επίπεδα τόσο του mRNA και η πρωτεΐνη του KLF4 ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε κύτταρα DLD-S siKLF4 παρά σε κύτταρα DLD-S SICON (Σχήμα 5Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι η έκφραση του γονιδίου KLF4 χτυπήθηκε με επιτυχία τα κάτω.

(Α) Το ποσοστό επιβίωσης ήταν παρόμοια μεταξύ των δύο DLD-S SICON και των κυττάρων DLD-S siKLF4 όπως εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία Annexin-V APC /PI Διπλή Επισήμανση. (Β) Η έκφραση της KLF4 ήταν αποτελεσματικά να χτυπήσει κάτω στα κύτταρα DLD-S. (C) με κυτταρομετρία αναλύσεις CD133 + κυττάρων. Το κλάσμα CD133 + μειώθηκε σημαντικά μετά από να χτυπήσει κάτω KLF4 στα κύτταρα DLD-S. (Δ) Η έκφραση του CD133, CD166, Lgr5 και ΑΙ_ϋΗ1 ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε DLD-S siKLF4 από ό, τι στο DLD-S SICON. (Ε) Καλλιεργημένα σε SFM, κύτταρα DLD-S siKLF4 σχηματίζονται μικρές σφαίρες σε σημαντικά χαμηλότερη συχνότητα από κύτταρα DLD-S SICON έκανε. * P & lt?. 0.05

Η

Στη συνέχεια ρώτησε αν νοκ ντάουν της έκφρασης KLF4 στο DLD-S αλλοιωμένη έκφραση του γονιδίου τους CSC-δείκτη, χρησιμοποιώντας ανάλυση FACS, real-time PCR και ανάλυση Western κηλίδωση. Βρήκαμε ότι ο αριθμός των κυττάρων CD133 + είναι σημαντικά χαμηλότερη στα κύτταρα DLD-S siKLF4 παρά σε κύτταρα DLD-S SICON (Σχήμα 5C) και την έκφραση όλων των γονιδίων CSC σήμανσης, συμπεριλαμβανομένων των CD133, CD166, Lgr5, και ΑΙ_ϋΗ1, σημαντικά χαμηλότερα στο DLD-S siKLF4 από ό, τι στο DLD-S SICON (Σχήμα 5D). Τέλος, ρωτήσαμε αν νοκ ντάουν της KLF4 επηρέασε την αυτο-ανανέωση των DLD-S. Οταν καλλιεργούνται σε μέσο χωρίς ορό, τα κύτταρα DLD-S siKLF4 σχηματίζονται μικρές σφαίρες σε σημαντικά χαμηλότερη συχνότητα από κύτταρα DLD-S SICON έκαναν (Σχήμα 5Ε), υποδηλώνοντας ότι KLF4 είναι απαραίτητη για την αυτο-ανανέωση των κυττάρων DLD-S.

Νοκ ντάουν της Εκδήλωσης KLF4 μετέβαλε την κακοήθη προφίλ του σφαιροειδές Πυρήνων της DLD-1 κύτταρα

Εμείς διερευνηθεί περαιτέρω κατά πόσον νοκ ντάουν της έκφρασης KLF4 στο DLD-S θα αλλάξει κακοήθη προφίλ τους, συγκρίνοντας την ικανότητα του DLD-S siKLF4 και DLD-S SICON να μεταναστεύσουν και να εισβάλουν, για να σχηματίσουν αποικίες, να ανταποκριθεί σε 5-FU, και να δημιουργήσει όγκους σε ποντίκια ανοσοανεπάρκεια. Πρώτον, με τη χρήση Transwell δοκιμασία, βρήκαμε ότι η DLD-S siKLF4 μετανάστευσαν και εισβάλει σημαντικά βραδύτερη από ό, τι τα κύτταρα DLD-S SICON (Σχήμα 6Α). Δεύτερον, εξετάσαμε τα ποσοστά επιβίωσης των κυττάρων DLD-S siKLF4 σε μέσο ανάπτυξης με 5-FU και διαπίστωσε ότι η DLD-S siKLF4 είχαν σημαντικά χαμηλότερα ποσοστά επιβίωσης από τα κύτταρα DLD-S SICON (Σχήμα 6Β). Τρίτον, με τη χρήση δοκιμασία μαλακού άγαρ και προσδιορισμό σχηματισμού αποικίας, βρήκαμε ότι τα κύτταρα DLD-S siKLF4 σχηματίζονται σημαντικά χαμηλότερο αριθμό αποικιών και μικρότερες αποικίες από το DLD-S SICON (Σχήμα 6C). Τέλος, χρησιμοποιείται το μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντίκι για να ρωτήσω αν KLF4 απαιτείται για

in vivo

ογκογένεση της CSC-εμπλουτισμένα κύτταρα DLD-S. Ένα εκατομμύριο DLD-S siKLF4 ή ο SICON κύτταρα υποδόρια ένεση σε κάθε Balb /c ηυ /ηυ ποντικό, αντίστοιχα. Βρήκαμε ότι οι όγκοι σχηματίστηκαν σε ποντίκια μεταμοσχεύθηκαν με κύτταρα DLD-S SICON νωρίτερα και σημαντικά μεγαλύτερη από ό, τι στα ποντίκια μεταμοσχευμένα με κύτταρα DLD-S siKLF4 (Σχήμα 6D). Για παράδειγμα, κατά την ημέρα 56 μετά την έγχυση των κυττάρων, οι όγκοι σε ποντικούς που λαμβάνουν DLD-S SICON αυξήθηκε κατά μέσο όρο σε 1256,52 mm

3 σε όγκο, ενώ οι όγκοι σε ποντικούς που λαμβάνουν DLD-S siKLF4 αυξήθηκε μόνο με το μέσο όρο των 374,11 mm

3. Η ιστολογική εξέταση των όγκων ξενομοσχεύματος εξετάστηκε με χρώση HE. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των ιστολογικών DLD-S SICON και ομάδες DLD-S siKLF4 (Σχήμα 6Ε). Στο σύνολό τους, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η εξουδετέρωση της έκφρασης KLF4 στα κύτταρα DLD-S ανάπηρος τις ικανότητες αυτών των κυττάρων να μεταναστεύουν, εισβάλει, να αντισταθεί 5-FU, και δημιουργούν όγκους.

(Α) DLD-S siKLF4 μετανάστευσαν και εισέβαλε σημαντικά πιο αργή από ό, τι τα κύτταρα DLD-S SICON, αξιολογούνται από φρεατίων δοκιμασία. (Β), όπως αξιολογείται με την δοκιμασία CCK8, DLD-S siKLF4 είχαν σημαντικά χαμηλότερα ποσοστά επιβίωσης από τα κύτταρα DLD-S SICON σε διάφορες συγκεντρώσεις της 5-FU. κύτταρα (C) DLD-S siKLF4 σχηματίζονται σημαντικά χαμηλότερο αριθμό αποικιών και μικρότερες αποικίες από το DLD-S SICON. (Δ και Ε) κύτταρα DLD-S SICON σχηματίζονται όγκοι νωρίτερα και σημαντικά μεγαλύτερη από ό, τι στα ποντίκια μεταμοσχευμένα με κύτταρα DLD-S siKLF4. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των ιστολογικών DLD-S SICON και ομάδες DLD-S siKLF4. Αρχικό μεγεθύνσεις × 200. * P & lt?. 0.05

Η

χτυπήσει κάτω KLF4 Έκφραση Καταστέλλει Τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά Μετάβαση στο σφαιροειδές κύτταρα

Τα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) η διαδικασία είναι στενά συνδεδεμένη με το μεταστατικό χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων [46], [47]. Τα καρκινικά κύτταρα εμπλοκής διαδικασία ΕΜΤ εκφράζουν γονίδια μεσεγχυματικά, όπως βιμεντίνης, σαλιγκάρι, και γυμνοσάλιαγκα, ενώ οι εκφράσεις του επιθηλιακού γονίδια δείκτες, όπως Ε-καδερίνης και ΖΟ-1 μειώνεται. Αυτά τα κύτταρα έχουν επίσης παρόμοια κακοήθη προφίλ ως ΚΕΠ ή καρκινικά κύτταρα έναρξη κάνουμε. Δείξαμε πρώτα ότι, σε αντίθεση με τα κύτταρα DLD-1, DLD-S εκφράζεται μια τυπική επιθηλιακή δείκτη, Ε-καδερίνη και ένα τυπικό μεσεγχυματικών δείκτη, βιμεντίνη με ανοσοφθορισμό και σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση (Σχήμα 7Α και 7Β), προτείνοντας ότι DLD-S διέθετε τα χαρακτηριστικά των κυττάρων που περνούν από EMT. Στη συνέχεια συγκρίναμε την έκφραση των επιθηλιακών και μεσεγχυματικών δεικτών μεταξύ των κυττάρων DLD-S siKLF4 και DLD-S SICON και διαπίστωσε ότι τα κύτταρα DLD-S siKLF4 είχαν σημαντικά επίπεδα υψηλότερα πρωτεΐνη του ΖΟ-1, αλλά σημαντικά επίπεδα χαμηλότερα πρωτεΐνη Ε-καδερίνης και βιμεντίνης από DLD-S SICON (Σχήμα 7C). Είναι ενδιαφέρον ότι, η έκφραση του σαλιγκαριού ήταν παρόμοια μεταξύ των δύο DLD-S siKLF4 και DLD-S SICON. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι KLF4 απαιτείται για την προώθηση της διαδικασίας EMT στα κύτταρα σφαιροειδές του παχέος εντέρου.

(Α) ανάλυση ανοσοφθορισμού σε κύτταρα DLD-S SICON και DLD-S siKLF4 για το E-cadherin και βιμεντίνης, πυρήνας χρωματίζεται με DAPI . (Β) Όπως εκτιμάται από την Real-time PCR κύτταρα, DLD-S είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα mRNA της E-cadherin, βιμεντίνη και σαλιγκάρι. Η έκφραση της ΖΟ-1 ήταν μειωμένη. κύτταρα (C) DLD-S siKLF4 είχαν σημαντικές υψηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης του ΖΟ-1, αλλά σημαντική χαμηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης Ε-καδερίνης και βιμεντίνης από DLD-S SICON. Η έκφραση των σαλιγκαριών ήταν παρόμοια μεταξύ τους. * P & lt?. 0.05

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, ήμασταν σε θέση να εμπλουτίσουν ΚΕΠ από διάφορες κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου με την καλλιέργεια τους σε μέσο ελεύθερο ορού. Οι σφαίρες που σχηματίζονται στο μέσο χωρίς ορό περιείχε σφαιροειδές κύτταρα, τα οποία κατείχαν χαρακτηριστικά ΚΕΠ του παχέος εντέρου: πρώτα, αυτά τα κύτταρα είχαν υψηλή έκφραση γονιδίων δεικτών του ΚΕΠ του παχέος εντέρου και βλαστικών κυττάρων (Σχήμα 2Α)? Δεύτερον, αυτά τα κύτταρα ήταν περισσότερο κακοήθη χαρακτηριστικά από γονικά κύτταρα τους DLD-1 (Σχήμα 2Β, 2C και 2D)? Τέλος, αυτά τα κύτταρα έδειξαν αυξημένη ογκογονικότητα όταν υποδορίως μεταμοσχευθεί σε ποντικούς με ανοσοανεπάρκεια (Σχήμα 2Ε). Άλλοι χρησιμοποίησαν επίσης μέτριο σύστημα ελεύθερο ορού για να πάρει ΚΕΠ εμπλουτισμένο με σφαίρες από HCT116, καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές ΗΤ29 [22], [43], [44]. Αξίζει να σημειωθεί ότι αυτή η μέθοδος ΚΕΠ-εμπλουτισμού δεν είναι κατάλληλο για όλες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου. Για παράδειγμα, στη μελέτη μας, δεν ήμασταν σε θέση να εμπλουτίσουν τις σφαίρες από SW480 χρήση αυτής της μεθόδου.

Επίσης, κατέληξε στο συμπέρασμα ότι KLF4 ήταν απαραίτητη για τα χαρακτηριστικά των ΚΕΠ του παχέος εντέρου. Πρώτον, KLF4 ήταν μόνο εντόνως εκφρασμένο σε CSC εμπλουτισμένα σφαιροειδές κύτταρα του DLD-1, HCT116, ΗΤ29 κύτταρα και CD133 + κυττάρων που απομονώνονται από κύτταρα DLD-1 (Σχήμα 3Δ, 3Ε, και η ημερομηνία δεν παρουσιάζεται). Δεύτερον, να χτυπήσει κάτω την έκφραση KLF4 σε κύτταρα DLD-S μείωσε τον αριθμό των κυττάρων CD133 + και μείωσε τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων δεικτών καρκίνου του παχέος εντέρου βλαστικών κυττάρων (Σχήμα 5C και 5D) και αυτά τα κύτταρα δεν μπορούν να σχηματίσουν αποτελεσματικά σφαίρες σε μέσο ελεύθερο ορού ( Σχήμα 5Ε). Τρίτον, τα κύτταρα DLD-S με μειωμένη έκφραση KLF4 έδειξαν ανάπηρος ικανότητα να μεταναστεύουν, εισβάλλουν, να αντισταθεί σε 5-FU, και δημιουργούν όγκους (Σχήμα 6Α, 6Β, 6C, 6D και 6Ε).