Αφηρημένο

CD133 είναι ένα μόριο μεμβράνης που έχει, αμφιλεγόμενα, ανέφερε ως δείκτη CSC σε καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC). Σε αυτή τη μελέτη, επιδιώξαμε να αποσαφηνιστεί η έκφραση και ο ρόλος του CD133 στο CRC. Αρχικά το μέγεθος του CD133 που εκφράζουν (CD133 +) πληθυσμού σε οκτώ καλώς περιγραφείσες κυτταρικές γραμμές CRC μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής και βρέθηκε να κυμαίνεται από 0% έως & gt? 95%. Η κυτταρική γραμμή ΗΤ29 έχει CD133 + πληθυσμού & gt? 95% και επιλέχθηκε για τη λειτουργική αξιολόγηση του CD133 μετά γονιδίου νοκ ντάουν με παρεμβολή RNA. Μια δοκιμασία πορεία του χρόνου έδειξε ότι η αναστολή CD133 δεν είχε σημαντική επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ή απόπτωση. Ωστόσο, CD133 knockdown είχε ως αποτέλεσμα μεγαλύτερη ευαισθησία σε σταυροσπορίνη απόπτωση (p = 0.01) και μείωση στην κυτταρική κινητικότητα (ρ & lt? 0,04). Από το γονίδιο νοκ ντάουν μπορεί να προκαλέσει «εκτός στόχου» επιδράσεις, η κυτταρική σειρά SW480 (η οποία έχει CD133 + πληθυσμό 40%) ήταν ταξινομημένο σε καθαρούς πληθυσμούς CD133 + και CD133- για τη λειτουργική σύγκριση ισογονιδιακές πληθυσμούς χωρίζονται μόνο από την έκφραση CD133. Σε συμφωνία με τα νοκ ντάουν πειράματα, μια δοκιμασία πορεία του χρόνου δεν έδειξαν σημαντικές πολλαπλασιαστικές διαφορές μεταξύ της CD133 + /CD133- πληθυσμών. Επίσης μεγαλύτερη αντοχή σε σταυροσπορίνη απόπτωση (p = 0,008), μεγαλύτερη κινητικότητα των κυττάρων (ρ = 0,03) και μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα σχηματισμού αποικιών παρατηρήθηκε στην CD133 + πληθυσμό από τον πληθυσμό CD133- σε 2D και 3D καλλιέργεια (ρ & lt? 0.0001 και ρ & lt ? 0,003 αντίστοιχα). Τέλος, η πλαστικότητα της έκφρασης CD133 σε κύτταρα όγκου ελέγχθηκε. Ποσοτική ανάλυση PCR έδειξε υπήρχε μεταγραφική καταστολή του πληθυσμού CD133- της SW480. Η παρατεταμένη καλλιέργεια ενός καθαρού πληθυσμού CD133- οδήγησε στην επανεμφάνιση των κυττάρων CD133 +. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η έκφραση CD133 σε CRCs συνδέεται με ορισμένα χαρακτηριστικά που αποδίδονται στην βλαστική ικανότητα και ότι υπάρχει πλαστικότητα της έκφρασης CD133. Περαιτέρω μελέτες είναι απαραίτητες για την οριοθέτηση της μηχανιστική βάση αυτά τα χαρακτηριστικά

Παράθεση:. Elsaba TMA, Martinez-Pomares L, Robins AR, Crook S, Seth R, Jackson D, et al. (2010) Η Βλαστικών Κυττάρων Marker CD133 Associates με ενισχυμένο σχηματισμό αποικιών και κυτταρική κινητικότητα στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 5 (5): e10714. doi: 10.1371 /journal.pone.0010714

Επιμέλεια: Μιχαήλ Β Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Φεβρουαρίου 2010? Αποδεκτές: 27 Απριλίου, 2010? Δημοσιεύθηκε: May 19, 2010

Copyright: © 2010 Elsaba et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Πανεπιστήμιο του Nottingham και CR-UK. Tarek Elsaba είναι αποδέκτης μιας υποτροφίας PhD, οι οποίες παρέχονται από την αιγυπτιακή κυβέρνηση. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα τελευταία χρόνια έχουν δει την εμφάνιση της «υπόθεσης του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων», η οποία υποθέτει ότι ένας πληθυσμός μειονότητας των κυττάρων εντός ενός όγκου αποτελείται από καρκινικά βλαστικά κύτταρα (CSC) [1], [2]. Ο πληθυσμός αυτός είναι υποτίθεται υπεύθυνος για τη δημιουργία του μεγαλύτερου του όγκου που αποτελείται από κύτταρα σε διάφορους βαθμούς διαφοροποίησης. Η ιεραρχία ενός όγκου έτσι πιστεύεται ότι είναι παρόμοια με τον ιστό από τον οποίο προέρχεται το όγκου και ΚΕΠ θεωρείται νεοπλασματικών ομολόγους των βλαστικών κυττάρων στον φυσιολογικό ιστό. Από την άποψη αυτή, ΚΕΠ θα αναμενόταν να έχουν ένα κύτταρο-όπως φαινότυπο στέλεχος (γενικά αναφέρεται ως «βλαστική ικανότητα»). Αυτό χαρακτηρίζεται από χαρακτηριστικά, όπως η απεριόριστη ικανότητα αντιγραφής, πολυδυναμικότητα και η αντίσταση στην απόπτωση [3]. Ο φαινότυπος των βλαστικών κυττάρων μπορεί επίσης να περιλαμβάνει κυτταροπροστατευτικές στρατηγικές όπως την ικανότητα να εξωθηθεί ενεργά επικίνδυνες ουσίες από το κύτταρο-ένα χαρακτηριστικό το οποίο μπορεί να είναι η βάση της αντοχής σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [3], [4].

παράλληλα με την εμφάνιση του καρκίνου βλαστικών κυττάρων υπόθεση, υπήρξε ένα αυξανόμενο ενδιαφέρον για την απομόνωση και τη μελέτη των ΚΕΠ. Ένας αριθμός μελετών ισχυρίζονται ότι έχουν απομονωμένα ΚΕΠ από αρκετούς διαφορετικούς τύπους όγκων, όπως του εγκεφάλου [5], [6], του μαστού [7], του παχέος εντέρου [8], [9], ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [10] και τον καρκίνο του παγκρέατος [11] . Αυτές οι μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει υποθετική δείκτες CSC να διαχωρίσει βλαστικών κυττάρων από τη διαφοροποίηση των κυττάρων εντός ενός όγκου. Μία κοινή μέθοδος διαχωρισμού είναι η μέθοδος εξάλειψη χρωστική (δηλ πλευρά πληθυσμός [12]), αν και εντοπισμό ορισμένων δεικτών κυτταρικής επιφάνειας (όπως CD24, CD44, CD166, και ιντεγκρίνες) επέτρεψε χρήση ενεργού φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS) να απομονώσει ΚΕΠ [13]. Ένας δείκτης ανέφεραν σταθερά ως ένας δείκτης βλαστικών κυττάρων σε όγκους των διαφορετικών προελεύσεων είναι CD133 (γνωστό και ως προμινίνη 1).

Το γονίδιο CD133 (

PROM1

) χαρτογραφείται στο χρωμόσωμα 4p15 και κωδικοποιεί μια 120 kD διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη (ENSG00000007062). Η πρωτεΐνη CD133 είναι pentaspan υποδοχέα της κυτταρικής επιφάνειας, αν και ούτε συνδέτη του ούτε για δευτερογενή αγγελιοφόροι του είναι γνωστά. Ήταν η πρώτη αναγνωρίζεται ως ένας δείκτης επιφάνειας για αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα [14], [15]. Αργότερα, χρησιμοποιήθηκε για να αναγνωρίσει καρκινικά βλαστικά κύτταρα σε πολλές συμπαγείς όγκους που προκύπτουν, για παράδειγμα, του μαστού [13], το πάγκρεας [16] και το ήπαρ [17].

Δύο πρόσφατες μελέτες που εντοπίστηκαν CD133 ως δείκτη για βλαστικά κύτταρα σε ορθοκολικούς καρκίνους (CRC) [8], [9]. Σε αυτές τις μελέτες, CD133 εκφράζει κύτταρα (CD133 +) απομονώθηκαν από πρωτογενή CRCs και έδειξαν να έχουν την ικανότητα να σχηματίζουν όγκους ως ξενομοσχεύματα σε γυμνά ποντίκια? σε αντίθεση CD133- κύτταρα από τους ίδιους όγκους έδειξαν να έχουν πολύ περιορισμένη ικανότητα να σχηματίζουν ξενομοσχεύματα και ακόμα και αυτό αποδόθηκε σε μόλυνση από CD133 + κύτταρα. Ανάλυση των ξενομοσχευμάτων που σχηματίστηκαν έδειξε ότι το μέγεθος του CD133 + πληθυσμό ήταν παρόμοιο με αυτό που παρατηρείται στον πρωτογενή όγκο και, επιπλέον, η δυνατότητα να διαδοθεί συνεχώς τα ξενομοσχεύματα ήταν στενά συνδεδεμένο με την έκφραση CD133. Μεταγενέστερες μελέτες, ωστόσο, δεν έχουν επικυρωθεί αυτές τις παρατηρήσεις [18] και σε μία μελέτη έχει αναφερθεί ότι, στην πραγματικότητα, η CD133- πληθυσμός έχει τη μεγαλύτερη ικανότητα σχηματισμού [19] αποικία. Η μελέτη μας προσπάθησε να διευκρινίσει περαιτέρω την έκφραση και το ρόλο του CD133 στο CRC. Χρησιμοποιήθηκαν δύο προσεγγίσεις για: έκφραση (i) CD133 ήταν λειτουργικά αξιολογήθηκε σε ΗΤ29 μετά γονίδιο knockdown και (ii) SW480 υποβλήθηκαν διαλογή κυττάρων εντός ενός CD133 + πληθυσμού και ενός πληθυσμού CD133- ακολουθείται από συγκριτική λειτουργική ανάλυση των δύο πληθυσμών

Υλικά και Μέθοδοι

ιστοκαλλιέργειας, κυτταρομετρία ροής και του φθορισμού ενεργοποιημένων κυττάρων διαλογή

Οκτώ ανθρώπινης ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (Caco2, DLD1, ΗΤ29, Lovo, LS1034, SW480, SW620, SW837) ήσαν διατηρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Ταυτότητα του όλες τις κυτταρικές σειρές επιβεβαιώθηκε με τη λήψη δακτυλικών αποτυπωμάτων για μεταλλάξεις στο

KRAS, BRAF, PI3KCA, CDC4, TP53

και μικροδορυφορικού δοκιμές αστάθεια.

Η αξιολόγηση του μεγέθους της έκφρασης (CD133 +) του πληθυσμού CD133 σε κάθε κυτταρική σειρά αναλήφθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα φυκοερυθρίνη (ΡΕ) επισημασμένου αντισώματος – CD133 /1 (κλώνος AC133 /1, Miltenyi Biotec, UK). Τα κύτταρα αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας διάλυμα μη-ενζυματική διαστάσεως κυττάρων (Sigma) και περίπου 5 × 10

5 κύτταρα επωάστηκαν με αντίσωμα (αραιωμένο 1:100 σε πλύση FACS (0,5% αλβουμίνη βόειου ορού? 2 mM NaN

3? 5 mM EDTA)) για 15 λεπτά στους 4 ° C. Μια ισοτόπου και η συγκέντρωση ταιριάζει ΡΕ σημασμένο αντίσωμα ελέγχου (Miltenyi Biotec, UK) χρησιμοποιήθηκε και τα δείγματα επισημαίνονται με αυτό το αντίσωμα χρησιμοποιείται για να ρυθμίσετε τα επίπεδα περίφραξη. Μετά από τρεις πλύσεις 5 λεπτών με πλύση FACS, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν και μονιμοποιήθηκαν σε διάλυμα που περιείχε FACS πλύνετε με 1% φορμαλδεΰδη. Προσδιορισμός του ποσοστού των κυττάρων CD133 + και τη διαλογή των κυτταρικών σειρών σε CD133 + /CD133- πληθυσμοί διεξήχθησαν σε μία ροή Epics Altra κυτταρομετρίας μηχάνημα (Beckman Coulter). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τη χρήση WinMDI 2,9 λογισμικού υπολογιστών.

Για φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων (FACS) των SW480, τα κύτταρα σημάνθηκαν χρησιμοποιώντας το ίδιο πρωτόκολλο, αλλά χωρίς το τελικό στάδιο στερέωσης. Προκειμένου να αξιολογηθεί πλαστικότητα της έκφρασης CD133, ταξινομημένα κύτταρα διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια για 3 εβδομάδες πριν να υποστούν εκ νέου αξιολόγηση. Για όλα τα άλλα πειράματα, τα CD133 πληθυσμοί + /CD133- ελέγχθηκαν αμέσως μετά τη διαλογή.

εκχύλιση RNA, η ανίχνευση των παραλλαγών ματίσματος και του mRNA ποσοτικοποίηση

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα χρησιμοποιώντας την RNeasy Mini Kit (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Δείγματα της κανονικής βλεννογόνου του κόλου συλλέχθηκαν με πλήρη έγκριση της τοπική επιτροπή δεοντολογίας (Oxford Research επιτροπή δεοντολογίας Β, C02.310 αναφορά REC). Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς των οποίων τα δείγματα εξετάστηκαν για έκφραση και παραλλαγές ματίσματος CD133. RNA εκχυλίστηκε και συμπληρωματικό DNA (cDNA) συντέθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20].

Δύο κύριες παραλλαγές συρραφής έχουν περιγραφεί για CD133. Το μεγαλύτερο παραλλαγή AC133-1 (NM_006017) ταυτοποιήθηκε πρώτα και περιέχει όλα τα εξώνια [15]. Η δεύτερη παραλλαγή, AC133-2, ματίζει έξω εξόνιο 4, το οποίο έχει μήκος 27 ζεύγη βάσεων και κωδικοποιεί μια ακολουθία 9 αμινοξέων στην πρώτη εξωκυτταρική περιοχή του CD133. Έκφραση των παραλλαγών ματίσματος ελέγχθηκε με RT-PCR χρησιμοποιώντας έναν ανοδικό εκκινητή στο εξόνιο 3 και ένα καθοδικό απαρχητή στο εξόνιο 5 (αλληλουχίες εκκινητών που διατίθενται από τους συγγραφείς). Αυτό θα παράγει ένα προϊόν 199 ζευγών βάσεων από AC133-1 και 172 bp από AC133-2. End σημείο ανάλυση PCR εκτελέστηκε με την προβολή προϊόντων PCR σε πηκτές αγαρόζης. Ωστόσο, δεδομένου ότι η προτιμησιακή ενίσχυση του μικρότερου προϊόντος μπορεί να παράγει αντικείμενα δεδομένων, η μελέτη επαναλήφθηκε χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου (με SYBR Green ως χρωστική αναφοράς) επί του θερμικό κυκλοποιητή MX3005P (Stratagene, UK). Ιδιαιτερότητα της PCR ελέγχθηκε με αμφίδρομη άμεση αλληλούχιση. Η παρουσία των παραλλαγών ματίσματος ελέγχθηκε σε cDNA που λαμβάνονται από τις κυτταρικές γραμμές CRC, τα ταξινομημένα πληθυσμοί CD133 + και CD133- των SW480 καθώς και 10 δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου του παχέως εντέρου

ταξινόμηση CD133 +/- πληθυσμοί υποβλήθηκαν σε ανάλυση των επιπέδων mRNA με ποσοτική ανάλυση RT-PCR χρησιμοποιώντας την πρότυπη μέθοδο καμπύλη. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν για κάθε δείγμα και

CD133

τιμές κανονικοποιήθηκαν στο γονίδιο καθαριότητας

HPRT

. Κάθε αντίδραση διεξήχθη σε τελικό όγκο 25 μΙ σε ένα MX3005P θερμικό ανακυκλωτή (Stratagene, UK). Τα δεδομένα για το Q-PCR αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό MxPro-QPCR.

Gene knockdown

Gene knockdown επετεύχθη με επιμόλυνση κυττάρων ΗΤ29 (φαίνεται να έχουν υψηλή έκφραση CD133) με CD133-ειδικό μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA που). Περίπου 2 × 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν σε 2 ml μέσου ϋΜΕΜ με 10% FBS σε πλάκες 6 φρεατίων (Corning) 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με CD133-ειδική stealth siRNA δίπολα (αλληλουχία: 5′-GAGUCGGAAACUGGCAGAUAGCAAU-3 ‘, Invitrogen) σε τελική συγκέντρωση 33 ηΜ χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αυτά είναι πλέον περιγράφονται ως ΗΤ29

CD133-. Έλεγχοι αποτελούνταν από κύτταρα επιμολυσμένα με ομελέτα ελέγχου siRNA (ακολουθία: 5′-GAGGGAACAGUCGGAUAGACCUAAU-3 ‘). Και πλέον περιγράφονται ως ΗΤ29

SSC (ομελέτα ελέγχου siRNA)

κηλίδωση Western

Για αποτύπωση κατά Western, λύματα παρασκευάστηκαν και προσδιορίστηκαν ποσοτικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Δείγματα (30 μg) υποβλήθηκαν σε δωδεκυλοθειικό νάτριο ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) με τη χρήση διαχωρισμού πηκτής πολυακρυλαμιδίου 10% και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη Hybond-P PVDF (Amersham Bioscience). Μετά τον αποκλεισμό με 5% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) /0.1% TPBS (Tween20 σε διάλυμα PBS) για 60 λεπτά, η μεμβράνη στη συνέχεια επωάστηκε για όλη τη νύχτα σε θερμοκρασία δωματίου με CD133 (C24B9) Rabbit mAB (κυτταρική σηματοδότηση) σε μια συγκέντρωση 1:1000. Η μεμβράνη πλύθηκε με 0,1% TPBS 3 φορές για 5 λεπτά κάθε κατόπιν επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (Sigma Aldrich) (1:10000, αντι-κουνελιού IgG) αραιώνεται με 5% BSA /PBS που περιέχει 0.1% Tween20. Μετά από άλλες 3 πλύσεις, η μεμβράνη οπτικοποιήθηκε ενισχυμένη αντιδραστήρια χημειοφωταύγειας (Thermo Scientific) για ένα στοιχείο ελέγχου φόρτωσης, χρησιμοποιήθηκε το μονοκλωνικό αντι-β-ακτίνης αντίσωμα (Sigma Aldrich) σε μια αραίωση 1:2000 κατά της β-ακτίνης πρωτεΐνης.

αναλύσεις πολλαπλασιασμού

Μια δοκιμασία πορεία του χρόνου για τον πολλαπλασιασμό πραγματοποιήθηκε μετά γονιδίου νοκ ντάουν και μετά από διαλογή κυττάρων. Για ΗΤ29, κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 24 φρεατίων σπάρθηκε με 10

4 κύτταρα 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με είτε ειδικά CD133 ή ως κωδικοποιημένο ελέγχου siRNA. Οι αριθμοί των κυττάρων αξιολογήθηκαν τις ημέρες 1, 3 και 5. Για SW480 τα ταξινομημένα πληθυσμοί CD133 + και CD133- σπάρθηκαν σε 10

4 κύτταρα ανά αριθμούς καλά και κυτταρικές αξιολογήθηκαν τις ημέρες 1, 3, 5, 7 και 9. Τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα, κάθε εις τριπλούν, διεξήχθησαν. Ένα μπλε του μεθυλενίου δοκιμασία [21], [22] χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση του αριθμού των προσκολλημένων βιώσιμων κυττάρων.

Stauropsorine απόπτωση που επάγεται

σταυροσπορίνη χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η αντίσταση που παρέχεται από CD133 σε εξωγενή αποπτωτικό στρες . Για ΗΤ29, κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96 φρεατίων (Costar) σπάρθηκε με είτε ΗΤ29

CD133- ή ΗΤ29

SSC κύτταρα 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Περίπου 5 × 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν ανά φρεάτιο και επωάστηκαν με σταυροσπορίνη (Sigma) σε τελική συγκέντρωση 8 μΜ για 24 ώρες. Μετά την περίοδο αυτή, βιώσιμη και αποπτωτικά κύτταρα μετρήθηκαν. Για SW480, κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96 φρεατίων σπάρθηκε με 10

5 κύτταρα των διαλεγμένων κυττάρων και σταυροσπορίνη προστέθηκε 24 ώρες αργότερα σε συγκέντρωση 8 μΜ. Μετά από άλλες 24 ώρες, αξιολογήθηκαν οι αριθμοί των βιώσιμων κυττάρων /αποπτωτικών σωμάτων. Η δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα.

2 διαστάσεων (2D) και 3 (3D) διαστάσεων αποικίας

δοκιμασία σχηματισμού

Η ικανότητα των απομονωμένων ενιαίας CD133 + και CD133- κύτταρα να σχηματίσουν αποικίες δοκιμάστηκε τόσο 2 διαστάσεων (2D) πολιτισμό και 3 διαστάσεων (3D) πολιτισμός. Για 2D καλλιέργεια, 300 προσφάτως ταξινομημένα κύτταρα σπάρθηκαν σε ατομικά φρεάτια μιας πλάκας 6 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 14 ημέρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με μετρήθηκαν μπλε μεθυλενίου και αποικίες που περιέχουν περισσότερο από 20 κύτταρα. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και σε δύο περιπτώσεις.

3D καλλιέργεια διεξήχθη για να αξιολογηθεί η colonogenic ικανότητα των ταξινομημένων πληθυσμών σε μη προσκολλημένα συνθήκες. Τα κύτταρα (2500 από κάθε πληθυσμό CD133 + και CD133-κύτταρα) μετρήθηκαν και επαναιωρείται ως μεμονωμένα κύτταρα στο 0,7% βαθμού DNA αγαρόζης (Sigma Aldrich) .Αυτό το επιστρώνεται σε μια βάση του 1% άγαρ ποιότητας DNA (Sigma Aldrich) και οι δύο πάνω και στρώσεις βάσης αναμίχθηκαν με 2Χ DMEM. Πειράματα στήθηκαν εις τριπλούν και μέσο άλλαξε δύο φορές την εβδομάδα. Μετά από δύο εβδομάδες, ο αριθμός των αποικιών που αναπτύσσονται στο εσωτερικό κάθε φρεάτιο μετρήθηκαν και οπτικοποιήθηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο μετά από χρώση με 0,05% κρυσταλλικό ιώδες για 1 ώρα και αντιπροσωπευτικά πεδία φωτογραφήθηκαν. Τόσο για 3D και 2D τον πολιτισμό, την αποτελεσματικότητα σχηματισμού αποικίας τοις εκατό (CFE) υπολογίστηκε ως ακολουθήσει,% CFE = (Αριθμός λαμβάνονται αποικίες /Αριθμός καλλιεργημένα κύτταρα) Χ 100 [23]. Σύνδεση μετασχηματισμένα τιμές στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για στατιστική ανάλυση.

In vitro

μετανάστευση

δοκιμασία

Transwell δοκιμασίες κυτταρικής μετανάστευσης πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός θαλάμου Boyden που περιέχει ένα φίλτρο από πολυανθρακικό με ένα 8 μm μέγεθος πόρων (Costar). Το μέσο καλλιέργειας (600 μΐ) που έχει συμπληρωθεί με 20% FBS προστέθηκε στον κάτω θάλαμο και 2,5 χ 10

5 κύτταρα των ταξινομημένων πληθυσμών προστέθηκαν εντός του άνω θαλάμου (σε 100 μΐ μέσο καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% FBS). Ο αριθμός των κυττάρων που μεταναστεύουν μέσω της μεμβράνης με το χέρι μετρήθηκαν μετά από 24 ώρες. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν και σε δύο διαφορετικές περιπτώσεις. Η μετανάστευση των κυττάρων μετρήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας ένα κύτταρο δοκιμασία πραγματοποιήθηκε σε 6 φρεατίων (Costar) τραυματισμό. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν προς συρροή και κατόπιν στερήθηκαν για 24 ώρες σε μέσο χωρίς ορό. Μια αποστειρωμένη πιπέτα 200 μl χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία τριών ξεχωριστών παράλληλων πληγές και μετανάστευση των κυττάρων σε όλη την γραμμή τραύμα αξιολογήθηκε μετά από 24 ώρες. Ελήφθησαν φωτογραφίες χρησιμοποιώντας μία συσκευή συζευγμένου φορτίου (CCD) (Canon, Japan) συνδέεται με το ανεστραμμένο μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης σε μία δύναμη του X40. Η απόσταση μεταξύ των ακμών μετρήθηκε σε 6 ισομερώς κατανεμημένα σημεία με τη χρήση του λογισμικού ImageJ [33] και στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας δύο tailed t-test. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν σε δύο διαφορετικές περιπτώσεις.

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του SPSS 13.0 Λογισμικό. Όλες οι αξιολογήσεις έγιναν χρησιμοποιώντας T-test unpaired δύο ουρά Student. Για μελέτες που περιλαμβάνουν κυττάρων και καταμέτρηση των αποικιών, οι αριθμοί των κυττάρων αναλύθηκαν. Για τις μελέτες με αριθμητική έξοδο φθορισμού, χρησιμοποιήθηκαν οι τιμές των πρώτων φθορισμού.

Αποτελέσματα

CD133 εκφράζοντας πληθυσμούς σε κυτταρικές σειρές

Το μέγεθος του CD133 + πληθυσμού δοκιμάστηκε σε 8 κυτταρικές γραμμές CRC με κυτταρομετρία ροής και σε κάθε περίπτωση περίπου 500 000 κύτταρα αναλύθηκαν. Σε δύο κυτταρικές σειρές (DLD1 και SW837), κύτταρα CD133 + δεν ήταν ανιχνεύσιμα. Το μέγεθος του CD133 + πληθυσμού βρέθηκε να είναι & gt? 95% σε δύο κυτταρικές σειρές (Caco2 και ΗΤ29). Στις υπόλοιπες κυτταρικές σειρές, ένα δίτροπο πληθυσμός ήταν παρούσα με CD133 + πληθυσμού που κυμαίνεται από 32-64% (Σχήμα 1).

Οκτώ κυτταρικές σειρές CRC δοκιμάστηκαν και έδειξαν ποικίλου μεγέθους του πληθυσμού των κυττάρων CD133 +. (Α) της ροής του δείγματος κυτταρομετρία εικόνες παρουσιάζονται για Caco2 (αριστερό πάνελ, & gt? 95% θετικά κύτταρα) και SW837 (δεξιά πάνελ). Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση /1 αντίσωμα AC133 (επάνω πάνελ) και πύλης διεξήχθη για κάθε κυτταρική σειρά χρησιμοποιώντας ένα στοιχείο ελέγχου ισοτύπου (κάτω πίνακας), PMTLin 1 είναι photmultiplier σωλήνας γραμμικό 1, η οποία δείχνει πλευρική σκέδαση) (b) δείχνει ότι σε δύο κυτταρικές σειρές δεν υπήρχαν CD133 + κυττάρων που ταυτοποιούνται ενώ σε δύο κυτταρικές σειρές σχεδόν όλα τα κύτταρα ήταν CD133 +. Οι υπόλοιπες κυτταρικές σειρές είχε διαφορετικό πληθυσμό μέγεθος των κυττάρων CD133 +.

Η

παραλλαγές ματίσματος του CD133 σε κυτταρικές σειρές CRC και φυσιολογικό βλεννογόνο

Η έκφραση των δύο κύριων παραλλαγές ματίσματος του CD133 (AC133- 1 και AC133-2) ελέγχθηκε με RT-PCR σε αμφότερα τα κυτταρικές γραμμές και δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου. Μόνο ένα προϊόν παρατηρήθηκε σε πηκτές αγαρόζης οι οποίες, αλληλούχιση, βρέθηκε να είναι η συντομότερη παραλλαγή ματίσματος AC133-2 από το οποίο εξώνιο 4 ματίζεται (Σχήμα 2α και 2c). Ωστόσο, κοντύτερα προϊόντα PCR υποβάλλονται σε προτιμησιακή ενίσχυση και είναι πιθανό ότι τα μεγαλύτερα προϊόντα μπορεί να χαθεί τόσο από ηλεκτροφόρηση πηκτώματος αγαρόζης και αλληλούχηση (ιδιαίτερα αν υπάρχει σε χαμηλά επίπεδα). Η ανάλυση τελειοποιήθηκε με πραγματοποίηση PCR χρησιμοποιώντας SYBR πράσινο ως χρωστική αναφοράς. Αξιολόγηση της καμπύλης διαστάσεως έδειξε την παρουσία ενός μόνο προϊόντος PCR μόνο (Σχήμα 2β).

Οι κυτταρικές σειρές και φυσιολογικά βλεννογόνου δείγματα εξετάστηκαν για έκφραση των δύο κύριων παραλλαγές CD133 ματίσματος με RT-PCR με εκκινητές καθηλωμένα στην σε κάθε πλευρά της συγκολλημένα έξω εξόνιο (εξόνιο 4). Δείγμα δεδομένα δείχνονται τα οποία καταδεικνύουν μία μόνο προϊόν ταυτοποιήθηκε όταν τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν σε αμφότερα (α) πηκτή αγαρόζης και (β) την πιο ευαίσθητη τεχνική Q-PCR χρησιμοποιώντας SYBR Green ως ρεπόρτερ. Μ = δείκτης μεγέθους, NC = αρνητικού ελέγχου, * αντιπροσωπεύει DLD1. (Γ) Ο προσδιορισμός αλληλουχίας των προϊόντων έδειξε ότι το εξώνιο 4 ήταν συγκολλημένα έξω της κωδικοποιητικής αλληλουχίας εκφράζονται έτσι μόνο μικρότερη παραλλαγή ματίσματος (AC133-2). Η ακολουθία πάνω από το ηλεκτροφόρημα είναι AC133-1 με εξόνιο 4 που φαίνεται ανάμεσα στις γραμμές.

Η

Νοκ ντάουν του CD133

ΗΤ29 έχει ένα υψηλό επίπεδο έκφρασης CD133. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με ειδικές CD133 ή ομελέτα ελέγχου siRNA και ελέγχθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. κηλίδα Western έδειξε ότι η πρωτεΐνη ήταν σχεδόν ανιχνεύσιμα στο όταν χρησιμοποιήθηκε CD133 συγκεκριμένες siRNA. Σε αντίθεση, η επιμόλυνση του siRNA ελέγχου δεν έχει καμία επίδραση στην έκφραση της πρωτεΐνης (Σχήμα 3).

ΗΤ29 κύτταρα επιμολύνθηκαν είτε με CD133 ειδικό siRNA (ΗΤ29

CD133-) ή ως κωδικοποιημένο ελέγχου ((ΗΤ29

SSC). κηλίδωση Western επιβεβαίωσε την απώλεια της έκφρασης CD133 με γονιδιακή νοκ ντάουν. β-ακτίνη δείχνει ίσης φόρτωσης πρωτεΐνης.

η

Σύλλογος της έκφρασης CD133 με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

Είμαστε σε σύγκριση τον πολλαπλασιασμό ποσοστό μεταξύ των κυττάρων με υψηλά και χαμηλά επίπεδα CD133 χρησιμοποιώντας δύο πειραματικές προσεγγίσεις. Σε ΗΤ29 η πρωτεΐνη CD133 χτυπήθηκε κάτω και αριθμούς κυττάρων παρακολουθήθηκαν για 5 ημέρες (Σχήμα 4α), ενώ SW480 ήταν ταξινομημένο σε CD133 + /CD133- πληθυσμούς και τους αριθμούς των κυττάρων παρακολουθήθηκαν πάνω από 9 ημέρες (Σχήμα 4β). και τα δύο πειράματα έδειξαν τα ίδια αποτελέσματα, δηλαδή δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των κυττάρων με υψηλή ή χαμηλή έκφραση CD133. Ομοίως, οι μετρήσεις του επιπλέοντα αποπτωτικών σωμάτων διάρκεια αυτής της περιόδου δεν έδειξαν καμία διαφορά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε μετά knockdown του CD133 σε ΗΤ29 (Σχήμα 4α) και τη διαλογή των SW480 σε καθαρούς πληθυσμούς CD133 + και CD133- (Σχήμα 4β). Μια δοκιμασία πορεία του χρόνου έγινε κατά τη διάρκεια αρκετών ημερών χωρίς συσχέτιση παρατηρείται μεταξύ CD133 και αριθμούς κυττάρων.

Η

Σύλλογος της έκφρασης CD133 με την απόπτωση και την αποικία σχηματισμό που προκαλείται σταυροσπορίνη

Ένα χαρακτηριστικό που μπορεί να είναι αναμένεται σε βλαστικά κύτταρα είναι η αντοχή σε απόπτωση μετά εξωγενή στρες. Τόσο πειραματικές προσεγγίσεις χρησιμοποιήθηκαν για να δοκιμαστεί η επίδραση των επιπέδων CD133 σχετικά με την αντοχή σε απόπτωση όταν εκτίθεται σε σταυροσπορίνη για 24 ώρες. Συγκλίνουσες αποτελέσματα ελήφθησαν δείχνουν ότι τα υψηλά επίπεδα του CD133 ανατίθενται αντίσταση σταυροσπορίνη. Λιγότεροι βιώσιμη ΗΤ29

CD133- κύτταρα ήταν παρόντες από ΗΤ29

SSC κύτταρα (Σχήμα 5α, p = 0,01)? Αντιστρόφως μεγαλύτερος αριθμός των βιώσιμων κυττάρων ήταν παρόντα στο ταξινομημένο πληθυσμό CD133 + από τον πληθυσμό CD133- (Σχ. 5β, p = 0,008). Δεν υπήρξε όμως καμία διαφορά μεταξύ των κυττάρων όταν εκτίθενται σε μόνο του DMSO.

CD133 έδωσε αντίσταση στην επαγόμενη από τη σταυροσπορίνη απόπτωση. Σχήμα 5α δείχνει ότι μετά από έκθεση σε σταυροσπορίνη υπήρχαν λιγότεροι βιώσιμων κυττάρων μετά από επιμόλυνση με CD133 ειδικά siRNA (ΗΤ29

CD133-) από ό, τι με τα ανακατωμένα ελέγχου (ΗΤ29

SSC) (p = 0.01). Δεν υπήρχαν διαφορές μεταξύ των κυττάρων μετά από έκθεση σε DMSO. Το Σχήμα 5b δείχνει ότι το CD133 + πληθυσμός των SW480 έδειξε κύτταρα έδειξαν σημαντικά μεγαλύτερη αντίσταση από τον πληθυσμό CD133- (p = 0.008). κύτταρα Σχήμα 5γ και 5δ δείχνουν CD133 + ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από ό, τι κλωνογονικού CD133- κύτταρα (p & lt? 0,0001 και p & lt? 0.003) σε 2D και 3D πολιτισμό αντίστοιχα. Σχήματα 5ε (αποικίες που σχηματίζονται από CD133 + κυττάρων) και 5F (αποικίες που σχηματίζονται από CD133- κύτταρα) δείχνουν ότι και οι δύο πληθυσμοί CD133 + και CD133- του SW480 ήταν σε θέση να σχηματίσουν αποικίες από μεμονωμένα κύτταρα (τυπικά αποικίες φαίνεται).

Η

Ένα άλλο χαρακτηριστικά του «βλαστική ικανότητα» είναι η ικανότητα να σχηματίζουν αποικίες. Αυτό ελέγχθηκε με ανάπτυξη μεμονωμένων κυττάρων σε μαλακό άγαρ για δύο εβδομάδες (3D καλλιέργειας) και καλλιέργεια 2D και η διαλογή CD133 + και CD133 – κύτταρα συγκρίθηκαν. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, οι αποικίες ήταν ορατές μετά από δύο εβδομάδες, αλλά ο αριθμός των αποικιών ήταν σημαντικά μεγαλύτερη στα κύτταρα CD133 + (Ρ & lt? 0,0001, και Ρ & lt? 0.003). Σε 2D και 3D καλλιέργεια αντίστοιχα (Σχήμα 5c και 5d)

Σύλλογος της έκφρασης CD133 με τη μετανάστευση των κυττάρων

Συγκριτική ανάλυση της κινητικότητας των κυττάρων μεταξύ των κυττάρων με υψηλή και χαμηλή έκφραση CD133 ελέγχθηκε από επικοινωνούντα δοκιμασίες μετανάστευσης. Τόσο πειραματικές συνθήκες που παράγεται σύμφωνα αποτελέσματα. Σημαντικά λιγότερες ΗΤ29

CD133- κύτταρα μετανάστευσαν κατά μήκος της μεμβράνης από ΗΤ29

SSC κύτταρα (Σχήμα 6α, p = 0.04). Αντιστρόφως, σημαντικά μεγαλύτερους αριθμούς CD133 + κυττάρων που μετανάστευσαν από κύτταρα CD133- (Σχήμα 6β, p = 0.03). Μια δοκιμασία τραυματίζοντας κυττάρων χρησιμοποιείται επίσης παρακάτω γονιδίου νοκ ντάουν η οποία έδειξε ότι οι άκρες της πληγής ήταν σημαντικά πιο κοντά στο ΗΤ29

SSC κύτταρα από ό, τι σε ΗΤ29

CD133- κύτταρα (p & lt? 0.001), επιβεβαιώνοντας με αυτόν τον τρόπο τη σχέση μεταξύ υψηλής έκφρασης CD133 και την αύξηση της κινητικότητα κυττάρου (Σχήμα 6γ).

Transwell μετανάστευσης μετρήθηκε μετά από νοκ ντάουν του CD133 σε ΗΤ29 και τη διαλογή των SW480 σε CD133 +/- πληθυσμούς. Σημαντικά λιγότερες ΗΤ29

CD133- κύτταρα μετανάστευσαν κατά μήκος της μεμβράνης από ΗΤ29

SSC κύτταρα (Σχήμα 6α, p = 0.04). Αντιστρόφως, μεγαλύτερο αριθμό ταξινομημένων CD133 + κυττάρων που μετανάστευσαν από κύτταρα CD133- (Σχήμα 6β, p = 0.03). Μια δοκιμασία τραυματίζοντας επίσης αναλάβει και γονιδίου νοκ ντάουν συνδέθηκε με σημαντική καθυστέρηση στο κλείσιμο του τραύματος που ήταν visiually αισθητή μετά από μόνο 24 ώρες (Σχήμα 6γ) και στατιστικά σημαντική (p & lt? 0.001).

Η

πλαστικότητας της έκφρασης CD133 σε κυτταρικές σειρές

Η κυτταρική σειρά SW480 ήταν ταξινομημένο σε CD133 + και CD133- πληθυσμούς που διατηρήθηκαν σε πρότυπες συνθήκες καλλιέργειας ιστού και υποβλήθηκαν σε τακτική ανάλυση με κυτταρομετρία ροής. Άμεση εκ νέου ανάλυση έδειξε ότι οι πληθυσμοί CD133 + και CD133- ήταν, αντίστοιχα, 97,6% και 99,9% καθαρό (Σχήμα 7α). Ποσοτική PCR έδειξε μεταγραφική καταστολή του CD133 στον πληθυσμό CD133- και αν CD133 mRNA ήταν ακόμη ανιχνεύσιμη, ήταν μόνο στο 15% του επιπέδου δει στο CD133 + πληθυσμού (Σχήμα 8).

SW480 ήταν ταξινομημένα σε CD133 θετικών και αρνητικών πληθυσμούς οι οποίοι στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν χωριστά. (Α) Gating ορίστηκε έτσι ώστε μόνο οι ακραίες πληθυσμοί συλλέχθηκαν τα οποία, στην άμεση επανέλεγχος, απεδείχθη ότι είναι πολύ καθαρούς πληθυσμούς. (Β) Μετά από παρατεταμένη καλλιέργεια, τόσο των ταξινομημένων πληθυσμών έγινε η διφασική. Οι αναλογίες των κυττάρων CD133 + και CD133- έγινε σταθερή μετά από τρεις εβδομάδες και δεν άλλαξε μετά από αυτό (αν και δεν ήταν το ίδιο με το αρχικό γονικό κύτταρο γραμμή).

Η

Q-RT-PCR ανάλυση των διαλεγμένων πληθυσμών έδειξαν ότι υπήρχε μεταγραφική καταστολή του

CD133

στον πληθυσμό CD133- (αν και χαμηλά επίπεδα του mRNA ήταν ακόμη ανιχνεύσιμα).

η

η παρατεταμένη καλλιέργεια οδήγησε σε δύο πληθυσμούς επαναφορά σε ένα δίτροπο προφίλ. Ο πληθυσμός CD133 +, μετά από 3 εβδομάδες, αποτελούνταν από CD133 + κυττάρων 70% και 30% των κυττάρων CD133-, συχνότητες οι οποίες παρέμειναν σταθερά μετά για τουλάχιστον 3 μήνες. Τα ευρήματα έρχονται σε αντίθεση με τις δημοσιευμένες εκθέσεις στις οποίες καθαρά πληθυσμούς κυττάρων CD133 + επανέλθει στην κανονική αναλογία CD133 +/- πληθυσμών [8]. Τα κύτταρα CD133- αναπτύξει ένα πληθυσμό κυττάρων CD133 + το οποίο, μετά από 3 εβδομάδες, έφτασε το 17%, αλλά δεν αύξησε στη συνέχεια (Σχήμα 7β).

Συζήτηση

Το CD133 + πληθυσμού είναι μεταβλητή σε CRC κυττάρων γραμμές

διαλογή μεγάλων αριθμών κυττάρων από οκτώ καλά καθιερωμένες κυτταρικές σειρές CRC με κυτταρομετρία ροής για την ποσοτικοποίηση του μεγέθους του πληθυσμού CD133 +. Βρήκαμε ότι, σε δύο κυτταρικές σειρές (DLD1 και SW837) δεν υπήρχαν ανιχνεύσιμες CD133 + κυττάρων, σε δύο κυτταρικές σειρές (Caco2 και ΗΤ29) ο CD133 + πληθυσμών ήταν & gt? 95% του συνόλου των καρκινικών κυττάρων ενώ οι υπόλοιπες κυτταρικές σειρές είχαν μεγέθη πληθυσμού που κυμαίνονται από 32% -64%. Τα στοιχεία μας είναι σε συμφωνία με μελέτες από letaet al. και Dalerba et al. [18], [24] οι οποίοι ανέφεραν παρόμοια επίπεδα έκφρασης CD133 στις κυτταρικές σειρές ΗΤ29, Lovo και καθόλου έκφραση σε DLD1. Τα δεδομένα μας είναι, ωστόσο, ασύμφωνα με εκείνες του O’Brien και Ricci-Vitiani [8], [9], αν και η αιτία αυτής της διαφοράς είναι άγνωστη. Μια πιθανότητα είναι ότι οι μελέτες μας που χρησιμοποιούνται καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές, ενώ οι άλλες μελέτες χρησιμοποιούνται νέες κυτταρικές γραμμές που προέρχονται στο δικό τους εργαστήρια. Είναι πιθανό η παρατεταμένη πολιτισμός μπορεί να προκαλέσει διατηρείται αλλαγές στον κανονισμό CD133 αν και αυτό από μόνο του θα δείχνουν ότι η έκφραση CD133 δεν είναι ένα πολύ καλό δείκτη των ΚΕΠ. Οι διαφορές στην τεχνική μπορεί να παρέχει μια άλλη εξήγηση αν και χρησιμοποιήσαμε τα ίδια αντισώματα ως O’Brien και Ricci-Vitiani και κρατήσαμε φορές την επώαση με το πρωτεύον αντίσωμα σε 15 λεπτά. Είτε έτσι είτε αλλιώς, τα δεδομένα μας έδειξαν σαφώς ότι σε 4/8 κυτταρικές σειρές, ο πληθυσμός CD133 + είτε απουσιάζει ή περιλαμβάνει σχεδόν το σύνολο του πληθυσμού των κυττάρων του όγκου. Τα στοιχεία αυτά, μαζί με άλλα δεδομένα που παρουσιάζονται παρακάτω, μας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι CD133 δεν είναι πιθανώς ένας ειδικός δείκτης των βλαστικών κυττάρων στο CRC.

Μόνο παραλλαγή CD133 συναρμογής AC133-2 εκφράζεται σε κολικό ιστό

Αν και μια ευρεία ποικιλία παραλλαγών ματίσματος έχουν περιγραφεί για CD133, μόνο ένα (ονομάζονται AC133-1 και η οποία ήταν η πρώτη που πρόκειται να κλωνοποιηθεί) κατανεμήθηκε ένας αριθμός ακολουθίας αναφοράς. Αυτό περιέχει το πλήρους μήκους κωδικοποιημένη αλληλουχία ενώ μία δεύτερη παραλλαγή ματίσματος (AC133-2, η δεύτερη για να κλωνοποιηθεί) φαίνεται να ματίσματος έξω εξώνιο 4. Η ανάλυσή μας της 8ης κυτταρικών γραμμών CRC και 10 δείγματα φυσιολογικού βλεννογόνου, χρησιμοποιώντας τόσο τελικού σημείου και μεθοδολογίες σε πραγματικό χρόνο, τα οποία προσδιορίζονται μόνο παραλλαγή AC133-2. Αυτό θα ήταν σύμφωνο με τη μελέτη του Yu et al. [25] στην οποία AC133-2 αναφέρθηκε ως η παραλλαγή ματίσματος που είναι παρούσα σε πολλές βλαστοκυττάρων διαμερίσματα ενώ AC133-1 περιορίζεται σε εμβρυϊκό εγκέφαλο και τους σκελετικούς μύες.

έκφραση CD133 συνδέεται με μερικά χαρακτηριστικά του ο βλαστοκυττάρων φαινότυπος

προκειμένου να αξιολογηθεί η λειτουργία του CD133, η κυτταρική γραμμή ΗΤ29 ελέγχθηκε μετά knockdown του CD133 με παρεμβολή RNA. Αυτή η μέθοδος μπορεί επίσης να παράγει «εκτός στόχου» αποτελέσματα και έτσι μια συμπληρωματική προσέγγιση χρησιμοποιήθηκε για να διαχωρίσει SW480-α κυτταρικής σειράς με έναν CD133 + πληθυσμό 40% – σε καθαρούς πληθυσμούς CD133 + και CD133-. Και οι δύο τύποι πειραμάτων έδωσε παρόμοια αποτελέσματα. Πρώτον, τα επίπεδα του CD133 δεν φάνηκε να μεταβάλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό ή απόπτωση. Υπήρχαν ωστόσο σημαντικές διαφορές στα χαρακτηριστικά τα οποία μπορούν να θεωρηθούν ως μέρος του φαινοτύπου των βλαστικών κυττάρων. Έτσι υψηλά επίπεδα CD133 συσχετίστηκαν με αυξημένη κλωνογονικότητας και αντίσταση στην επαγόμενη σταυροσπορίνη απόπτωση. Το τελευταίο μπορεί να οφείλεται σε μια έμφυτη αντίσταση στην απόπτωση (ενδεχομένως που επιτελούνται από αυτές που αναφέρθηκαν ενώσεις μεταξύ της έκφρασης CD133 και αντι-αποπτωτικά γονίδια όπως FLIP (κασπάση 8 αναστολέα) και Bcl-2 [26]. Εναλλακτικά, μπορεί να οφείλεται σε ενισχυμένη κυτταροπροστατευτική στρατηγικές όπως την ικανότητα να εξωθηθεί ενεργά τοξικές ουσίες από το κυτταρόπλασμα [3].

ένα άλλο χαρακτηριστικό βρήκαμε ότι σχετίζονται με έκφραση CD133 ενισχύθηκε κινητικότητα των κυττάρων. Άλλες μελέτες έχουν προτείνει έναν ρόλο για CD133 στο κελί κινητικότητα δεδομένου ότι κλασικά εκφράζεται σε προεξοχές μεμβράνη [27], [28]. σε ορισμένες περιπτώσεις, όπως την εμβρυογένεση και την επούλωση τραυμάτων, τα βλαστικά κύτταρα πρέπει να αποκτήσουν χαρακτηριστικά της κινητικότητας. στο ΚΕΠ, τα χαρακτηριστικά της ενισχυμένης κινητικότητας μπορεί να επιτρέψει εισβολή και μετάσταση στην συμβεί-μια έννοια που υποστηρίζεται από τη μελέτη των Rappa et al, που βρήκαν την έκφρασή CD133 συνδέθηκε με μετάσταση στα κύτταρα μελανώματος [29]. Τα δεδομένα μας, ωστόσο, σε αντίθεση με εκείνες του Horst et al. [30] οι οποίοι δεν βρίσκουν ότι η έκφραση CD133 συνδέθηκε με την κυτταρική κινητικότητα σε Caco2.