Αφηρημένο

Ιστορικό

εξιδρώματα ιστών περιέχουν χαμηλά επίπεδα των πρωτεϊνών του συμπληρώματος στον ορό, και ρυθμιστικές επιπτώσεις τους στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Εξετάσαμε συγκεκριμένα συστατικά του συμπληρώματος στον ορό σε συντονισμό της ενεργοποίησης των καταστολείς των όγκων p53 και WWOX (ονομάζεται επίσης υπέρ ή WOX1) και κινασών ERK, JNK1 και STAT3 σε ανθρώπινα κύτταρα DU145 του προστάτη.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

DU145 κύτταρα καλλιεργήθηκαν για μία νύχτα σε 1% φυσιολογικό ανθρώπινο ορό ή σε ανθρώπινο ορό εξαντλημένο μιας δεδομένης πρωτεΐνης συμπληρώματος. Σύμφωνα με συμπλήρωμα C1q- ή συνθήκες C6-free, WOX1 και ERK ήταν κυρίως παρούσα στο κυτταρόπλασμα χωρίς φωσφορυλίωση, ενώ φωσφορυλιωμένη JNK1 συσσωρεύθηκε σε μεγάλο βαθμό στους πυρήνες. Εξωγενείς C1q αποκατασταθεί ταχέως την ενεργοποίηση WOX1 (με φωσφορυλίωση Tyr33) σε λιγότερο από 2 ώρες. Χωρίς συμπλήρωμα ορού C9, ρ53 ενεργοποιήθηκε, και υαλουρονάνη (ΗΑ) αντέστρεψε το αποτέλεσμα. Υπό συνθήκες C6-free, ΗΑ επαγόμενη ενεργοποίηση STAT3, ενός ενισχυτή της μετάστασης. Αξίζει να σημειωθεί ότι, εξωγενείς C1q επάγεται σημαντικά απόπτωση WOX1-κύτταρα που υπερεκφράζουν DU145, αλλά όχι όχημα-εκφράζοντα κύτταρα. Ένα κυρίαρχο αρνητικό και Y33R μετάλλαξη της WOX1 μπλοκάρει την αποπτωτική δράση. C1q δεν ενίσχυσε ρ53 απόπτωση. Με συνολική εσωτερική ανάκλαση φθορισμού (TIRF) μικροσκοπία, προσδιορίσθηκε ότι C1q αποσταθεροποιηθεί προσκόλληση του WOX1 κυττάρων που εκφράζουν DU145 με μερική απόσπαση και το σχηματισμό επαγωγή του συμπλέγματος μικρολαχνών για την εστιακή προσκόλληση ιδιαίτερα στις μεταξύ των κυττάρων. Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε συρρίκνωση, διόγκωση της μεμβράνης και θάνατο. Αξίζει να σημειωθεί ότι, όπως προσδιορίζεται με ανοσοχρώση, καλοήθους προστατικής υπερπλασίας και του καρκίνου του προστάτη αποδείχθηκε ότι έχουν μια σημαντικά μειωμένη έκφραση του ιστού C1q, σε σύγκριση με αντίστοιχης ηλικίας κανονικούς ιστούς του προστάτη.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

συμπέρασμα ότι το συμπλήρωμα C1q μπορεί να επάγει την απόπτωση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη, με την ενεργοποίηση WOX1 και αποσταθεροποιητικών κυτταρική προσκόλληση. Προς τα κάτω ρύθμιση των C1q ενισχύει την υπερπλασία του προστάτη και το σχηματισμό καρκινικών λόγω της αποτυχίας της ενεργοποίησης WOX1

Παράθεση:. Χονγκ Q, Sze C-Ι, Lin S-R, Λι Μ-Η, Ο R-Υ, Schultz L, et al. (2009) συμπληρώνουν C1q Ενεργοποιεί Ογκοκατασταλτικής WWOX να επάγουν απόπτωση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 4 (6): e5755. doi: 10.1371 /journal.pone.0005755

Επιμέλεια: Nils Cordes, Dresden University of Technology, Γερμανία

Ελήφθη: 4η Ιανουαρίου, 2009? Αποδεκτές: 5 Μαΐου 2009? Δημοσιεύθηκε: 1 Ιούνη του 2009

Copyright: © 2009 Hong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα ήταν υποστηρίζεται εν μέρει από το Ίδρυμα Guthrie Παιδείας και Έρευνας, το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, την Ταϊβάν (NSC96-2320-B-006-014, 96-2628-Β-006-041-my3 & amp? 96-2628-Β-006- 045-my3), το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών Υγείας, Ταϊβάν (NHRIEX97-9704BI), οι Εθνική Cheng Kung University Landmark Έργα (C0167), και το Υπουργείο άμυνας των ΗΠΑ (BC075692) στην NS Chang. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Το υαλουρονικό οξύ ή υαλουρονάνη (ΗΑ) συμμετέχει σε αξιοσημείωτα πλήθος κυτταρικών και φυσιολογικών γεγονότων, συμπεριλαμβανομένης της εμβρυϊκής ανάπτυξης, μορφογένεση, διαφοροποίηση, φλεγμονή, τραυματισμό επούλωσης, ανοσοαπόκριση, και την εξέλιξη του καρκίνου και μετάσταση [1] – [ ,,,0],4]. ΗΑ εμπλέκεται στην έναρξη και την εξέλιξη της φλεγμονής και στα δύο κυτταρικά και εξωκυτταρικά επίπεδα [5], [6]. Στα κυτταρικά επίπεδα φλεγμονής, ΗΑ στρατολογεί ουδετερόφιλα, ενεργοποιεί τα μακροφάγα και διεγείρει την ωρίμανση των δενδριτικών κυττάρων. Ωστόσο, στον ορό ΗΑ μπορεί να αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες συμπληρώματος. Φυσικά απαντώμενες γλυκοζαμινογλυκάνες πολυθειωμένα, όπως ηπαρίνη, να περιορίζει την ενεργοποίηση του συμπληρώματος στον ορό μέσω τόσο κλασσικής και εναλλακτικής οδού κατά τη διάρκεια της φλεγμονής [7] – [10]. Η δραστικότητα των γλυκοζαμινογλυκανών στην αναστολή της ενεργοποίησης του συμπληρώματος εξαρτάται από την έκταση και τις θέσεις των πολυθείωση τους. Εκτός αν διαμορφωτικώς τροποποιημένο, μη-θειωμένη ΗΑ, ακόμη και σε υψηλές συγκεντρώσεις (1-5 mg /ml), δεν μπορεί να περιορίσει την ενεργοποίηση του συμπληρώματος [7], [11] – [13]. Η επαγωγή της ενεργοποίησης του συμπληρώματος στον ορό έχει θεωρηθεί ως σημαντική στρατηγικές στη θανάτωση καρκινικών κυττάρων

in vivo

[14], [15]. Καρκίνος που προέρχεται από κύτταρα αναστολείς για τον αποκλεισμό νωρίς συστατικά συμπληρώματος είναι γνωστό ότι ενισχύουν την ανάπτυξη του καρκίνου [16]. Η έκφραση της εναλλακτικής αναστολέα οδού παράγοντα Η σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα φαίνεται να είναι κρίσιμη για την επιβίωσή τους [17]. Παρ ‘όλα αυτά, ο λειτουργικός ρόλος του κάθε συστατικού του συμπληρώματος του ορού στη ρύθμιση επιβίωση των καρκινικών κυττάρων είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη.

Όπως άλλους ιστούς, προστάτη εκτίθεται σε εκκρίματα από το αίμα, το οποίο περιέχει χαμηλά επίπεδα κυκλοφορούσες πρωτεΐνες συμπληρώματος. Είτε πρωτεΐνες του συμπληρώματος ελέγχουν την ανάπτυξη του προστάτη των κυττάρων και υπερπλασία με την ηλικία είναι άγνωστη. Εδώ, με τη χρήση ορών με επιλεγμένα διαγραφή των πρωτεϊνών συμπληρώματος, ερευνήσαμε εάν κάθε επιμέρους πρωτεΐνη συμπληρώματος ρυθμίζει την ενεργοποίηση των καταστολείς όγκων και πρωτεΐνες κινάσης σε ανθρώπινα κύτταρα DU145 του προστάτη. Αυτές οι πρωτεΐνες περιλαμβάνουν εξωκυτταρικό σήμα ρυθμίζεται /ενεργοποιείται από μιτογόνο πρωτεΐνη κινάση κινάσης (ERK ή ΜΑΡΚ) [18], WW οξειδοαναγωγάση που περιέχει την περιοχή (WWOX, FOR, ή WOX1) [19] – [21], p53 [22], c -Jun

Ν

-τερματική κινάση (JNK1), και μετατροπέας σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (STAT3) [23] – [25]. Έχουμε διαπιστώσει ότι χωρίς συμπλήρωμα ορού C1q ή C6, τα βασικά επίπεδα της ενεργοποίησης ή πυρηνική συσσώρευση της ERK και WOX1 είχαν μειωθεί σημαντικά, ενώ συστατική ενεργοποίηση του JNK1 συμβεί. WOX1 είναι ένα ογκοκατασταλτικό και προαποπτωτική πρωτεΐνη [19] – [21? σχόλια]. Είναι ενδιαφέρον ότι, στην απουσία συμπληρώματος ορού C9, συστατική ενεργοποίηση ρ53 συμβεί. Υψηλού μοριακού μεγέθους ΗΑ επάγεται σημαντικά την ενεργοποίηση STAT3 σε DU145, μόνο όταν C1q απουσίαζε στον ορό. STAT3 προάγει τον καρκίνο του προστάτη εισβολή [23] – [25]. Τέλος, C1q μόνη της ήταν σε θέση να ενεργοποιήσει έκτοπη WOX1 στη θανάτωση καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Συζητήσαμε το πιθανότερο σενάριο για την κυκλοφορία ή περικυτταρικές ΗΑ και τη συμπλήρωση των πρωτεϊνών στη ρύθμιση της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων και του θανάτου μέσω της ενεργοποίησης της p53, WOX1, JNK1, και STAT3.

Αποτελέσματα

Συμπλήρωμα C1q ενεργοποιεί ογκοκατασταλτικό WWOX /WOX1 στα κύτταρα DU145 ανθρώπινο προστάτη

καθοριστεί αν C1q ενεργοποιεί ενδογενείς WOX1 για την πυρηνική συσσώρευση. Ουσιαστικές αποδείξεις αποκαλύπτει ότι WOX1 είναι ένας καταστολέας όγκων [19] – [21], [26]. Η φωσφορυλίωση του WOX1 στο Tyr33 (ρ-WOX1) είναι απαραίτητη για την αποπτωτική δραστικότητα του τόσο

in vitro

και

in vivo

[27] – [31]. Παρ ‘όλα αυτά, κατά τη διάρκεια της αρχικής υπερπλασία και καρκινικές στάδια, υπάρχει μια σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης WOX1 και φωσφορυλίωση Tyr33 στον προστάτη, του δέρματος και του μαστού, και ότι η έκφραση μειώνεται δραματικά κατά τη διάρκεια της κακοήθειας και μετάσταση

in vivo

[21] , [29], [32]. Ποντικού WOX1 /Wwox είναι κρίσιμης σημασίας για την επιβίωση μετά τη γέννηση, στο βαθμό που οι ποντικοί νοκ-άουτ θα μπορούσε να επιβιώσει για μόνο ένα μήνα [20], [33]. Επίσης, αυτή η πρωτεΐνη είναι απαραίτητη για το φυσιολογικό μεταβολισμό των οστών [33]. Οι μηχανισμοί όσον αφορά τον έλεγχο για WOX1 να ασκήσει prosurvival ή προαποπτωτικών λειτουργίες απομένουν να καθοριστούν.

Ανθρώπινα κύτταρα DU145 καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα με την παρουσία βόειου εμβρυϊκού ορού θερμο-απενεργοποιημένο (10%), ακολουθούμενη από την πείνα για 1 hr χωρίς ορό. Αυτά τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με καθαρισμένη C1q για 1 ώρα. Localization ρ-WOX1 προσδιορίστηκε με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού. Αυτά τα πεινασμένα κύτταρα είχαν πολύ χαμηλά επίπεδα κυτταροπλασματικής ρ-WOX1 (Εικ. 1Α). Εξωγενείς C1q επάγεται ταχέως συσσώρευση p-WOX1 στους πυρήνες (Εικ. 1Β). Σε σύγκριση, όταν τα πέθαναν από κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 1% C1q-εξαντλημένο (ΔC1q) ανθρώπινο ορό για 1 ώρα, ρ-WOX1 εντοπίστηκε κυρίως στο κυτταρόπλασμα (Εικ. 1 C). Ανασύσταση του ορού με καθαρισμένο ΔC1q C1q ταχέως επαγόμενη συσσώρευση p-WOX1 στους πυρήνες (Εικ. 1ϋ).

(Α, Β) κύτταρα DU145 αναπτύχθηκαν σε γυάλινο κάλυμμα και καλλιεργήθηκαν για μία νύχτα σε 10% θερμο-απενεργοποιημένο εμβρυϊκό βόειο ορό. Τα κύτταρα στη συνέχεια πέθαναν κάτω από συνθήκες χωρίς ορό για 1 ώρα, που ακολουθείται από κατεργασία με ή χωρίς καθαρισμένο C1q (1 μg /ml) για 1 ώρα. Ο εντοπισμός του ενδογενούς Tyr33-φωσφορυλιωμένο WOX1 (ρ-WOX1) προσδιορίστηκε με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού. (C, D) Επιπλέον, τα πέθαναν από κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε 1% C1q-εξαντλημένο ανθρώπινο ορό (ορός ΔC1q) για 1 ώρα, με την παρουσία ή απουσία εξωγενούς C1q (1 μg /ml). (Ε) παρουσία π-WOX1 στους πυρήνες παρουσιάζεται από την καταμέτρηση -100 κύτταρα σε 3 πειράματα (μέση ± τυπική απόκλιση).

Η

Συμπληρώματος C1q ενεργοποιεί την έκτοπη WOX1 για να επάγει απόπτωση κυττάρων DU145

Θα καθοριστεί αν C1q ενεργοποιεί έκτοπη WOX1 για επαγωγή απόπτωσης. κύτταρα DU145 ήταν επιμολυσμένα με EGFP-WOX1 (με ετικέτα EGFP) ή EGFP και μόνο με ηλεκτροπόρωση. Αυτά τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα (10% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό), ακολουθούμενη από κατεργασία με καθαρισμένο C1q για 24 ώρες. C1q ενισχυμένη WOX1 επαγόμενη απόπτωση και ανάπτυξη καταστολή των κυττάρων DU145 με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, όπως αποκαλύπτεται από τον αυξημένο κυτταρικό πληθυσμό κατά τη φάση SubG1 και μειωμένο πληθυσμό κατά τη φάση G0 /G1 του κυτταρικού κύκλου (σχ. 2Α και 2Β και Συμπληρωματική Σχ. S1). Σε ελέγχους, C1q δεν επάγουν απόπτωση σε κύτταρα που υπερεκφράζουν DU145 φορέα EGFP μόνο (Σχ. 2Α και 2Β).

(Α) κύτταρα DU145 επιμολύνθηκαν με EGFP-WOX1 (tagged με EGFP) ή EGFP μόνος με ηλεκτροπόρωση , καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με καθαρισμένο C1q (1 μg /ml) για 24 ώρες. C1q ενισχυμένη WOX1-επαγόμενη απόπτωση των κυττάρων DU145 (βλέπε αυξήσεις στη φάση SubG1). Σε ελέγχους φορέα, C1q δεν ενίσχυσε την απόπτωση σε κύτταρα που υπερεκφράζουν DU145 EGFP. (Β) αντιπροσωπευτικό σετ δεδομένων από 3 πειράματα δείχνεται στο ραβδόγραμμα. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν με επιμόλυνση κυττάρων DU145 με διάφορες ποσότητες WOX1, που ακολουθείται από κατεργασία με 1 μg /ml C1q όλη τη νύχτα (βλέπε συμπληρωματικό σχήμα. S1). WOX1: EGFP-WOX1. Vector: μόνο EGFP. ΕΡ: κύτταρα χωρίς ηλεκτροδιάτρηση. (Γ) καθορίστηκαν Σταθερά επιμολυσμένα των BCC κυττάρων για την έκφραση ή EGFP ΕΟΡΡ- hWOX1 (ανθρώπινη WOX1 /WWOX). Με time-lapse μικροσκοπία, C1q (1 μg /ml) προκάλεσε θάνατο του hWOX1-εκφράζοντα κύτταρα, αλλά όχι EGFP-εκφράζοντα κύτταρα. Αυτά τα κύτταρα hWOX1 εκφράζουν φάνηκε να υποστούν τυπικές απόπτωση, καθώς παρουσίασαν συρρίκνωση κυττάρου και σχηματισμό φυσαλίδων μεμβράνης σε μια εποχή που σχετίζονται τρόπο. Ένα αντιπροσωπευτικό δεδομένα παρουσιάζεται από 5 πειράματα.

Η

Η ενίσχυση της απόπτωσης από C1q δεν οφειλόταν στην ενεργοποίηση του συμπληρώματος καταρράκτη στο εμβρυϊκό βόειο ορό, στο μέτρο που ο ορός ήταν απενεργοποιημένο με θέρμανση. Επίσης, υπό συνθήκες χωρίς ορό, εξωγενείς C1q ενισχυμένη έκτοπη WOX1 απόπτωση που διαμεσολαβείται (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι WOX1 είναι καθοδικός τελεστής του C1q-απόπτωση, χωρίς τη συμμετοχή της ενεργοποίησης του συμπληρώματος.

υπό παρόμοιες πειραματικές συνθήκες, δείξαμε ότι C1q αυξημένη απόπτωση σε κύτταρα που υπερεκφράζουν WOX1. Αυτές περιλάμβαναν MCF7 μαστού (Συμπληρωματικό Σχ. S2), και νευροβλάστωμα SH-SY5Y (Συμπληρωματικές Εικ. S3) και τα κύτταρα SK-N-SH (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Και πάλι, καμία επίδραση δεν παρατηρήθηκε με τη χρήση κυττάρων που υπερεκφράζουν μόνο EGFP.

Παράλληλα, σταθερά επιμολυσμένα καρκινώματος του δέρματος βασικοκυτταρικό καρκίνωμα (BCC) κύτταρα για την έκφραση EGFP ή ανθρώπινο WWOX /WOX1 (hWOX1 με ετικέτα EGFP) καθορίστηκαν χρησιμοποιώντας G418 επιλογή. Με μικροσκοπία time-lapse, δείξαμε ότι τα κύτταρα που εκφράζουν EGFP BCC ήταν ανθεκτικά σε C1q μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο, ενώ hWOX1 εκφράζουν κύτταρα ήταν ευαίσθητα σε C1q (Σχ. 2C). Αυτά τα κύτταρα hWOX1 εκφράζουν φάνηκε να εμφανίζουν μορφολογία χαρακτηριστική της απόπτωσης, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής συρρίκνωση και διόγκωση της μεμβράνης.

N-τερματική

Tyr33-φωσφορυλιωμένη περιοχή ww του WOX1 είναι υπεύθυνη για C1q επαγόμενη απόπτωση κύτταρα DU145

προσδιορίστηκε η οποία τομέα (ες) σε WOX1 συμμετέχει σε C1q-μεσολαβούμενη απόπτωση κυττάρων DU145. Ανθρώπου και ποντικού WWOX /FOR /WOX1 αποτελείται από δύο

N-τερματική

domains WW, μια πυρηνική ακολουθία εντοπισμού, και ένα

C-τερματικό

μικρής αλυσίδας αλκοόλης αφυδρογονάσης /αναγωγάση (SDR) τομέα [19-21,34? σχόλια]. Ένα κυρίαρχο αρνητικό-WOX1 (dn-WOX1) σχεδιάστηκε προηγουμένως, με αλλαγές στο

Ν

τερματική πρώτη περιοχή ww [27]. dn-WOX1 είναι γνωστό να μπλοκάρει την αποπτωτική λειτουργία του γονιδίου ρ53 και την πρόληψη φωσφορυλίωση του ενδογενούς WOX1 στο Tyr33 [27]. Όταν τα κύτταρα DU145 παροδικά υπερεκφράζεται με DN-WOX1 (EGFP ετικέτα), τα κύτταρα αντιστάθηκαν C1q-επαγόμενη απόπτωση (Σχ. 3). Σε ελέγχους, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν μόνο με ένα φορέα EGFP, και τα κύτταρα δεν υφίστανται απόπτωση σε απόκριση προς C1q (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα ή βλέπε Εικ. 2). Σε θετικοί έλεγχοι, μη-επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με σταυροσπορίνη να διεγείρει απόπτωση (Εικ. 3).

(Α) κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε ηλεκτροδιάτρηση με διάφορα ποσότητα dn-WOX1 (tag EGFP) ή EGFP μόνο, ακολουθούμενο με καλλιέργεια για 24 ώρες. dn-WOX1 εκφράζουν κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με C1q (1 μg /ml) όλη τη νύχτα, και η ανάλυση κυτταρικού κύκλου εκτελέστηκε. EGFP που εκφράζουν κύτταρα κατεργάστηκαν παρομοίως (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, τα μη-επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς σταυροσπορίνη (1 μΜ) επί μία νύκτα. (Β, Γ) έναν εκπρόσωπο των δεδομένων που τόσο SubG1 και G0 /G1 φάση φαίνεται (από 3 πειράματα).

Η

Έτσι, με βάση τις παραπάνω παρατηρήσεις, η

Ν

-καταληκτική περιοχή ww του WOX1 είναι πιθανό να είναι υπεύθυνη για C1q επαγόμενη ενεργοποίηση WOX1 για τη θανάτωση καρκινικών κυττάρων. κύτταρα DU145 επιμολύνονται με το

Ν

-τερματική περιοχή ww του WOX1 (WOX1ww με μια ετικέτα EGFP) ή EGFP μόνο με ηλεκτροπόρωση και καλλιεργήθηκε για 24 ώρες. Με time-lapse μικροσκοπία των ζωντανών κυττάρων, εξωγενές C1q επαγόμενη απόπτωση των κυττάρων που εκφράζουν τα πεδία WW (Σχ. 4Α). Κυττάρων συρρίκνωση και πυρηνική συμπύκνωση εμφανίστηκε περίπου 100-130 min κατά την έκθεση των κυττάρων σε C1q. Αυτό είναι ένα τυπικό γεγονός της απόπτωσης. Όταν τα κύτταρα DU145 συνεπιμολύνθηκαν με WOX1ww και dn-WOX1, C1q επαγόμενη απόπτωση ελαττώνεται (Εικ. 4Β). Tyr33 φωσφορυλίωση σε WOX1 παίζει καθοριστικό ρόλο στην απόπτωση και

in vitro

και

in vivo

[27] – [31]. Εμείς μεταβληθεί Tyr33 να Arg33 στο πρώτο τομέα WW [27], [35], και διαπιστώσαμε ότι C1q δεν μεσολαβούν απόπτωση όταν τα κύτταρα εξέφρασαν αυτής της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης (Εικ. 4C). Στα κύτταρα ελέγχου φορέα, δεν παρατηρήθηκε απόπτωση (Σχ. 4D). C1q μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο δεν παρατηρήθηκε σε αυτά τα κύτταρα ελέγχου μετά από μεγαλύτερο από επώαση για περισσότερο από 8-24 ώρες, η οποία είναι παρόμοια με τις προαναφερθείσες παρατηρήσεις (Σχ. 2).

(Α) Live DU145 κύτταρα- εκφράζοντας την

Ν

-τερματική περιοχή ww (WOX1ww? ετικέτα EGFP) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με C1q (1 μg /ml), ακολουθούμενη από την καταγραφή μορφολογικές αλλαγές με αυτόματη μικροσκοπία time-lapse (ένα καρέ ανά 10 λεπτά). Κυττάρων συρρίκνωση και πυρηνική συμπύκνωση εμφανίστηκε περίπου 100-130 min κατά την έκθεση των κυττάρων σε C1q. (Β) Όταν τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με WOX1ww και dn-WOX1, C1q επαγόμενη απόπτωση ήταν σημαντικά μειωμένη. (C) Τροποποίηση του Tyr33 να Arg33 στο WOX1 δεν προκάλεσε C1q μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο. (D) αριθ απόπτωση παρατηρήθηκε σε κύτταρα που εκφράζουν EGFP μόνο κατά την έκθεση σε C1q. Σε σύγκριση με τα ανωτέρω πειράματα, η συγκέντρωση C1q αυξήθηκε για τα πειράματα μικροσκοπία time-lapse. Ένα αντιπροσωπευτικό σύνολο δεδομένων φαίνεται από 5 πειράματα. Περίπου 100 κύτταρα εξετάστηκαν στο τέλος της μικροσκοπίας time-lapse. Μια νέα φωτογραφία του κυττάρου που εκφράζει πράσινο φθορισμό και το φωτεινό πεδίο εικόνα εμφανίζεται (πριν την πρόκληση με C1q).

Η

Η /απόπτωση WOX1 που προκαλείται C1q επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με ανάλυση κατάτμησης μεσονουκλεοσωμικού DNA χρησιμοποιώντας αγαρόζης ηλεκτροφόρηση πηκτής. Τα αποτελέσματα έδειξαν τα διασπασμένο σκάλες DNA όπως επάγεται από C1q σε WOX1 εκφράζουν DU145 και SH-SY5Y κύτταρα (Εικ. 5 και Συμπληρωματικό Σχ. S4). Σε κατάλληλα κύτταρα ελέγχου που εκφράζουν EGFP ή τίποτα, C1q δεν προκάλεσε DNA κατακερματισμού (Εικ. 5 και συμπληρωματική Εικόνα. S4).

(Α) κύτταρα DU145 ηλεκτροδιατρήθηκαν με κατασκευές έκφρασης cDNA της WOX1, dn-WOX1 ( DN), και /ή ρ53. 24 ώρες αργότερα, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε C1q για 8 ώρες. Σε κατάλληλους ελέγχους, τα κύτταρα ηλεκτροδιατρήθηκαν με μέσο (Sham) ή χωρίς ηλεκτροδιάτρηση (Cont). Δεν DNA κατακερματισμός παρουσιάστηκε στους ελέγχους αυτούς. C1q αύξησε την κατάτμηση του DNA σε κύτταρα που εκφράζουν WOX1, αλλά όχι p53. C1q κατέστειλε p53 /WOX1-αυξημένο κατακερματισμό του DNA. dn-WOX1 ανέστειλε κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από ρ53. (Β) Η ένταση της κατάτμησης ϋΝΑ ποσοτικοποιήθηκε με Photoshop, και κατά μέσο όρο αποτελέσματα φαίνονται στο ραβδογράφημα ήταν από δύο πειράματα. Ο έλεγχος «Sham» (χωρίς θεραπεία C1q) θεωρείται ως 0%.

Η

C1q δεν αυξάνει p53-απόπτωση

Έχουμε δείξει ότι ογκοκατασταλτικό ρ53 αλληλεπιδρά φυσικά με WOX1 , και αμφότερες οι πρωτεΐνες μπορούν να προκαλέσουν απόπτωση σε συνεργιστικό τρόπο [26], [27], [30]. Είναι σημαντικό, WOX1 σταθεροποιεί p53 και εμποδίζει την υποβάθμιση της [30]. Προσδιορίσαμε το ρόλο της ρ53 και WOX1 σε C1q ρυθμιζόμενες κυτταρικό θάνατο. Όταν τα κύτταρα DU145 παροδικά υπερεκφράζεται με p53, C1q δεν αύξησε σημαντικά την έκταση της κατάτμησης DNA (Σχ. 5Α και 5Β). Σε συνδυασμό, τα δύο ρ53 και WOX1 αύξησε την κατάτμηση του DNA. Περιέργως, C1q κατέστειλε τον κατακερματισμό του DNA στα κύτταρα p53 /WOX1 εκφράζουν. Σε συμφωνία με τις προηγούμενες παρατηρήσεις μας [27], dn-WOX1 αποδείχθηκε ότι αναστέλλει ρ53-διαμεσολαβούμενη κατάτμησης DNA (Σχ. 5Α και 5Β).

έκτοπη WOX1 επάγει το σχηματισμό δεσμών μικρολαχνών ανάμεσα κύτταρα DU145 και ενισχύει C1q ο σχηματισμός συμπλέγματος

Εμείς εξέτασε τις μορφολογικές αλλοιώσεις των κυττάρων που προκαλείται από την έκτοπη έκφραση με EGFP ή EGFP-WOX1 στα κύτταρα DU145, καθώς και την επίδραση των C1q. μικροσκοπίας time-lapse έδειξε ότι C1q που προκαλείται συρρίκνωση και διόγκωση της μεμβράνης του WOX1 εκφράζουν DU145 και BCC κυττάρων κατά τη διάρκεια της θεραπείας για 2-4 ώρες ή και περισσότερο (Σχ. 2C και 4Α). Όταν τα κύτταρα DU145 υπερεκφράστηκαν με EGFP και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα, αυτά τα ηρεμούντα κύτταρα προσκολλημένα κατηγορηματικά στη γυάλινη επιφάνεια κάλυμμα, όπως προσδιορίστηκε με συνολική εσωτερική ανάκλαση φθορισμού (TIRF) μικροσκοπία (Σχ. 6Α). μέτρα απεικόνιση TIRF τα πρωτεϊνικά δυναμική γεγονότα σχετικά με την κυτταρική μεμβράνη και περιοχές κυτταροσκελετική [36], [37]. Είναι ενδιαφέρον, παροδικά υπερεκφράζεται ΕΟΡΡ- WOX1 επάγεται σχηματισμός στικτή στην κυτταρική επιφάνεια, και αυτά τα punctates, που περιέχει EGFP-WOX1, ως επί το πλείστον συγκεντρωμένα σε μεταξύ των κυττάρων (Σχήμα 6Β? Βλ. Βέλη). Σε υψηλότερη μεγέθυνση, οι punctates ήταν πράγματι μικρολάχνες, οι οποίες είναι αναγκαίες για την εστιακή προσκόλληση (Σχ. 6C). Αξίζει να σημειωθεί ότι, πολλά από αυτά τα κύτταρα WOX1 εκφράζουν προσκολλάται πάνω στη γυάλινη επιφάνεια κάλυμμα κυρίως από περικυτταρικό μικρολάχνες, όπως κοιλιακή περιοχή τους αποσπάστηκαν από την επιφάνεια. Κατά τη διάρκεια της θεραπείας για 1 ώρα, C1q αύξησε σημαντικά το σχηματισμό δεσμών μικρολάχνες σε μεταξύ των κυττάρων (Σχήμα 6Β? Βλ. Βέλος). Η δράση αυτή φαίνεται να αποσταθεροποιήσει την προσκόλληση των κυττάρων για την μετέπειτα συρρίκνωση, διόγκωση μεμβράνης και τελικά το θάνατο. Σε συμφωνία με την πρόσφατη έκθεση μας [38], WOX1 μπορεί να συσχετιστεί με την επιφάνεια των κυττάρων υαλουρονιδάση Hyal-2.

(Α) Όταν τα κύτταρα DU145 επιμολύνθηκαν με EGFP και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα, τα κύτταρα αυτά προσκολλώνται κατηγορηματικά στο γυάλινο κάλυμμα επιφάνεια, όπως προσδιορίζεται με μικροσκοπία TIRF για τη μέτρηση της πράσινου φθορισμού επί της κυτταρικής μεμβράνης και κυτταροσκελετικών περιοχές (600 × μεγέθυνση). Epi: επιφθορισμού. (Β) Σε αντίθεση, παροδικά υπερεκφράζεται ΕΟΡΡ- WOX1 προκάλεσε το σχηματισμό punctates, όπως φάνηκε σε συστάδες, στην επιφάνεια των κυττάρων (βλέπε βέλη? 600 × μεγέθυνση). C1q αύξησε σημαντικά το σχηματισμό στικτή, ιδιαίτερα σε μεταξύ των κυττάρων (βλέπε βέλος). Αυξήσεις στους αριθμούς των punctuates είναι περίπου 3-6 φορές. (Γ) Τα συγκεντρωμένα punctates, τα οποία είναι πλούσια σε έκφραση EGFP-WOX1, είναι πράγματι μικρολάχνες στην επιφάνεια των κυττάρων (600 χ μεγέθυνση με μικροσκόπιο και 3x ψηφιακό μεγέθυνση).

Η

C1q εκφράζεται στο αρχειακό δείγματα προστάτη ιστών και σημαντικά προς τα κάτω σε υπερπλασία και καρκινικούς ιστούς του προστάτη

Οι παραπάνω παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι ελεύθερο ορού ή ιστού που προέρχεται από συμπλήρωμα C1q μπορεί να προκαλέσει την ενεργοποίηση WOX1

in vivo

, περιορίζοντας έτσι τα καρκινικά εξέλιξη. Ενώ οι μεταβολές των ανθρωπίνων

WWOX

γονιδίου συμβαίνουν πιο συχνά στον προστάτη και του μαστού [20], [21], [34], εξετάσαμε την έκφραση του C1q σε αρχειακό ιστούς του προστάτη από μεταθανάτια ασθενείς. Με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού, διαπιστώσαμε ότι σε σύγκριση με αντίστοιχης ηλικίας ιστούς του προστάτη, C1q είναι σημαντικά προς τα κάτω σε καλοήθη υπερπλασία του προστάτη (ΒΡΗ) και του καρκίνου του προστάτη (Σχήματα 7Α και 7Β?. 100 × μεγέθυνση). Σε υψηλότερη μεγέθυνση, C1q δείχθηκε να εκφράσει στα βασικά και επιθηλιακά κύτταρα των δειγμάτων αρχειακό προστατικό ιστό, και C1q ήταν colocalized με ρ-WOX1 σε αυτά τα κύτταρα (Εικ. 7C).

(Α) του προστάτη ιστούς, συμπεριλαμβανομένου κανονικό προστάτη, ΒΡΗ και καρκίνο του προστάτη, βάφτηκαν με ειδικό αντίσωμα έναντι C1q και στη συνέχεια με δευτερεύον αντίσωμα φθορισμού. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (100 × μεγέθυνση). (Β) C1q σημαντικά προς τα κάτω σε ΒΡΗ και καρκίνο του προστάτη, σε σύγκριση με αντίστοιχης ηλικίας ιστούς προστάτη (

ρ

& lt? 0,0001, η = 5?

t

δοκιμή Student). Όταν μη-άνοσο ορό χρησιμοποιήθηκε ως η πηγή για πρωτογενές αντίσωμα, δεν παρατηρήθηκε σήμα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). (Γ) C1q εκφράζεται στην βασική και επιθηλιακά κύτταρα των αρχειακό κανονικούς αδένες προστάτη (400 × μεγέθυνση). Τόσο C1q και ρ-WOX1 Οι colocalized σε αυτά τα κύτταρα. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν με τα κύτταρα αρχειακό αδένα από ΒΡΗ. Σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη, ο χρόνος έκθεσης για τη λήψη των φωτογραφιών για καλοήθη υπερπλασία του προστάτη αυξήθηκε. μπαρ κλίμακα, 100 μm.

Η

Ορός συμπληρώνουν C1q και C6 είναι απαραίτητα για την υποστήριξη των βασικών φωσφορυλίωση της ERK και WOX1 στα κύτταρα DU145

Ερευνήσαμε κατά πόσο αρνητική ρύθμιση των C1q

in vivo

μπορεί να μειώσει την ενεργοποίηση του καταστολείς όγκων

in vitro

, παρέχοντας έτσι καλύτερη επιβίωση για τον καρκίνο του προστάτη κύτταρα. DU145 κύτταρα καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα κάτω από συνθήκες χωρίς ορό, με την παρουσία 1% φυσιολογικό ανθρώπινο ορό, ή 1% ανθρώπινο ορό με εξάντληση του C1q, C6, C7, C8, C9 ή. Με κηλίδωση Western, διαπιστώσαμε ότι και οι δύο ΔC1q και ΔC6 ορούς δεν μπορούσε να υποστηρίξει την συστατική έκφραση WOX2 (ισομορφή WOX1) και ρ-ERK σε κύτταρα DU145 (Σχ. 8Α και 8Β), υποδηλώνοντας ότι C1q και C6 συστατικά του ορού είναι απαραίτητα για την έκφραση αυτών των πρωτεϊνών. Σε σύγκριση, το συστατικό C7, C8 και C9 δεν υποστήριξαν την έκφραση του WOX2 και ρ-ERK (Σχ. 8Α και 8Β). Έκφραση των ERK, WOX1, ΜΕΚ1, και ρ53 δεν επηρεάστηκε σημαντικά από τις προαναφερθείσες συνθήκες καλλιέργειας (Εικόνες 8Α και 8Β?. Δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα για ΜΕΚ1).

(Α, Β) κύτταρα DU145 καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα κάτω από συνθήκες (SF) χωρίς ορό, ή σε 1% φυσιολογικό ανθρώπινο ορό (NHS) ή NHS εξαντλημένο με C1q (ΔC1q), C6 (ΔC6), C7 (ΔC7), C8 (ΔC8), ή C9 (ΔC9). Σημαντική μείωση της έκφρασης ισομορφής WOX2 παρατηρήθηκε στα κύτταρα DU145 όταν καλλιεργούνται σε ΔC1q ή ορό ΔC6 (έναντι των μαρτύρων SF?

σ

& lt? 0.001?

t

test του Student), ενώ ΔC7, ΔC8, ή ΔC9 ορού ήταν λιγότερο αποτελεσματική. Η ενεργοποίηση ή φωσφορυλίωση του ERK (ρ-ΕΚΚ) ήταν εξαρτάται από την παρουσία του C1q ή C6 στον ορό (έναντι των μαρτύρων SF?

ρ

& lt? 0,001?

t

δοκιμή Student). Ένα αντιπροσωπευτικό σύνολο των δεδομένων από 3 πειράματα παρουσιάζεται. Τα γραφήματα μπάρας παρουσιάζουν τον μέσο όρο των 3 πειραμάτων. (C) Τα ανωτέρω κύτταρα επίσης αυξάνονται σε γυάλινες κάλυψη υπό ταυτόσημες συνθήκες ορού. Με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού, ορός χωρίς C1q ή C6 δεν θα μπορούσε να υποστηρίξει τη συστατική έκφραση της WOX2 (

σ

& lt? 0,0001, ως έναντι SF ή NHS?

t

test του Student). Περίπου 200 κύτταρα προσδιορίστηκαν ποσοτικά ατομικά υπό μικροσκοπία φθορισμού και το βαθμό φθορισμού αφαιρέθηκε (ή κανονικοποιημένη) από τους αρνητικούς μάρτυρες (κύτταρα χρωματίστηκαν με δευτερεύον αντίσωμα μόνο). Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI. (D, Ε) Τα ίδια κύτταρα, όπως αναφέρεται στο (Α), χρωματίστηκαν με αντίσωμα ρ-WOX1 και η έκταση της έκφρασης πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκε. (F) Και πάλι, όμοια πειράματα διεξήχθησαν για κηλίδωση Western. Σύμφωνα με C1q χωρίς όρους (ΔC1q ορού), η βασική ενεργοποίηση της WOX1 μειώθηκε σημαντικά (μείωση περίπου 50%?

σ

& lt? 0,001 από έναντι SF και NHS?

t

δοκιμή Student? n = 3).

η

Για να επιβεβαιώσετε τις παραπάνω παρατηρήσεις, μικροσκοπία ανοσοφθορισμού διεξήχθη. Κύτταρα από το παραπάνω πείραμα αναπτύχθηκαν σε γυάλινο κάλυμμα κάτω από τις ίδιες συνθήκες ορού, στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και βάφτηκαν με ειδικά αντισώματα φθορισμού. Και πάλι, διαπιστώσαμε ότι σε απουσία ορού C1q και C6, η έκφραση WOX2 ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε DU145 κύτταρα (Σχ. 8C). Επιπλέον, όταν τα κύτταρα DU145 καλλιεργήθηκαν σε ορό χωρίς C1q ή C6, τα επίπεδα του p-WOX1 μειώθηκαν σημαντικά σε κύτταρα DU145, σε σύγκριση με άλλες συνθήκες καλλιέργειας, όπως προσδιορίζεται με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού (Σχ. 8D και 8Ε). Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με κηλίδωση Western, η οποία αποκάλυψε ρύθμιση προς τα κάτω του ρ-WOX1 υπό C1q-free συνθήκες (Εικ. 8F). Υπό αυτές τις συνθήκες, π-WOX1 ήταν παρούσα κυρίως στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων DU145. Δεν απόπτωση παρατηρήθηκε σε αυτά τα κύτταρα κατά τη διάρκεια 24 ωρών σε καλλιέργεια, όπως προσδιορίζεται από τη μορφολογία των πυρήνων κηλιδώθηκαν με DAPI.

εξάντληση συμπληρώματος C9 προωθεί p53 πυρηνική συσσώρευση, και υαλουρονάνης διεγείρει την πυρηνική εξαγωγή

WOX1 φυσικά αλληλεπιδρά με ρ53 τόσο

in vitro

και

in vivo

, και μπορεί να επάγουν απόπτωση συνεργικά [21], [26], [27], [30]. Αν και εξωγενείς C1q δεν θα μπορούσε να αυξήσει την ρ53-μεσολαβούμενη απόπτωση (Σχ. 5), εξετάσαμε την επίδραση του συμπληρώματος ορού C1q και C6 στην ενίσχυση τα βασικά επίπεδα της ρ53 πυρηνική συσσώρευση ή ενεργοποίηση. Όταν τα κύτταρα DU145 αναπτύχθηκαν σε 1% φυσιολογικό ορό ή σε ορό χωρίς C1q ή C6, συσσώρευση του ρ53 στους πυρήνες ήταν μειωμένη, σε σύγκριση με τις συνθήκες χωρίς ορό (Εικ. 9Α και 9C). Αξίζει να σημειωθεί ότι, χωρίς C9 ορού, ρ53 συσσωρευτεί στους πυρήνες (Εικ. 9Β και 9C), προτείνοντας ότι το συμπλήρωμα στον ορό C9 είναι σε θέση να περιορίσουν την ενεργοποίηση ρ53. Κάτω από C9 ανεπάρκεια συνθήκες, εξωγενές υψηλού μοριακού βάρους ΗΑ επάγεται πυρηνική εξαγωγή του ρ53 στο κυτταρόπλασμα (Σχ. 9Β και 9C). Σε αντίθεση, το ΗΑ αποκαθίσταται ρ53 πυρηνική συσσώρευση υπό C6-free συνθήκες (Εικ. 9Α και 9C).

κύτταρα DU145 καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα σε κάθε υποδεικνύονται ορό με εξάντληση μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης συμπληρώματος. p53 εντοπισμό σε κύτταρα προσδιορίστηκε με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού. (Α) Σε περίπτωση απουσίας C6 συμπληρώματος (ΔC6 ορού), ρ53 ήταν κυρίως παρούσα στο κυτταρόπλασμα. Υψηλού μοριακού μεγέθους ΗΑ (50 μg /ml) προκάλεσε πυρηνική συσσώρευση της ρ53 κατά τη διάρκεια της θεραπείας για 1 ώρα. (Β) Σε περίπτωση απουσίας του C9 ορού (ΔC9 ορού), ρ53 κυρίως εντοπισμένη στους πυρήνες, και ΗΑ (50 μg /ml) προκάλεσε την πυρηνική εξαγωγή σε 1 ώρα. (Γ) Για τον προσδιορισμό πυρηνικό εντοπισμό του ρ53, περίπου 200 κύτταρα μετρήθηκαν. Φαίνεται στο γράφημα μπαρ είναι ένας μέσος όρος των αποτελεσμάτων σχηματίζουν δύο πειράματα. (D) Σε αρνητικούς ελέγχους, κύτταρα βάφτηκαν με μόνο Texas Red συζευγμένο με δευτερογενές αντίσωμα. SF, ελεύθερο ορού? NHS, φυσιολογικό ανθρώπινο ορό.

Η

Serum συμπλήρωμα C1q και C6 εξάντληση επάγει συστατική ενεργοποίηση JNK1

Έχουμε δείξει ότι JNK1 αλληλεπιδρά φυσικά με WOX1, και ότι η σύνδεση είναι αυξημένη κατά τη διέγερση του κυττάρων με υπεριώδες φως ή ανισομυκίνης (ενεργοποιητής του JNK1)

in vitro

[27]. Είναι ενδιαφέρον ότι, ντοπαμινεργικούς νευροτοξίνη 1-μεθυλ-4-φαινυλ-πυριδινίου (MPP

+) μειώνει την πρόσδεση του WOX1 με JNK1 σε εγκεφάλους αρουραίων [31]. μπλοκ JNK1 η αποπτωτική λειτουργία του WOX1

in vitro

[27], ενώ το λειτουργικό ανταγωνισμό

in vivo

είναι άγνωστη. JNK1 και ισομορφές εμπλέκονται σε αποπτωτικό στρες και απαντήσεις, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και πολλοί τύποι ασθενειών [39]. Ενώ τα ανωτέρω αποτελέσματα έδειξαν ότι το συμπλήρωμα C1q και C6 υποστήριξε την ενεργοποίηση του WOX1 (Εικ. 8), αυτές οι πρωτεΐνες αναμένεται να εμποδίσει την ενεργοποίηση JNK1, και η εξάντληση του C1q και C6 από ορούς θα προκαλέσει την ενεργοποίηση JNK1. Κάτω από παρόμοιες πειραματικές συνθήκες, όταν τα κύτταρα DU145 αναπτύχθηκαν σε ΔC1q ή ΔC6 ορού, συστατική ενεργοποίηση JNK1 συνέβη, όπως προσδιορίζεται από τα δύο κηλίδωση Western (Εικ. 10Α) και μικροσκοπία ανοσοφθορισμού (Σχ. 10Β).

(Α) κύτταρα DU145 καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες (SF) χωρίς ορό, ή σε 1% NHS, ΔC1q ή ΔC6 ορό για 16-24 ώρες. Σε περίπτωση απουσίας του C1q και C6, αυθόρμητη ενεργοποίηση JNK1 συνέβη (σε σχέση με τους ελέγχους SF?

σ

& lt? 0.001?

t

test του Student), όπως προσδιορίζεται με κηλίδωση Western. Ένα αντιπροσωπευτικό σύνολο δεδομένων παρουσιάζεται από 3 πειράματα. (Β) Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού, η οποία δείχνει σημαντική ενεργοποίηση JNK1 ή πυρηνική συσσώρευση υπό ορό C1q- και C6-free συνθήκες (έναντι SF?

ρ

& lt? 0,001? Του Student

t

δοκιμής, η = 3). ΔC9 ορός δεν είχε καμία επίδραση. Περίπου 200 κύτταρα μετρήθηκαν από κάθε πείραμα. (C, D) Δεν υπήρχε ενεργοποίηση STAT3 σε κύτταρα DU145 υπό όλες τις υποδεικνυόμενες συνθήκες ορού. Κάτω από C1q χωρίς συνθήκες, ΗΑ (50 μg /ml) προκάλεσε αποτελεσματικά φωσφορυλίωση STAT3 σε κύτταρα κατά τη διάρκεια της θεραπείας για 1 ώρα. Περίπου 200 κύτταρα μετρήθηκαν από κάθε πείραμα (η = 3).

Η

Ελλείψει C1q, ΗΑ επάγει φωσφορυλίωση STAT3 σε κύτταρα DU145

ενεργοποίηση STAT3 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο σε προστάτη καρκινικών κυττάρων εισβολή [23] – [25]. ΗΑ συμμετέχει επίσης σε εισβολή καρκίνου, υποδηλώνοντας ότι το ΗΑ ενεργοποιεί STAT3 για την προώθηση της μετάστασης του καρκίνου. Παρομοίως, κύτταρα DU145 καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα κάτω από διάφορες συνθήκες χωρίς ορό ή Υποβολή του. Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια εξετέθησαν σε ΗΑ για 1 ώρα. Αριθ ενεργοποίηση STAT3 παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας φυσιολογικά ή συμπλήρωμα εξαντλημένο ορών (Σχ. 10C και 10D). Αξίζει να σημειωθεί ότι, σε περίπτωση απουσίας του C1q, ΗΑ επαγόμενη ενεργοποίηση STAT3 σε κύτταρα DU145 (Εικ. 10C και 10D), υπονοώντας ότι το ΗΑ μπορεί να αυξήσει τη μετάσταση των C1q ελλειμματικών κυττάρων καρκίνου του προστάτη από προς τα πάνω ρύθμιση φωσφορυλίωση STAT3 και την καταστολή της ενεργοποίησης των ρ53 και WOX1. Όλα τα ανωτέρω πειράματα διεξήχθησαν με τη χρήση ιατρικού βαθμού HA από Lifecore. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ιατρικής ποιότητας Healon (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα παρασκευάσματα ΗΑ είναι ελεύθερη μόλυνσης πρωτεΐνης.

Συζήτηση

Το ανθρώπινο καταρράκτη του συμπληρώματος στον ορό είναι παραδοσιακά θεωρείται ως ένα ισχυρό χυμική ανοσοποιητικό σύστημα που προστατεύει από την εισβολή μικροοργανισμών. Παρ ‘όλα αυτά, οι λειτουργικές ιδιότητες του κάθε μεμονωμένου συστατικού του συμπληρώματος είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε για πρώτη φορά ότι C1q εκφράζεται στον προστάτη. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η έκφραση C1q μειώνεται σημαντικά σε καλοήθη υπερπλασία του προστάτη και του καρκίνου του προστάτη.