Αφηρημένο

Ιστορικό

anacardic οξύ (ΑΑ) είναι ένα μίγμα ομόλογα 2-υδροξυ-6-alkylbenzoic οξύ. Ορισμένες αντικαρκινικές δράσεις του ΑΑ έχουν αναφερθεί σε μία ποικιλία καρκίνων. Ωστόσο, η λειτουργία του ΑΑ στον καρκίνο των ωοθηκών, μέχρι σήμερα, έχει παραμείνει άγνωστος.

Μέθοδοι

κυτταρικές γραμμές καρκίνος των ωοθηκών εκτέθηκαν σε ΑΑ, μετά την οποία τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση, την εισβολή και προσδιορισμούς μετανάστευσης διεξήχθησαν. χρώση phalloidin χρησιμοποιήθηκε για να παρατηρήσουν το σχηματισμό ελασματοπόδια. Αντίστροφη μεταγραφή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR) και κηλίδωση Western χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των επιπέδων mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης της κινάσης φωσφατιδυλινοσιτόλης-3 (ΡΙ3Κ), αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) και κασπάση 3.

Αποτελέσματα

Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι AA προάγει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, αναστέλλει αργά απόπτωση, και επάγει κυτταρική μετανάστευση και εισβολή, καθώς επίσης και τον σχηματισμό ελασματοπόδια. έκθεση AA σημαντικά επάνω ρυθμισμένη ΡΙ3Κ και VEGF mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης, ενώ, αντίθετα, το προς τα κάτω ρυθμισμένη έκφραση κασπάσης 3 mRNA και της πρωτεΐνης σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου.

Συμπέρασμα

Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν για πρώτη φορά ότι η ΑΑ μπορεί να ενισχύσει τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή, τη μετάσταση και σχηματισμός ελασματοπόδια σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών μέσω ΡΙ3Κ, VEGF και κασπάσης 3 οδών

Παράθεση:. Xiu YL, Zhao Υ, Gou WF, Τσεν S, Takano Υ, Zheng HC (2014) anacardic οξύ ενισχύει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του Ανθρώπου καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 9 (6): e99361. doi: 10.1371 /journal.pone.0099361

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 18, Δεκεμβρίου του 2013? Αποδεκτές: 14 Μαΐου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Xiu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από Shenyang Εξαιρετική Ίδρυμα ταλέντο της Κίνας? Shenyang Επιστήμης και Τεχνολογίας Grant (F11-264-1-10? F12-277-1-01)? το σχέδιο που υποστηρίζεται από την επιστημονική Ταμείο Έρευνας του Τμήματος επαρχιακού Παιδείας Liaoning (L2010633)? Liaoning Επιστήμης και Τεχνολογίας Grant (2009225008-11? 2.013.021.077)? και το Φυσικό Επιστημονικό Ίδρυμα της Κίνας (81172371? 81202049). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών παραμένει η πιο κοινή αιτία θανάτου από γυναικολογικό κακοήθειες [1], [2]. Πρωτογενής θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών είναι η χειρουργική εκτομή του ορατού νόσου που ακολουθείται από επικουρική χημειοθεραπεία, συνήθως αποτελείται από ένα συνδυασμό με βάση την πλατίνα και ταξάνης με βάση χημειοθεραπεία. Δεδομένου ότι η υποτροπή και μετάσταση επηρεάσει σοβαρά την πρόγνωση του καρκίνου των ωοθηκών, το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης για όλα τα στάδια του καρκίνου των ωοθηκών έχει εκτιμηθεί ότι είναι 35-38% [3], [4]. Έτσι, η μελέτη νέων φαρμάκων χημειοθεραπεία δεύτερης γραμμής, τα οποία αναστέλλουν τις διαδικασίες μεταστατικό και υποτροπή του καρκίνου των ωοθηκών, έχουν γίνει το επίκεντρο της πρόσφατης έρευνας ενδιαφέροντος, όπως η ανάπτυξή τους μπορεί να βελτιώσει τα ποσοστά πενταετούς επιβίωσης.

anacardic οξύ (ΑΑ) είναι ένα μείγμα ομολόγων 2-υδροξυ-6-alkylbenzoic οξύ και βρίσκεται συνήθως σε φυτά της οικογένειας Anacardiaceae [5], [6]. Είναι ένα διατροφικό συστατικό που βρέθηκαν στο κάσιους μήλο (

Anacardium occidentale

) και ginkgo (

Ginkgo biloba

) φύλλα και καρπούς. AA δρα ως μιτοχονδριακό αποζεύξεως της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης [7] και ευαισθητοποιεί ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα σε ιοντίζουσα ακτινοβολία από την αναστολή της δραστικότητας ακετυλοτρανσφεράσης ιστόνης [8]. AA έχει επίσης δείξει ορισμένες δραστηριότητες κατά του όγκου στον καρκίνο του προστάτη, καρκίνωμα του πνεύμονα και καρκίνωμα του μαστού, καθώς και ορισμένες άλλες μορφές καρκίνου, και πιστεύεται ότι ασκούν τη δράση της μέσω διαφόρων μηχανισμών [9] – [13]. Πρόσφατα, ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών έχουν διερευνήσει τον ρόλο της ΑΑ σε καρκίνο, με την ελπίδα ότι μπορεί να εφαρμοστεί τελικά στην κλινική θεραπεία. Ωστόσο, η λειτουργία του ΑΑ σε καρκίνο των ωοθηκών έχει παραμείνει άγνωστος. Έτσι, η μελέτη μας καταδεικνύει τα ρόλο και τις δυνατότητες των μηχανισμών της ΑΑ στον καρκίνο των ωοθηκών, για πρώτη φορά.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

ωοθηκών κυτταρικές σειρές καρκινώματος, SKOV3 ( ορώδες θηλώδες κυστικό αδενοκαρκίνωμα), HO8910 (ορώδες κυστική αδενοκαρκίνωμα) και ιδιαίτερα επεμβατική HO8910 (HO8910-PM), αγοράστηκαν από την ATCC. Σισπλατίνη ανθεκτικά SKOV3 (SKOV3 /DDP), αγοράστηκε από τον όγκο των κυττάρων Τράπεζα της Κινεζικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών (Πεκίνο, Κίνα). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (HO8910, HO8910-PM και SKOV3 /DDP) και του McCoy μέσο 5Α (SKOV3) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 100 μονάδες κ.εκ.

-1 πενικιλλίνη (SKOV3 /DDP ήταν επίσης συμπληρωμένο με 20 ng mL

-1 σισπλατίνη, (DDP) και 100 μg mL

-1 στρεπτομυκίνη. οι κυτταρικές σειρές διατηρήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στους 37 ° C με ή χωρίς AA θεραπεία (Sigma, Saint Louis, Αμερική). Όλα τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση μετά τα κύτταρα εκτέθηκαν σε θρυψίνη, ξεπλύθηκε με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και υποβλήθηκε σε συνολική εκχύλιση πρωτεΐνης με υπερήχους σε δοκιμασία ραδιο-ανοσοκαταβύθισης ρυθμιστικό (RIPA).

δοκιμασία πολλαπλασιασμού

Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 (CCK-8, Xiongben, Japan) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του αριθμού των βιώσιμων κυττάρων μέσω ενός χρωματομετρική δοκιμασία. Εν συντομία, 2.5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν. σε διαφορετικά χρονικά σημεία, 10 μL του CCK-8 διάλυμα προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο της πλάκας και η πλάκα στη συνέχεια επωάστηκε για 3 ώρες στους 37 ° C πριν από την καταγραφή της οπτικής πυκνότητας στα 450 nm.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Μετά από επώαση για 48 ώρες στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO

2, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με θρυψινοποίηση, συλλέχθηκε, πλύθηκε δύο φορές με PBS και σταθεροποιήθηκαν σε 10 mL παγωμένης αιθανόλης (70%) για τουλάχιστον 2 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και πάλι και επωάστηκαν με 500 μL RNase (0,25 mg mL

-1) στους 37 ° C για 30 λεπτά. Τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) σε συγκέντρωση 50 μg mL

-1 και επωάζονται στο σκοτάδι στους 4 ° C για 30 λεπτά. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου εκτελέσθηκε με ανάλυση χρώσης ΡΙ με κυτταρομετρία ροής.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε μετά από χρώση με ΡΙ και ΡΙΤΟ-επισημασμένο αννεξίνη V (keygen Biotech, Nanjing, Κίνα) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή για την ανίχνευση φωσφατιδυλοσερίνη εξωτερίκευση ως δείκτης τελικό σημείο της πρώιμη απόπτωση στα κύτταρα. Εν συντομία, μετά από επώαση για 48 ώρες στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO

2, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS, επαναιωρήθηκαν σε 1 χ ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης σε συγκέντρωση 1 × 10

6 κύτταρα mL

-1 και στη συνέχεια επωάστηκαν με 200 μί 1 χ ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης και 10 μL ΡΙΤΟαννεξίνης V. τα δείγματα στροβιλίστηκαν ήπια και επωάστηκαν για 15 λεπτά στους 25 ° C στο ρυθμιστικό σκοτάδι, τότε 300 μι 1 × δεσμευτικό και 5 μL ΡΙ προστέθηκαν σε κάθε σωλήνα. Τα δείγματα στροβιλίστηκαν ήπια και επωάστηκαν για λιγότερο από 1 ώρα στους 25 ° C στο σκοτάδι. Κυτταρομετρία ροής εκτελέστηκε μέσα σε 1 h επώασης.

επούλωση πληγών δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1,0 × 10

6 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες καλλιέργειας των 6 φρεατίων. Αφού είχαν αναπτύχθηκαν σε συρροή, η κυτταρική μονοστιβάδα γδαρμένο με ένα ρύγχος πιπέτας (200 μL) για να δημιουργήσει μια γρατσουνιά. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS τρεις φορές και καλλιεργήθηκαν σε FBS μέσο ελεύθερο. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν σε 0, 12, 24, 48 και 72 h (

n

= 9) και οι γρατσουνιές περιοχές μετρήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού Image. Το ποσοστό επούλωση της πληγής υπολογίσθηκε σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο:

ρυθμού επούλωσης τραυμάτων = (Περιοχή του αρχικού τραύματος – Περιοχή της πραγματικής πληγής σε διαφορετικές χρονικές στιγμές) /Περιοχή του αρχικού τραύματος × 100%

.

προσδιορισμούς κυττάρων εισβολή

Για την δοκιμασία εισβολής, 5 × 10

4 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ελεύθερο από FBS RPMI-1640 και εμβολιάζονται στην κορυφαία θαλάμους του Matrigel επικαλυμμένα ενθέματα Transwell (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Το κάτω διαμέρισμα του θαλάμου περιείχε 10%

ν /ν FBS

ως χημειοελκτικό. Μετά από επώαση για 48 ώρες στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO

2, τα κύτταρα επί της άνω επιφάνειας της μεμβράνης εξαφανίστηκαν μακριά, και τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης πλύθηκαν με PBS, σταθεροποιήθηκαν σε 100% μεθανόλη και χρωματίσθηκαν με κρυσταλλικό ιώδες χρώμα για την ποσοτικοποίηση της έκτασης της εισβολής.

σε πραγματικό χρόνο αλύσου πολυμεράσης ανάστροφης μεταγραφής αντίδραση (σε πραγματικό χρόνο RT-PCR)

Ολικό RNA εξήχθη από οι κυτταρικές γραμμές καρκινώματος των ωοθηκών χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Takara, Kyoto, Japan). Real-time RT-PCR πραγματοποιήθηκε από 2 μg ολικού RNA χρησιμοποιώντας ΑΜν ανάστροφη μεταγραφάση και τυχαίους εκκινητές (Takara, Kyoto, Japan). PCR εκκινητές σχεδιάστηκαν σύμφωνα με τις αλληλουχίες σε GeneBank και παρατίθενται στον Πίνακα S1. Ενίσχυση του cDNA διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας ένα κιτ SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Kyoto, Japan) και

GAPDH

ως εσωτερικός έλεγχος. Εν συντομία, η ενίσχυση RT-PCR του cDNA για κάθε εκκινητή εκτελέστηκε σε τελικό όγκο 20 μί, που περιείχε 10 μι SYBR Πρόμιγμα Εχ Taq (χ 2), 0.08 εκκινητές μί, 0.4 χρωστική αναφοράς μί ROX και 1 μL cDNA εκμαγείο (50 μα μι

-1). Οι παράμετροι πρωτόκολλο ήταν ως ακολούθως: αρχική επώαση στους 95 ° C για 30 s που ακολουθείται από 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 5 s και ανασύνδεση σε 60 ° C για 34 s. Όλα τα πειράματα PCR συνοδεύονταν με έναν έλεγχο χωρίς εκμαγείο και

GAPDH

ως εσωτερικός έλεγχος. Το σχετικό επίπεδο γονιδιακής έκφρασης (η ποσότητα του στόχου ρυθμίζεται σύμφωνα με το ενδογενές γονίδιο ελέγχου) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη συγκριτική μέθοδο CT: 2

-ΔΔCt. Οι αλληλουχίες των εκκινητών για πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR που παρέχονται στον Πίνακα S1.

Western ανάλυση κηλίδος

δοκιμασίες πρωτεΐνης διεξήχθησαν σύμφωνα με τη μέθοδο Bradford χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πρωτείνης Bio-Rad (Bio -Rad, Hercules, CA, USA). Μετουσιωμένες πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με δωδεκυλικού νατρίου ηλεκτροφόρηση πηκτής θειικού-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) σε γέλες ακρυλαμιδίου 12%, και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε Hybond-μεμβράνες (Amersham, Γερμανία). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για μία νύχτα σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα με Tween 20 (TBST? 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20). Για ανοσοστύπωση, οι μεμβράνες επωάστηκαν για 1 ώρα με το πρωτογενές αντίσωμα, ξεπλένονται με TBST και επωάστηκαν με αντισώματα αντι-κουνελιού IgG, αντι-ποντικού ή αντι-κατσίκας συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας (HRP? Dako, Carpinteria CA, USA) σε ένα αραίωση του 1:1000. Μετά την εφαρμογή ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) -PLUS αντιδραστήρια ανίχνευσης (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), οι πρωτεϊνικές ζώνες έγιναν ορατές χρησιμοποιώντας ένα φιλμ ακτίνων-Χ (Fujifilm, Tokyo, Japan). Τα ανοσοαποτυπώματα πλύθηκαν με κηλίδωση western (WB) ρυθμιστικό απογύμνωσης (ρΗ 2-3? Nacalai, Tokyo, Japan) και ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για β-ακτίνη (1:1000? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA ).

ανοσοφθορισμού

τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες, μονιμοποιήθηκαν με PBS που περιέχει 4% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά και κατέστησαν διαπερατά με 0,2% Triton Χ-100 σε PBS για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με Alexa Fluor 594 Φαλλοϊδίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) για να καταστεί δυνατή η ελασματοπόδια να οπτικοποιείται. Οι πυρήνες βάφτηκαν με 1 μg mL

-1 (DAPI? Sigma-Aldrich St Louis, ΜΟ, USA) για 15 λεπτά στους 37 ° C. Οι καλυπτρίδες στη συνέχεια τοποθετείται με Αντιδραστήριο SlowFade Gold αντιξεθωριάσματος (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και παρατηρήθηκαν κάτω από ένα συνεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ (Όλυμπος, Tokyo, Japan).

Η στατιστική ανάλυση

Στατιστική αξιολόγηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας ο συντελεστής Spearman να αναλύει κατετάγη δεδομένα, και το Mann-Whitney U διαφοροποίησης των μέσων των διαφόρων ομάδων. Ένα

σ

-τιμή του & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. SPSS v. 10.0 λογισμικού (SPSS, Chicago, IL, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση όλων των δεδομένων.

Αποτελέσματα

Τα αποτελέσματα της anacardic οξέων στα κύτταρα του καρκινώματος των ωοθηκών

Δύο ζεύγη κυτταρικών σειρών, SKOV3 και SKOV3 /DDP κύτταρα και HO8910 και τα κύτταρα HO8910-PM, εκτέθηκαν σε ΑΑ (0 μΜ, 2.5 μΜ, 5 μΜ, 10 μΜ, 15 μΜ, 20 μΜ) και υποβλήθηκε σε CCK-8 δοκιμασίες πολλαπλασιασμού (Σχήμα 1Α,

p & lt? 0,05

). SKOV3, SKOV3 /DDP, HO8910 και HO8910-PM κύτταρα έδειξαν ισχυρότερη πολλαπλασιασμό όταν έλαβαν θεραπεία με ΑΑ σε σύγκριση με κυτταρικές γραμμές ελέγχου. Βρήκαμε ότι η λειτουργία της ΑΑ στην προαγωγή του πολλαπλασιασμού ήταν θετική σχετίζεται με τη συγκέντρωση του, 10 μΜ ΑΑ μπορεί να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό σημαντικά, τότε επιλέγουμε 10 μΜ, 15 μΜ, 20 μΜ ως πειραματικές συνθήκες για να ολοκληρωθεί το ακόλουθο πείραμα. επεξεργασία AA πολλαπλασιασμό που προκαλείται από S σε κύτταρα SKOV3 και SKOV3 /DDP? αντιστρόφως, AA που προκαλείται από τη σύλληψη G1 στα κύτταρα HO8910 και HO8910-PM (Εικόνα 1Β,

p & lt? 0,05

). Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής απόπτωσης έδειξαν ότι η θεραπεία ΑΑ (15 μΜ) ανέστειλε αργά απόπτωση σε SKOV3, SKOV3 /DDP, HO8910 και HO8910-PM κύτταρα (Σχήμα 2,

ρ & lt? 0,05

), και την επούλωση πληγών και εισβολή δοκιμασίες έδειξε ότι AA προωθείται κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (Σχήμα 3Α και Β,

ρ & lt? 0,05

). Επιπλέον, η έκθεση ΑΑ προκαλούμενη σχηματισμό ελασματοπόδια σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές σειρές, όπως υποδεικνύεται από το F-ακτίνης δομή (Σχήμα 4).

CCK-8 προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού των κυττάρων δείχνουν ότι η θεραπεία ΑΑ του SKOV3 και SKOV3 /DDP, και HO8910 και HO8910-PM ζεύγη κυτταρική σειρά επάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Α). επεξεργασία AA που προκαλείται από τον πολλαπλασιασμό S στα κύτταρα SKOV3 και SKOV3 /DDP, και G1 σύλληψη στην HO8910 και τα κύτταρα HO8910-PM (Β). *

p & lt? 0,05

. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ξεχωριστών πειραμάτων? Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση.

Η

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής απόπτωση δείχνει ότι η αγωγή AA αναστέλλει αργά απόπτωση σε SKOV3, SKOV3 /DDP, HO8910 και τα κύτταρα HO8910-PM. *

p & lt? 0,05

. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ξεχωριστών πειραμάτων? Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση.

Η

επούλωση πληγών δοκιμασίες δείχνουν ότι η θεραπεία AA αυξάνει την ικανότητα του SKOV3, SKOV3 /DDP, HO8910 και HO8910-PM κυττάρων να μεταναστεύουν σε μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση τρόπο (Α). Επεξεργασμένα κύτταρα εμφανίζουν επίσης επεμβατικές δυναμικό (Β). *

p & lt? 0,05

. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ξεχωριστών πειραμάτων? Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση.

Η

έκθεση ΑΑ προκαλεί σχηματισμό ελασματοπόδια στις τέσσερις κυτταρικές γραμμές όπως υποδεικνύεται από την F-ακτίνης δομή.

Η

Το mRNA και πρωτεΐνη έκφραση του φαινοτύπου που σχετίζονται με μόρια στα κύτταρα του καρκινώματος των ωοθηκών μετά από έκθεση σε ΑΑ

μετά τη θεραπεία με ΑΑ, τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της κασπάσης 3 σε κυτταρικές σειρές SKOV3, SKOV3 /DDP, HO8910 και HO8910-PM ήταν χαμηλότερες από ό, τι εκείνες που παρατηρούνται σε κύτταρα ελέγχου. Αντίθετα, τα επίπεδα έκφρασης του mRNA της ΡΙ3Κ και VEGF ήταν υψηλότερα από αυτά των κυττάρων ελέγχου (Εικόνα 5Α,

ρ & lt? 0,05

). Η ανάλυση στυπώματος Western των επιπέδων έκφρασης πρωτεΐνης έδειξε ότι η έκθεση ΑΑ επάνω ρυθμισμένη ΡΙ3Κ και η έκφραση πρωτεΐνης VEGF, και ρυθμισμένα προς τα κάτω κασπάσης 3 έκφραση πρωτεΐνης σε δύο ζεύγη κυτταρική γραμμή (σχήμα 5Β,

ρ & lt? 0,05

).

Επιδράσεις της έκθεσης ΑΑ στα επίπεδα έκφρασης του mRNA του πολλαπλασιασμού και μορίων σχετίζονται με την απόπτωση, και αντίστοιχων πρωτεϊνών τους, στα καρκίνωμα ωοθηκών ζεύγη κυτταρική σειρά χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου RT-PCR (Α) και ανάλυση κηλίδος western (ΣΙ). *

σ

& lt? 0,05. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ξεχωριστών πειραμάτων? Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση.

Η

Συζήτηση

ΑΑ βρίσκεται συνήθως σε φυτά της οικογένειας Anacardiaceae και είναι ένα διατροφικό συστατικό που βρέθηκαν στο κάσιους μήλο (

Anacardium Occidentale

) και ginkgo (

Ginkgo biloba

) φύλλα και φρούτα και βρίσκεται σε μια σειρά από φαρμακευτικά φυτά τα οποία έχουν το δυναμικό δραστικότητα έναντι κυτταρικών γραμμών καρκίνου [14] – [15]. Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ότι ΑΑ διαδραματίζει αντικαρκινικό ρόλο, η οποία μπορεί να σχετίζεται με τη μειωμένη έκφραση του survivin και Χ-συνδεδεμένη αναστολέας της πρωτεΐνης απόπτωσης, τα οποία είναι αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών που σχετίζονται με την κυτταρική επιβίωση και ραδιοαντοχή, και η ραδιοευαισθητοποίηση των κυττάρων αδένωμα της υπόφυσης [ ,,,0],16]. AA παίζει επίσης αντιβακτηριακή ρόλος και μια προηγούμενη μελέτη επικεντρώθηκε σε σχέσεις δομής-δραστικότητας αποκάλυψε ότι η καρβοξυλομάδα επί του αρωματικού δακτυλίου και ένα ακόρεστο πλευρική αλυσίδα στο παράγωγο anacardic οξέος είναι σημαντικές για την αναστολή της κινητικότητας και την λυτική δραστικότητα ΑΑ έναντι ζωοσπόρους [17 ]. Παίζει επίσης σημαντικό ρόλο ως ένα αντι-οξειδωτικό και επιδεικνύει κατά της παχυσαρκίας και αντι-φλεγμονώδεις δραστηριότητες [18] – [20]

AA αναστέλλει την ενεργοποίηση τόσο της επαγώγιμη και συστατική έκφραση του πυρηνικού παράγοντα-κάπα. Β (NF-kB), η οποία ενεργοποιείται από καρκινογόνα και αυξητικούς παράγοντες, και πιστεύεται ότι ενισχύουν την απόπτωση σε κύτταρα όγκου σε συγκέντρωση 25 μΜ [9]. Εν τω μεταξύ, μια προηγούμενη μελέτη έχει δείξει μέσω μιας σειράς των ερευνών, όπως η ανίχνευση του κυτταροτοξικότητα, την έκφραση των σχετικών πρωτεϊνών και Ca

2+ κινητικότητα, ότι ΑΑ επάγει ER (Ενδοπλασμικό Δίκτυο) άγχος και αυτοφαγία στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα σε μια συγκέντρωση 10 μΜ [10]. Ναρκωτικά επούλωσης της πληγής δοκιμασίες μετανάστευσης, δοκιμασίες μετανάστευσης Transwell και προσδιορισμούς μοντέλο ποντικού έχουν επιπλέον προτείνει ότι ΑΑ μπορεί να λειτουργήσει ως ισχυρός αναστολέας της αγγειογένεσης των όγκων με στόχευση του μονοπατιού Src /FAK /Rho ΟΤΡάσης σηματοδότησης, οδηγώντας σε σημαντική καταστολή της ανάπτυξης του όγκου του προστάτη σε χαμηλά επίπεδα δοσολογίας ( 5-50 μΜ) [11]. AA έχει δειχθεί από μία σειρά πειραμάτων, συμπεριλαμβανομένης της ανάλυσης κυτταρικού κύκλου, RT-PCR και WB, να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP με επαγωγή G1 /S διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε συγκεντρώσεις 5, 25, 125 μΜ [12]. Ωστόσο, ΑΑ δεν έχει εφαρμοστεί σε κλινικές καταστάσεις, αν και πολλοί άνθρωποι πιστεύεται να το πάρετε ως συμπλήρωμα της υγειονομικής περίθαλψης. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι, σε αντίθεση με ορισμένες άλλες μορφές καρκίνου, μας παρούσα μελέτη δείχνει ότι ΑΑ μπορεί να προάγει τον πολλαπλασιασμό και αναστέλλουν απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, υποδεικνύοντας ότι η λειτουργία του ΑΑ σε καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών είναι ένα αμφιλεγόμενο ζήτημα.

Οι συναφείς μοριακοί μηχανισμοί της ΑΑ σε κύτταρα καρκινώματος των ωοθηκών έχει, μέχρι σήμερα, παραμένει άγνωστο. Για να διερευνηθούν οι μηχανισμοί που σχετίζονται με τον καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα, επιλέξαμε δύο ζεύγη κυτταρικών σειρών καρκινώματος των ωοθηκών με βάση την αντοχή τους για τα ναρκωτικά και επεμβατικές ικανότητες (SKOV3 και SKOV3 /DDP, και HO8910 και HO8910-ΡΜ, αντίστοιχα). πειραματικές μελέτες μας έδειξαν ότι AA επάγεται σημαντικά η βιωσιμότητα των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών σε 15 μΜ. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι, αν και ΑΑ προκαλούμενη από τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε όλα τα κύτταρα σε μια συγκέντρωση και το εξαρτώμενο από το χρόνο τρόπο, τόσο τα κύτταρα ανθεκτικά σε φάρμακο (SKOV3 /DDP) και ιδιαίτερα επεμβατική (HO8910-ΡΜ) έδειξε μεγαλύτερη ευαισθησία σε έκθεση ΑΑ, η οποία μπορεί να οφείλεται σε μεγαλύτερο ποσοστό τους από βλαστικά κύτταρα (ογκογενή κύτταρα) ή των αυξημένων βλαστοκυττάρων ιδιότητες παρόμοιες αυτών των κυττάρων. επεξεργασία AA πολλαπλασιασμό που προκαλείται από S σε κύτταρα SKOV3 και SKOV3 /DDP? Αντίθετα, προκαλείται από G1 σύλληψη στα κύτταρα HO8910 και HO8910-PM. Ανάλυση απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι η θεραπεία με ΑΑ ανέστειλε τέλη της απόπτωσης σε SKOV3, SKOV3 /DDP, HO8910 και τα κύτταρα HO8910-PM. Υπήρξε μια περίπτωση που αναφέρθηκαν, σε καρκινικό κύτταρο μαστού, ΑΑ μπορεί κατά προτίμηση αναστέλλουν ER-α (υποδοχείς οιστρογόνων α) πολλαπλασιασμός -θετικό μαστού καρκινικό κύτταρο κατά τομέα δέσμευσης DNA απευθείας υποδοχέα οιστρογόνου (ER DBD) αλληλεπίδραση [13]. Έχουμε περαιτέρω πλήρης πείραμα immunofluoresce να ανιχνεύσει την έκφραση του ER σε τέσσερις κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών, το αποτέλεσμα έδειξε ότι τέσσερα κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών έχουν όλα έκφραση ER. Στη συνέχεια προτείνουμε ότι ER-αρνητικό ή ER-θετικό δεν μπορεί να επηρεάσει τη λειτουργία AA επί κυτταρικών γραμμών καρκίνου ωοθηκών, η διαφορά μεταξύ της λειτουργίας ΑΑ στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού και κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών μπορεί μέσω διαφορετικών οδών. Για να διερευνηθεί αυτό το εύρημα περαιτέρω, αξιολογήσαμε δείκτης μονοπάτι που σχετίζονται με την απόπτωση, κασπάσης 3 [25] – [27], και βρήκε ότι τα επίπεδα του mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε κύτταρα που εκτίθενται σε ΑΑ. Σε διαφωνία με ορισμένα πειράματα [28] – [31]. Συνεπώς, θεωρήσαμε ότι AA μπορεί να έχει μια λειτουργία προ-όγκου σε καρκίνωμα ωοθήκης.

Για να μελετήσει αυτό το εύρημα, περαιτέρω, εξετάσαμε μια σειρά από άλλους δείκτες και διαπίστωσε ότι οι εκφράσεις του PI3K mRNA και πρωτεϊνών στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών κατεργάζεται με ΑΑ ήταν υψηλότερα σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Τα δεδομένα μας είναι σύμφωνα με εκείνη των Zachary et al. [21], ο οποίος ανέφερε ότι η οδός PI3K /AKT /mTOR είναι ποικίλα και επηρεάζει εξίσου ποικίλες πτυχές της ανάπτυξης των ωοθηκών των όγκων, την εξέλιξη και την επιβίωση των ασθενών. Αρκετές πειράματα έχουν διεξαχθεί για να διερευνήσει στοχευμένη θεραπεία του καρκίνου μέσω της οδού ΡΙ3Κ. Μάλιστα, μια πρόσφατη προοπτική, μεγάλης κλίμακας γονιδιωματική ανάλυση έδειξε ότι η οδός PI3K /AKT συχνά απελευθερωθεί σε υψηλής ποιότητας ορώδες όγκους των ωοθηκών [22] – [23]. ΡΙ3Κ μπορεί να θεωρηθεί ως ένα σημαντικό μεσολαβητή των σημάτων επιβίωσης που προστατεύει ωοθηκών καρκινικά κύτταρα από επαγωγή απόπτωσης [24]. Για το λόγο αυτό, θεωρούμε ότι ΑΑ μπορεί να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό στον καρκίνο των ωοθηκών μέσω της οδού ΡΙ3Κ. Επιπλέον, η μελέτη μας έδειξε ότι ΑΑ προάγει κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο και η έκθεση ΑΑ προκαλεί σχηματισμό ελασματοπόδια σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν, όπως υποδεικνύεται από το στενά συμπυκνώθηκε F-ακτίνης δομή.

Διαπιστώσαμε επίσης εισβολή και μετάσταση δείκτες που σχετίζονται και διαπιστώθηκε ότι τα επίπεδα έκφρασης του VEGF mRNA και πρωτεΐνης σε κύτταρα ΑΑ-αγωγή αυξημένη σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. VEGF είναι γνωστή ως ένας από τους κύριους παράγοντες ανάπτυξης που εμπλέκονται στο σχηματισμό σκάφος [32], [33]. Τα στοιχεία δείχνουν ότι η μη φυσιολογική έκφραση του VEGF στον καρκίνο των ωοθηκών συνδέεται στενά με εισβολή και μετάσταση όγκου [34], [35]. Όπως έχουμε συζητήσει παραπάνω, AA παίζει ένα διαφορετικό ρόλο σε διάφορες μορφές καρκίνου και δρα μέσω πολλαπλών οδών. Για παράδειγμα, η ισχυρή ανασταλτική δράση του ΑΑ από το VEGF-διεγερμένα μετανάστευση, σχηματισμός τριχοειδή δομή, προσκόλληση και ενεργοποίηση παξιλλίνη στα ενδοθηλιακά κύτταρα έχει προηγουμένως αναφερθεί [11]. Ωστόσο, στη μελέτη μας, ΑΑ βρέθηκε να προωθήσει την έκφραση του VEGF mRNA και της πρωτεΐνης στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Ως εκ τούτου, εμείς εικάζουν ότι AA μπορεί να προωθήσει τη μετανάστευση και την εισβολή στον καρκίνο των ωοθηκών μέσω της οδού του VEGF.

Εν κατακλείδι, προτείνουμε AA μπορεί να ενισχύσει τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και τη μετάσταση μέσω του PI3K και πορείες VEGF σε κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών . Ωστόσο, οι παρεκκλίνουσα συγκεκριμένες μοριακών μηχανισμών της ΑΑ στο καρκίνωμα των ωοθηκών χρειάζονται περαιτέρω μελέτη και κλινική χειραγώγηση της πρέπει επίσης να εξεταστεί με προσοχή σε μελλοντικές εργασίες.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

Primer ακολουθίες που έχουν επιλεγεί για πραγματικού χρόνου RT-PCR

doi: 10.1371 /journal.pone.0099361.s001

(DOC)