Αφηρημένο

Ιστορικό

Η τρέχουσα διάγνωση και θεραπεία του καρκίνου ουροδόχου κύστης (BC) έχει δείξει μεγάλη πρόοδο με την αξιοποίηση των μικροσυστοιχιών.

Σκοπός

Ο στόχος μας ήταν να εντοπιστούν τα κοινά γονίδια που εκφράζονται διαφορικά (DE) μεταξύ κλινικά σχετικές υποκατηγορίες π.Χ. χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

δείγματα και τους μάρτυρες π.Χ., τόσο πειραματικά όσο και διαθέσιμες στο κοινό σύνολα δεδομένων, αναλύθηκαν με ολόκληρο μικροσυστοιχίες γονιδίωμα. Εμείς ομαδοποιούνται τα δείγματα σύμφωνα με την ιστολογία τους και ορίζονται τα γονίδια DE σε κάθε δείγμα ξεχωριστά, καθώς επίσης και σε κάθε ομάδα όγκου. Μια διπλή στρατηγική ανάλυση ακολούθησε. Κατ ‘αρχάς, πειραματικά δείγματα αναλύθηκαν και διατυπώθηκαν συμπεράσματα? και το δεύτερο, πειραματικές ομάδες ενώθηκαν με δημόσια διαθέσιμες σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχιών και αναλύθηκαν περαιτέρω σε αναζήτηση των κοινών γονιδίων DE. Το πειραματικό σύνολο δεδομένων εντοπίστηκαν 831 γονίδια που ήταν DE σε όλα τα δείγματα όγκων, ταυτόχρονα. Επιπλέον, 33 γονίδια ήταν προς τα πάνω ρυθμισμένα και 85 γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω σε όλα τα δείγματα 10 π.Χ. σε σύγκριση με τα 5 φυσιολογικούς ιστούς, ταυτόχρονα. Ιεραρχική ομαδοποίηση κατανέμεται ομάδες όγκου σύμφωνα με την ιστολογία τους. K-σημαίνει ομαδοποίηση όλων των γονιδίων και όλα τα δείγματα, καθώς και ομαδοποίηση των ομάδων όγκου, παρουσίασε 49 συμπλέγματα. K-means clustering των κοινών γονιδίων DE σε όλα τα δείγματα αποκάλυψαν 24 ομάδες. Γονίδια που εκδηλώνεται διάφορα διαφορική πρότυπα έκφρασης, με βάση την PCA. ΥΥ1 και ΝΡκΒ ήταν μεταξύ των πιο κοινούς παράγοντες μεταγραφής που ρυθμίζεται η έκφραση των γονιδίων που προσδιορίζονται DE. Χρωμόσωμα 1 περιείχε 32 γονίδια DE, που ακολουθείται από τα χρωμοσώματα 2 και 11, το οποίο περιείχε 25 και 23 γονιδίων DE, αντίστοιχα. Χρωμόσωμα 21 είχε το μικρότερο αριθμό γονιδίων DE. ανάλυσης GO αποκάλυψε την επικράτηση των μεταφορών και της δέσμευσης των γονιδίων στα κοινά κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια DE? η επικράτηση του μεταβολισμού RNA και τα γονίδια επεξεργασία στο up-ρυθμιζόμενα γονίδια DE? καθώς και η επικράτηση των γονιδίων που είναι υπεύθυνα για την επικοινωνία των κυττάρων και την μεταγωγή σήματος στα γονίδια DE που ρυθμίζεται προς τα κάτω σε Τ1-Grade III και όγκους πάνω ρυθμισμένα σε /T3-Grade όγκους Τ2 III. Συνδυασμός δείγματα από όλες τις πλατφόρμες μικροσυστοιχιών αποκάλυψε 17 κοινά γονίδια DE, (BMP4, CRYGD, DBH, GJB1, KRT83, MPZ, NHLH1, TACR3, ACTC1, MFAP4, SPARCL1, TAGLN, TPM2, CDC20, LHCGR, TM9SF1 και ΕΑΣ) 4 που συμμετέχουν σε διάφορες οδούς.

Συμπεράσματα /Σημασία

Ο εντοπισμός των κοινών γονιδίων DE μεταξύ των δειγμάτων π.Χ. διαφορετικών ιστολογία μπορεί να παράσχει περαιτέρω πληροφορίες για την ανακάλυψη νέων υποθετικών δεικτών.

Παράθεση: Zaravinos Α, Λάμπρου GI, Boulalas Ι, ΔΕΛΑΚΑΣ D, Spandidos DA (2011) Στοιχεία της Κοινής διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων στον καρκίνο της ουροδόχου κύστεως. PLoS ONE 6 (4): e18135. doi: 10.1371 /journal.pone.0018135

Επιμέλεια: Μιχαήλ Polymenis, Texas A & amp? Μ University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Σεπτεμβρίου του 2010? Αποδεκτές: 26 Φεβρουαρίου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 4 του Απρ 2011

Copyright: © 2011 Zaravinos et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το Τμήμα Ουρολογίας, Ασκληπιείο Νοσοκομείο, 16673 Βούλα, Αθήνα, Ελλάδα χρηματοδότησε την παρούσα μελέτη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος της ουροδόχου κύστεως (BC) είναι η πέμπτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες. Η κορυφή επικράτηση της ασθένειας είναι μεταξύ των ασθενών 60-70 ετών. BC είναι ιάσιμη αν διαγνωστεί κατά τα πρώτα στάδια της νόσου. Οι όγκοι της ουροδόχου κύστης αναπτύξει μέσω δύο διακριτών αλλά κάπως επικαλυπτόμενες οδούς: την θηλώδη και μη θηλώδη. Περίπου το 80% του BCS αποτελούνται από επιφανειακές εξωφυτικό θηλώδους βλάβες που προέρχονται από ουροθηλιακό υπερπλασία. Αυτά συνήθως χαμηλού βαθμού θηλώδες όγκοι μπορεί να επαναληφθεί, αλλά σπάνια εισβάλλουν στο τοίχωμα της ουροδόχου κύστης ή μεταστάσεις. Το υπόλοιπο 15-20% των όγκων αντιπροσωπεύουν υψηλής ποιότητας στερεό μη θηλώδη ΣΔ που προκύπτουν από υψηλής ποιότητας intraurothelial νεοπλασία. Αυτοί οι όγκοι εισβάλλουν δυναμικά το τοίχωμα της ουροδόχου κύστης και έχουν υψηλή τάση για απομακρυσμένη μετάσταση [1].

Parallel παρακολούθηση έκφρασης των γονιδίων είναι ένα ισχυρό εργαλείο για την ανάλυση των σχέσεων μεταξύ των όγκων της ουροδόχου κύστης, ανακαλύπτοντας νέες υποομάδες των όγκων, την ανάθεση των όγκων να προ -defined τάξεις, εντοπίζοντας συν-ρυθμιζόμενων ή όγκου φάση-ειδικών γονιδίων και την πρόβλεψη έκβαση της νόσου [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8]. Μέχρι σήμερα, πολλή προσπάθεια έχει δαπανηθεί για τον εντοπισμό γονιδίων που εμφανίζουν διαφορική έκφραση (DE) μεταξύ των διαφόρων τύπων όγκου εναντίον άλλων ομάδων ιστό, όπως φαινοτυπικώς φυσιολογικό ιστό. Ωστόσο, οι αναφερόμενες γονίδια DE ποικίλλουν μεταξύ διαφορετικών ομάδων μελέτης, ανάλογα με τη μεθοδολογία που βασίζεται σε μικροδιάταξη και τον αριθμό των περιπτώσεων. Μια ενδιαφέρουσα ζήτημα που δεν έχει ακόμη εξετασθεί το ενδεχόμενο περιλαμβάνει πιθανές δεδομένα που μπορούν να συλλέγονται σχετικά με τα γονίδια που εκφράζονται διαφορικά ταυτόχρονα σε όλες τις περιπτώσεις όγκων μελέτη.

Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε ανάλυση cDNA μικροσυστοιχιών, η οποία περιλαμβάνει ΕΝΤΟΣ σπίτι πειραματική καθώς και δημοσίως διαθέσιμα δεδομένα, για να αναλύσουν το προφίλ γονιδιακής έκφρασης των BC και για τον προσδιορισμό των γονιδίων DE μεταξύ καρκίνου και υγιείς ιστούς. Η ανίχνευση των γονιδίων DE διεξήχθη σε κάθε δείγμα ξεχωριστά, καθώς επίσης και σε κάθε ομάδα όγκου, όπως ορίζεται από την ιστολογική εξέταση και αναφερόμενων δεδομένων. Τα δεδομένα συγκεντρώθηκαν με διαφορετικούς αλγόριθμους, και τις λειτουργίες των γνωστών γονιδίων DE περαιτέρω ορίζεται από Γονιδιακή Οντολογία. Επιπλέον, δεν έψαξε μόνο για τις διαφορές μεταξύ των τύπων των όγκων, αλλά μάλλον για ομοιότητες. Ο λόγος για αυτή την προσέγγιση ήταν ότι, αν και οι διάφοροι τύποι όγκων αναμένεται να έχουν διαφορές στα προφίλ έκφρασης τους, ακόμη και μεταξύ ατόμων με την ίδια υπότυπο του όγκου, υποθέσαμε ότι οι όγκοι έχουν παρόμοια χαρακτηριστικά που μπορεί τελικά να οδηγήσει σε γνώση των αιτιολογιών της καρκινογένεσης. Σε ένα σημαντικό έργο από

Goldstein et al.

Μια προσπάθεια να ανιχνεύσει ένα κοινό κελί προέλευσης των καρκίνων του προστάτη αναφέρθηκε. Μπορούν να εννοηθεί ότι, παρά τις διαφορές που τα καρκινικά κύτταρα να κάνει μετοχή, υπάρχει το ενδεχόμενο μιας κοινής [9] προέλευσης. Στην ίδια κατεύθυνση θα προσπαθήσει να εντοπίσει προφίλ έκφρασης κοινών γονιδίων μεταξύ διαφορετικών καρκινικών ιστών. Σε αυτό το σημείο θα πρέπει να αναφέρουμε ότι η γονιδιακή έκφραση, ιδιαίτερα από βιοψίες όγκων, αποτελεί κυριολεκτικά ένα «στιγμιότυπο» της κρατικής χώρο του αλλιώς δυναμικής συμπεριφοράς της νόσου. Ωστόσο, αυτή η «στιγμιότυπο» μπορεί να είναι επαρκής προκειμένου να λάβει χρήσιμες πληροφορίες σχετικά με τη δυναμική του συστήματος της μελέτης. Ιδιαίτερα στην περίπτωση των όγκων, είναι το μόνο εργαλείο που έχουμε για να εξαγάγετε πληροφορίες η

ex vivo

επίπεδο.

Τα παρόντα στοιχεία υποστηρίζουν την αξία των υπογραφών γονιδιακής έκφρασης μικροσυστοιχιών με βάση όπως αυτά προσδιορίζουν κλινικά σημαντικές κυτταρικές ιδιότητες.

Υλικά και Μέθοδοι

Δειγματοληψία όγκου ιστών και τη χειρουργική διαδικασία

Δέκα καρκίνο της ουροδόχου κύστεως δείγματα από ασθενείς με νέα διάγνωση ΣΔ που υποβάλλονται σε διουρηθρική όγκων της ουροδόχου κύστης εκτομή στο Τμήμα Ουρολογίας, «Ασκληπιείο» Γενικό Νοσοκομείο, Αθήνα, καθώς και πέντε δείγματα φυσιολογικού ιστού, αποκτήθηκαν μετά το ύψος του ιστού είναι απαραίτητες για εξέταση ρουτίνας παθολογίας είχαν αφαιρεθεί. Οι ασθενείς που μελετήθηκαν ήταν προχωρημένης ηλικίας (73,9 ± 12,0 χρόνια). Η πλειοψηφία (6/10, 60%) ήταν καπνιστές ή πρώην καπνιστές, ενώ τέσσερις (40%) χαρακτηρίστηκαν από κάποιο επίπεδο της επαγγελματικής έκθεσης σε παράγοντες που σχετίζονται με BC (χρώματα, χημικά, κλπ). Όλα τα δείγματα όγκων είχαν ταξινομηθεί και βαθμολογούνται από τον ίδιο παθολογοανατόμο. Η ιστολογική διαβάθμιση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τόσο το 1973 του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (ΠΟΥ) και το 2004 WHO /Διεθνής Εταιρεία Ουρολογικής Παθολογίας (ISUP) ταξινομήσεων [1]. το στάδιο του όγκου αξιολογήθηκε σύμφωνα με την αμερικανική μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο του συστήματος 2002 στάσης [10]. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς που περιλαμβάνονται σε αυτή τη μελέτη. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Κρήτης. τα κριτήρια επιλεξιμότητας που χρησιμοποιήθηκαν επιλεκτικά τεμαχίστηκαν πρωτογενή ΣΔ και τη διαθεσιμότητα του DNA από κανονικό και όγκου ιστού για αναλύσεις βιομοριακής. Τα κριτήρια αποκλεισμού ήταν ένα ιστορικό προηγούμενων νεοπλασμάτων και χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία πριν από τη χειρουργική επέμβαση

Τα δείγματα ιστού ελήφθησαν σε χειρουργική επέμβαση από τον όγκο και τα ακόλουθα τρία κατάφωρα κανονική επιλεγμένες τοποθεσίες (βιοψίες κρύο φλιτζάνι):. οπισθίου τοιχώματος, τρίγωνο , και περιοχή δίπλα στον όγκο. Τμήματα των αποσυντίθενται φυσιολογικά δείγματα εστάλησαν για ιστοπαθολογική ανάλυση. Όγκου και φυσιολογικών ιστών καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο, μεταφέρονται και αποθηκεύονται στους -80 ° C μέχρι την εκχύλιση του DNA.

Οι ασθενείς με μη-διηθητικό BCs παρακολουθήθηκαν με περιοδική κυστεοσκοπική εξετάσεις και ενδοκυστικής θεραπείας όπως υποδεικνύεται. Οι ασθενείς με διηθητικό BCs προσφέρθηκαν ριζική κυστεκτομή με ή χωρίς συστηματική χημειοθεραπεία.

Η ανοσοϊστοχημεία

Τμήματα, πάχους 3 mm, από φορμόλη σταθερό, έχει εμπεδωθεί με παραφίνη ιστού κόπηκαν και τοποθετήθηκαν σε πλακίδια επικαλυμμένα με 3-aminopropyltriethoxysilone. Τα πλακίδια ξηράνθηκαν στους 56 ° C για 1 ώρα πριν την ανοσοϊστοχημική χρώση. Τομές ιστού αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο πριν επανυδάτωση σε διαβαθμισμένες αλκοόλες, και ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείσθηκε δι ‘επεξεργασίας με 3% Η

2O

2 σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. αποκάλυψη αντιγόνου διεξήχθη με 30 λεπτά επώασης στους 80 ° C σε 10 mM κιτρικό τρινάτριο (ρΗ 6.1). Ανοσοχρώση και αποκάλυψη πραγματοποιήθηκαν σε μια αυτοματοποίηση Dako. Τα πλακίδια επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου με πρωτογενές πολυκλωνικό κατσίκα αντισώματα έναντι αντι-ErbB2 (1:800? Dako), κυκλίνη D1 (1:100? SP4? Epitomics), μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι αντι-p53 (1:250? Ε26? Epitomics) και μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι αντι-Ki-67 (1:100? SP6? Epitomics). Επίτοποι του πρωτογενούς αντισώματος ήταν εντοπισμένες από ανοσοϋπεροξειδάσης τεχνική χρησιμοποιώντας το δευτερεύον αβιδίνης-βιοτίνης και υπεροξειδάσης κιτ υποστρώματος αντίσωμα (kit 5001, Dako), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι τομές στη συνέχεια σε επεξεργασία με Chromagen 30-30 διαμινοβενζιδένιο τετραϋδροχλωρική για τον εντοπισμό των τόπων ανοσοκαταβύθιση με οπτικό μικροσκόπιο. Τέλος, τα τμήματα πλύθηκαν, αντίθετα με αιματοξυλίνη, και τοποθετημένο κάτω από καλυπτρίδες. Καμία συγκεκριμένη χρώση παρατηρήθηκε όταν το πρωτογενές αντίσωμα παραλείφθηκε από το πρωτόκολλο (αρνητικός έλεγχος). Ιδιαιτερότητα της ανοσοχρώση επιπροσθέτως ελέγχεται με ταυτόχρονη χρώση των δειγμάτων καρκίνου του μαστού με γνωστές ErbB2, κυκλίνη D1, ρ53 και πρότυπα έκφρασης Κί67. Ένας έμπειρος παθολόγος σημείωσε την ένταση χρώσης σε τέσσερα επίπεδα (αρνητικό, ασθενές, μέτρια και ισχυρή), λαμβάνοντας υπόψη τόσο την ένταση του χρώματος και του αριθμού των χρωματισμένων κυττάρων.

μικροσυστοιχιών πειραματισμός και η ένταξη των Δημοσίως διαθέσιμες μικροσυστοιχιών Σύνολα

μάρκες ολιγονουκλεοτίδια μικροσυστοιχιών (-57 k γονίδια) ελήφθησαν από την GE Healthcare (IL) και AppliedMicroarrays (MA) (πρώην Amersham Biosciences) (CodeLink 57 k Ανθρώπινο ολόκληρο το γονιδίωμα) [11], [12], [13]. Ο υβριδισμός πραγματοποιήθηκε με το κιτ ενίσχυσης και Labeling CodeLink RNA όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή, χρησιμοποιώντας την φθορίζουσα χρωστική Cy5. Διαφάνειες σαρώθηκαν με ένα σαρωτή μικροσυστοιχιών (ScanArray 4000XL). Οι εικόνες που δημιουργούνται με λογισμικό απόκτησης ScanArray μικροσυστοιχιών (GSI Lumonics, USA). cRNAs από τρεις πειραματικές διατάξεις που χρησιμοποιούνται σε πειράματα με ενιαία εσωτερική αιχμές ως έλεγχοι. Οι πειραματικές διατάξεις αποτελούνταν από 10 δείγματα ούρων π.Χ. διαφορετικών ιστολογία (βλ Δειγματοληψία ιστού και χειρουργικής ενότητα Διαδικασία) και 5 δείγματα ελέγχου. Οι σαρωμένες εικόνες σε περαιτέρω επεξεργασία με την CodeLink Έκφρασης Ανάλυση v5.0 λογισμικού από την Amersham Biosciences (προς το παρόν GE Health Care Inc.). Η πειραματική διάταξη αναλύθηκε με βάση την αναφορά σχεδιασμού όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14], [15], [16], όπως παρουσιάζονται στο Σχήμα S1 Α. Όλα τα δείγματα όγκων συγκρίθηκαν ενάντια στην μέση τιμή των δειγμάτων ελέγχου. Ανεπεξέργαστα δεδομένα μικροσυστοιχιών είναι διαθέσιμα στην βάση δεδομένων μικροσυστοιχιών GEO. Όλα τα δεδομένα μικροσυστοιχιών είναι MIAME συμβατό

Για να διευρύνει τον αριθμό των δειγμάτων π.Χ. υπό διερεύνηση, θα περιλαμβάνονται τα ακόλουθα διαθέσιμα στο κοινό σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχιών στην ανάλυσή μας:. 1) GSE89 σύνολο δεδομένων (GDS183) [17], που αποτελείται από 40 δείγματα π.Χ.? 2) GSE3167 σύνολο δεδομένων (GDS1479) [18], που αποτελείται από 60 δείγματα (9 έλεγχοι και 51 δείγματα π.Χ.)? 3) GSE7476 σύνολο δεδομένων [19], που αποτελείται από 12 δείγματα (3 έλεγχοι και 9 δείγματα π.Χ.) και 4) του συνόλου δεδομένων GSE12630 [20], που αποτελείται από 19 δείγματα. Π.Χ. Συνολικά, συγκεντρωτική ανάλυση μικροσυστοιχιών μας αποτελούνταν από 17 δείγματα ελέγχου (n = 5, για την πλατφόρμα CodeLink? Και η = 12, για τις υπόλοιπες πλατφόρμες μικροσυστοιχιών) και 129 δείγματα BC (n = 10, για την πλατφόρμα CodeLink? Και το η = 119, για τις υπόλοιπες πλατφόρμες μικροσυστοιχιών). Δημόσια δεδομένα χρησιμοποιήθηκαν σε διαθέσιμα κανονικοποιημένη μορφή τους, δεδομένου ότι η διόρθωση υποβάθρου και την κανονικοποίηση είχε ήδη πραγματοποιηθεί.

επεξεργασία μικροσυστοιχιών δεδομένων

Φιλτράρισμα μικροσυστοιχιών δεδομένων και Ιστορικό Διόρθωση της Πλατφόρμας CodeLink.

το φιλτράρισμα γίνεται με βάση την ένταση του σήματος και στο κριτήριο του κατά πόσον το σήμα αυτό είναι πάνω από ένα ορισμένο επίπεδο. Στην ανάλυσή μας, η διήθηση διεξήχθη χρησιμοποιώντας την εξίσωση: όπου S είναι η μετρούμενη ένταση σήματος, B

L είναι η τοπική φόντο μετρηθεί και σ

BL είναι η τυπική απόκλιση της τοπικής φόντο. Σήματα με ένταση μικρότερη από την παραπάνω μετράται, λαμβάνεται μια σημαία. διόρθωση Ιστορικό πραγματοποιήθηκε αφαιρώντας από το διάμεσο παγκόσμια υποβάθρου από το διάμεσο τοπικό παρασκήνιο από την ένταση του σήματος. Ένα όριο των 2 ορίστηκε ως cut-off, που σημαίνει ότι η ένταση για τουλάχιστον ένα κανάλι σημείο θα πρέπει να είναι διπλάσια από εκείνη του υποβάθρου.

μικροσυστοιχιών Δεδομένων Κανονικοποίηση της πλατφόρμας CodeLink.

δεδομένα μικροσυστοιχιών ομαλοποιήθηκαν από την προεπιλεγμένη διαδικασία του λογισμικού CodeLink, δηλαδή εντάσεις σημείο χωρίστηκαν από την παγκόσμια μέση (παγκόσμια μέση κανονικοποίηση) [13]. Κανονικοποιημένα δεδομένα εξήχθησαν, προ-επεξεργασία και διαλογή με το Microsoft Excel ®. Για περαιτέρω ανάλυση των δεδομένων χρησιμοποιήθηκε το Matlab ® (Η Mathworks Inc.) υπολογιστικό περιβάλλον. Τα στοιχεία εξετάστηκαν για το πρότυπο κατανομής τους για την περαιτέρω επιλογή της μεθόδου στατιστική δοκιμή.

μικροσυστοιχιών δεδομένων Cross-Κανονικοποίηση.

δεδομένα μικροσυστοιχιών ήταν cross-κανονικοποιημένη, χρησιμοποιώντας ένα ποσοστημόριο αλγόριθμο, προκειμένου να ληφθούν υπόψη για την προκατάληψη που συμπεριλήφθηκε λόγω πειραματισμό, διαφορετικές πλατφόρμες και διαφορετικά δειγματοληψίας (Σχήμα S2). Εξομάλυνση των δεδομένων cross-platform έχει περιγραφεί στο παρελθόν [21], [22], [23] με πολύ καλές συσχετίσεις και τη συνοχή μεταξύ των πλατφορμών CodeLink και Affymetrix [24], [25].

Δημιουργία ενός κοινού γονίδιο Λίστα και BC Ομάδες

για να διασφαλιστεί ότι τα αποτελέσματα της ανάλυσής μας ήταν συγκρίσιμα, δημιουργήσαμε ένα κοινό κατάλογο γονιδίου ανάμεσα όλες τις πλατφόρμες μικροσυστοιχιών. Για το σκοπό αυτό, ο αριθμός NCBI Gene ID χρησιμοποιήθηκε ως κοινή αναφορά. Μετά από σύγκριση των γονιδίων DE μεταξύ όλων των συνόλων δεδομένων, επιλέχθηκαν μόνο εκείνα που υπάρχουν σε όλες τις πλατφόρμες για περαιτέρω ανάλυση. Συνολικά, η προσέγγιση αυτή φιλτράρισμα απέδωσε ένα σύνολο γονιδίων των 11.837 μοναδικές εγγραφές, ταυτόχρονα παρούσα σε όλες τις πλατφόρμες μικροσυστοιχιών. Σύνολα δεδομένων χρησιμοποιήθηκαν ως μεμονωμένα δείγματα, καθώς και σε ομάδες του όγκου. Η διανομή ομάδα παρουσιάζεται στον Πίνακα S1.

μικροσυστοιχιών Δεδομένων Στατιστικά στοιχεία για την πλατφόρμα CodeLink και η Δημοσίως διαθέσιμες μικροσυστοιχιών Σύνολα

Σε ό, τι αφορά στην πλατφόρμα CodeLink, η προσέγγισή μας αποτελείται από την εξής μεθοδολογία. Κάθε γονίδιο ελέγχθηκε για τη σημασία του σε διαφορική έκφραση χρησιμοποιώντας ένα z-test. Γονίδια θεωρήθηκαν σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων αν ληφθεί μια τιμή p & lt? 0,05. Οι συγκρίσεις έγιναν τόσο μεταξύ των πειραμάτων καθώς και στο πλαίσιο των πειραμάτων. Ρυθμίστε τη χειραγώγηση στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για να ανακαλύψετε περαιτέρω υποσύνολα που θα χαρακτηρίζουν, αν είναι δυνατόν, όλα τα δείγματα όγκων. . Για περισσότερες αναλύσεις χρησιμοποιήσαμε τα γονίδια που εκφράστηκαν διαφορικά μεταξύ των δειγμάτων όγκου

Όσον αφορά τη σύγκριση μεταξύ των γονιδίων του όλα τα διαθέσιμα σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχιών, χρησιμοποιήσαμε την εξής μεθοδολογία:

Πρώτον, ψάξαμε για τις διαφορές συγκρίνοντας όλα τα δείγματα ελέγχου (που θεωρείται ως μία ομάδα), έναντι όλων των δειγμάτων του όγκου (θεωρούνται ως μία άλλη ομάδα), χρησιμοποιώντας ένα two-tailed t δύο δειγμάτων-test. Δεδομένου ότι αυτές οι ομάδες περιείχαν τα δείγματα που ποικίλουν σε εθνικότητα και το βαθμό του όγκου, θα ελέγχονται όλες τις προκαταλήψεις, συγκρίνοντας τους ως ενωμένο ομάδες.

Δεύτερον, χωρίσαμε τα δείγματα σε ομάδες (11 ομάδες συνολικά) (Πίνακας S1), καθώς και κάθε ομάδα συγκρίθηκε έναντι όλων των δειγμάτων ελέγχου, χρησιμοποιώντας μια δίπλευρη δύο δειγμάτων T-test.

Τρίτον, συγκρίναμε τα δείγματα ατομικά για σημαντικές γονιδίων μεταξύ κάθε πείραμα, χρησιμοποιώντας μία δίπλευρη z-test, η οποία είναι αναφέρεται ως «ενδο-πειραματική». Αυτό το είδος της σύγκρισης είχε μια ιδιαιτερότητα. Δεδομένου ότι η έκφραση των γονιδίων σε σύγκριση με το μέσο όρο του γονιδιακής έκφρασης μέσα στο ίδιο πείραμα, τα γονίδια DE θα σήμαινε τη διαφορά ότι κάθε δείγμα ιστού εμφάνισε σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς. Αυτό σημαίνει ότι τα κοινά γονίδια μεταξύ τους θα είναι εκείνα τα γονίδια που είναι κοινά σε ιστό του όγκου.

Συγκρίναμε δείγματα ατομικά για σημαντικές γονιδίων, δηλαδή οι λόγοι γονίδιο, μεταξύ πειραματικές διατάξεις, χρησιμοποιώντας ένα δίπλευρη z-test, η οποία αναφερόμαστε ως «δια-πειραματικές». Με άλλα λόγια, ψάξαμε για γονίδια που παρουσίασαν διαφορετική έκφραση από το ένα δείγμα στο επόμενο, αλλά όχι εναντίον των δειγμάτων ελέγχου. Είναι ενδιαφέρον, οι σημαντικές γονίδια που προέρχονται από αυτά περιλαμβάνονται τα γονίδια που δεν ήταν DE. Με άλλα λόγια, αυτά τα γονίδια εντοπίστηκαν μεταξύ εκείνων των οποίων η έκφραση παρέμεινε το ίδιο σε όλα τα δείγματα.

Η

Για να προσδιοριστούν τα διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων, χρησιμοποιήσαμε δύο μεθόδους. Γονίδια θεωρήθηκαν σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων αν ληφθεί μια τιμή p & lt? 0,05. Οι συγκρίσεις έγιναν τόσο μεταξύ των πειραμάτων καθώς και στο πλαίσιο των πειραμάτων. Ρυθμίστε τη χειραγώγηση στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για να ανακαλύψετε περαιτέρω υποσύνολα που θα χαρακτηρίζουν, αν είναι δυνατόν, όλα τα δείγματα όγκων. Για περαιτέρω αναλύσεις χρησιμοποιήσαμε τα γονίδια που εκφράστηκαν διαφορικά μεταξύ δείγματα όγκων, με βάση την ανάγκη για χρήση. Στην περίπτωση όπου συγκρίθηκαν ομάδες δείγμα, η μέση του κάθε γονιδίου ελήφθη κατά τη μέση όλων των δειγμάτων ελέγχου. Στην περίπτωση των επιμέρους συγκρίσεων των δειγμάτων, αναλογίες γονίδιο υπολογίστηκαν κατά τη μέση της όλα τα δείγματα ελέγχου.

False Discovery Rate (FDR)

Το Λάθος Discovery Rate υπολογίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26 ], [27], [28].

Ομαδοποίηση ανάλυση

ανάλυση Ομαδοποίηση έγινε με τον αλγόριθμο k-means. Συνολικά, 81 ομάδες του πλήρους συνόλου δεδομένων της πλατφόρμας CodeLink και 100 clusters για όλες τις διαθέσιμες σύνολα δεδομένων, σχηματίστηκαν και DE γονίδια περαιτέρω ταξινομούνται χρησιμοποιώντας αμφίδρομη (γονιδίων-εναντίον-δείγματα) μέση-σύνδεση ιεραρχική ομαδοποίηση με Ευκλείδεια απόσταση [29 ]. ανάλυση ομαδοποίησης και χαρτογράφηση χρωμοσώματος ήταν εν μέρει γίνεται με Genesis 1.7.2 (Technische Universitaet-Graz, Αυστρία) με χρήση συσχέτισης του Pearson (

r

) και την αντιστοιχία σειρά κατάταξης Spearman του (

ρ

) [30 ], [31], [32].

TFBM Ανάλυση

για να εντοπίσει τους παράγοντες μεταγραφής οδήγηση των παρατηρούνται αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων, ερευνήσαμε τη μεταγραφή Factor μοτίβα πρόσδεσης (TFBMs) στη Βάση Δεδομένων Ακούγοντας Σύστημα Μεταγραφή Element (Τέλης) (www.telis.ucla.edu) [33]. Η βάση δεδομένων μεταγραφικός παράγοντας TRANSFAC χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση των θέσεων πρόσδεσης παράγοντα μεταγραφής γονιδίου [34].

Χαρτογράφηση γονιδίων

χαρτογράφηση χρωμοσωμάτων φαίνεται να είναι μια πολλά υποσχόμενη μέθοδος για την ταυτοποίηση μοτίβα μεταξύ γονιδίων. Η κύρια ιδέα αναφερθεί αρχικά από τον

Cohen et al

. είναι για χαρτογράφηση γονιδίων σε χρωμοσωμικές περιοχές και με αυτόν τον τρόπο, αν υπάρχουν συσχετισμοί εμφανίζονται μέσω της τοποθεσίας των γονιδίων επί χρωμοσωμικών περιοχών, αφού διαδοχικές γονίδια συχνά εκφράζονται ομοίως [30]. Για την ανάλυση χαρτογράφηση χρωμοσωμάτων, χρησιμοποιήσαμε την οντολογία γονιδίων Δέντρο Machine, WebGestalt web-εργαλείο (Vanderbilt University, The Netherlands, https://bioinfo.vanderbilt.edu/gotm/) [35] και το Matlab ® (Η Mathworks Inc.) υπολογιστικό περιβάλλον.

Γονιδιακή Οντολογία (GO) ανάλυση

Γονιδιακή Οντολογία (GO) ανάλυση αρχικά πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το online εργαλείο Egon για τη Γονιδιακή Οντολογία (νορβηγικό Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας, Τρόντχαϊμ, Νορβηγία , https://www.genetools.microarray.ntnu.no/egon/) για να βρει λείπουν τα σύμβολα γονιδίου [36]. WebGestalt web-εργαλείο (Vanderbilt University, The Netherlands, https://bioinfo.vanderbilt.edu/gotm/) [35], [37] χρησιμοποιήθηκε για ταξινομήσεις της λειτουργίας των γονιδίων. Οι σχέσεις των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων και τα μοτίβα δέσμευσης παράγοντα μεταγραφής ερευνήθηκαν περαιτέρω με τη χρήση της βάσης δεδομένων Pubgene Οντολογία (www.pubgene.org). ορισμούς των γονιδίων και λειτουργίες βασίστηκαν στο Εθνικό Ινστιτούτο των βάσεων δεδομένων υγείας (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez/).

Οι αριθμοί ένταξη GEO

Array δεδομένα έχουν κατατεθεί στο Gene Expression Omnibus (National Center for Biotechnology Information) με αριθμούς πρόσβασης GSM678186 μέσω GSM678385 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE27448).

Results

Immunohistochemistry

Tumor δείγματα βάφτηκαν με αντισώματα για ErbB2, κυκλίνη D1, ρ53 και Ki-67. Εάν υπάρχει, αντι-ErbB2 χρώση σε δείγματα όγκων είναι μια χρώση μεμβράνη, διάχυτη στο ουροθήλιο (Σχήμα 1). Όλα τα δείγματα TCC (100%) παρουσίασαν μέτρια /strong (++, +++) ανοσοχρώση, ενώ κανένα δείγμα δεν TCC δεν έδειξε /αδύναμο ανοσοχρώση (0, +). Κατώτατα όρια για υψηλούς δείκτες επισήμανση τέθηκαν για Ki-67 σε ≥10% πυρήνες θετικά όγκου και για την p53 σε 10 και 20%. όγκους Τ1 /2-Grade III παρουσίασαν την ισχυρότερη ανοσοχρώση (+++, & gt? 70%). Τ1-Grade Ι /ΙΙ όγκων έδειξαν ασθενή χρώση για αντι-Ki-67 (40% και 7,5%, αντίστοιχα), ενώ οι όγκοι Τ1 /2-Grade III παρουσίασαν την ισχυρότερη ανοσοχρώση (54%). Ομοίως, οι όγκοι T1-Grade Ι /ΙΙ έδειξαν ασθενή χρώση για αντι-ρ53 (10% και 35%, αντίστοιχα), ενώ οι όγκοι Τ1 /2-Grade III παρουσίασαν την ισχυρότερη ανοσοχρώση (53%). Από την άλλη πλευρά, όγκοι T1-Grade Ι /ΙΙ έδειξαν έντονη χρώση για αντι-κυκλίνη D1 (80% και 80%, αντίστοιχα), ενώ οι όγκοι Τ1 /2-Grade III εμφάνισαν αδύναμος ανοσοχρώση (31,8%).

Από την άλλη πλευρά, όγκοι T1-Grade II έδειξαν έντονη χρώση για αντι-κυκλίνη D1 (80%), ενώ οι όγκοι Τ1-Grade III εμφάνισαν αδύναμος ανοσοχρώση. Εκπρόσωπος H & amp? Ε διαφάνειες υποδηλώνουν την ιστολογία του Τ1-Grade II, Τ1-Grade III και Τ2-Grade III όγκους

Η

CodeLink Πλατφόρμα των στοιχείων διανομής και Ανάλυση

δεδομένα μικροσυστοιχιών ερευνήθηκαν. για την κανονική ιδιοκτησία της διανομής τους. Τα κανονικοποιημένα δεδομένα ακολούθησαν μια κανονική κατανομή όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα S1B και S1c. στατιστικές Z-test εφαρμόστηκαν στα δεδομένα, τόσο σε μεμονωμένα δείγματα, καθώς και για τις ομάδες του όγκου. Στην περίπτωση των ομάδων των όγκων, γονίδια τα οποία απέκτησε τιμή ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκαν διαφορικά εκφρασμένων. Στο Σχήμα S3A-C η κατανομή των ρ-τιμές παρουσιάζονται. FDR υπολογίστηκε όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [27], [28]. FDR υπολογίστηκε ότι είναι 9,3% για μία τιμή ρ & lt? 0,05 για όγκους της ομάδας II, 8,6% για ρ-τιμή & lt Τ1-Grade? 0,05 για όγκους της ομάδας Τ1-Grade III και 11,03% για τιμή ρ & lt? 0,05 για όγκους του Τ2 και Τ3 ομάδα-Grade III (Σχήμα S3D-F). Η ίδια διαδικασία ακολουθήθηκε για κάθε δείγμα χωριστά. Γονίδια απεικονίζονται στο box-οικόπεδα, προκειμένου να εξετάσει τις κατανομές έκφρασης με περισσότερες λεπτομέρειες. Box-οικόπεδα των ομάδων του όγκου, καθώς και εκείνα για τα ατομικά δείγματα απεικονίζονται στο Σχήμα S4A και Εικόνα S4B, αντίστοιχα

Ανάλυση της Κοινής διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων:. Platform CodeLink

Για τον εντοπισμό του γονιδίου πρότυπα έκφρασης σε ουρική π.Χ., αναλύσαμε περαιτέρω δεδομένα μικροσυστοιχιών μας με τέτοιο τρόπο ώστε εντοπίστηκαν κοινά πρότυπα έκφρασης μεταξύ των διαφορετικών δειγμάτων. Εμείς επικέντρωσε την ανάλυσή μας, όχι μόνο σχετικά με τις διαφορές μεταξύ των δειγμάτων όγκου, αλλά και για τις ομοιότητες τους. Δεν ήταν έκπληξη το γεγονός ότι δεν υπάρχουν τέτοιες ομοιότητες. Διασταυρώσεις μεμονωμένων δειγμάτων όγκων απεκάλυψε 831 γονίδια που εκφράζονται διαφορικά ταυτόχρονα σε όλα τα δείγματα όγκου (είτε ανάντη, είτε ρυθμισμένα προς τα κάτω). Από αυτά τα γονίδια DE, εντοπίσαμε 33 γονίδια με ταυτόχρονη αυξημένη έκφραση και 85 γονίδια με ταυτόχρονη μειωμένη έκφραση σε όλα τα δείγματα π.Χ., σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό.

Μεταξύ των up-ρυθμιζόμενα γονίδια, εκείνες που παρουσιάζουν την υψηλότερη έκφραση φορές ( μέση τιμή ± SD) ήταν: υποξία πρωτεΐνη 2 (HIG2? NM_013332.1) (2,70 ± 0,54)? APC11 προώθηση συγκρότημα υπομονάδα 11 ανάφαση (ANAPC11? NM_001002245.1) (2.50 ± 0.60)? zo54e12s1 Stratagene παγκρέατος (# 937208) cDNA κλώνος IMAGE: 590.734 3 ‘παρόμοια με TR: G1022718 G1022718 πυρηνικών υποδοχέων CO καταστολέα (NCOR1? AA156336.1) (2,01 ± 1,13)? UI-1-BB1p-ATP-e-01-0-UIs1 NCI_CGAP_Pl6 cDNA κλώνος UI-1-BB1p-ATP-e-01-0-UI 3 ‘, (BU754189? BU754189.1) (1,89 ± 0,56). Ομοίως, τα γονίδια που εμφάνισαν τα χαμηλότερα ποσοστά έκφρασης φορές (μέση τιμή ± SD) ήταν: tn52a12.x1 κλώνος NCI_CGAP_Kid11 cDNA IMAGE: 2171998 3 ‘παρόμοια με περιέχει PTR5.b2 MER22 επαναλαμβανόμενο στοιχείο (AI565993? AI565993.1) (-3,13 ± 0,66 )? zx51b02r1 Soares_testis_NHT cDNA κλώνος IMAGE: 795.723 5 ‘(AA461577? AA461577.1) (-2,75 ± 0,86)? lactotransferrin (LTF) (ANKRD29? NM_173505.2) (-2,28 ± 1,17)? HUMNK566 Ανθρώπινα cDNA επιδερμικά κερατινοκύτταρα κλώνος 566 (ODZ2? D29453.1) (-2,15 ± 1,02)? υπεροικογένεια νέκρωσης όγκων υποδοχέα του παράγοντα, μέλος 17 (TNFRSF17) (TNFRSF17? NM_001192.2) (-2,07 ± 0,73)? και των σκελετικών μυών LIM-πρωτεΐνης FHL1 mRNA (FHL1? U60115.1). (-2,06 ± 0,87)

Όσον αφορά τις τρεις ομάδες του όγκου (Τ1-Grade II, Τ1-Grade III και Τ2 /Τ3-Grade III ), η ανάλυση μας δεν έδειξαν ένα υποσύνολο των γονιδίων κοινά σε όλες τις ομάδες. Συνεπώς, διερευνήσαμε τις κοινές γονιδίων DE μεταξύ των ζευγών των ομάδων όγκου (Πίνακες S2, S3, S4). DE γονίδια κοινά σε όλα τα άτομα, ανεξάρτητα από την ομάδα των όγκων, περαιτέρω συγκεντρωμένα χρήση ιεραρχικής ομαδοποίησης με Ευκλείδεια απόσταση. Οι ομάδες των κοινών γονιδίων σε διάφορους συνδυασμούς που παρουσιάζονται στον Πίνακα S5

Ιεραρχική Ομαδοποίηση με Ευκλείδεια Απόσταση:.. CodeLink Πλατφόρμα

Πραγματοποιήσαμε αμφίδρομη μέσο-σύνδεση ιεραρχική ομαδοποίηση με Ευκλείδεια απόσταση για -57 k γονίδια. Μια λεπτομερής άποψη του δενδρογράμματος συμπλέγματος δείγμα εμφανίζεται στην εικόνα 2. Θα κατανεμήθηκε τους όγκους σε δύο κύριες ομάδες και πολλές υποομάδες με βάση την διαφορική έκφραση του γονιδιώματος τους. Το πρώτο κατάστημα περιείχε έναν όγκο Τ1-Grade II και το άλλο περιείχε όγκους T1-3-Grade II /III, οι οποίες περαιτέρω συγκεντρωμένα σε επιπλέον υποομάδες

Η

K-means clustering:. CodeLink πλατφόρμα.

K-means clustering αλγόριθμος είναι ένας άλλος τρόπος ταξινόμησης των δεδομένων για να βρει τα πρότυπα της έκφρασης. Η ανάλυσή μας είχε οργανωθεί ως εξής:

k-means όλων των γονιδίων και όλων των δειγμάτων. Το αποτέλεσμα του k-means συσταδοποίηση όλων των γονιδίων και όλα τα δείγματα παρουσιάζεται στο Σχήμα 3Α. Εμείς συγκεντρωμένα δεδομένα σε 49 συμπλέγματα μαζί με κεντροειδή τους (Σχήμα 3Β). Για κάθε ομάδα cluster υπήρχαν αρκετά γονίδια που χαρακτήριζε το σύμπλεγμα δηλαδή χαρακτηρίζεται το δείγμα ότι τα γονίδια ανήκαν.

k-μέσων κοινά γονίδια DE σε όλα τα δείγματα. Τα κοινά γονίδια DE μεταξύ όλων των δειγμάτων προαγμένος συγκεντρωμένα (Σχήμα 4Α και 4Β).

k-means των ομάδων όγκου. Για την ολοκλήρωση της ανάλυσης με βάση την k-means clustering τις ομάδες όγκου αναλύθηκαν όπως ορίζεται παραπάνω. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 5Α και 5Β για σύμπλεγμα και κεντροειδή, αντίστοιχα. Συστάδες των ομάδων όγκου αποκάλυψε δύο διαφορές, καθώς και τις ομοιότητες μεταξύ των διαφόρων ομάδων. Για παράδειγμα, ορισμένες κατηγορίες γονιδίων αποκάλυψε συστατική ρύθμιση προς τα κάτω σε μία ομάδα όγκων έναντι της ομάδας του ανώτερο στάδιο /βαθμός, ενώ άλλες κατηγορίες γονίδιο εμφάνισαν συστατική πάνω ρύθμιση μεταξύ των αντίστοιχων ομάδων (clusters 11, 24, 27, 30, 33, 41, 46). Ταυτόχρονα, αρκετές συστάδες περιλαμβάνονται γονίδια τα οποία παρέμειναν αμετάβλητα μεταξύ των ομάδων του όγκου (clusters 21, 26, 35, 37, 45, 47, 48).

Η

K-means cluster έδωσε κάποια διακριτά πρότυπα μεταξύ των δειγμάτων , όπως σε ομάδες 1, 3, 4, 5, κλπ

η

clusters (Α) και κέντρα βάρους (Β) παρουσιάζονται, όπου δεν μπορεί να γίνει σαφής διάκριση μεταξύ των επιμέρους δειγμάτων.

Principal Component Analysis (PCA):. CodeLink Πλατφόρμα

PCA όλων των γονιδίων σε όλα τα δείγματα. PCA ανάλυση των δεδομένων μας περαιτέρω διεξάγεται για να αναζητήσετε άλλες πιθανές μορφές μεταξύ των γονιδίων. Η αρχική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με γονίδια που συνήθως ϋΕ μεταξύ όλων των δειγμάτων. Υπολογίστηκε κύρια συστατικά σχεδιάστηκαν έναντι μεταξύ τους σε διαγράμματα διασποράς, όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 6. PCA ανάλυση των γονιδίων διεξήχθη για να βρει περαιτέρω μοτίβα στα δεδομένα έκφρασης. Για να διεξαχθεί η παρούσα ανάλυση με όλα τα γονίδια και σε όλα τα δείγματα, το πρώτο βήμα ήταν να σχεδιάσει διαγράμματα διασποράς όλων των συνδυασμών από τα κύρια συστατικά (Σχήμα 6Α, Β). Τα γονίδια που εκδηλώνεται διάφορα μοτίβα όπως σημειώνεται στις περιοχές κυκλωμένα στο Σχήμα 6Β. Στη συνέχεια, τα δείγματα εξετάστηκαν για το ποσοστό της διακύμανσης που αποδίδεται στα κύρια συστατικά (Σχήμα 6C, D). Τέλος, ένας biplot κατασκευάστηκε προκειμένου να εξετάσουν την κατάταξη του δείγματος σε σχέση με το συνολικό γονιδιακής έκφρασης (Σχήμα 6Ε). Όπως παρουσιάζεται στις κυκλωμένα περιοχές στο σχήμα 6Ε, τα δείγματα ομαδοποιούνται σε δύο βασικές κατηγορίες: Δείγματα 22Α (T2 /T3-Grade III), 27Α (Τ1-Grade III) και 29Α (Τ2 /Τ3-Grade III) από τη μία πλευρά, και το υπόλοιπο των δειγμάτων ομαδοποιούνται. Για την επίλυση περαιτέρω για τις διαφορές που βασίζεται στην ανάλυση PCA συγκρίναμε την έκφραση του γονιδίου ως εξής.

PCA των κοινών γονιδίων DE σε όλα τα δείγματα. PCA ανάλυση των κοινών γονιδίων DE παρουσιάζεται στο Σχήμα 7. Ομαδοποίηση των δειγμάτων με βάση τα κύρια στοιχεία έδειξαν διαφορετικές ταξινομήσεις. δείγματα όγκων 2Α, 3Α και 4Α ομαδοποιήθηκαν διακριτά σύμφωνα με τις τρεις πρώτες κύριες συνιστώσες (Σχήμα 7Ε). Αυτά τα τρία δείγματα συγκεντρώθηκαν όταν θεωρήθηκε το πλήρες σύνολο δεδομένων. Η επίλυση αυτού του αποτελέσματος με τα κοινά γονίδια DE έδειξε μια διαφορά μεταξύ των ομάδων των όγκων. Παρομοίως, διάφορες διαφορετικές ομαδοποιήσεις ελήφθησαν με PCA ανάλυση των κοινών γονιδίων DE μεταξύ όλων των δειγμάτων, όπως μεταξύ δείγματα όγκων 22Α, 10Α, τα δείγματα 2Α, 4Α, 16Α που σχηματίζεται μια ξεχωριστή ομάδα και τα δείγματα 3Α, 17Α, 26Α, 27Α, 29Α ότι διαμορφώνεται ένα άλλο (Σχήμα 7F). Παρομοίως, σχεδιάζοντας των συστατικών ομαδοποιημένων δειγμάτων 3Α και 16Α, καθώς επίσης και δείγματα 2Α, 4Α και 10Α σε μια ξεχωριστή ομάδα.

PCA των ομάδων του όγκου.