Αφηρημένο

Ο καρκίνος εξακολουθεί να είναι μία από τις κύριες αιτίες θανάτου παγκοσμίως, και την εξεύρεση νέων θεραπειών παραμένει μεγάλη πρόκληση. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι τροποποιημένες μορφές της πηκτίνης, ένα σύμπλεγμα πολυσακχαρίτη που υπάρχει στο πρωτογενές τοίχωμα φυτικού κυττάρου, κατέχουν αντικαρκινικές ιδιότητες. Παρ ‘όλα αυτά, ο μηχανισμός δράσης των τροποποιημένων πηκτίνη και τα μονοπάτια που εμπλέκονται είναι ασαφείς. Εδώ, δείχνουμε ότι πηκτίνη κίτρου τροποποιηθεί με θερμική επεξεργασία θάνατος που επάγεται σε κύτταρο HepG2 και τα κύτταρα Α549. Η επαγόμενη κυτταρικό θάνατο διαφέρει από την κλασική απόπτωση επειδή δεν παρατηρήθηκε διάσπαση του DNA. Επιπλέον, Z-VAD-fmk, ένας αναστολέας παν-κασπάσης, δεν επηρέασε την παρατηρούμενη κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα HepG2 αλλά φάνηκε να είναι εν μέρει προστατευτική σε κύτταρα Α549, υποδεικνύοντας ότι θερμικά τροποποιημένη πηκτίνη εσπεριδοειδών μπορούσε να προκαλέσει κασπάσης-ανεξάρτητο θάνατο κυττάρου. Μια αύξηση στην αφθονία της φωσφατιδυλαιθανολαμίνης-συζευγμένου Ελαφριάς Αλυσίδας 3 πρωτεΐνη (LC3) και μια μείωση στην πρωτεΐνη ρ62 αφθονία παρατηρήθηκαν σε δύο τύπους κυττάρων όταν επωάζονται παρουσία της πηκτίνης εσπεριδοειδών θερμότητα τροποποιηθεί. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν την ενεργοποίηση της αυτοφαγία. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη φορά που autophagy έχει αποκαλυφθεί σε κύτταρα επωάζονται παρουσία μίας τροποποιημένης μορφής της πηκτίνης. Αυτή η ενεργοποίηση αυτοφαγία φαίνεται να είναι προστατευτικός, τουλάχιστον για τα κύτταρα Α549, επειδή η αναστολή της με 3-μεθυλαδενίνη αύξησε την παρατηρούμενη τροποποιημένη πηκτίνη επαγόμενη κυτταροτοξικότητα. Αυτή η μελέτη επιβεβαιώνει το δυναμικό της τροποποιημένης πηκτίνη για τη βελτίωση χημειοθεραπευτικών θεραπείες για τον καρκίνο

Παράθεση:. Leclere L, Fransolet Μ, Cote F, Cambier P, Arnould Τ, Van Cutsem P, et al. (2015) Heat-Modified πηκτίνη εσπεριδοειδών προκαλεί απόπτωση-Όπως κυτταρικό θάνατο και Autophagy σε HepG2 και Καρκίνος Α549 κύτταρα. PLoS ONE 10 (3): e0115831. doi: 10.1371 /journal.pone.0115831

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Daolin Τανγκ, του Πανεπιστημίου του Πίτσμπουργκ, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 11 Αυγούστου του 2014? Αποδεκτές: 2 του Δεκέμβρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 20, Μαρτίου, 2015

Copyright: © 2015 Leclere et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση: Λ. LECLERE ήταν ο αποδέκτης μιας υποτροφίας FRIA (Fonds pour la σχηματισμό à la Recherche dans l’Industrie et dans l’Agriculture, Βρυξέλλες, Βέλγιο) . Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

Ο καρκίνος παραμένει μια από τις κύριες αιτίες θανάτου παγκοσμίως. Παρά ένα ευρύ φάσμα θεραπευτικών προσεγγίσεων, ο καρκίνος δεν μπορεί να θεραπευτεί εύκολα, και πολλοί τύποι καρκίνου του εξακολουθούν να έχουν ένα χαμηλό ρυθμό σκλήρυνσης. Αν και απαραίτητη για την θεραπεία, η χημειοθεραπεία και η ακτινοθεραπεία αποτελούν επίσης πηγές πολλές παρενέργειες, και η χειρουργική επέμβαση μπορεί μερικές φορές να λείπει μεταστάσεις. Αυτοί είναι οι λόγοι για τους οποίους η ανάπτυξη νέων θεραπειών για τη βελτίωση των υφιστάμενων θεραπειών είναι μια μεγάλη πρόκληση. Φυσικές ενώσεις και φυτοχημικά πρόσφατα απέκτησαν μεγάλο ενδιαφέρον για την ικανότητά τους να ρυθμίζουν τα μονοπάτια σηματοδότησης που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό του καρκίνου και μετάσταση ή για προστατευτικό δυναμικό τους στην ακτινοθεραπεία, όπως ανασκοπείται από Hazra [1].

πηκτίνες είναι άφθονα και πολύπλοκες συστατικά του πρωτογενούς φυτικού κυτταρικού τοιχώματος και είναι καλά γνωστά ως φυτικές ίνες. πολυσακχαρίτες πηκτίνη περιλαμβάνουν homogalacturonan (HG), υποκατεστημένο γαλακτουρονάνες, ραμνογαλακτουρονάνη-Ι (RG-I) και ραμνογαλακτουρονάνη-ΙΙ (ΡΟ-ΙΙ). HG είναι ένα πολυμερές του α-1,4-συνδεδεμένη-D-γαλακτουρονικό οξύ και τα κατάλοιπα HG μπορεί να είναι μεθυλο-εστεροποιημένα στο C-6 καρβοξυλίου ή ακετυλιωμένη σε O-2 ή O-3, ανάλογα με την πηγή πηκτίνης. Η ραχοκοκαλιά του HG είναι ομοιοπολικά εγκάρσια συνδεδεμένη με RG-Ι και RG-II. RG-Ι είναι ένα διακλαδισμένο πολυμερές με σκελετό από δισακχαρίτη (α-1,4-D-GalA- α-1,2-LRha) επαναλαμβάνει όπου τα υπόλοιπα Rha μπορούν να υποκατασταθούν με β-1,4-γαλακτάνη, διακλαδισμένη αραβινάνης ή /και πλευρικά αραβινογαλακτάνη αλυσίδες. Η δομή του ΡΟ-ΙΙ είναι εξαιρετικά πολύπλοκη: οι πλευρικές αλυσίδες συνδέονται προς μία ραχοκοκαλιά του HG, και αυτές οι πολύπλοκες πλευρικές αλυσίδες που αποτελούνται από 12 τύπους γλυκοζυλο υπόλοιπα συνδέονται μεταξύ τους με τουλάχιστον 22 διαφορετικές γλυκοσιδικούς δεσμούς [2,3]

Αρκετές in vitro μελέτες έχουν δείξει ότι διάφορες μορφές τροποποιημένης πηκτίνης έχουν ιδιότητες κατά των όγκων (για μια επισκόπηση, βλέπε [4]). Η περιοχή RG-Ι μπάμιες πηκτίνη μειώνει τον πολλαπλασιασμό και επάγει την απόπτωση σε κύτταρα μελανώματος [5], και ολιγοσακχαρίτες πηκτίνη επίσης επάγουν απόπτωση σε κύτταρα μυελώματος [6]. Jackson

κ.ά.

έδειξε ότι διαφορετικά πρωτόκολλα κατακερματισμός πηκτίνης μπορεί να οδηγήσει σε διαφορές στην δραστικότητα επαγωγής απόπτωσης πηκτίνη, και ότι κατακερματισμένη πηκτίνη έχει κυτταροτοξική δράση σε ανδρογόνο-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Επιπλέον, αυτοί οι συγγραφείς έδειξαν ότι το ρΗ έχει τροποποιηθεί πηκτίνη εσπεριδοειδών είχε μικρή ή καθόλου δραστηριότητα αποπτωτική [7].

In vivo

, έχει δειχθεί ότι η angelan, μια πηκτίνη που προέρχεται πολυσακχαρίτη, θα μπορούσε να αποτρέψει την ανάπτυξη μελανώματος κυττάρων και τη μετάσταση, και angelan επίσης αναφερθεί ότι είναι ένας ανοσοτροποποιητής που ενισχύει την ανοσολογική λειτουργία των Β κυττάρων, μακροφάγων και φυσικά κύτταρα φονείς [8]. Από του στόματος πρόσληψη διαλυτών θραυσμάτων πηκτίνη αναστέλλει την ανάπτυξη και τη μετάσταση των μεταμοσχευθέντων όγκων σε ποντικούς [9,10], και έχει δειχθεί ότι οι τροποποιημένες πηκτίνη κίτρου αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου και του ήπατος μετάσταση [11]. Πάντως, οι μηχανισμοί με τους οποίους τροποποιημένα πηκτίνη ασκεί αυτές οι επιδράσεις δεν είναι γνωστές

Ο σκοπός αυτής της μελέτης είναι να χαρακτηρίσει τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα της πηκτίνης εσπεριδοειδών θερμικά κατακερματισμένη (HFCP) σε κυτταρικές σειρές δύο όγκου:. HepG2 κύτταρα από ανθρώπινη ηπατοκαρκινώματος και Α549 κύτταρα από ανθρώπινο καρκίνωμα πνεύμονα. Αναφέρουμε ότι η θερμότητα-κατακερματισμένη πηκτίνη εσπεριδοειδών επάγει μία αποπτωτική-όπως κυτταρικού θανάτου που είναι εν μέρει κασπάσης-ανεξάρτητη και ενεργοποιεί αυτοφαγία σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλασμάτωση πηκτίνη κίτρου από θερμική επεξεργασία

Heat-κατακερματισμένη πηκτίνη εσπεριδοειδών (HFCP) λήφθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται από τον Jackson

et al

[7]. Ένα διάλυμα από 0,1% του πηκτίνη κίτρου (Sigma P9135, η οποία αποτελείται κυρίως από homopolygalacturonic οξύ) σε διπλά απεσταγμένο νερό θερμάνθηκε για 60 λεπτά στους 123 ° C και υπό πίεση 17,2 έως 21,7 psi. Το διάλυμα στη συνέχεια καταψύχθηκε στους -80 ° C και λυοφιλοποιήθηκε. Το ξηρό υλικό φυλάχθηκε στους 4 ° C. Φρέσκα διαλύματα σε μέσο καλλιέργειας παρασκευάστηκαν μόλις πριν προστεθούν στα κύτταρα για τις επωάσεις.

Κυτταρική καλλιέργεια και πηκτίνη επώαση

HepG2, Α549, MCF-7 και ΜΟΡ10Α κύτταρα ελήφθησαν από την American Τύπος κύτταρα Culture Collection HepG2 και MCF-7 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM (Gibco 31825-023) και τα κύτταρα Α549 σε θρεπτικό μέσο ΜΕΜ (Gibco 41090-028). Για συνήθη καλλιέργεια, μέσα συμπληρώθηκαν με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Gibco 10270), και τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε μια ατμόσφαιρα 95% αέρα και

2 5% CO. κύτταρα ΜΟΡ10Α καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM /F12 (Gibco 11320-074) που περιέχει 5% ορό αλόγου (Gibco 16050-122), 20 μg /ml EGF, 0,5 μg /ml υδροκορτιζόνη, 10 μg /ml ινσουλίνη και 100 ng /ml της χολέρας τοξίνη. Για τη θεραπεία, τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες μετά την σπορά. Το μέσο αφαιρέθηκε, και τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS (Lonza BE17-516F) και τοποθετούνται σε ένα μέσο χωρίς ορό που περιέχει τα ακόλουθα: 3 mg /ml του αποστειρωμένου με διήθηση HFCP, 3 mg /ml του φίλτρου αποστειρωθεί πηκτίνη κίτρου 3 mg /ml ή 50 μΜ ετοποσίδη, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Οι αρνητικοί μάρτυρες ήταν κύτταρα επωάστηκαν μόνα σε μέσο. Σε μερικά πειράματα, όταν ενδείκνυται, σταυροσπορίνη (Sigma S4400), παν-κασπάσης αναστολέας Ζ-VAD-fmk (BD Pharmingen 550.377), 3-μεθυλαδενίνη (Sigma M9281) ή βαφιλομυκίνης (Sigma B1793) προστέθηκε κατά τον ίδιο χρόνο όπως η ετοποσίδη, HFCP ή πηκτίνη.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

κύτταρα HepG2 σπάρθηκαν σε 50 000 κύτταρα /φρεάτιο και τα κύτταρα Α549 σε 30 000 κύτταρα /φρεάτιο σε τρυβλία 24 φρεατίων πριν από θεραπείες για 6, 24 ή 48 h. ΜΤΤ (3- [4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ] 2,5- διφαινυλτετραζόλιο βρωμίδιο, Sigma Μ2128) διάλυμα παρασκευάστηκε σε συγκέντρωση 2,5 mg /mL σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό, και 500 μL προστέθηκε ανά φρεάτιο . Μετά από 2 ώρες στους 37 ° C και 5% CO

2 ατμόσφαιρα, το μέσο και το διάλυμα ΜΤΤ απομακρύνθηκαν πριν την προσθήκη ρυθμιστικού λύσης. Η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε 1 ώρα αργότερα στα 570 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο μικροπλάκας (Bio-Rad x φασματοφωτόμετρο Mark Microplate) και

διαχειριστής Microplate 6

λογισμικού.

δοκιμασία κυτταροτοξικότητας κυττάρων

κύτταρα HepG2 σπάρθηκαν σε 50 000 κύτταρα /φρεάτιο και τα κύτταρα Α549 σε 30 000 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 24 φρεατίων πριν από την επώαση για 24 ή 48 ώρες. Για κάθε φρεάτιο, γαλακτικής αφυδρογονάσης δράση μετρήθηκε στο υπερκείμενο, σε αποκολληθούν τα κύτταρα και σε προσκολλημένα κύτταρα μετά από λύση σε PBS που περιείχε 10% Triton Χ-100 (Merck 9036-19-5). Η δραστικότητα γαλακτικής αφυδρογονάσης ανιχνεύθηκε από μία χρωματομετρική ανίχνευση χρησιμοποιώντας ένα κιτ κυτταροτοξικότητα (Roche 11644 793 001) και ένα φασματοφωτόμετρο μικροπλάκας. ποσοστά κυτταροτοξικότητας υπολογίστηκε από την αναλογία της ποσότητας της LDH που υπάρχει στο υπερκείμενο και αποσπασμένων κυττάρων της συνολικής ποσότητας της LDH, όπως στο ακόλουθο τύπο: 100 * (α + β) /(α + β + γ), όπου a = υπερκείμενο LDH? β = αποσπαστούν κύτταρα LDH? c = προσκολλημένα κύτταρα LDH.

κατακερματισμού του DNA

δοκιμασία

HepG2 κύτταρα εμβολιάστηκαν σε 50 000 κύτταρα /φρεάτιο και τα κύτταρα Α549 σε 30 000 κύτταρα /φρεάτιο σε τρυβλία 24 φρεατίων πριν από την επώαση για 6, 24 ή 48 ώρες. Μια ανίχνευση κυτταρικού θανάτου ELISA (Roche 11 544 675 001) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η απορρόφηση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο στα 405 nm. Η κανονικοποίηση για την περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη από αμφιθαλή πλάκες προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Pierce διεξήχθη.

Caspase-3 δραστικότητα

HepG2 και Α549 κύτταρα σπάρθηκαν σε 600 000 κύτταρα /φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων πριν θεραπείες για 24 ή 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε πάγο σε PBS και φυγοκεντρήθηκαν στους 4 ° C στα 1000 χ g για 5 λεπτά. Τα σφαιρίδια του κυττάρου ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης για 15 λεπτά στους 4 ° C, και οι διαλυτές πρωτεΐνες συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στους 4 ° C. Τα δείγματα παρασκευάστηκαν για να ληφθούν 20 μg πρωτεϊνών ανά 100 μL αποσταγμένου νερού, στο οποίο προστέθηκαν 50 μΐ ρυθμιστικού αντίδρασης και 1 μΙ Ac-DEVD-AFC υπόστρωμα. Τα δείγματα επωάστηκαν στους 37 ° C για 60 λεπτά, και ο φθορισμός ανιχνεύθηκε στα 505 nm μετά από διέγερση στα 400 nm χρησιμοποιώντας ένα Fluoroscan. Η δοκιμασία για τη δράση της κασπάσης-3 πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με Cosse

κ.ά.

[12].

Western ανάλυση κηλίδος

Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (40 mM Tris ? ρΗ 7,5, 150 mM ΚΟΙ, 1 mM EDTA, 1% Triton Χ-100) που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Complete από την Roche Molecular Biochemicals? 1 δισκίο σε 2 ml H

2O, προστέθηκε σε μία αραίωση 1: 25 ) και ρυθμιστικό αναστολέα φωσφατάσης (25 mM NaVO

3, 250 mM ΡΝΡΡ, 250 mM α-γλυκεροφωσφορικό και 125 mM NaF, σε αραίωση 1: 25) σύμφωνα με Cosse

κ.ά.

[12]. Το μέσο φυγοκεντρήθηκε, και δισκιοποιημένα κύτταρα προστέθηκαν σε κυτταρολύματα. Τα προϊόντα λύσης στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 12 000 χ g για 5 λεπτά, και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν. Οι πρωτεΐνες (15 μg) μετουσιώθηκαν με την προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος LDS (Invitrogen NP0007) και θερμάνθηκε στους 70 ° C για 10 λεπτά. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε 4-12% NuPAGE (Invitrogen) γέλη και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη χαμηλής φθορισμού (Millipore IPFL00010). Οι μεμβράνες κρατήθηκαν για 1 ώρα σε διάλυμα αποκλεισμού LiCor και ανιχνεύτηκαν για όλη τη νύχτα με είτε ένα αντι-κασπάση-3 αντίσωμα κουνελιού (Cell Signaling # 9662S) που αναγνωρίζει το πλήρους μήκους και διασπασμένο μορφές της κασπάσης-3 σε αραίωση 1/500 , ένα αντίσωμα ποντικού αντι-PARP (BD Biosciences # 551024) σε αραίωση 1/1000, αντι-κασπάση-8 αντίσωμα ποντικού (Cell Signaling # 97465) σε αραίωση 1/1000, ένα αντι-ubiquitin αντισωμάτων ποντικού ( LifeSensor VU101) σε αραίωση 1/1000, ένα αντίσωμα ποντικού αντι-LC3 (NanoTools 0260-100 /LC3-2G6) σε αραίωση 1/600 ή ένα αντίσωμα ποντικού αντι-Ρ62 (ΑΒ Nova # H00008878-M03) στους μια αραίωση 1/500. Ένα αντι-SS-ακτίνης αντίσωμα ποντικού (Sigma T5168) χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1/30 000 για το SS-ακτίνη ανοσοανίχνευση ως έλεγχος φόρτωσης. Όλα τα αντισώματα αραιώθηκαν σε διάλυμα LiCor περιέχει 0.1% Tween 20 (Sigma Ρ1379). Οι μεμβράνες ξεπλύθηκαν με PBS + 0.1% Tween 20 και επωάστηκαν με συζευγμένο με ένα φθοριόχρωμα αντισώματα αντι-ποντικού ή αντι-κουνελιού (BD Bioscience # 926 έως 32.221) σε αραίωση 1/10 000 για 1 ώρα στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου . Για αντι-ουβικιτίνης επισήμανσης, οι μεμβράνες πλύθηκαν σε PBS μετά τη μεταφορά, σταθεροποιήθηκαν σε PBS που περιέχει 0,5% γλουταραλδεΰδη (ρΗ 7) και ξεπλένονται τρεις φορές σε PBS πριν από το κλείδωμα. Οι μεμβράνες ξεπλύθηκαν μία φορά ακόμη με PBS + 0.1% Tween 20 και ξηραίνονται πριν σαρώνονται και αναλύονται με χρήση λογισμικού Οδύσσεια.

επισήμανσης ανοσοφθορισμού

κύτταρα HepG2 σπάρθηκαν σε 50 000 κύτταρα /φρεάτιο και Α549 κύτταρα σε 30 000 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 24 φρεατίων 24 ώρες πριν από την επώαση με HFCP, πηκτίνη ή ετοποσίδης επί 24 ώρες. Μετά την επώαση, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και κατέστησαν διαπερατά για 10 λεπτά με ένα ψυχρό διάλυμα 80% μεθανόλης και 20% ακετόνη, ξεπλένονται τρεις φορές με PBS-2% BSA και επωάστηκαν για 2 ώρες με πρωτεύοντα αντισώματα. Το πρωτογενές αντίσωμα για χρώση LC3 ήταν κουνελιού αντι-LC3 (L7543 Sigma) (αραίωση 1/250), και το πρωτογενές αντίσωμα για χρώση LAMP1 ήταν αντι-LAMP1 ποντικού (H4A3 έλαβε από τον Αύγουστο & amp? Hildreth, Baltimore [13]). Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS-2% BSA και στη συνέχεια επωάστηκαν για 1 ώρα με τα δευτερεύοντα αντισώματα. Alexa Fluor-488-συζευγμένο αντίσωμα αντι-κουνελιού IgG και Fluor-568-συζευγμένο αντίσωμα IgG Alexa αντι-ποντικού (Molecular Probes) χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1/1000. Μετά από 1 ώρα επώασης, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν τρεις φορές με PBS. Για πυρηνική σήμανση, τα κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά με TOPRO-3 (Molecular Probes, dil. 1/80) με την παρουσία των 2 mg /ml RNAse και κατόπιν ξεπλύθηκαν τρεις φορές με PBS. Τέλος, καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν χρησιμοποιώντας Mowiol (Sigma, St Louis, USA), και τα κύτταρα παρατηρήθηκαν με φθορίζουσα συνεστιακό μικροσκόπιο (Leica SP5).

Αποτελέσματα

Heat-κατακερματισμένη επάγει πηκτίνη εσπεριδοειδών HepG2 και Α549 κυτταρικό θάνατο

για να μελετήσει το θάνατο-επαγωγικές επιδράσεις των κυττάρων του HFCP, δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου, HepG2 και τα κύτταρα Α549, εκτέθηκαν για διαφορετικές χρονικές περιόδους για να HFCP. Η συγκέντρωση των 3 mg /ml επιλέχθηκε μετά από τη δοκιμή αρκετές συγκεντρώσεις του HFCP επί δύο τύπους κυττάρων για 24 ώρες (S1 Εικ.). Etoposide σε συγκέντρωση 50 μΜ χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. μορφολογία των κυττάρων αναλύθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκοπία αντίθεσης φάσης έδειξε ότι η ετοποσίδη επάγει μια ελαφρά θνησιμότητα σε κύτταρα Α549, ενώ τα κύτταρα HepG2 φάνηκε να είναι πιο ευαίσθητα σε αυτό το φάρμακο. Επιπλέον, ο κυτταρικός θάνατος αυξήθηκε με το χρόνο επώασης. HFCP σε συγκέντρωση 3 mg /ml επίσης επάγεται κυτταρικό θάνατο στους δύο τύπους κυττάρων, αλλά σε πολύ μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι η ετοποσίδη σε συγκέντρωση 50 μΜ? αποτέλεσμα ήταν επίσης εξαρτώμενη από το χρόνο. Αντίστροφα, μη τροποποιημένο πηκτίνη σε συγκέντρωση 3 mg /ml δεν επηρέασαν τη μορφολογία των κυττάρων (S2 Εικ.).

προσδιορισμοί ΜΤΤ Διεξήχθησαν μετά από 24 και 48 ώρες (Εικ. 1Α και 1Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι HFCP μείωσε τη βιωσιμότητα των HepG2 και τα κύτταρα Α549 στα δύο χρόνους επώασης, ενώ μη τροποποιημένη πηκτίνη εσπεριδοειδών δεν το έκανε. HFCP τοξικότητα αυξάνεται με τον χρόνο επώασης και ήταν πιο σοβαρή από εκείνο που προκαλείται από ετοποσίδη, ειδικά για τα κύτταρα HepG2. Για την επιβεβαίωση αυτών των δεδομένων, η απελευθέρωση LDH προσδιορίστηκε μετά από 24 και 48 ώρες (Εικ. 1 C και 1 D), και τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την κυτταροτοξική δράση του HFCP επί HepG2 και Α549 κυττάρων, με ισχυρότερη επίδραση επί του πρώτου.

κύτταρα HepG2 και τα κύτταρα Α549 επωάστηκαν με μέσο μόνο (Ctl-), 50 μΜ ετοποσίδη (ETOP), 3 mg /ml θερμικά κατακερματισμένες πηκτίνη κίτρου (HFCP) ή 3 mg /ml πηκτίνη κίτρου (πηκτίνη). (Α) και (Β) Κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ σε κύτταρα HepG2 (Α) και τα κύτταρα Α549 (Β) μετά από 24 και 48 ώρες. (Γ) και (Δ) Η κυτταροτοξικότητα προσδιορίστηκε σε κύτταρα HepG2 (C) και τα κύτταρα Α549 (D) χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης κυτταροτοξικότητας LDH μετά από 24 και 48 ώρες επώασης. Τα δεδομένα είναι τα μέσα τουλάχιστον 3 επαναλήψεις από ανεξάρτητα πειράματα, κάθε πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν +/- SD (η = 3-8). Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν ήταν η δοκιμή Hartley και δοκιμή ANOVAII. Οι τιμές Ρ σε σύγκριση με την αντίστοιχη ελέγχου είναι *: Ρ ≤ 0,05? **: Ρ ≤ 0,01? ***: P ≤ 0.001

Η

Για να διερευνηθεί αν ορού μπορεί να είναι προστατευτική έναντι αυτής HFCP επαγόμενη κυτταροτοξικότητα, όπως παρατηρήθηκε για κάποιους άλλους επαγωγείς απόπτωσης, όπως ετοποσίδη, κύτταρα HepG2 επωάστηκαν 24 ώρες στο. παρουσία HFCP σε ένα μέσο συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό ορό σταυροσπορίνη ορός χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας δεδομένου αποτέλεσμα αποπτωτικό του δεν αναστέλλεται από τον ορό. Ωστόσο, η κυτταροτοξική δράση του HFCP δεν ανεστάλη καθόλου από τον ορό υπό αυτές τις συνθήκες (S3 Εικ.). Πειράματα έχουν επίσης πραγματοποιηθεί με χαμηλότερες συγκεντρώσεις για μεγαλύτερο χρόνο επώασης (72 ώρες) χρησιμοποιώντας κύτταρα HepG2. Αυτό πραγματοποιήθηκε με και χωρίς ορό. Σε σύγκριση με 24 ώρες επώασης, 1 mg /ml HFCP προκάλεσε μια πιο σημαντική μείωση στον αριθμό των βιώσιμων κυττάρων μετά από 72 ώρες επώασης. Ορός φάνηκε να είναι ελαφρώς προστατευτική μετά από 72 ώρες επώασης, η οποία δεν ήταν η περίπτωση μετά από 24 ώρες επώασης (S4 Εικ.).

Η επίδραση της HFCP έχει επίσης δοκιμαστεί σε φυσιολογικά κύτταρα. Αυτό πραγματοποιήθηκε με υψηλές συγκεντρώσεις για σύντομο χρονικό διάστημα επώασης (24 ώρες), καθώς και με χαμηλές συγκεντρώσεις για μεγάλο χρονικό διάστημα επώασης (72 ώρες), με και χωρίς ορό. τα κύτταρα ΜΟΡ-10Α χρησιμοποιήθηκε για αυτά τα πειράματα. κύτταρα ΜΟΡ10Α είναι μια αθανατοποιημένη, μη-μετασχηματισμένα επιθηλιακά κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται από ανθρώπινο ινοκυστική μαστικό ιστό. Συχνά θεωρείται ως κανονικό έλεγχο για τα καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι HFCP επάγεται επίσης ισχυρή κυτταροτοξική δράση στα κύτταρα αυτά. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι HFCP δεν είναι πιθανώς ειδικά για καρκινικά κύτταρα (S5 Εικ.). Πρέπει να σημειωθεί ότι η ετοποσίδη και η σταυροσπορίνη ήταν επίσης ως τοξική για τα κύτταρα ΜΟΡ10Α όπως και για τα κύτταρα HepG2 ενώ ετοποσίδη χρησιμοποιείται επί του παρόντος σε κλινικές για τη θεραπεία πολλών τύπων καρκίνου.

Κατακερματισμένες πηκτίνη εσπεριδοειδών επάγει μη κανονικά απόπτωση σε HepG2 και Α549

Για να διερευνηθεί αν τα θραύσματα πηκτίνη επάγουν απόπτωση, αναλύσαμε την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 με ανάλυση στυπώματος western. Η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 έγινε μέσω διάσπασης, καταλήγοντας σε θραύσματα 14 kDa και 17 kDa, όπως παρατηρείται όταν τα κύτταρα επωάστηκαν με ετοποσίδη για 24 ή 48 ώρες (Σχ. 2Α). HepG2 κύτταρα επωάζονται για 24 ή 48 ώρες με HFCP εμφανίζονται διαφορετικές μορφές διασπασμένη κασπάση-3 από τα κύτταρα επωάζονται με ετοποσίδη. Στις 24 ώρες, επιπλέον ζώνες υψηλότερων φαινόμενα μοριακά βάρη περίπου 20 και 60 kDa, εμφανίστηκε? στις 48 ώρες, τα θραύσματα διασπώνται της κασπάσης-3 ήταν λιγότερο άφθονα στα κύτταρα επωάστηκαν με HFCP, αλλά η μορφή 60-kDa της κασπάσης-3 ήταν ακόμα παρούσα (Εικ. 2Α). Μετά από 48 ώρες επώασης, ένα θραύσμα 20 kDa εμφανίστηκε στα κύτταρα που εκτίθενται σε μέσο μόνο, ετοποσίδη και άθραυστον πηκτίνη, πιθανότατα επειδή αυτά τα κύτταρα επωάστηκαν χωρίς ορό. Ανεξάρτητα, η ζώνη των 60 kDa ήταν ειδική για τις HFCP-επωάστηκαν κύτταρα.

HepG2 και Α549 κύτταρα επωάστηκαν μόνο με μέσο (Ctl-), 50 μΜ ετοποσίδη (ETOP), 3 mg /ml θερμικά κατακερματισμένη πηκτίνη εσπεριδοειδών (HFCP) ή 3 mg πηκτίνης /ml εσπεριδοειδή (πηκτίνη) για 24 και 48 ώρες. (Α) και (Β) Ανίχνευση των ενεργοποιημένων κασπάσης-3 και διασπασμένη PARP σε HepG2 (Α) και τα κύτταρα Α549 (Β) με ανάλυση Western blot. Ανοσοανίχνευση του α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (C) και δραστηριότητα (D) Caspase-3 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα ειδικά φθορισμογόνα υπόστρωμα μετά από 6, 24 και 48 ώρες επώασης σε κύτταρα HepG2 (C) και τα κύτταρα Α549 (D). (Ε) και (ΣΤ) κατάτμηση του DNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης ELISA μετά από 6, 24 και 48 ώρες επώασης σε κύτταρα HepG2 (Ε) και σε κύτταρα Α549 (F). Τα δεδομένα είναι τα μέσα τριπλούν +/- SD (η = 3). Τα δεδομένα είναι τα μέσα τριπλούν +/- SD (η = 3). Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν ήταν η δοκιμή Hartley και δοκιμή ANOVAII. Οι τιμές Ρ σε σύγκριση με την αντίστοιχη ελέγχου είναι *: Ρ ≤ 0,05? **: Ρ ≤ 0,01? ***:. P ≤ 0.001

Η

διάσπασης κασπάσης και πρόσθετες ζώνες ήταν επίσης αισθητή στα κύτταρα Α549 μετά από 24 ή 48 ώρες θεραπείας HFCP (Σχήμα 2Β.). Επιπλέον, το μοτίβο της κασπάσης-3 διάσπαση σε κύτταρα Α549 επωάζονται με HFCP εμφανίζεται μια ενδιαφέρουσα επίχρισμα από 30 έως 60 kDa (Σχ. 2Β). Μια ανάλυση western blot για την πρωτεΐνη PARP (Εικ. 2Α και 2Β), ένα υπόστρωμα της κασπάσης-3, έδειξε την αποκοπή αυτής της πρωτεΐνης και στους δύο τύπους κυττάρων που επωάστηκαν με HFCP ή ετοποσίδη και για τις δύο χρονικές περιόδους. διάσπαση PARP ανιχνεύθηκε επίσης σε κύτταρα HepG2 επωάστηκαν για 48 ώρες με μέσο μόνο ή μη τροποποιημένη πηκτίνη, αν και διασπασμένης ΡΑΚΡ ήταν λιγότερο άφθονα στα κύτταρα αυτά σε σχέση με τα HFCP-επωάστηκαν κύτταρα. Α549 κύτταρα επωάστηκαν για 24 ή 48 ώρες με μη τροποποιημένη πηκτίνη έδειξε μια μόλις ανιχνεύσιμη ποσότητα διασπασμένης ΡΑΚΡ, πιθανότατα επειδή η επώαση σε μέσο χωρίς ορό.

Για να καθοριστεί αν η μη συμβατική διάσπαση της κασπάσης-3 οδήγησε σε ενζυμική ενεργοποίηση, δραστικότητα κασπάσης-3 προσδιορίστηκε σε HepG2 και τα κύτταρα Α549 επωάστηκαν με 50 μΜ ετοποσίδη, 3 mg /ml HFCP ή 3 mg /ml πηκτίνη για 8, 24 και 48 ώρες (Σχ. 2C και 2D). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, μετά από 24 ώρες επώασης, ετοποσίδη αυξήθηκε σημαντικά δραστικότητα κασπάσης-3 σε κύτταρα HepG2 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Τα κύτταρα HepG2 που έλαβαν θεραπεία με HFCP έδειξε επίσης μια υψηλότερη δραστικότητα κασπάσης-3, που αυξήθηκε με τον χρόνο επώασης. Τα κύτταρα Α549 που έλαβαν θεραπεία με ετοποσίδη έδειξε μια μικρή αύξηση στην δραστικότητα της κασπάσης-3 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, αν και αυτή η αύξηση στη δραστικότητα της κασπάσης-3 ήταν λιγότερο σημαντική από αυτή που παρατηρήθηκε στα κύτταρα HepG2, αλλά παρ ‘όλα αυτά ήταν στατιστικά σημαντική. HFCP εκτεθειμένα κύτταρα Α549 εμφανίζεται επίσης κασπάσης-3 ενεργοποίησης που αυξήθηκε με την πάροδο του χρόνου.

Για να επιβεβαιώσετε ότι HFCP επάγει την απόπτωση, τον κατακερματισμό του DNA, μια καθυστερημένη χαρακτηριστικό της απόπτωσης, αξιολογήθηκε. Μια ελεύθερη νουκλεοσώματος κιτ ELISA χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η απελευθέρωση ελεύθερου νουκλεοσωμάτων από DNA (Σχ. 2Ε και F), και τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι HepG2 και Α549 κύτταρα επεξεργασμένα με ετοποσίδη έδειξε κατακερματισμού του DNA που οδηγούν σε νουκλεοσώματος απελευθέρωση. Σε αντίθεση με ό, τι παρατηρήθηκε για ετοποσίδη, κατάτμηση του DNA δεν παρατηρήθηκε σε κύτταρα που επωάζονται με HFCP, υποδεικνύοντας ότι HepG2 και Α549 κύτταρα επεξεργασμένα με κατακερματισμένο πηκτίνη δεν εμφανίζουν κλασικά χαρακτηριστικά αποπτωτικά. Αυτό είναι σύμφωνο με το πυρηνικό μορφολογία που παρατηρείται μετά από χρώση ϋΑΡΙ, η οποία δεν εμφανίζει τυπικά αποπτωτικά κατακερματισμένο χαρακτηριστικά, αλλά φάνηκε να συρρικνωμένο.

Μια δοκιμασία βιωσιμότητας πραγματοποιήθηκε επίσης σε κύτταρα MCF7 κασπάσης-3-ανεπαρκή (S6 Σχ. ). Τα αποτελέσματα έδειξαν μία μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων αυτών όταν επωάζονται παρουσία του HFCP για 24 ή 48 ώρες, υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση της κασπάσης-3, δεν απαιτείται για την επαγωγή του κυτταρικού θανάτου ως απάντηση στην έκθεση HFCP.

Ο ρόλος της κασπάσες σε HFCP-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο

Για να διερευνηθεί αν κασπάσες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στο θάνατο κυττάρου που διεγείρεται από HFCP, τα κύτταρα επωάστηκαν με HFCP παρουσία ενός αναστολέα παν-κασπάσης (Ζ VAD-fmk-) , και η βιωσιμότητα του και κυτταροτοξικότητα σε HepG2 και Α549 κυττάρων μετά από 24 ώρες αναλύθηκαν. Ο αναστολέας κασπάσης οδήγησε σε μικρή αύξηση στην βιωσιμότητα και στους δύο τύπους κυττάρων που επωάστηκαν με ετοποσίδη (Σχ. 3Α και 3Β), μία μικρή μείωση στην κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα HepG2 επωάστηκαν με ετοποσίδη και αξιοσημείωτη μείωση στην κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα Α549 επωάζονται με ετοποσίδη (Εικ . 3C και 3D). Αυτό το σύνολο των δεδομένων υποδεικνύει ότι το Ζ-VAD-fmk ήταν σε θέση να εμποδίσει, τουλάχιστον εν μέρει, το κυτταρικό θάνατο που σχετίζεται με δραστικότητα κασπάσης. Εντούτοις, κύτταρα HepG2 επωάστηκαν με HFCP παρουσία Ζ-VAD-fmk δεν παρουσίασαν καμία αύξηση στην βιωσιμότητα σε σύγκριση με κύτταρα που επωάστηκαν μόνο με HFCP. Μια δοκιμασία κυτταροτοξικότητας επιβεβαίωσε αυτές τις παρατηρήσεις (Εικ. 3Α και 3C), υποδεικνύοντας έτσι ότι κασπασών δεν συνέβαλε στο θάνατο HepG2 κυττάρων που προκαλείται από HFCP. Ωστόσο, Α549 κύτταρα επωάζονται με αναστολέα HFCP και κασπάσης έδειξαν μία υψηλότερη βιωσιμότητα και πολύ λιγότερο κυτταροτοξικότητα από τα κύτταρα Α459 επωάζονται με μόνη HFCP, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι κασπάσες θα μπορούσε να εμπλέκεται στο θάνατο που προκαλείται από HFCP σε κύτταρα Α549 (Σχ. 3Β και 3D).

HepG2 και Α549 κύτταρα επωάστηκαν μόνο με μέσο (Ctl-), 50 μΜ ετοποσίδη (ETOP), 3 mg /ml θερμικά κατακερματισμένες πηκτίνη κίτρου (HFCP) ή 3 mg /ml πηκτίνη κίτρου (πηκτίνη) σε η παρουσία ή απουσία του Ζ-VAD-fmk, έναν αναστολέα κασπάσης, στα 20 μΜ. (Α) και (Β) Κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων HepG2 (Α) και τα κύτταρα Α549 (Β) μετρήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ μετά από 24 ώρες επώασης. (Γ) και (Δ) Η κυτταροτοξικότητα προσδιορίστηκε σε HepG2 (C) και σε Α549 (D) μετά από 24 ώρες επώασης χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης κυτταροτοξικότητας LDH. Τα δεδομένα είναι τα μέσα τριπλούν +/- SD (η = 3). Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν ήταν η δοκιμή Hartley και δοκιμή ANOVAII. Οι τιμές Ρ σε σύγκριση με την αντίστοιχη ελέγχου είναι *: Ρ ≤ 0,05? **: Ρ ≤ 0,01? ***: P ≤ 0,001. (Ε) και (F) Ένα ανάλυση western blot των ενεργοποιημένων κασπάσης-3 και διασπασμένη PARP πραγματοποιήθηκε σε 15 μg πρωτεΐνης από κύτταρα HepG2 (Ε) και τα κύτταρα Α549 (F) μετά από 24 ώρες επώασης. Ανοσοανίχνευση των β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Σε μια προσπάθεια να κατανοήσουμε τη διαφορική επίδραση του αναστολέα κασπάσης σε αυτούς τους δύο τύπους κυττάρων, διαπιστώσαμε ότι το Ζ-VAD-fmk έκανε αναστέλλουν τη δράση της κασπάσης κατά τη συγκέντρωση που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή την εργασία (S1 πίνακα). Πράγματι, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το Ζ-VAD-fmk ανέστειλε εντελώς ετοποσόδη- και HFCP επαγόμενη ενεργοποίηση της κασπάσης. Εμείς επόμενη αναλύθηκαν κασπάσης-3 διάσπασης και η διάσπαση PARP με την απουσία ή παρουσία του Ζ-VAD-fmk με κηλίδωση Western (Σχ. 3Ε και 3F). Ο κατακερματισμός της κασπάσης-3, που παρατηρήθηκε όταν τα κύτταρα εκτέθηκαν σε ετοποσίδη είχε πλέον παρατηρήθηκε όταν το Ζ-VAD-fmk προστέθηκε, ένα αποτέλεσμα που είναι σε συμφωνία με τη βιβλιογραφία [14]. Το μη-κανονική κατακερματισμό της κασπάσης-3, που παρατηρήθηκε όταν HepG2 και Α549 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με HFCP ανεστάλη επίσης, και το μοτίβο της κασπάσης-3 διάσπαση έγινε συγκρίσιμη με εκείνη που παρατηρείται για κύτταρα που εκτίθενται σε ετοποσίδη παρουσία Ζ-VAD -fmk, εκτός από τη ζώνη των 60 kDa που ανιχνεύτηκε ακόμα και στους δύο τύπους κυττάρων που επωάστηκαν με HFCP και Ζ-VAD-fmk.

τα στοιχεία αυτά εγείρουν την πιθανότητα ότι η «μη συμβατικών» διάσπαση της κασπάσης-3 παρατηρήσαμε μπορεί να οφείλεται σε άλλες κασπάσες ή πρωτεάσες και έτσι μπορεί να μην σχετίζεται με την κλασική απόπτωση. Πράγματι, η διάσπαση της πρωτεΐνης PARP HFCP επαγόμενη ανεστάλη μόνο μερικώς από Z-VAD-fmk, υποδεικνύοντας ότι μπορεί να υπάρχει μηχανισμός πλην ενεργοποίηση της κασπάσης που θα μπορούσαν να συμμετέχουν. Επιπλέον, η διάσπαση της πρωτεΐνης ΡΑΚΡ που προκαλείται από ετοποσίδη δεν ανεστάλη από Z-VAD-fmk σε κύτταρα Α549, ενώ η διάσπαση της πρωτεΐνης PARP επάγεται από την αγωγή HFCP ανεστάλη πλήρως.

Επειδή οι κασπάσες ενέργειας ενεργοποιούνται από κασπάσες εκκινητή , κασπάσης-8 διάσπαση αναλύθηκε σε κύτταρα HepG2 με ανάλυση Western blot (Σχ. 4Α). Το αποτέλεσμα έδειξε ότι η επώαση των κυττάρων HepG2 με την παρουσία ετοποσίδης ή HFCP παρήγαγαν διασπασμένων θραυσμάτων της κασπάσης-8 με ένα μοριακό βάρος 43 και 41 kDa (Σχ. 4Α). Η διάσπαση της κασπάσης-8 σε κύτταρα που εκτίθενται σε ετοποσίδη είναι συνεπής με τη βιβλιογραφία [15], και αυτή η διάσπαση εμποδίστηκε από την παρουσία του Ζ-VAD-fmk τόσο ετοποσόδη- και HFCP εκτεθειμένων κυττάρων (Σχ. 4Α). Επιπλέον, η αφθονία του πλήρους μήκους προκασπάσης μειώθηκε στα κύτταρα HepG2 επωάστηκαν με HFCP και δεν εμποδίστηκε από την προσθήκη του Ζ-VAD-fmk. Ως εκ τούτου, η μείωση σε αφθονία του procaspase-8 δεν οφειλόταν σε διάσπαση που προκαλείται από άλλες κασπάσες επειδή Z-VAD-fmk, δεν την εμποδίζει.

κύτταρα HepG2 επωάστηκαν με μέσο μόνο (Ctl-), 50 μΜ προστέθηκε ετοποσίδη (ETOP), 3 mg /ml θερμικά κατακερματισμένες πηκτίνη κίτρου (HFCP) ή 3 mg /ml πηκτίνη κίτρου (πηκτίνη) (Α) Ζ-VAD-fmk στα 20 μΜ ή όχι στα κύτταρα κατά τη διάρκεια της επώασης. Η ανίχνευση των ενεργοποιημένων κασπάσης-8 σε κύτταρα HepG2 με ανάλυση κηλίδος Western πραγματοποιήθηκε σε 15 μg πρωτεΐνης μετά από 24 ώρες επώασης. Η ανοσοανίχνευση β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Θεωρητική εικονογράφηση διάσπασης α-φοδρίνη που προκύπτουν από την ενεργοποίηση της κασπάσης (Casp), καλπαϊνη (Calp) ή ο συνδυασμός της κασπάσης και καλπαΐνης (Casp + Calp). (Γ) και (Δ) HepG2 και Α549 κύτταρα επωάστηκαν μόνο με μέσο (Ctl-), 50 μΜ ετοποσίδη (ETOP), 3 mg /ml θερμικά κατακερματισμένες πηκτίνη κίτρου (HFCP) ή 3 mg /ml πηκτίνη κίτρου (πηκτίνη) , και 20 μΜ Ζ-VAD-fmk προστέθηκε ή όχι στα κύτταρα για 6 ή 24 ώρες επώασης. Η ανίχνευση του α-φοδρίνη σε HepG2 (C) και Α549 (D) κύτταρα με ανάλυση κηλίδος Western πραγματοποιήθηκε σε 15 μg πρωτεΐνης.

Η

καλπαΐνες είναι οι πρωτεάσες οι οποίες επίσης ενεργοποιούνται σε απόκριση στο στρες και μπορεί να συμμετέχει σε κυτταρικό θάνατο. Καθώς η μελέτη του προτύπου διάσπασης α-φοδρίνη θα μπορούσε να ενημερώσει σχετικά κασπάσης ή ενεργοποίηση καλπαΐνης [16,17], ο κατακερματισμός του α-φοδρίνη εκτιμήθηκε με ανάλυση στυπώματος western σε HepG2 και Α549 κυττάρων μετά από 6 και 24 ώρες επώασης με ή με προσθήκη Ζ-VAD-fmk να προσδιοριστεί αν καλπαΐνες ενεργοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της HFCP κυτταρικό θάνατο που επάγεται (Σχ. 4 C, D). Το θεωρητικό μοντέλο για τη διάσπαση του α-φοδρίνη φαίνεται στο Σχ. 4Β. Πλήρους μήκους α-φοδρίνη έχει ένα μοριακό βάρος από 280 kDa? α-φοδρίνη διασπώνται από κασπάση δείχνει ζώνες 150 και 120 kDa, και α-φοδρίνη διασπώνται από καλπαΐνη δείχνει ζώνες 150 και 145 kDa. Και στους δύο τύπους κυττάρων που εκτίθενται σε ετοποσίδη ή HFCP (Εικ. 4C και Δ), η μορφή πλήρους μήκους της πρωτεΐνης ανιχνεύθηκε, ως ήταν ένα θραύσμα 150 kDa. Αυτό το θραύσμα θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει την διάσπαση του α-φοδρίνη σε υπερευαισθησία θέση από τα χαμηλά επίπεδα του ενδογενούς δραστικού πρωτεασών [18]. Μετά από 24 ώρες επώασης, το α-φοδρίνη προτύπου διάσπασης σε κύτταρα HFCP-επωάστηκαν ήταν παρόμοιο με το πρότυπο διάσπασης στα κύτταρα ετοποσίδη-επωάστηκαν, και οι δύο παρουσιάζονται ένα θραύσμα 120 kDa. Καθώς το 120-kDa προϊόν α-φοδρίνη συνδέεται με κασπάσης-3 ενεργοποίησης [19] και το σχηματισμό αυτού του θραύσματος ανεστάλη όταν Ζ-VAD-fmk προστέθηκε σε αμφότερες τις περιπτώσεις, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι HFCP προκάλεσε την ενεργοποίηση κάποιων κασπασών στους δύο τύπους κυττάρων.

Caspase 8 ενεργοποίηση έχει δειχθεί ότι επάγεται κατά τρόπο ανεξάρτητο από υποδοχέα οφείλεται στην αναστολή πρωτεασώματος [20]. Επειδή καμία υποδοχέας έχει ακόμη αναφερθεί για HFCP και να εξεταστεί αν θα μπορούσε να ενεργοποιήσει HFCP μια τέτοια οδό, πρωτεΐνη ουβικιτινίωση εκτιμήθηκε με ανάλυση στυπώματος western σε HepG2 και σε κύτταρα Α549. Μια πρώιμη αύξηση στην ουβικιτινίωση παρατηρήθηκε όταν τα κύτταρα επωάστηκαν με την παρουσία HFCP για 6 ώρες αλλά όχι με την παρουσία μόνο του μέσου, ετοποσίδη ή μη τροποποιημένη πηκτίνη η οποία ήταν ακόμη ανιχνεύσιμη μετά από 24 ώρες επώασης (Εικ. 5Α και Β).