Αφηρημένο

Η ανώμαλη έκφραση microRNA-146a (miR-146a) έχει αναφερθεί ότι εμπλέκεται στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των διαφόρων τύπων καρκίνου. Ωστόσο, ο ρόλος του σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), δεν έχει διευκρινισθεί. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί η συμβολή του miR-146a σε διάφορες πτυχές του κακοήθους φαινοτύπου των ανθρωπίνων NSCLCs. Σε λειτουργικά πειράματα, miR-146a κατέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων, που προκαλείται από την κυτταρική απόπτωση και ανέστειλε την κατάντη σηματοδότησης EGFR σε πέντε κυτταρικές σειρές NSCLC (Η358, H1650, H1975, HCC827 και Η292). miR-146a ανέστειλε επίσης τη μεταναστευτική ικανότητα αυτών των NSCLC κυττάρων. Από την άλλη πλευρά, miR-146a ενίσχυσε την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων από φάρμακα που στοχεύουν EGFR, συμπεριλαμβανομένων τόσο TKIs (gefitinib, erlotinib, και afatinib) και ένα μονοκλωνικό αντίσωμα (cetuximab). Αυτά τα αποτελέσματα ήταν ανεξάρτητα της κατάστασης μετάλλαξης EGFR (άγριου τύπου, ευαισθητοποιητικές μετάλλαξη ή μετάλλαξη αντίστασης), αλλά ήταν λιγότερο ισχυρά σε σύγκριση με τα αποτελέσματα του siRNA που στοχεύει του EGFR. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι επιδράσεις των miR-146a οφείλονται στην στόχευση του EGFR και NF-κΒ σηματοδότηση. Βρήκαμε επίσης, σε κλινικές φορμόλη σταθερά ενσωματωμένα σε παραφίνη δείγματα (FFPE) καρκίνο του πνεύμονα, η χαμηλή έκφραση του miR-146a συσχετίστηκε με προχωρημένα στάδια κλινικών TNM και μακρινή μετάσταση σε NSCLC (

P

& lt? 0,05). Οι ασθενείς με υψηλή έκφραση του miR-146a σε όγκους τους έδειξαν μεγαλύτερη επιβίωση χωρίς εξέλιξη (25,6 εβδομάδες σε υψηλά ασθενείς miR-146a έναντι 4,8 εβδομάδες σε χαμηλή ασθενείς miR-146a,

P

& lt? 0,05). miR-146a εκ τούτου, είναι ένα ισχυρό υποψήφιο προγνωστικό βιοδείκτη σε NSCLC. Έτσι επαγωγή miR-146a μπορεί να είναι μια θεραπευτική στρατηγική για NSCLC

Παράθεση:. Chen G, Umelo ΙΑ, Lv S, Teugels Ε, Fostier Κ, Kronenberger P, et al. (2013) miR-146a αναστέλλει την κυτταρική ανάπτυξη, μετανάστευση των κυττάρων και επάγει την απόπτωση σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. PLoS ONE 8 (3): e60317. doi: 10.1371 /journal.pone.0060317

Επιμέλεια: Srikumar Π Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center & amp? Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: τέταρτης Οκτωβρίου 2012? Αποδεκτές: 25 Φλεβάρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 26, Μαρτίου του 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη εν μέρει υποστηρίζεται από το ταμείο έρευνας της Boehringer Ingelheim GmbH. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς λάβει χρηματοδότηση από εμπορική πηγή: Boehringer Ingelheim GmbH. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) αποτελείται από 75-85% των νεοδιαγνωσθέντων καρκίνων του πνεύμονα. Πάνω από το 70% των ασθενών με NSCLC παρόν με προχωρημένη νόσο, και το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών για NSCLC είναι μόνο 16%. Για πρώιμου σταδίου ή τοπικά προχωρημένο καρκίνο του πνεύμονα, η χειρουργική επέμβαση είναι η πιο αποτελεσματική θεραπεία, και ο συνδυασμός χημειοθεραπείας είναι η τυπική προσέγγιση ανοσοενισχυτικό. Για τη φάση III /IV NSCLC, με βάση την πλατίνα σε συνδυασμό χημειοθεραπείας είναι το τρέχον πρότυπο της περίθαλψης, αλλά με πολλά περιθώρια βελτίωσης [1], [2]. Lung καρκινογένεση είναι μία πολυσταδιακή διαδικασία, η οποία προκύπτει από την ενεργοποίηση των ογκογονιδίων και αδρανοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν την ανάπτυξη των NSCLC σήμερα ακόμη πλήρως κατανοητό. Ως εκ τούτου, μια καλύτερη κατανόηση αυτών των μηχανισμών να είναι χρήσιμη για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στόχων και στρατηγικές για τη θεραπεία της ανθρώπινης NSCLC [3], [4], [5].

Τα τελευταία χρόνια, microRNAs (miRNAs) έχουν λάβει αυξανόμενη προσοχή στην έρευνα για τον καρκίνο. Αυτές οι μικρές, μη-κωδικοποίησης RNAs μπορούν να αναστείλουν την έκφραση του γονιδίου-στόχου με σύνδεση προς το 3 ‘αμετάφραστη περιοχή του mRNA στόχου, με αποτέλεσμα είτε αποικοδόμηση mRNA ή αναστολή της μετάφρασης. MiRNAs παίζουν σημαντικούς ρόλους σε πολλές φυσιολογικές βιολογικές διαδικασίες που περιλαμβάνουν κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση, και αντοχή στο στρες [6], [7]. Ωστόσο, μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι η παρεκκλίνουσα έκφραση miRNA ή μετάλλαξη συσχετίζεται με την ανάπτυξη και την εξέλιξη των καρκίνων. Τα miRNAs μπορούν να έχουν ογκογόνο ή όγκου δραστηριότητες καταστολέα, και έτσι miRNAs αναδυόμενες ως στόχοι για τη θεραπεία του καρκίνου [8]. Επιπλέον, miRNAs θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως προγνωστικός και διαγνωστικός βιοδείκτες στον καρκίνο.

Η έκφραση του miR-146a έχει βρεθεί να είναι up-ρυθμίζεται με θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς [9], αναπλαστικό καρκίνο του θυρεοειδούς [10] και καρκίνο του τραχήλου [11], το οποίο προτείνει miR-146a θα μπορούσε να λειτουργήσει ως ένα «ογκογόνο» miRNA σε αυτούς τους καρκίνους. Παρ ‘όλα αυτά, χαμηλότερη έκφραση του miR-146a έχει αναφερθεί σε καρκίνο του προστάτη [12], του καρκίνου του παγκρέατος [13] και γαστρικού καρκίνου [14], [15]. Ως εκ τούτου, ο ρόλος του miR-146a μπορεί να ποικίλλει σε διαφορετικούς τύπους καρκίνων. Επιπλέον, το επίπεδο miR-146a έχει βρεθεί ότι συσχετίζεται με μεταστατική εξέλιξη στη στοματική όγκους [16]. Λειτουργικά, miR-146a-κύτταρα που εκφράζουν δείχνουν εμφανώς μειωμένη εισβολή και την ικανότητα της μετανάστευσης σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου και στα δύο του καρκίνου του μαστού [17] και τον καρκίνο του παγκρέατος [13]. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η ρύθμιση των επιπέδων του miR-146a έχει θεραπευτικές δυνατότητες για να καταστείλει τις εισβολές και τις μεταστάσεις. Ωστόσο, εξ όσων γνωρίζουμε, δεν υπάρχουν μελέτες έχουν εκτιμήσει τη σχέση μεταξύ miR-146a και τα κύτταρα NSCLC. Επιπλέον, δεν υπάρχουν διαθέσιμα σχετικά με τις επιπτώσεις του miR-146a σχετικά με τη βιολογία των κυττάρων NSCLC δεδομένων. miR-146a μπορούν να στοχεύουν EGFR, με βάση την προβλεπόμενη ζευγάρωμα βάσης με χρήση ανάλυσης miRBase [18], η οποία έχει επιβεβαιωθεί λειτουργικά στον καρκίνο του μαστού [17], [19] και τον καρκίνο του παγκρέατος [13]. EGFR διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην NSCLC και τη δραστηριότητα των αναστολείς κινάσης τυροσίνης EGFR (ΤΚΙδ) σε NSCLC, ειδικά με την παρουσία της ενεργοποίησης μεταλλάξεων EGFR [20]. Το συγκρότημα οδό μεταγωγής σήματος του EGFR περιλαμβάνει την καταρράκτη Ras /ΜΑΡΚ, φωσφατιδυλο ινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ), μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής (STAT), και κατάντη της πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC) [21]. Επιπλέον, EGFR ενεργοποιεί NF-κΒ με φωσφορυλίωση της ΙκΒ [22]. Επιπλέον, miR-146a παίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση του NF-κΒ [13], [17], [19], [23] σε διάφορες κακοήθειες, αν και ΝΡ-κΒ δεν είναι άμεσος στόχος του miR-146a. Επιπλέον, η σχέση μεταξύ του miR-146a και σηματοδότηση του EGFR ή NF-κΒ δεν έχει διευκρινιστεί.

Η δυνητική σημασία της συγκεκριμένης miRNA, miR-146a, ήρθε στην προσοχή μας σε πειράματα που πραγματοποιήθηκαν και ότι συμφωνηθέντων πριν από την ανακάλυψη του ρόλου του σε άλλες κακοήθειες ή τη σχέση της με το mRNA EGFR. Σε αυτά τα αδημοσίευτα πειραμάτων, προφίλ έκφρασης miRNA σε κύτταρα Ba /F3 επιμολύνονται με άγριου τύπου και μεταλλαγμένα γονίδια EGFR αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας ένα υγρό συστοιχία με βάση σφαιρίδια που περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Συγκριτική προφίλ miRNA λήφθηκαν σε συνθήκες βασικής γραμμής και υπό θεραπεία με EGFR TKIs. Η πλατφόρμα ήταν ένα in-house ιδιόκτητη πλατφόρμα και περιλάμβανε 425 miRNAs. miR-146a ήταν το miRNA που εντονότερα συσχετίζεται με την ιδιότητα του μεταλλάξεων EGFR, και είχε τη μεγαλύτερη διακύμανση στην απόκριση σε θεραπεία TKIs σε EGFR μεταλλαγμένα κύτταρα NSCLC και τα κύτταρα ΒΑ /F3 επιμολύνονται με μεταλλαγμένο EGFR σε σύγκριση με τα κύτταρα φυσικού τύπου EGFR. Ταυτόχρονα εντοπίστηκε η ομολογία αλληλουχίας με EGFR [18].

Με αφορμή αυτά τα αποτελέσματα, διερευνήσαμε περαιτέρω την επίδραση του miR-146a στην κυτταρική ανάπτυξη, την απόπτωση και την κινητικότητα των ανθρώπινων κυττάρων NSCLC. Επιπλέον, εξετάστηκε η επίδραση ενός μιμούνται miR-146a όταν συνδυάζεται με EGFR TKIs (gefitinib, erlotinib, και afatinib) και ένα μονοκλωνικό αντίσωμα (cetuximab) ειδικά σε κυτταρικές σειρές NSCLC που είναι ανθεκτικά σε EGFR TKIs. Τέλος, η σχέση μεταξύ της έκφρασης miR-146a και κλινικές παραμέτρους και την πρόγνωση επίσης εξερευνηθεί χρησιμοποιώντας εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) τα δείγματα καρκίνου του πνεύμονα μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρικές σειρές και αντιδραστήρια

Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NSCLC Η358, H1650, H1975, HCC827 και Η292 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (

ATCC, Ολλανδία

) και καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25], [ ,,,0],26]. Το cetuximab μονοκλωνικό αντίσωμα ΕΟΡΚ-ειδικό (2 mg /ml), EGFR TKIs gefitinib και erlotinib, και ένας αναστολέας panHER του EGFR, HER2 και HER4 κινάσες, afatinib (BIBW 2992, Boehringer Ingelheim GmbH), παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25] , [26].

Re-έκφραση και η αναστολή της miR-146a σε κύτταρα NSCLC

κύτταρα NSCLC σπάρθηκαν σε πλάκα 24 φρεατίων (2.5 χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο ) ή μία πλάκα 96 φρεατίων (2.5 χ 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνονται με ένα μιμητικό miR-146a, μια miRNA μιμούνται αρνητικός μάρτυρας, ένας αναστολέας miR-146a, ή ένας αρνητικός έλεγχος αναστολέα miRNA (

Ambion, Life Technologies Europe BV, Γάνδη, Βέλγιο

) αντίστοιχα σε μια τελική συγκέντρωση των 60 nmol /L χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη

TM 2000 (

Cat. No. 11668-019, Invitrogen Merelbeke, Βέλγιο

). Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με το μιμητικό miRNA ή miRNA αναστολέα καθημερινά. Μετά από 5 ημέρες την επιμόλυνση, τα κύτταρα χωρίστηκαν και επιμολύνθηκαν καθημερινά πάλι μέχρι την ημέρα 10 [13]. Η ειδική siRNA EGFR περιγράφηκε προηγουμένως [25], [27] (αλληλουχία: GCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTAT). Η συγκεκριμένη siRNA EGFR μετασκευάστηκε σε κύτταρα NSCLC με την ίδια μέθοδο όπως παραπάνω

δείγματα ιστών

Εμείς συλλέγονται ιστών από 101 διαδοχικούς ασθενείς. (Εύρος ηλικίας 29-83 χρόνια? Σημαίνει 68,3 χρόνια) που είχαν υποβληθεί σε χειρουργική εκτομή ή βιοψία για NSCLC στα δύο όργανα. Ένα δείγμα μη-προσβεβλημένο φυσιολογικό πνευμονικό ιστό επίσης συλλέχθηκαν από 76 ασθενείς και χρησιμοποιούνται ως ζεύγη ελέγχου. Όλα τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για παθολογική εξέταση. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από τις τοπικές Ηθική Επιτροπές της First Affiliated Νοσοκομείο Guangxi Ιατρικό Πανεπιστήμιο, την Κίνα και την Universitair Ziekenhuis Brussel (UZ Brussel), στο Βέλγιο. Γραπτή πληροφορημένες συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλους τους ασθενείς. Οι κλινικοπαθολογοανατομικές παράμετροι που περιγράφονται στον Πίνακα 1.

Η

RT-qPCR

μεταγραφή

Για

in vitro

πειράματα, την απομόνωση RNA, RNA εξομάλυνση, και να αντιστρέψει είχαν ως περιγράφηκε προηγουμένως [25], [27], [28]. Για κλινική ιστό FFPE, μπλοκ κόπηκαν σε πάχος 10 μm (3 τμήματα για ολική απομόνωση του RNA). Ο ιστός αποκηρωμένου με ξυλόλιο και αιθανόλη. Το συνολικό RNA απομονώθηκε από τομές όγκων με τη χρήση του miRNeasy FFPE Kit (

QIAGEN, KJ Venlo, Ολλανδία

) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή με τις τροποποιήσεις με την αλλαγή του χρόνου επώασης μετά την ανάμιξη με πρωτεϊνάση Κ για 36 ώρες στους 55 ° C, εν τω μεταξύ, προσθέτοντας πρωτεϊνάση Κ κάθε 12 ώρες για να διατηρηθεί η συγκέντρωση του. Ανάλογα με το μέγεθος του δείγματος όγκου, η συγκέντρωση του RNA κυμαίνεται από 20 ng /μl σε 2 μg /μΙ ανιχνεύθηκαν με Nanodrop 2000 (

Wilmington, DE 19810 USA

). Intron-εκτείνονται RT-PCR εκκινητές ειδικούς για EGFR ή GAPDH mRNA έχουν περιγραφεί προηγουμένως [25], [28], [29]. Οι εκκινητές για miR-146a και RNU6B συμπεριλήφθηκαν στην TaqMan

® microRNA δοκιμασίες (

4427975-000468, Applied Biosystems, Life Technologies Europe B.V., Γάνδη, Βέλγιο

). Οι αντίστροφοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν επίσης στο στάδιο της αντίστροφης μεταγραφής με TaqMan

® microRNA Reverse Transcription Kit (

4.366.596, Applied Biosystems, Life Technologies Europe BV, Gent, Βέλγιο

), σε συνολικό όγκο 10 μΐ . Σε πραγματικό χρόνο qPCR για EGFR mRNA διεξήχθη με τον Roche LightCycler

® 1,5 όργανο με SYBR πράσινο ανίχνευση και ανάλυση καμπύλης τήξης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως και για miRNA, Applied Biosystems PCR7900 χρησιμοποιήθηκε [28]. Το mRNA στόχου ή miRNA αφθονία σε κάθε δείγμα κανονικοποιήθηκε προς GAPDH αναφοράς ή RUN6B ως αναφερθεί [25], [27], [30].

Η κυτταρική ανάπτυξη

Η ανάπτυξη των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας μια χρωματομετρική τετραζολίου (MTS) δοκιμασία (

CellTiter96 υδατική Solution Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού προσδιορισμός G3580, Promega, Madison, USA

). Η miRNA μιμούνται, ο αναστολέας miRNA ή siRNA επιμολύνθηκαν καθημερινά για 0, 5 και 10 ημερών. Για τα πειράματα συνδυασμού miR-146a μιμούνται και άλλων παραγόντων (EGFR TKIs και mAb), το μιμητικό miR-146a αρχικά επιμολυσμένα εντός των κυττάρων, και στη συνέχεια τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 7 ημέρες. Οι άλλοι παράγοντες προστέθηκαν στις 7

ης ημέρας, και κυτταρική καλλιέργεια παρατάθηκε για άλλες 3 ημέρες. Το πρωτόκολλο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25].

Κυτταρική βιωσιμότητα

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω τα δεδομένα από τη δοκιμασία MTS, η βιωσιμότητα των κυττάρων ανιχνεύθηκε με φθορισμομετρική ανίχνευση ρεσορουφίνης (

CellTiter-Μπλε κυττάρων η βιωσιμότητα Δοκιμασία, G8080, Promega, Madison, USA

) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25].

Caspase-3/7 δράση

ανίχνευση

Caspase-3/7 δράση μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα συνθετικό ροδαμίνη επισημασμένο κασπάσης-3/7 υπόστρωμα εκτελείται αμέσως μετά την ανίχνευση της βιωσιμότητας των κυττάρων με τις ίδιες εκβαθύνσεις όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25].

φθορισμού αξιολόγηση μικροσκοπία κυτταρικής απόπτωσης και της μορφολογίας

Η επιδράσεις του miR-146a μιμούνται, ή αναστολέα ή EGFR siRNA επί της απόπτωσης και της πυρηνικής μορφολογίας στα κύτταρα εκτιμήθηκαν με Hoechst 33342 και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) διπλή χρώση χρωματίνη φθορισμού όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25].

τυλίγεται ομαλά σε ρολό επούλωση

δοκιμασία

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ανεξάρτητα φρεάτια μιας πλάκας καλλιέργειας των 6 φρεατίων. Η επιμόλυνση πραγματοποιήθηκε όπως παραπάνω. Πριν την επιμόλυνση, ένα στείρο ρύγχος πιπέτας 10 μl χρησιμοποιήθηκε για να διαμήκως μηδέν μια λωρίδα σταθερής διαμέτρου στο συρρέουσα μονοστιβάδα. Το μέσο και τα κυτταρικά υπολείμματα αναρροφήθηκαν μακριά και αντικαταστάθηκε με 2 ml νωπού μέσου. Οι φωτογραφίες ελήφθησαν σε 0, 36, 72 και 108 ώρες μετά τον τραυματισμό. Για στατιστική ανάλυση, δέκα τυχαίως επιλεγμένα πεδία κατά μήκος κάθε τραύμα σημαδεύτηκαν, και η περιοχή του τραύματος μετρήθηκε και υπολογίσθηκε η μέση τιμή ως η περιοχή του τραύματος της παρούσας τραύματος. Η επούλωση της πληγής περιοχή = τραύματος περιοχή της ζώνης 0 ώρες-πληγή του 36, 72 ή 108 ώρες, αντίστοιχα, για επούλωση της πληγής περιοχή πρώτα σύγκριση με την περιοχή του τραύματος από 0 ώρες, και τελικά σε σύγκριση με τον ψευδο ελέγχου.

Western ανάλυση κηλίδος

Μετά την θεραπευτική αγωγή για τις υποδεικνυόμενες περιόδους, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και λύθηκαν σε ένα ρυθμιστικό που περιέχει Tris /HCl (ρΗ 7.6) 20 mM, NaCl 150 mM (ρΗ 6,85), EDTA 1 mM (ρΗ 8), TRITON-Χ 1%, Na-πυροφωσφορικό 2,5 mM, ορθοβαναδικό νάτριο (Na3VO4) 1 mM, λευπεπτίνη 1 μg /ml, κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης 1% και αναστολέα φωσφατάσης κοκτέιλ 1% (

Sigma -Aldrich NV /SA, Bornem, Βέλγιο

). Τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 12,000 χ g για 10 λεπτά στους 4 ° C και έβρασαν για 5 λεπτά. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης του προϊόντος λύσης ανιχνεύθηκε με την δοκιμασία πρωτεΐνης Bradford Bio-Rad (

Ναζαρέτ Eke, Βέλγιο

) και 25 μg μετουσιωμένης πρωτεΐνης υποβλήθηκε σε SDS-PAGE (10% SDS-πήκτωμα ακρυλαμιδίου) με ρυθμιστικού φόρτωσης που περιέχει 80 mM Tris-HCl (ρΗ 6.8), 5% SDS, 10% γλυκερόλη, 5 mM EDTA (ρΗ 8), 5% 2-μερκαπτοαιθανόλη, 0.2% κυανό βρωμοφαινόλης και 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Η μεμβράνη επωάστηκε με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα όπως υποδεικνύεται: EGFR (

Cell Signaling

), φωσφο-EGFR (Tyr1173, κλώνος 9Η2Ο,

Upstate

), φωσφο-ERK1 /2 (pTpY185 /187,

Invitrogen

), φωσφο-AKT /ΡΚΒ (Ser473,

Invitrogen

), φωσφο-STAT3 (Tyr705, 3E2,

Cell Signaling

), φωσφο-Stat5 ( Tyr694,

BD Biosciences

), φωσφο-ΙκΒα (Ser32 /36, 5a5,

Cell Signaling

), ΙκΒα (L35A5,

Cell Signaling

), φωσφο-ΝΡ κΒ p65 (Ser536,

Cell Signaling

), NF-κΒ (

Cell Signaling

), φωσφο-IRAK-1 (Ser376,

Santa Cruz Biotechnology

), IRAK- 1 (

Santa Cruz Biotechnology

) και β-ακτίνη (

Sigma-Aldrich NV

.).

η στατιστική ανάλυση

SPSS19.0 χρησιμοποιήθηκε για Στατιστική ανάλυση. Τα αποτελέσματα ήταν αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά. Οι τιμές παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD). Ανάλυση Διασποράς με έναν παράγοντα δοκιμής (ANOVA) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση σημαντικότητα μεταξύ των ομάδων. Η μέθοδος λιγότερο σημαντική διαφορά (LSD) πολλαπλών συγκρίσεων με γονικών και ομάδα ελέγχου εφαρμόστηκε όταν η πιθανότητα για ANOVA ήταν στατιστικά σημαντική. ανάλυση επιβίωσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank και η προσέγγιση οικόπεδα Kaplan-Meier. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε σε ένα

P

& lt? 0,05 επίπεδο. Στην ανάλυση της προσθετικότητας και συνέργεια, η θεωρητική μηδενικής αλληλεπίδρασης (ακριβώς πρόσθετο) δόσης-απόκρισης καμπύλη για κάθε συνδυασμό miR-146a μιμούνται + ναρκωτικών ήταν υπολογίζονται εφαρμόζοντας το κριτήριο της ανεξαρτησίας Bliss [31], [32]. Η στατιστική αξιολόγηση της προσθετική ή συνεργιστική δράση έγινε με τη σύγκριση κάθε miR-146a μιμούνται + καμπύλη δόσης-απόκρισης του φαρμάκου με την καμπύλη ανεξαρτησία Bliss. Συνέργεια συνάπτεται όταν miR-146a μιμούνται + καμπύλη δόσης-απόκρισης του φαρμάκου είναι υψηλότερη από ό, τι τα διαστήματα εμπιστοσύνης 95% για την αντίστοιχη καμπύλη ανεξαρτησία Bliss, ενώ η προσθετικότητα είναι όταν το miR-146a μιμούνται + καμπύλη δόσης-απόκρισης του φαρμάκου είναι μικρότερη από εκείνη του Bliss την ανεξαρτησία της καμπύλης και υψηλότερα από την καμπύλη ατομική μεταχείριση. Η ανάλυση των προσθετικότητα και συνεργία εκτιμήθηκε επίσης από το πρόγραμμα Biosoft CalcuSyn (Ferguson, ΜΟ, USA). Ο συνδυασμός Δείκτης (CI) χρησιμοποιήθηκε για να εκφράσει συνέργεια (CI & lt? 1), αθροιστική δράση (CI = 1), ή ανταγωνισμού (CI & gt? 1). [33]

Αποτελέσματα

miR -146a αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων και επάγει κυτταρική απόπτωση στα κύτταρα NSCLC

Κατ ‘αρχάς η βασική γραμμή έκφραση του miR-146a αξιολογήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-qPCR. αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης του μιμούνται miR-146a και ο αναστολέας ήταν επίσης η πρώτη επαληθεύεται με ανάλυση RT-qPCR. Το επίπεδο έκφρασης miR-146a σε 5 και 10 ημέρες μετά την επιμόλυνση αναλύθηκε. Μετά την επιμόλυνση με τον αναστολέα miR-146a, ΔΔCq ήταν 1,82 (71,68% miR-146a knock-down) για Η358, 1,09 (53,02% knock-down) για H1650, 2.4 (81,05% κάτω νοκ-) για H1975, 1.92 (73.57 % miR-146a knock-down) για HCC827, και 1,89 (73,02% knock-down) για Η292 10 ημέρες μετά την επιμόλυνση. Μετά την επιμόλυνση το μιμούνται miR-146a για 10 ημέρες, τα επίπεδα miR-146a είχαν σοβαρά αυξημένες, με ΔΔCq -14,69 (26,431.0372 πτυχώσεις) για Η358, -10,97 (2005,8528 πτυχώσεις) για H1650, -12,78 (7032,3681 πτυχώσεις) για H1975, -13,25 (9741.9847 πτυχώσεις) για HCC827 και -13,81 (14,362.3081 πτυχώσεις) για Η292. Οι αρνητικοί έλεγχοι δεν είχαν καμία αλλαγή του επιπέδου του miR-146a (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Με τον αναστολέα miR-146a, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ήταν ελαφρά αυξημένη σε όλες τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, αλλά χωρίς σημαντική διαφορά σε σύγκριση με ψευδο ελέγχους. Μετά την επιμόλυνση με τον μιμητικό miR-146a, μια σημαντική μείωση στον πολλαπλασιασμό σημειώθηκε στις 10

ης ημέρας σε όλες τις πέντε κυτταρικές γραμμές, αν και λιγότερο από ό, τι παρατηρείται με siRNA που στοχεύει EGFR (Εικόνα 1, Εικόνα 2). Για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων αυτών, η επίδραση στη βιωσιμότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία φθορισμομετρική ρεζορουφίνη βιωσιμότητας (CellTiter μπλε, Promega, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), και με μικροσκοπική μέτρηση των βιώσιμων (αρνητικών Hoechst 33342 θετική /ΡΙ) κύτταρα (Σχήμα 3, Σχήμα 4) . Σε αμφότερες τις αναλύσεις τα αποτελέσματα σε μεγάλο βαθμό καθρεφτίζονται τα αποτελέσματα της δοκιμασίας τετραζολίου MTS. Για να επαληθευθεί αν miR-146a είναι ικανή να διεγείρει απόπτωση, το CellTiter Μπλε δοκιμασία πολυπλέκονται με μια φθορίζουσα κασπάσης 3/7 δοκιμασίας (Αρο One, Promega). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ο αναστολέας miR-146a δεν αύξησε κασπάσης-3/7 Δράση. Ωστόσο, το μιμητικό miR-146a ενίσχυσε σημαντικά κασπάσης-3/7 Δράση σε όλες τις πέντε κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν NSCLC, αλλά το αποτέλεσμα ήταν πολύ μικρότερη από ό, τι παρατηρείται με siRNA που στοχεύει EGFR (Σχήμα 5, Σχήμα 6). Η επίδραση επί της απόπτωσης επιβεβαιώθηκε μικροσκοπικά με Hoechst 33342 και ΡΙ διπλή χρώση φθορισμού (Σχήμα 3, Σχήμα 7).

NSCLC κύτταρα (Η358, H1650 και H1975) επωάστηκαν με την παρουσία του αναστολέα miR-146a, μιμητικό , EGFR siRNA και διαφορετικά στοιχεία ελέγχου, για 0, 5 και 10 ημερών. Η ανάπτυξη των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον χρωματομετρικό προσδιορισμό τετραζολίου (MTS) (CellTiter96 υδατική Λύση Κυττάρου Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού). Αρνητικός έλεγχος 1 είναι αναστολέας miRNA αρνητικού μάρτυρα και αρνητικού ελέγχου 2 είναι miRNA μιμούνται αρνητικό έλεγχο. *

P

& lt?. 0.05, σε σύγκριση με το μάρτυρα κατά το ίδιο χρονικό σημείο

Η

κύτταρα NSCLC υποβλήθηκαν σε θεραπεία, όπως αναφέρεται στο σχήμα 1. *

P

& lt ?. 0.05 σε σύγκριση με μάρτυρα στο ίδιο χρονικό σημείο

η

κύτταρα NSCLC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως αναφέρεται στο Σχήμα 1, και η επίδραση στην απόπτωση εκτιμήθηκε και συγκρίθηκε με την ψευδο έλεγχο σε 0, 5 και 10 ημέρες μετά την επιμόλυνση με Hoechst 33342 και PI διπλή χρώση φθορισμού.

Η

Η επίδραση του miR-146a στην κυτταρική ανάπτυξη (H358, H1650 και H1975) αναλύθηκε με Hoechst 33342 και διπλή χρώση φθορισμού ΡΙ. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01 σε σύγκριση με το μάρτυρα κατά την ίδια χρονική στιγμή

Η

κύτταρα NSCLC υποβλήθηκαν σε θεραπεία, όπως αναφέρεται στην Εικόνα 1, και της κασπάσης-3/7 δράση εξετάστηκε και συγκρίθηκε με εικονικές ελέγχους. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01 σε σύγκριση με το μάρτυρα κατά την ίδια χρονική στιγμή

Η

κύτταρα NSCLC (HCC827 και Η292) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως αναφέρεται παραπάνω. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01 σε σύγκριση με το μάρτυρα κατά την ίδια χρονική στιγμή

Η

Η επίδραση του miR-146a σε απόπτωση σε H358, H1650 και H1975 εξετάστηκε με Hoechst 33342 και χρώση διπλό φθορισμού ΡΙ. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με το μάρτυρα κατά το ίδιο χρονικό σημείο

Η

miR-146a καταστέλλει την κινητικότητα του. κύτταρα NSCLC

στη συνέχεια, αξιολόγησε την επίδραση της λειτουργίας miR-146a σχετικά με την κινητικότητα των τριών κυτταρικών σειρών NSCLC H358, H1650 και H1975. Στις εικονικές ελέγχους, μη επιμολυσμένα κύτταρα Η358 χρειάζονται το μεγαλύτερο χρονικό διάστημα για να επουλωθούν (& gt? 108 ώρες). Αντιθέτως, τα κύτταρα H1975 επουλωθεί την ταχύτερη (& lt? 72 ώρες). Ο αναστολέας miR-146a προκάλεσε μια αξιοσημείωτη ποσοστό επιτάχυνση της επούλωσης των πληγών σε Η358 κύτταρα, και είχε μικρή επίδραση στα κύτταρα H1650 και H1975. Το μιμούνται miR-146a οδήγησε σε ρυθμό επούλωσης των πληγών μέτριας μειωθεί στα κύτταρα Η358 και H1650 αντίστοιχα. Ωστόσο, η μιμούνται miR-146a δεν είχε καμία επίδραση στην κυτταρική κινητικότητα στο H1975 κυττάρων. Το siRNA που στοχεύει EGFR ανέστειλαν το ρυθμό επούλωσης πληγών σε όλες τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, με πολύ ισχυρότερη επίδραση από το μιμητικό miR-146a (Σχήμα 8, Σχήμα 9).

κύτταρα NSCLC επωάστηκαν με την παρουσία του αναστολέας miR-146a, miR-146a μιμούνται, EGFR siRNA και διαφορετικά χειριστήρια για 0, 36, 72 και 108 ώρες μετά την επιμόλυνση. Κινητικότητα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό επούλωση της πληγής. Οι εικόνες από το ένα πεδίο μιας αντιπροσωπευτικές δέκα τομείς της όρασης στον ένα και εμφανίζονται (× 100). Μ: παρωδία ελέγχου? C: Αρνητικός μάρτυρας για miRNA μιμούνται? Inhi: αναστολέας miR-146a? Mimi: miR-146a μιμούνται? Si: EGFR-ειδικά siRNA. Ο ρυθμός επούλωσης πληγών εκφράζεται σε σχέση με τον ψευδο ελέγχου.

Η

κύτταρα NSCLC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στα πειράματα που παριστάνεται στο σχήμα 8. Το ποσοστό επούλωση της πληγής εκφράζεται σε σχέση με τον ψευδο ελέγχου. Ο μέσος δείκτης υπολογίσθηκε από δέκα πεδία και τα πειράματα επαναλήφθηκαν σε τρία ανεξάρτητα φρεάτια. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01 σε σύγκριση με το μάρτυρα κατά το ίδιο χρονικό σημείο

Η

miR-146a προκαλεί αναστολή του EGFR. και NF-κΒ σηματοδότηση στα κύτταρα NSCLC

για να διερευνήσουν το ρόλο του miR-146a στη ρύθμιση της κυτταρικής σηματοδότησης, εμείς επιμολυσμένα NSCLC κύτταρα με αναστολέα miR-146a και μιμούνται, και καλλιεργούνται τα κύτταρα για χρονικό διάστημα μέχρι για 10 ημέρες. Βρήκαμε ότι η αυξημένη έκφραση του miR-146a στα κύτταρα NSCLC είχε ως αποτέλεσμα την ρύθμιση προς τα κάτω του EGFR τόσο στο mRNA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 10). Είναι σημαντικό ότι, βρήκαμε ότι φωσφορυλιωμένη EGFR επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά miR-146a μιμούνται την επιμόλυνση παρόμοια με EGFR-ειδικό siRNA σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές (Σχήμα 10). Ταυτόχρονα, κατάντη σηματοδότησης (ΑΚΤ, ERK και οδοί stat) επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω από miR-146a μιμούνται, με ένα ασθενέστερο αποτέλεσμα σε σύγκριση με EGFR-ειδικό siRNA. Για την επιβεβαίωση των επιδράσεων του miR-146a επί EGFR, επιμολύναμε τα κύτταρα NSCLC με τον αναστολέα miR-146a και διαπίστωσε ότι η αναστολή του miR-146a αύξησε τα επίπεδα του ρ-EGFR, EGFR και κατάντη σηματοδότησης (Σχήμα 10). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν τα ανασταλτικά αποτελέσματα της miR-146a επί αυτοφωσφορυλίωσης EGFR και κατάντη σηματοδότησης. Επειδή miR-146a αναφέρθηκε για τη ρύθμιση και την έκφραση του IRAK-1, το οποίο μπορεί να ενεργοποιήσει NF-κΒ σηματοδότηση [13], [34], [35], μελετήσαμε τα αποτελέσματα των miR-146a για NF-κΒ μονοπάτια σηματοδότησης σε οι κυτταρικές γραμμές NSCLC. miR-146a μιμούνται μειωμένη φωσφορυλίωση του NF-κΒ αναστολέας ΙκΒα, αλλά όχι το σύνολο ΙκΒα. Επιπλέον, το επίπεδο φωσφο-NF-κΒ, η συνολική ΝΡ-κΒ και η συνολική IRAK-1 μειώθηκαν επίσης μετά miR-146a μιμούνται την επιμόλυνση (Σχήμα 11, Σχήμα 12), υποδεικνύοντας ότι miR-146a ρυθμίζει NF-κΒ και IRAK-1 σηματοδότησης.

κυτταρικές σειρές NSCLC επιμολύνθηκαν με αναστολέα miR-146a, miR-146a μιμούνται, EGFR-ειδικά siRNA και διαφορετικές αρνητικοί μάρτυρες και κηλίδα western αναλύθηκε 10 ημέρες μετά την επιμόλυνση. Αντισώματα που περιλαμβάνονται φωσφο-EGFR (ρ-EGFR), EGFR, ρ-ERK1 /2, π-ΑΚΤ, ρ-STAT3, ρ-Stat5 και β-ακτίνης. Μ: παρωδία ελέγχου? C1: Αρνητικός μάρτυρας για αναστολέας miRNA? C2: Αρνητικός μάρτυρας για miRNA μιμούνται? Inhi: αναστολέας miR-146a? Mimi: miR-146a μιμούνται? Si:. EGFR-ειδικό siRNA

Η

κυτταρικές σειρές NSCLC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο σχήμα 4. Αντισώματα περιλαμβάνονται φωσφο-ΙκΒα (ρ-ΙκΒα), ΙκΒα, ρ-ΝΡ-κΒ, ΝΡ-κΒ και β ακτίνης. Μ: παρωδία ελέγχου? C1: Αρνητικός μάρτυρας για αναστολέας miRNA? C2: Αρνητικός μάρτυρας για miRNA μιμούνται? Inhi: αναστολέας miR-146a? Mimi: miR-146a μιμούνται? Si:. EGFR-ειδικό siRNA

Η

κυτταρικές σειρές NSCLC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο σχήμα 4. Αντισώματα περιλαμβάνονται φωσφο-IRAK-1 (S

376), IRAK-1 και β-ακτίνης. C1: Αρνητικός μάρτυρας για αναστολέας miRNA? C2: Αρνητικός μάρτυρας για miRNA μιμούνται? Inhi: αναστολέας miR-146a? Mimi: miR-146a μιμούνται? Si:. EGFR-ειδικό siRNA

Η

miR-146a μιμούνται ενισχύει την ανασταλτική επίδραση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του TKIs και cetuximab

Σε προηγούμενη εργασία έχουμε εξετάσει τις επιπτώσεις της χτένισμα EGFR siRNA με EGFR TKIs ή cetuximab. Μεταξύ όλων των παραγόντων που δοκιμάστηκαν, afatinib, ένας αναστολέας της οικογένειας ErbB, είχε την ισχυρότερη ανασταλτική δράση ανάπτυξης [25]. Επιδιώξαμε να διερευνήσει πώς αυτό θα μπορούσε να συγκριθεί με την επίδραση του συνδυασμού του μιμούνται miR-146a και TKIs (gefitinib, erlotinib, afatinib) ή cetuximab, χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία φορμαζάνη πολλαπλασιασμό χρωματομετρική MTS. Η αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού ήταν πολύ υψηλότερη όταν miR-146a μιμούνται συνδυάστηκε με afatinib, σε σύγκριση με μονό φάρμακο ή μονά μιμητικό miR-146a σε όλες τις δοκιμασμένες κυτταρικές σειρές, ειδικά σε χαμηλότερες, υπο-μοριακές συγκεντρώσεις του afatinib. Ωστόσο, δεν είναι ολόκληρη η καμπύλη ανάπτυξης των κυττάρων του πολλαπλασιασμού ήταν υψηλότερη από την καμπύλη Bliss ανεξαρτησία, η οποία έδειξε ότι η επίδραση ήταν συνδυασμός προσθέτου (Σχήμα 13). Οι συνδυασμένες επιδράσεις του miR-146a μιμούνται με άλλα TKIs ή cetuximab ήταν παρόμοιες αλλά ασθενέστερη από εκείνη του afatinib (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι miR-146a μιμούνται ενισχύει την ανασταλτική επίδραση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων από TKIs και cetuximab. Για να επαληθεύσετε την προσθετική ή συνεργιστική φύση του συνδυασμού ΤΚΙ /cetuximab με το να μιμούνται miR-146a, μια CI υπολογίστηκε [31], [32]. Αυτό δείχνει σαφώς ότι η επίδραση είναι προσθετική (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

MTS διεξήχθη όπως παραπάνω και ο ρυθμός αναστολής πολλαπλασιασμού υπολογίστηκε. *

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με το μέσο μόνο. κριτήριο Bliss ανεξαρτησίας έγινε για τον υπολογισμό του θεωρητικού προσθετικό αποτέλεσμα. – – – – -, Ευδαιμονία ανεξαρτησία της καμπύλης, το οποίο δείχνει τη θεωρητική κατάσταση στην οποία η συνδυασμένη επίδραση των miR-146a μιμούνται και άλλοι παράγοντας είναι ακριβώς πρόσθετο. •, τα ναρκωτικά + miR-146a μιμούνται. ▾drugs + Αρνητικό μιμούνται ελέγχου. ▪ φάρμακα μόνο. ◊miR-146α μιμούνται μόνο (60 nM). Τα σημεία των δεδομένων αντιπροσωπεύουν μέσες τιμές από φρεάτια εις τριπλούν και οι ράβδοι σφάλματος είναι SD

Η

Η αρχική διερεύνηση της κλινικής σημασίας της έκφρασης miR-146a σε περιπτώσεις NSCLC

Στη συνέχεια εξετάσαμε το miR-146a έκφραση σε FFPE βιοψίες από 101 περιπτώσεις NSCLC. Οι βιοψίες ελήφθησαν πριν από κάθε συστηματική θεραπεία. Στη σειρά, 76 περιπτώσεις ήταν διαθέσιμο με αντίστοιχες παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων. Η σχετική έκφραση miR-146a ήταν συνολικά σημαντικά χαμηλότερη σε ιστούς NSCLC από ό, τι στους φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων (5,20 vs 14.01,

P

& lt? 0.001) (Σχήμα 14). Στη σειρά των 76 ασθενών με μια αντιστοιχισμένη δείγμα, υπήρχε επίσης μια σημαντικά χαμηλότερη έκφραση miR-146a σε ιστούς του καρκίνου σε σύγκριση με φυσιολογικό πνεύμονα (5,91 vs 14.01,

P

= 0.005, Εικόνα 14). επίπεδα miR-146a ήταν σημαντικά υψηλότερα (

P

= 0,001) στις περιπτώσεις με κλινικά στάδια ΤΝΜ Ι και ΙΙ σε σχέση με τα στάδια III και IV (Πίνακας 1, Σχήμα 15Α). Επιπλέον, η έκφραση του miR-146a ήταν σημαντικά υψηλότερη (

P

= 0,001) στις περιπτώσεις χωρίς μακρινή μετάσταση από εκείνους με μετάσταση (Πίνακας 1, Σχήμα 15Β). Επιπλέον, οι 32 ασθενείς με υψηλότερη έκφραση του miR-146a (υψηλότερο από το μέσο επίπεδο) είχαν μεγαλύτερη επιβίωση χωρίς εξέλιξη από τους ασθενείς με χαμηλή έκφραση. Συνολικό χρόνο επιβίωσης των ασθενών με υψηλή έκφραση του miR-146a ήταν μεγαλύτερη από εκείνη των ασθενών με χαμηλή έκφραση (25,6 εβδομάδες σε υψηλά ασθενείς miR-146a έναντι 4,8 εβδομάδες σε χαμηλή ασθενείς miR-146a,

P

= 0,038, Εικόνα 15C). Η έκφραση του miR-146a δεν είχε σχέση με άλλες κλινικοπαθολογοανατομικές παράμετροι, όπως το φύλο, η ηλικία, η έκφραση της πρωτεΐνης EGFR, ενίσχυση γονιδίου EGFR ή την κατάσταση μετάλλαξης του EGFR (Πίνακας 1).

επίπεδα miR-146a (κανονικοποιημένη σε RNU6B) προσπελαστεί με RT-qPCR σε 101 περιπτώσεις NSCLC καρκινικούς ιστούς και 76 περιπτώσεις μη-καρκινικούς ιστούς πνεύμονα (Πίνακας Α). έκφραση του miR-146a συγκρίθηκε στα ζεύγη 7 περιπτώσεις. *

P

& lt?. 0.05

Η

επίπεδα miR-146a πρόσβαση με RT-qPCR στα στάδια Ι και ΙΙ σε σχέση με τα στάδια III και IV (Πίνακας Α), χωρίς μακρινή μετάσταση και με μετάσταση (Πίνακας Β). Kaplan-Meier καμπύλες συνολική επιβίωση ανάλογα με το επίπεδο miR-146a στον Πίνακα Γ

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα εργασία έχουμε διερευνηθεί ο ρόλος του miR-146a σε ανθρώπινο NSCLCs. Πρώτα ανεξάρτητα προσδιορίζονται miRNA-146a ως ο ισχυρότερος συσχετίζεται miRNA με την κατάσταση ενεργοποίησης EGFR και φαρμακολογική αναστολή του EGFR σε μια οθόνη που εμπλέκονται μια σειρά από 425 miRNAs σε μία σειρά NSCLC κυτταρικές σειρές και επιμολυντές BA /F3 με διάφορα EGFR γονιδιωματική κατάσταση (μη δημοσιευμένα δεδομένα στο αρχείο). Αυτό ώθησε την τρέχουσα έρευνα για να επιβεβαιωθούν τα ευρήματα και την περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου αυτού του miRNA στον NSCLC. Λειτουργικά, miR-146a κατέστειλε την κυτταρική ανάπτυξη, ανέστειλαν μετανάστευση κυττάρου, επαγωγή απόπτωσης και ανέστειλε κατάντη σηματοδότησης EGFR σε κυτταρικές σειρές NSCLC. Επιπλέον, miR-146a ενίσχυσε την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων που προκαλείται από φάρμακα που στοχεύουν EGFR, συμπεριλαμβανομένων TKIs (gefitinib, erlotinib, και afatinib) και ένα μονοκλωνικό αντίσωμα (cetuximab). Βρήκαμε επίσης σε κλινικά δείγματα FFPE που χαμηλή έκφραση του miR-146a συσχετίστηκε με προχωρημένα στάδια κλινικών TNM και μακρινή μετάσταση στον NSCLC.