Αφηρημένο

Misexpression των αυξητικών παραγόντων, ιδιαίτερα εκείνων που σχετίζονται με την βλαστικών κυττάρων φαινότυπο, παρατηρείται συχνά σε διάφορους τύπους καρκίνου. Έχει βρεθεί να επηρεάζουν τις παραμέτρους της εξέλιξης της νόσου, όπως τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, συντήρηση των αδιαφοροποίητων φαινότυπο και ρύθμιση του ανοσοποιητικού συστήματος. GdF3 είναι ένα μέλος της οικογένειας ΤΟΡβ που συνδέονται με pluripotency και διαφοροποίηση κατά την διάρκεια εμβρυϊκής ανάπτυξης που έχει αναφερθεί στο παρελθόν να είναι εκ νέου εκφράζονται σε ορισμένους τύπους καρκίνου. Ωστόσο, ο ρόλος του στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου δεν έχει διευκρινιστεί ακόμα. Σε αυτή τη μελέτη αποκρυπτογραφήσει το ρόλο του GdF3 σε

in vitro

μοντέλο καρκίνου βλαστικών κυττάρων, τα κύτταρα NCCIT. Με κλασσική προσέγγιση για τη μελέτη πρωτεΐνη λειτουργία σε συνδυασμό με την τεχνική υψηλής απόδοσης για ανάλυση μεταγραφικό και προσδιορισμούς διαφοροποίησης αξιολογήσαμε GdF3 ως δυνητικό θεραπευτικό στόχο. Παρατηρήσαμε ότι GdF3 επάγει σθεναρά μια ομάδα γονιδίων που σχετίζονται με τη διαφοροποίηση, μεταξύ των οποίων αρκετά ισχυροί καταστολείς των όγκων, χωρίς να επηρεάζεται η ικανότητα πολλαπλασιασμού. Επιπλέον, αναφέρουμε για πρώτη φορά την προστατευτική δράση των GdF3 έναντι απόπτωσης ρετινοϊκού οξέος που επάγεται σε κύτταρα με ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν. Η μελέτη μας υποδηλώνει ότι η παρεμπόδιση της GdF3 σε συνδυασμό με ρετινοϊκό οξύ-επεξεργασία των στερεών καρκίνων είναι μια συναρπαστική κατεύθυνση για περαιτέρω έρευνες, οι οποίες μπορούν να οδηγήσουν σε εκ νέου σχεδιασμό του καρκίνου θεραπείες διαφοροποίηση

Παράθεση:. Tykwinska K, Lauster R, Knaus Ρ, Rosowski Μ (2013) ανάπτυξη και διαφοροποίηση Παράγοντα 3 επάγει την έκφραση του γονίδια που σχετίζονται με διαφοροποίηση σε ένα μοντέλο του Καρκίνου βλαστοκύτταρα και προστατεύει Them από ρετινοϊκό οξύ απόπτωση. PLoS ONE 8 (8): e70612. doi: 10.1371 /journal.pone.0070612

Επιμέλεια: Sumitra Deb, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28, Φεβρουαρίου 2013? Αποδεκτές: 20 Ιουνίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 12 Αυγούστου 2013

Copyright: © 2013 Tykwinska et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς θα ήθελα να δηλώσω ότι το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από το Technische Universität Berlin και από DFG μέσω του Βερολίνου-Βραδεμβούργου Σχολή αναγεννητικής Θεραπείες ΓΓΣ 203. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την παρασκευή του χειρόγραφο

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Ο καρκίνος Εισαγωγή

βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (CSC) αποτελούν ένα μικρό πληθυσμό του όγκου έναρξη της έρευνας. κύτταρα, με εκτεταμένη ικανότητα αυτο-ανανέωσης, ικανότητα να παράγουν μη ογκογόνα κύτταρα και τέλος δυναμικό multidifferentiation. Τα ΚΕΠ πιστεύεται ότι είναι η κύρια αιτία της αντίστασης χημειοθεραπεία και υποτροπή της νόσου. Σύμφωνα με την υπόθεση CSC, τον έλεγχο αυτού του εξαιρετικά πολλαπλασιασμού κυτταρικό διαμέρισμα ορίζει την απόλυτη θεραπεία για τον καρκίνο [1] – [3]

Υπήρξαν συνεχιζόμενες μελέτες για να καθορίσουν δείκτες CSC

in vivo

. , αλλά καμία αξιόπιστη, καθολική συνδυασμός έχει βρεθεί μέχρι σήμερα. Ωστόσο, ο Ben-Porath [4] και άλλοι [5], [6] έδειξε ότι ένα κοινό χαρακτηριστικό των ιστολογικά χαμηλής διαφοροποίησης όγκους – που γενικά παρουσιάζουν τις χειρότερες προβλέψεις – είναι το ES-όπως υπογραφής, συμπεριλαμβανομένης της έκφρασης του Nanog, Oct4, SOX2 και τους στόχους τους [7], [8]. Η ανώμαλη έκφραση των παραγόντων αρχέγονων κυττάρων εντός των όγκων συντηρεί επιθετικό φαινότυπο και ενισχύει την πιθανότητα της εξέλιξης και μετάστασης [9].

Μεταξύ ο τεράστιος όγκος των καρκινικών κυτταρικών σειρών διατίθενται για να μελετηθεί η βιολογία του καρκίνου

in vitro

, του εμβρύου κυτταρικές σειρές καρκινώματος εμφανίζουν ES-σαν υπογραφή, συμπεριλαμβανομένης της έκφρασης των κύριων σχετιζόμενων παραγόντων μεταγραφής πλειοδυναμίας-δίκτυο, και δεν είναι σε θέση να διαφοροποιήσει μόνο

in vitro

, αλλά είναι επίσης εξαιρετικά ογκογόνο

in vivo

. Ως εκ τούτου, εμβρυϊκό καρκίνωμα (ΕΚ) κυτταρικές σειρές, αναμένεται να είναι ένα κατάλληλο μοντέλο της CSC [10], [11].

στην ανάπτυξη και παράγοντα διαφοροποίησης 3 (GdF3) είναι ευρέως αποδεκτή ως πολυδύναμο σημειωτή, όπως είναι μια άμεση μεταγραφική στόχος του Nanog [12]. Έχει αναφερθεί να ρυθμίζουν τόσο βασικά χαρακτηριστικά των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων, η διατήρηση της αδιαφοροποίητο φαινότυπο και του δυναμικού διαφοροποίησης [13].

Μαζί με άλλους δείκτες εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα, GdF3 δείχθηκε ότι εκφράζεται σε αρκετές καρκινικές είδη όπως το καρκίνωμα του μαστού [14], [15], το μελάνωμα [16], σεμίνωμα [15] και των όρχεων όγκους γεννητικών κυττάρων [17]. Ενώ Nanog, Oct4 και SOX2 διαπιστώθηκαν ως παράγοντες μεταγραφής βλαστική ικανότητα, την προώθηση, ο ρόλος της GdF3 παραμένει ελάχιστα κατανοητή. Αποτελέσματα που δημοσιεύθηκε από άλλους μέχρι σήμερα, όσον αφορά τον υποθετικό ρόλο αυτού του μορίου στη βιολογία του καρκίνου είναι αντιφατικές. Απεδείχθη, ότι GdF3 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκινώματος μαστού MCF7 γραμμή [14], αλλά αυξάνει τον πολλαπλασιασμό των Β16 μυελώματος και μπορεί να προωθήσει νευρωνική διαφοροποίηση των κυττάρων PC12 [18].

GdF3 ανήκει στο ισχυρός αυξητικός παράγοντας οικογένεια του αυξητικού παράγοντα μεταμόρφωσης β (ΤΟΡβ). Μέλη της οικογένειας ΤΟΡβ, συμπεριλαμβανομένων των οστών μορφογενετικές πρωτεΐνες (ΒΜΡ), παράγοντες ανάπτυξης και διαφοροποίησης (GDFs) και ΤΟΡβ, εμφανίζουν διακριτή, μερικές φορές αντίθετες επιδράσεις στα κύτταρα-στόχους, ανάλογα με τον κυτταρικό πλαίσιο, άλλα προσδέματα παρόν, δοσολογία και την ταυτότητα της κυτοκίνης [ ,,,0],19]

GdF3 αναφέρθηκε ότι εμπλέκεται στις δύο κανονικών μονοπατιών που προκαλούνται από τα μέλη της οικογένειας ΤΟΡβ:. (1) εξωκυτταρικό αναστολή της ΒΜΡ [13] και (2) διέγερση /3 φωσφορυλίωσης SMAD2 λόγω σύνδεσης με ακτιβίνη Οι υποδοχείς τύπου ΙΒ ή IC (ACVRIB, ACVRIC) και Ακτιβίνης υποδοχείς ένας τύπος ΙΙΑ ή ΙΙΒ (ACVRIIA, ACVRIIB) σε συνεργασία με την υποχρεωτική συν-υποδοχέα τερατοκαρκινώματος αυξητικός παράγοντας 1 (TDGF1) [20], [21].

Ο αναδυόμενος ρόλος του SMAD2 /3 καταρράκτη σηματοδότησης έχει ήδη καταδειχθεί σε παγκρεατικό, μαστού, στομάχου, ωοθηκών, του δέρματος και πολλά άλλα είδη καρκίνου. Ωστόσο, και οι δύο, ενεργοποίηση και μπλοκάρισμα της οδού SMAD2 /3 μπορεί να έχει θετικές επιπτώσεις στην έναρξη της νόσου [22] – [24]. Ως εκ τούτου, η δράση του κάθε συνδέτη ενεργοποίηση αυτού του μονοπατιού πρέπει να διερευνηθεί και να αξιολογηθεί προσεκτικά.

Ενθαρρυμένος από αυτά τα γεγονότα, θα αγκαλιάσει την πρόκληση να ερευνήσει διεξοδικά τις επιπτώσεις της GdF3 σηματοδότησης σε ένα μοντέλο της CSC γραμμή μεταγραφικό προφίλ και προσδιορισμοί διαφοροποίηση και να αξιολογήσει το δυναμικό του ως θεραπευτικό στόχο. Βρήκαμε ότι GdF3 ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην διαφοροποίηση, αλλά δεν επηρεάζει την ικανότητα πολλαπλασιασμού των μη διαφοροποιημένων CSC. Επιπλέον, έχουμε καταδείξει ότι GdF3 προστατεύει το CSC από την απόπτωση που επάγεται από το ρετινοϊκό οξύ, η μόνη κλινικά εγκεκριμένο CYTO-διαφοροποίησης, αντικαρκινικό παράγοντα.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και διαφοροποίηση

NCCIT και τα κύτταρα ΗΕΚ293Τ (Αμερικανική Συλλογή Type Cell) αναπτύχθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco με 4,5 g /l γλυκόζη (ΡΑΑ Laboratories, Αυστρία) που περιέχει 10% FBS (ΡΑΑ Laboratories, Αυστρία) και Πενικιλλίνη-Στρεπτομυκίνη (ΡΑΑ Laboratories , Αυστρία).

για να δημιουργήσετε GdF3 νοκ ντάουν κυτταρικές σειρές, shRNA ολιγονουκλεοτίδια για τη στόχευση GdF3 συντέθηκαν από TibMolBiol (TibMolBiol, Γερμανία) και κλωνοποιήθηκε σε λεντοϊού pLL3.7 φορέα (addgene, USA). Όλα τα κατασκευάσματα αλληλουχήθηκαν (GATC, Γερμανία) πριν την εφαρμογή. Σε συνδυασμό με πλασμίδια 2 συσκευασίες ΡΑΧ2 και VSVG του ιού παράχθηκε με διαμόλυνση φωσφορικού ασβεστίου των κυττάρων 293Τ. Το περιέχον ιός μέσο συλλέχθηκε, 20 × συμπυκνώθηκε σε Spin® FX® UF Concentrator (Corning, Γερμανία) και αναμίχθηκαν με κύτταρα NCCIT με προσθήκη 10 μg /mL πολυβρένιο (Sigma, Germany). Το μέσο αλλάχθηκε σε κανονικό μέσο την επόμενη ημέρα.

Για να επάγουν διαφοροποίηση, τα κύτταρα NCCIT υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 μΜ all-trans ρετινοϊκό οξύ (Sigma, Γερμανία) για 14 ημέρες.

ανάλυση μικροσυστοιχιών

για το ανθρώπινο γονιδίωμα ανάλυση μεταγραφικό CGH μικροσυστοιχιών 44K (Agilent Technologies, USA) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, το απομονωμένο RNA σημάνθηκε με χαμηλό Input RNA kit φθορισμού γραμμική ενίσχυση (Agilent Technologies, USA), αποσπασματικές, αναμιγνύονται με τους στόχους ελέγχου και υβριδοποιήθηκαν όλη τη νύχτα. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες στη συνέχεια πλύθηκαν και σαρώνεται με 5 μm ανάλυση χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχιών DNA σαρωτή (Agilent Technologies, USA). Χαρακτηριστικά εξήχθησαν με το εργαλείο ανάλυσης εικόνας Α 6.1.1. (Agilent Technologies, USA) χρησιμοποιώντας τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με το Rosetta Πληροφορικής πλατφόρμα επίλυσης Χτισμένο 4.0.

Η ανάλυση υπερεκπροσώπηση αναλήφθηκε από το φόρτωμα των συνόλων γονιδίων με π-value≤0.05 και διπλώστε change≥1.5 βάσης δεδομένων για το σχολιασμό, την απεικόνιση και την Ολοκληρωμένη Discovery (DAVID ) v6.7 [25], καθώς και την ανάλυση των γονιδίων Onthology, χρησιμοποιώντας την καταχώρηση Panther_BP_ALL.

δεδομένα μικροσυστοιχιών (αριθμός ένταξης GSE44670) έχει υποβληθεί στη βάση δεδομένων NCBI GEO. Το σύνολο δεδομένων περιλαμβάνει 3 συνθήκες (Α-Γ, που περιγράφεται περαιτέρω στη βάση δεδομένων GEO και στο τμήμα αποτελεσμάτων) με μία βιολογική επανάληψη κάθε μία. Το μη επεξεργασμένο έλεγχο στην Α και Β αντιπροσωπεύεται από ένα διαφορετικό δείγμα.

Ο χάρτης θερμότητας που παράγεται από CIMminer, ένα δωρεάν λογισμικό που αναπτύχθηκε από Γονιδιωματική και του Ομίλου Βιοπληροφορικής, Εργαστήριο Μοριακής Φαρμακολογίας, Κέντρο Έρευνας για τον Καρκίνο, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου . επιλέχθηκαν μόνο ανιχνευτές με p ≤ 0,05 και διπλώστε την αλλαγή ≥1.5 είτε μικροσυστοιχιών Α ή Β. Αν p & gt? 0,05, διπλώστε αλλαγή προεπιλογή οριστεί σε 1 (που σε μαύρο χρώμα στο χάρτη θερμότητας)

Απομόνωση νουκλεϊκών οξέων, σύνθεση cDNA και qPCR

Η απομόνωση του RNA έγινε με τη χρήση. κιτ NucleoSpin® RNA II (Macherey-Nagel, Γερμανία), ακολουθώντας τις οδηγίες που παρέχονται.

αντίστροφη μεταγραφή του mRNA διεξήχθη με χρήση κιτ TaqMan® Αντίστροφη Μεταγραφή Αντιδραστήρια cDNA (Applied Biosystems, USA), σύμφωνα με του κατασκευαστή οδηγίες.

πραγματικού χρόνου PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας cDNA 1 μΐ με 1 μΐ μίγματος εκκινητή και SensiFAST ™ SYBR No-ROX kit (Bioline, Γερμανία), σε 96 φρεατίων πλάκες PCR (Biozym Scientific, Γερμανία), και διαβάστηκαν με Stratagene MX 3005P ™ Multiplex Ποσοτική PCR System (Agilent Technologies, USA). Εκκινητές παραγγέλθηκαν από TIBMolBiol (Γερμανία).

Ο κατάλογος αστάρι μπορεί να βρεθεί στον Πίνακα 1.

Η

λουσιφεράσης δοκιμασία

Το ΒΜΡ-απόκρισης κατασκεύασμα BRE-Luc [26] και το στοιχείο δεσμευτική SMAD κατασκευάσει SBE-Luc ήταν ευγενικό δώρα από τον καθηγητή Π Δέκα Dijke (Πανεπιστήμιο Leiden Medical Center). CAGA-Luc ήταν ένα είδος δώρο από τον καθηγητή Π Knaus (Freie Universität Berlin). Τα κύτταρα εμβολιάστηκαν, επιμολυσμένα με TurboFect (Thermo Scientific, Γερμανία, διαδικασία σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών) και 24 ώρες αργότερα πεινασμένο για 3 ώρες σε μέσο ελεύθερο ορού και στη συνέχεια διεγέρθηκαν για τουλάχιστον 20 ώρες με συνδέτη του ενδιαφέροντος (rhGDF3, rhNodal και rhBMP2 αγοράστηκαν από την R &? D Systems, Γερμανία). Για να δοκιμαστεί η ανασταλτική ικανότητα του GdF3, rhGDF3 και rhBMP2 επωάστηκαν μαζί σε μέσο χωρίς ορό για 1 ώρα πριν από τη διέγερση των κυττάρων. Τα κύτταρα στη συνέχεια λύθηκαν και η ενεργότητα της λουσιφεράσης μετρήθηκε σε προϊόντα λύσης με διπλή Luciferase® σύστημα προσδιορισμού ανταποκριτή (Promega, Γερμανία) σε αναγνώστη μικροπλακός Omega (BMC Labtech, Germany). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως σχετική λουσιφεράσης μονάδες (RLU), οι οποίες υπολογίζονται ως πυγολαμπίδας στην αναλογία της Renilla.

TDGF1 πλασμίδιο έκφρασης

πλασμίδιο έκφρασης TDGF1 δημιουργήθηκε με ενίσχυση του πλήρους TDGF1 ORF χρησιμοποιώντας NCCIT cDNA ως ένα εκμαγείο με τα εναρκτήρια TDGF1 κλωνοποίηση μέχρι κλωνοποίησης /TDGF1 κάνει. Το PCR προϊόν εισήχθη σε pIRES2-EGFP (BD Biosciences, Germany) μέσω θέσεων περιορισμού NheI /BamHI. NheI, BamHI, Taq πολυμεράσης και Τ4 λιγκάση αγοράστηκαν από την Thermo Scientific.

Primer αλληλουχίες παρατίθενται στον Πίνακα 1.

ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα εμβολιάστηκαν σε πλάκες θάλαμο (BD Biosciences, Germany) και την επόμενη ημέρα μονιμοποιήθηκαν σε 4% PFA, διαπερατά με PBS /0.05% Triton Χ-100 (Sigma, Germany) και χρωματίστηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του προμηθευτή ab. Οι εφαρμοζόμενες αντισώματα ήταν: αντι-ανθρώπινο SMAD2 ab (Thermo Scientific, Γερμανία), κουνέλι αντι-ανθρώπινο TUBB3 ab (Sigma, Germany) και IgG αντι-ποντικού (Η + L) -A594 ab και IgG αντι-κουνελιού (Η + L) -. Alexa594 ab (Molecular Probes, USA)

για την μετατόπιση SMAD, τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής 3 ώρες σε μέσο ελεύθερο ορού και στη συνέχεια διεγείρονται με 300 ng /mL rhGDF3 για 1 ώρα, πριν από τη μονιμοποίηση.

Οι φωτογραφίες λήφθηκαν με ψηφιακή μικροσκόπιο φθορισμού BZ 9000 (Keyence, Γερμανία) και απεικονίστηκαν με BZviewer (Keyence, Γερμανία), μετά από αντίθετη χρώση των πυρήνων με Hoechst 33342 (Sigma, ΗΠΑ).

Western blot

για ανάλυση κηλίδος western, τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό 5xLaemmli και έβρασαν για 5 λεπτά. Λύματα ολόκληρων κυττάρων διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου και οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF (Macherey-Nagel, Γερμανία). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% BSA και στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα αντι-SMAD2 (Thermo Scientific, Γερμανία), αντι-pSMAD2 (Invitrogen, Γερμανία), και αντι-GAPDH (Thermo Scientific, Γερμανία) ABS, που ακολουθείται από επώαση με ραφανιδική υπεροξειδάση συζευγμένο δευτερεύον κοιλιακούς (Thermo Scientific, Γερμανία). Ανοσοαντιδραστικές πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο κιτ ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Thermo Scientific, Γερμανία). Οι φωτογραφίες των μεμβρανών αποκτήθηκαν από Fusion FX7 (Peqlab, Γερμανία).

FACS Ανάλυση

Ο πολλαπλασιασμός παρακολουθούνται με χρώση των κυττάρων με CellTrace® Violet (Invitrogen, Γερμανία) και την απόπτωση από Αννεξίνη V- Pacific Blue (BioLegend, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός MACSQuant® Analyzer (Miltenyi, Γερμανία) κυτταρόμετρο ροής και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FlowJo, έκδοση 7.6.5 (Δέντρο αστέρι inc., USA). Δεδομένα από τουλάχιστον 30 000 κύτταρα συνήθως αποκτώνται για κάθε δείγμα. αριθμός των κυττάρων έχει ομαλοποιηθεί στο ύψος της κορυφής κατά τρόπο κατανομής από τον αλγόριθμο FlowJo, έτσι ώστε απόλυτος αριθμός αντιπροσωπεύεται από το 100% του συνόλου (% του Max).

Η στατιστική ανάλυση

Μονήρη Student t-test εφαρμόστηκε στα σύνολα δεδομένων, χρησιμοποιώντας το

GraphPad Prism

® έκδοση λογισμικού 5.0 (GraphPad Software Inc., USA). Ρ-τιμές μικρότερες ή ίσες με 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές. (*) Υποδηλώνει p ≤ 0,05, (**) p≤0.01 και (***) p≤0.001. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο +/- τυπική απόκλιση.

Αποτελέσματα

κύτταρα NCCIT εκφράζουν απαραίτητα συστατικά του καταρράκτη σηματοδότησης GdF3

GdF3 και υποχρεωτική συν-υποδοχέα της TDGF1 έχουν στενό πρότυπο έκφρασης και συνδέονται με πολυδύναμα φαινοτύπου σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα και τον καρκίνο. Για τον καθορισμό της εμβρυονική κυτταρική γραμμή καρκινώματος NCCIT ως ένα κατάλληλο μοντέλο CSC να μελετήσει το ρόλο του GdF3, αξιολογήσαμε την έκφραση σημαντικά συστατικά του μονοπατιού σηματοδότησης GdF3 με RT-PCR. Ανιχνεύσαμε την έκφραση του

GdF3

και άλλες εκκρίνονται συνδέτες ενδεχομένως εμπλέκονται στη σηματοδότηση GdF3, όπως

κομβικό

και

LEFTY2

(Εικόνα 1Α). Κομβικών χρησιμοποιεί τον ίδιο τύπο Ι και τύπου II υποδοχείς [27] και μπορεί ως εκ τούτου να ανταγωνιστεί με GdF3 για τις θέσεις σύνδεσης υποδοχέα. LEFTY2 είναι ένα φυσικό, εξωκυτταρικό αναστολέας της κομβικών και GdF3 [28]. Επίσης μεταγραφές των δύο, τύπου Ι (ACVRIB και C) και τύπου II (ACVRIIA και Β) υποδοχείς είναι παρόντες σε κύτταρα NCCIT, μαζί με την υποχρεωτική συν-υποδοχέα

TDGF1

(Εικόνα 1Β) και ενδοκυτταρική σηματοδότηση μεσολαβητές R-Smads (

SMAD2

και

Smad3

), συν-SMAD (

Smad4

) και η ανασταλτική

Smad7

(σχήμα 1Γ), που συμμετέχουν στην η αρνητική αλληλεπίδραση των SMAD2 /3 καταρράκτη σηματοδότησης σε εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα.

Α-C. Έκφραση των GdF3, αγωνιστικού συνδέτη κομβικών και εξωκυτταρικά αναστολέα Lefty2 (Α), GdF3 υποδοχείς (Β) και την ενδοκυτταρική σηματοδότηση μεσολαβητές Smads (C). Η έκφραση προσδιορίστηκε με RT-PCR, έκφραση GAPDH χρησίμευσε ως μάρτυρας. Ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα απεικονίζεται. n = 3 Δ BRE-εξαρτώμενη ενεργότητα λουσιφεράσης σε κύτταρα NCCIT επεξεργασία με 20 ng /mL ΒΜΡ2 μόνη της ως ένα θετικό έλεγχο ή με προ-επωάστηκαν μίγματα 20 ng /mL BMP και 3 × 5 × 10 × μοριακή περίσσεια GdF3 . Ε SBE-εξαρτώμενη ενεργότητα λουσιφεράσης σε κύτταρα NCCIT διεγείρονται με GdF3 σε συγκεντρώσεις κυμαινόμενες από 50 έως 700 ng /mL. Τα αποτελέσματα σε D-E παρουσίασαν ως πυγολαμπίδας να Renilla αναλογία και ομαλοποιήθηκε ως προς μη διεγερμένα δείγμα. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν μια μέση τιμή των τριών βιολογικών επαναλήψεων +/- τυπική απόκλιση. Ρ-τιμές μικρότερες ή ίσες με 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές. (*) Υποδηλώνει p ≤ 0,05, (**) p≤0.01. ΣΤ ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση της φωσφορυλίωσης SMAD2 σε κύτταρα NCCIT μετά ασιτία και την θεραπεία με 300 ng /mL κομβικά ή 100 ng /mL GdF3 για 1 ώρα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Ένας εκπρόσωπος ανοσοαποτύπωση απεικονίζεται. n = 3. G. Η μετατόπιση του SMAD2 σε NCCIT κατά τη διέγερση με 300 ng /mL GdF3. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με αντι-SMAD2 και αντι-ποντικού-Alexa594 (άνω πάνελ) αντίσωμα και αντίθετα με τη Hoechst (κάτω πίνακας). Κίτρινη γραμμή δείχνει 100 μm. Ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα απεικονίζεται. n = 3.

Η

Η έκφραση της GdF3 συνδετήρα, υποδοχείς και τελεστές δοκιμάστηκε σε άλλο εμβρυϊκή κυτταρική γραμμή καρκινώματος, NTERA2 (Σχήμα S1). Εκτός του

ACVRIC

και

ACVRIIB

, όλα τα συστατικά της GdF3 καταρράκτη σηματοδότησης ανιχνεύθηκαν επίσης με RT-PCR.

σηματοδότηση GdF3 είναι λειτουργικά ενεργά στην CSC μοντέλο

GdF3 αναφέρθηκε στο (1) να είναι σε θέση να μπλοκάρει SMAD1 /5/8-σηματοδότηση μέσω σύνδεσης με ΒΜΡ, π.χ. ΒΜΡ4 στον εξωκυττάριο χώρο [13] και (2) προκαλούν SMAD2 /3 καταρράκτη [20] σηματοδότησης, [29]. Στην τελευταία περίπτωση GdF3 δρα με σύνδεση προς και ενώνει υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας TDGF1 και διμερή της Ι και τύπου II υποδοχείς τύπου που οδηγεί σε φωσφορυλίωση των SMAD2 ή Smad3 ως ενδοκυτταρικό τελεστές τα οποία στη συνέχεια μετατοπίζεται εντός του πυρήνα του κυττάρου να δρουν ως παράγοντες συν-μεταγραφή . Για να δοκιμαστεί η οποία τρόπος δράσης του GdF3 είναι λειτουργικό στο μοντέλο μας CSC, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία λουσιφεράσης. Τα κύτταρα NCCIT επιμολύνθηκαν με φορείς που περιέχουν ΒΜΡ-αποκριτικά στοιχεία (BRE-Luc) και ακολούθως διεγείρονται με ένα μείγμα από ΒΜΡ2 και GdF3 σε 1-, 3-, ή 10-πλάσια γραμμομοριακή περίσσεια. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1ϋ, η έκφραση λουσιφεράσης σθεναρά ενεργοποιείται από ΒΜΡ2, παρά την παρουσία GdF3 στο μέσο.

Για να αξιολογηθεί η ενεργοποίηση της SMAD2 /3 μονοπατιού, επιμολύναμε τα κύτταρα NCCIT με ένα φορέα που περιέχει το Binding SMAD Element (SBE-Luc) και διεγέρθηκαν τα κύτταρα με αυξανόμενες συγκεντρώσεις GdF3. Η μέγιστη δραστικότητα λουσιφεράσης καθοδηγείται από το κατασκεύασμα υποκινητή επιτεύχθηκε με 300 ng /mL και δεν αυξήθηκε περαιτέρω με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του συνδέτη (Εικόνα 1 Ε).

επιβεβαίωσε την ταυτότητα του φωσφορυλιωμένου SMAD με εκχύλιση πρωτεΐνης από GdF3-διεγερμένα κύτταρα NCCIT και την ανίχνευση της φωσφορυλιωμένης SMAD2 με κηλίδα western. Η διέγερση με ανασυνδυασμένη ανθρώπινη κομβικά (rhNodal) εκτελέστηκε ως θετικός έλεγχος για την ενεργοποίηση του SMAD2 /3 καταρράκτη σηματοδότησης (Σχήμα 1 F). Ήμασταν επίσης σε θέση να παρακολουθείτε την μετατόπιση της SMAD2 στον πυρήνα κατά GdF3-διέγερση με χρώση ανοσοφθορισμού, που φαίνεται στο Σχήμα 1G.

Εν ολίγοις, ήμασταν σε θέση να αποδείξει ότι GdF3 προκαλεί την SMAD2 /3 μονοπατιού στο NCCIT κύτταρα, και δεν λειτουργεί σαν ένα εξωκυτταρικό ΒΜΡ-ανταγωνιστή.

GdF3 δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NCCIT

από GdF3 αναφέρθηκε στο [14], [16 επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων προηγουμένως ], θα καθοριστεί αν GdF3 έχει αντίκτυπο στον πολλαπλασιασμό του μοντέλου κυτταρικής σειράς CSC. Τα κύτταρα NCCIT βάφτηκαν με χρωστική ουσία CellTrace® Violet, σπάρθηκε και διεγείρονται με rhGDF3 κάθε 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν κάθε μέρα και η ποσότητα της ενσωματωμένης χρωστικής σε GdF3 διεγερμένα και μη-κατεργασμένα κύτταρα αξιολογήθηκε με FACS και συγκρίνονται. Δεν βρέθηκαν διαφορές, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α και στον Πίνακα 2.

A. ανάλυση FACS του ποσού της CellTrace® Violet ενσωματώνονται μέσα σε κύτταρα NCCIT επαναληπτικά διεγείρονται με 300 ng /mL rhGDF3 (εγχρώμων καμπύλη) και χωρίς θεραπεία (μαύρη γραμμή). Π.Χ. ανάλυση FACS του ποσού της CellTrace® Violet ενσωματωθεί NCCIT SCR (Β) και NCCIT sh1GDF3 κύτταρα (C). Τα κύτταρα βάφτηκαν, σπάρθηκαν και συλλέχθηκαν κάθε μέρα (που υποδεικνύεται ως D0-D3). Γκρι γραμμή δείχνει μη χρωματισμένα κύτταρα. αριθμός των κυττάρων έχει ομαλοποιηθεί στο ύψος της κορυφής κατά τρόπο κατανομής από τον αλγόριθμο FlowJo, έτσι ώστε απόλυτος αριθμός αντιπροσωπεύεται από το 100% του συνόλου (% του Max). Το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν, ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα απεικονίζεται.

Η

Για να δοκιμαστεί η επίδραση της μειωμένης συγκέντρωσης της ενδογενούς GdF3 στα κύτταρα NCCIT, δημιουργήσαμε ένα σταθερό GdF3 νοκ ντάουν κυτταρική γραμμή, με μεταγωγή της NCCIT κυττάρων με φακοϊό με shRNA κασέτα στόχευσης GdF3. Η αποτελεσματικότητα της μεταγωγής και την επακόλουθη GdF3 μειορύθμιση παρακολουθήθηκε μέσω FACS με έκφραση GFP και με qPCR για

GdF3

έκφραση, αντίστοιχα (Σχήμα S2). Από τα δύο shRNA κατασκευάσματα που δοκιμάστηκαν, GdF3 knockdown στην κυτταρική γραμμή που παράγεται με sh1GDF3 ήταν πιο αποτελεσματική και έφθασε το 96%, και ως εκ τούτου χρησιμοποιούνται για όλα τα επόμενα πειράματα. GdF3 knockdown δεν επηρέασε την πολλαπλασιαστική ικανότητα των κυττάρων NCCIT, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, μεταγωγή με κωδικοποιημένο φορέα (Σχήμα 2Β-C και Πίνακας 2).

GdF3 ρυθμίζει την γονιδιακή έκφραση στο μοντέλο CSC

για να πάρετε περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τον πιθανό ρόλο των GdF3 στο μοντέλο μας CSC και να προσδιορίσει GdF3-κατάντη στόχοι, προφίλ έκφρασης γονιδίου παγκόσμια κυττάρων NCCIT διεγείρονται με GdF3 ή με GdF3 νοκ ντάουν αναλύθηκαν από μια πλατφόρμα cDNA μικροσυστοιχιών. Επιλέξαμε ένα σύντομο χρονικό διάστημα διέγερση 3 ωρών, για την αξιολόγηση πρωτογενείς επιπτώσεις της διέγερσης συνδέτη.

Η μεταγραφική απόκριση σε διέγερση από διάφορα μέλη της οικογένειας ΤΟΡβ που σηματοδοτούν μέσω της ίδιας οδού συχνά διαφέρει, ανάλογα στην πρώτη θέση για την η αντοχή του SMAD σηματοδότησης ενεργοποιούνται σε κύτταρα-στόχους και την ενεργοποίηση των μη-SMAD οδών [30]. Επιπλέον, συνδέτη εξαρτάται από τη συγκέντρωση SMAD2 /3 σηματοδότηση αναφέρθηκε να προκαλέσει απόκλιση, ακόμη και αντίθετες επιδράσεις [19], [31]. Ως εκ τούτου, στη μελέτη μας έχουμε ως στόχο να καλύψει ένα ευρύ φάσμα μεταγραφικής επιδράσεις που προκαλούνται από τη μείωση και την αύξηση της αντοχής του SMAD2 /3 σηματοδότηση σε κύτταρα NCCIT (Πίνακας 3, μικροσυστοιχίες Α έως C). Συγκεκριμένα, εφαρμόζεται χαμηλή (100 ng /mL) και υψηλή (300 ng /mL) δόση GdF3 (microarray Α & amp? Β, αντίστοιχα). Από την μικροσυστοιχιών C μελετήσαμε τα αποτελέσματα της GdF3 νοκ ντάουν στο μοντέλο κυτταρική σειρά CSC.

Η

Για την αξιολόγηση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών, μόνο σημεία με p-value ≤0.05, διπλώστε την αλλαγή ≥1.5 και με επίσημη γονίδιο σχολιασμού συμπεριλήφθηκαν (Πίνακας 3). Αυτό περιόρισε την ποσότητα των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε 390 και 421 λόγω της διέγερσης με χαμηλή και υψηλή δόση GdF3. Ο αριθμός των ρυθμιζόμενων μεταγραφές συσχετίζεται θετικά με τη δύναμη της SMAD2 /3 σηματοδότηση που προκαλείται από το εφαρμοζόμενο συνδέτη (ες) (σύγκρινε Σχήμα 1 Ε). Οι πιο σημαντικές αλλαγές μεταγραφική με 2075 διαφορικά ρυθμιζόμενα γονίδια παρατηρήθηκαν ως αποτέλεσμα της GdF3 knockdown. Ενώ λόγω GdF3 θεραπεία πιο γονίδια ρυθμίζεται αυξητικά από μειωτικά (μικροσυστοιχίες Α & amp? Β, Πίνακας 3), το αντίθετο πρότυπο εμφανίζεται ως αποτέλεσμα της GdF3 knockdown (microarray C, Πίνακας 3)

GdF3 πράξεων. ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο

για την αντιμετώπιση του βιολογικού ρόλου του GdF3, γονιδίων που ρυθμίζονται λόγω GdF3 διέγερση και knockdown (Πίνακας 3) ταξινομήθηκαν με βάση την βιολογική τους λειτουργία. Για το σκοπό αυτό ρυθμίζονται τα γονίδια με τα επίσημα ονόματα γονιδίων εξήχθησαν από κάθε μικροσυστοιχιών και μια ανάλυση υπερεκπροσώπηση έγινε με βάση δεδομένων για το σχολιασμό, την απεικόνιση και την Ολοκληρωμένη Discovery (David) v6.7 [25]. Αυτή η διαδικασία επιτρέπει την αξιολόγηση του κατά πόσον μια συγκεκριμένη λειτουργικά καθορισμένη ομάδα γονιδίων που εκπροσωπείται περισσότερο από το αναμενόμενο κατά τύχη μέσα σε μια λίστα γονίδιο [32]. Γονίδια που ρυθμίζονται από GdF3 ταξινομήθηκαν σε βασικές κατηγορίες όπως οι αναπτυξιακές διαδικασίες, μεσόδερμα και ανάπτυξη εξώδερμα, νευρογένεση και μεταγωγής σήματος (Πίνακας S1 και Πίνακας 4). Μεταξύ 15,3% και 18,2% των γονιδίων που ρυθμίζονται σε μικροσυστοιχίες Α και C, αντίστοιχα, συνδέθηκαν με αναπτυξιακές διαδικασίες. Ρύθμιση των γονιδίων με λειτουργία σε ανάπτυξη εξώδερμα και νευρογένεση σημειώθηκε στις μικροσυστοιχίες Α (6,5% και 6,5%) και C (6,5% και 5,8%), αλλά όχι Β Περαιτέρω, μεταξύ των γονιδίων που ρυθμίζονται από GdF3 knockdown 5,3% σχετίστηκαν με την ανάπτυξη μεσόδερμα. Περίπου. 25% των γονιδίων σε όλες τις μικροσυστοιχίες ταξινομήθηκαν σε μεταγωγή σήματος. ανάλυση Overrepresetation αποκάλυψε επίσης ότι ένα μικρό, αλλά σημαντικό αριθμό (p ≤ 0,05) των γονιδίων που σχετίζονται με την αγγειογένεση σε μικροσυστοιχιών C (0,9%) (Πίνακας S1) ρυθμίζεται από SMAD2 /3 σηματοδότησης.

Η

Η διέγερση των κυττάρων NCCIT με διαφορετικές συγκεντρώσεις GdF3 και GdF3 knockdown επηρεάζονται διαφορετικά SMAD2 /3 σηματοδοσίας δύναμη (σχήμα 1 Ε). Για τη σύγκριση περαιτέρω αυτά τα αποτελέσματα, αναλύσαμε την ποσοτική επικάλυψη της μεταγραφικής αλλαγές στα διεγερμένα κύτταρα, καθώς και τα υποσύνολα γονιδίων που ρυθμίζονται αποκλειστικά από κάθε πειραματική συνθήκη (Σχήμα 3). Οι κατάλογοι εκχυλίζεται γονίδιο στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση υπερεκπροσώπηση. 48 γονίδια συνήθως ρυθμίζεται σε όλες τις τρεις προϋποθέσεις. Ωστόσο, μόνο 9 από αυτά ήταν σημαντικά εμπλουτίζεται σύμφωνα με τη βιολογική τους λειτουργία στην κατηγορία των μεσολάβηση υποδοχέα μεταγωγή σήματος κυτταρικής επιφάνειας. Από τα γονίδια 2075 και 421 διαφορικά ρυθμίζονται από GdF3 knockdown ή υψηλή συγκέντρωση GdF3, αντίστοιχα (Α & amp? C), 129 μεταγραφές ρυθμίζονταν σε αμφότερες τις συνθήκες. Αυτά ήταν κυρίως εμπλουτισμένο με κατηγορίες που σχετίζονται με την ανάπτυξη και την καταγωγή δέσμευση: αναπτυξιακών διαδικασιών, ανάπτυξης εξώδερμα και νευρογένεση. Ωστόσο, όταν συνήθως ρυθμιζόμενα γονίδια εξαιρέθηκαν από την πισίνα γονιδίου και μόνο γονιδίων που ρυθμίζονται αποκλειστικά από την αύξηση (microarray Α) ή διακόπτεται (microarray C) SMAD2 /3 σηματοδότηση Αναλύθηκαν, παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην επίδραση στις διάφορες βιολογικές διαδικασίες. Ενώ η υψηλή δόση του GdF3 επηρέασε μόνο διαδικασίες που σχετίζονται με σηματοδότηση (υποδοχέας κυτταρικής επιφάνειας που προκαλείται μεταγωγή σήματος, κυτταρική επικοινωνία, σηματοδότηση συνδέτη μεσολάβηση, μεταγωγή σήματος) και νευρογένεση, τα GdF3 knockdown επηρεαστεί περαιτέρω σύνολα γονιδίων αποδίδεται όχι μόνο για σηματοδότηση, αναπτυξιακές διαδικασίες και την ανάπτυξη εξώδερμα, μεσόδερμα αλλά και την ανάπτυξη και την αιμοποίηση.

Venn διάγραμμα που απεικονίζει την αλληλεπικάλυψη μεταξύ μικροσυστοιχίες Α, Β και C. Μόνο ανιχνευτές για τις μικροσυστοιχίες με ρ-τιμή ≤0.05 και φορές αλλαγή ≥1.5 χρησιμοποιήθηκαν σε αυτό ανάλυση. Υποσύνολα των γονιδίων που αναφέρονται στους τίτλους των χρωματική κωδικοποίηση κουτιά υποβλήθηκαν σε ανάλυση υπερεκπροσώπηση γονίδιο οντολογία και μια επιλογή από κυρίως εμπλουτισμένο βιολογικών διεργασιών είναι εισηγμένη (πλήρης κατάλογος μπορεί να βρεθεί στον πίνακα S1). Οι βιολογικές διαδικασίες που αναφέρονται επίσης στον Πίνακα 4 εκτυπώνονται με έντονα γράμματα. Α – διέγερση με 300 ng /mL rhGDF3, Β – διέγερση με 100 ng /mL rhGDF3, Γ -. GdF3 knockdown

Η

Μία παρόμοια διαδικασία χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της λειτουργίας των γονιδίων που ρυθμίζονται από υψηλές και χαμηλές δόσεις GdF3 (Σχήμα 4Α). 89 γονίδια ρυθμίζονται και στις δύο συνθήκες, αλλά η αξιολόγηση της γονιδιακής οντολογίας αποδίδει μέσα σε αυτή την ομάδα δεν εξέδωσε στατιστικά σημαντική (p ≤ 0,05) αποτελέσματα. Σημειώσαμε σαφείς διαφορές στις βιολογικές διεργασίες που ρυθμίζονται από διαφορετικές συγκεντρώσεις GdF3. συγκέντρωση High GdF3 επηρέασε την μεταγραφή αρκετών γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη εξώδερμα, νευρογένεση και μεταγωγής σήματος, ενώ 100 ng /mL του διαμορφωμένου GdF3 μόνο διαδικασία της μεταγωγής σήματος. Η θερμότητα χάρτη της πτυχής αλλαγές αναδεικνύει αρκετές ομάδες γονιδίων δυνητικά ρυθμίζονται διαφορικά (Εικόνα 4Β) με υψηλή και χαμηλή συγκέντρωση GdF3.

Α. διάγραμμα Venn απεικονίζει εγκάρσια ανάλυση των συνήθως ρυθμισμένων γονιδίων λόγω 300 ng /mL rhGDF3 (Microarray Α) και 100 ng /mL rhGDF3 (Microarray Β) διέγερση των κυττάρων NCCIT. συμπεριλήφθηκαν μόνο τα γονίδια με p-value ≤0.05 και διπλώστε την αλλαγή ≥1.5. B. χάρτη θερμότητας της πτυχής αλλαγές των γονιδίων που ρυθμίζονται από υψηλή και χαμηλή δόση GdF3 (μικροσυστοιχιών Α & amp? Β). συμπεριλήφθηκαν γονιδίων με πολλαπλή μεταβολή ≥1.5 και ρ-τιμή ≤0.05 σε τουλάχιστον μία από τις μικροσυστοιχίες. Μαύρες μπάρες δείχνουν την αλλαγή φορές & lt? 1.5 ή p-value & gt? 0,05. Η πολλαπλή μεταβολή είναι χρωματική κωδικοποίηση από πράσινο σε κόκκινο (βλ κλίμακα bar).

Η

Οι τρεις όροι που εφαρμόζονται για να τεμαχίσει τον αντίκτυπο των GdF3 σε κύτταρα NCCIT περιλαμβάνει (Α) υψηλή δόση GdF3 να ενεργοποιήσετε τη μέγιστη SMAD2 /3 μονοπατιού, (Β) χαμηλή δόση GdF3 για τη μέτρια SMAD2 /3 σηματοδότηση και (C) διαταραχή της σηματοδότησης GdF3 με GdF3 knockdown δημιουργούνται διαφορετικά επίπεδα GdF3 δύναμη σηματοδότησης. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η διαμόρφωση του SMAD2 /3 σηματοδότησης από GdF3 διέγερση ή διακοπή του μονοπατιού σηματοδότησης GdF3 επηρεάζει πολλές βιολογικές διεργασίες, όπως αναπτυξιακές διαδικασίες, ανάπτυξη εξώδερμα, νευρογένεση και μεταγωγή σήματος στο μεταγραφικό επίπεδο. Επιπλέον, η σταθερή GdF3 knockdown οδήγησε στην επαγωγή των γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη μεσόδερμα και αιμοποίηση σε κύτταρα NCCIT. Επιπλέον, GdF3 διαμορφωμένο το μεταγραφικό κυττάρων NCCIT με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Ακόμη και μια χαμηλή δόση GdF3 (microarray Β) άλλαξε σημαντικά το μεταγραφικό των κυττάρων-στόχων. Ωστόσο, σε αντίθεση με μια υψηλή δόση GdF3, μια χαμηλή δόση δεν έχει καμία επίπτωση για τη ρύθμιση των γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη.

GdF3 επάγει την έκφραση διαφόρων γονιδίων που σχετίζονται με την μεταγωγή σήματος και την ανάπτυξη

για να επιβεβαιώσετε τα αποτελέσματα μικροσυστοιχιών, εμείς επιλέξαμε διάφορα γονίδια που σχετίζονται με την μεταγωγή σήματος και αναπτυξιακές διαδικασίες και επικυρώνονται έκφραση τους, κατά την διέγερση GdF3 με qPCR. Η κατάρτιση των μικροσυστοιχιών και qPCR αποτελέσματα παρουσιάζονται στον Πίνακα 5, που συνοψίζει την επικύρωση του πειράματος μικροσυστοιχιών.

Η

Η επιλογή των υποψηφίων για τα γονίδια-στόχους GdF3 επικεντρωθήκαμε κυρίως σε μέλη της οικογένειας ΤΟΡβ και παράγοντες μεταγραφής, η οποία μπορεί να λειτουργήσει ως κύριο διακόπτες στις αποφάσεις της κυτταρικής τύχης.

Η έκφραση του

LEFTY2

, ένας γνωστός στόχος SMAD2 /3 σε εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα [33], ήταν έντονα ρυθμισμένη προς τα πάνω από χαμηλή και υψηλή δόση GdF3 (Σχήμα 5Α) και χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος για την διέγερση.

A-G. Επίδραση της διέγερσης με διαφορετικές συγκεντρώσεις GdF3 στη μεταγραφή πολλών γονιδίων που ρυθμίζονται με τις μικροσυστοιχίες A & amp? Β n = 5. Η Επίδραση της GdF3 knockdown στη μεταγραφή πολλών γονιδίων που ρυθμίζονται στη μικροσυστοιχία Ε n = 3. Η έκφραση μετρήθηκε με qPCR, τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως

GAPDH

αναλογία και ομαλοποιήθηκε ως προς μη διεγερμένα κύτταρα (Α-G) ή κύτταρα μεταδιεγείρονται με περιπλεγμένο-φορέα (H). Ρ-τιμές μικρότερες ή ίσες με 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές. (*) Υποδεικνύει p ≤ 0,05 και (**) p≤0.01.