Αφηρημένο

Η κυκλίνη G-συνδέονται κινάσης (ΓΑΚ), ένας βασικός παράγοντας στη διακίνηση μεμβράνη clathrin μεσολάβηση, υπερεκφράζεται σε διάφορα καρκινικά κύτταρα. Εδώ, αναφέρουμε ότι η έκφραση ΓΑΚ συσχετίζεται θετικά με το σκορ Gleason σε χειρουργικά δείγματα από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη. Τα εμβρυϊκά ινοβλάστες από knockout ποντίκια που εκφράζουν μια (KD) μορφή της κινάσης-νεκρό του GAK έδειξε συστατική υπερ-φωσφορυλίωση του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR). Εκτός από τη γνωστή αναστολείς EGFR gefitinib και erlotinib, η διατροφική φλαβονοειδές λουτεολίνη ήταν ένας ισχυρός αναστολέας της δραστικότητας κινάσης Ser /Thr του GAK

in vitro

. Η συγχορήγηση του luteolin και gefitinib σε κύτταρα PC-3 είχε μεγαλύτερη επίδραση στην κυτταρική βιωσιμότητα από χορήγηση είτε μόνος ένωση? Αυτή η μείωση της βιωσιμότητας συνδέθηκε με δραστική τα κάτω ρύθμιση έκφρασης πρωτεΐνης GAK. Μια ολοκληρωμένη ανάλυση της σειράς microRNA αποκάλυψε αυξημένη έκφραση του miR-630 και miR-5703 μετά τη θεραπεία του PC 3-κυττάρων με luteolin ή /και gefitinib, και εξωγενείς υπερέκφραση του miR-630 προκαλείται διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων αυτών. ΓΑΚ φαίνεται να είναι απαραίτητη για τον κυτταρικό θάνατο, επειδή η συγχορήγηση του gefitinib και luteolin στα κύτταρα οστεοσαρκώματος U2OS EGFR ανεπάρκεια είχαν επίσης μεγαλύτερη επίδραση στην κυτταρική βιωσιμότητα από τη χορήγηση κάθε ένωση μόνη της. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι ΓΑΚ μπορεί να είναι ένα νέο θεραπευτικό στόχο για τον καρκίνο του προστάτη και οστεοσαρκώματος

Παράθεση:. Sakurai MA, Ozaki Υ, Okuzaki D, Naito Υ, Sasakura Τ, Okamoto A, et al. (2014) Gefitinib και Luteolin Αιτία Ανάπτυξη Σύλληψη του Ανθρώπου του καρκίνου του προστάτη PC-3 κύτταρα μέσω αναστολής της κυκλίνης G-Associated κινάσης και επαγωγή του miR-630. PLoS ONE 9 (6): e100124. doi: 10.1371 /journal.pone.0100124

Επιμέλεια: Ichiro Aoki, Yokohama City University School of Medicine, Ιαπωνία

Ελήφθη: 20 του Φεβρουαρίου του 2014? Αποδεκτές: 21 Μάη 2014? Δημοσιεύθηκε: 27 Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Sakurai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα S (Νο 15101006), Επιστημονική Έρευνα Β (Νο 20370081 και 23370086), και αναγνωριστικής έρευνας (Νο 21651085) με HN? και Επιστημονικής Έρευνας C (Νο 22570185) στη Νέα Υόρκη από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι ένα από τα πιο συχνά διαγιγνώσκονται καρκίνοι και είναι η κύρια αιτία της ανδρικής θανάτων από καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1]. Επειδή οδηγείται κυρίως από υποδοχέα ανδρογόνων (AR) σηματοδότησης, προχωρημένο καρκίνο του προστάτη συνήθως αντιμετωπίζεται με θεραπεία στέρησης ανδρογόνων, στην οποία χειρουργικό ή ιατρικό ευνουχισμό γίνεται για να εμποδίσει ενεργό AR σηματοδότησης είτε με την εξάλειψη του συνδετήρα ή επηρεάζουν άμεσα τον υποδοχέα [2] . Αν και αποτελεσματική, ανδρογόνων ελέγχει μεταστατικό καρκίνο του προστάτη για λίγα μόνο χρόνια και σχεδόν όλοι οι ασθενείς αναπτύσσουν προοδευτική ορμόνη-ανθεκτικό καρκίνο προστάτη (HRPC). θεραπεία στέρησης ανδρογόνων δεν είναι θεραπευτική για αυτούς τους ασθενείς, ακόμη και όταν συνδυάζεται με πιο αποτελεσματικές θεραπείες που στοχεύουν το κεντρικό σύνθεση της τεστοστερόνης, όπως η αμπιρατερόνη αναστολέα CYP17A1 και ανταγωνιστή AR MDV3100 [3], [4]. Ταυτοποίηση ενός νέου στόχου που ελέγχει AR σηματοδότησης έμμεσα, ή ακόμα και ένα στόχο που είναι άσχετη με σηματοδότηση AR, μπορεί να είναι χρήσιμη για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων για HRPC.

Το εκφράζεται παντού κυκλίνη G-συνδέονται κινάσης (ΓΑΚ) ρυθμίζει την εμπορία μεμβράνη κλαθρίνη μεσολάβηση δρώντας ως ουσιαστικό συμπαράγοντας για Hsc70 εξαρτώμενη απόδυση του κλαθρίνη επικαλυμμένα κυστίδια στο κυτταρόπλασμα [5], [6]. GAK είναι επίσης εντοπισμένη στον πυρήνα [7], όπου δρα ως μεταγραφικός συνενεργοποιητή του ΑΕ. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η έκφραση GAK αυξάνεται σημαντικά σε κύτταρα HRPC [8]. Επιπλέον, GAK παίζει ρόλο στη διατήρηση της σωστής κεντροσωμάτων ωρίμανσης και μιτωτική congression χρωμόσωμα, και siRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν των ΓΑΚ ενεργοποιεί το σημείο ελέγχου ατράκτου συναρμολόγησης, το οποίο ανιχνεύει προεξείχε, ευθυγραμμισμένα ή ασυνήθιστα συμπυκνωμένο χρωμοσώματα, οδηγώντας σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη μετάφαση [9]. GAK είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των κυττάρων από το GAK knockout (GAK

– /-) ποντίκια είναι εμβρυϊκά θανατηφόρα [10] και ποντικού εμβρυϊκών ινοβλαστών (MEF) που προέρχεται από GAK

– /- ποντίκια αποτυγχάνουν να διαιρέσει και τελικά γηράσκουν [ ,,,0],11] λόγω της διακοπής του κλαθρίνη ενδοκυττάρωση. Ωστόσο, στο παρελθόν έδειξαν ότι knockout ποντίκια που εκφράζουν την κινάση-νεκρή μορφή GAK (GAK-kd) δεν ήταν εμβρυϊκά θανατηφόρες και GAK-κδ ΠΜΑ αναπτύχθηκαν φυσιολογικά [12], υποδηλώνοντας ότι η απώλεια της δράσης της κινάσης GAK μπορεί να μην είναι θανατηφόρος σε φυσιολογικά κύτταρα που εκφράζουν τη σωστή ποσότητα των ΓΑΚ. Αυτή η απόδειξη προτείνει ότι ένας αναστολέας της δραστηριότητας κινάσης GAK θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη μιας νέας θεραπείας μοριακό στόχο που αναστέλλει επιλεκτικά την ανάπτυξη των κυττάρων HRPC με ενισχυμένη έκφραση GAK με έλεγχο σηματοδότησης AR έμμεσα.

Gefitinib [13], ένας αναστολέας τυροσινικής κινάσης επιλεκτικός για τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), αναστέλλει επίσης τη δράση της κινάσης της GAK [14]. Αν και EGFR [15] και GAK [8] εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα σε καρκίνο του προστάτη και την ενισχυμένη έκφραση τους συσχετίζεται με κακή πρόγνωση [8], [15], τη χορήγηση μόνο gefitinib είναι αναποτελεσματική [16] και συνδυασμένη χορήγηση του gefitinib και ακτινοθεραπεία [17] ή ντοσεταξέλη [18] έχουν περιορισμένες θεραπευτικές επιδράσεις. Luteolin, ένα κοινό διαιτητική φλαβονοειδές που βρίσκεται σε μια μεγάλη ποικιλία φυτών και των τροφίμων [19], είναι ένα άλλο ανταγωνιστής του EGFR σχετίζεται με κινάσες τυροσίνης πρωτεΐνης. Παρόμοια με gefitinib, λουτεολίνη προκαλεί την ανάπτυξη σύλληψη του PC-3 ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κύτταρα μέσω ρύθμισης των ρυθμιστικών γονιδίων του κυτταρικού κύκλου [20]. Luteolin αναστέλλει επίσης τοποϊσομεράσες του DNA, τα κλινικά στόχους των αντικαρκινικών φαρμάκων [21]. Ως εκ τούτου, λουτεολίνη μπορεί να είναι χρήσιμο ως αντικαρκινικό φάρμακο, αν και του

bona fide

στόχου (ες) και οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων παραμένουν ασαφείς λόγω της ευρύ φάσμα της φαρμακολογικές ιδιότητες.

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει ένα νέο παράγοντα που ελέγχει AR σηματοδότησης έμμεσα σε ασθενείς HRPC, και να εξετάσει κατά πόσον ΓΑΚ θα μπορούσαν να έχουν ως στόχο για την θεραπεία της όχι μόνο HRPC, αλλά και άλλες μορφές καρκίνου με αυξημένη έκφραση ΓΑΚ. Πράγματι, εμείς εδώ αναφέρουν ότι μια αύξηση στην έκφραση του GAK σε ασθενείς HRPC συσχετίζεται θετικά με το σκορ Gleason, ένα μέτρο της σοβαρότητας της νόσου. Τόσο GAK και AR εντοπισμένη στους πυρήνες των καρκινικών κυττάρων σε χειρουργικά δείγματα GAK-θετική. Ένα

in vitro δοκιμασία κινάσης

αποκάλυψε ότι luteolin και gefitinib αναστέλλουν τη δράση της κινάσης του GAK με παρόμοια ισχύ, γεγονός που υποδηλώνει τη χρησιμότητά τους ως αναστολέων της δραστηριότητας κινάσης GAK του. Σε σύγκριση με τα αποτελέσματα είτε του φαρμάκου και μόνο, η συγχορήγηση του luteolin και gefitinib σε PC-3 κύτταρα είχε μεγαλύτερη ανασταλτική επίδραση στην βιωσιμότητα των κυττάρων. Αυτές οι ενώσεις είχαν επίσης μια αθροιστική ανασταλτική επίδραση στην έκφραση πρωτεΐνης GAK που ήταν ανεξάρτητη από την υποβάθμιση πρωτεασώματος μεσολάβηση. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ υποδεικνύουν ότι GAK, η οποία υπερεκφράζεται σε πολλά καρκινικά κύτταρα, είναι ένα νέο υποψήφιο για υπόσχεται στοχευμένη χημειοθεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα και siRNAs

Αντισώματα έναντι των ακόλουθων πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη: AR (Santa Cruz Biotechnology), δραστική κασπάση 3 (Cell Signaling Technology), Ki67 (DakoCytomation), Lefty (Abcam), λαμίνη A /C (Bethyl Laboratories), EGFR ( κουνέλι? Cell Signaling Technology), EGFR (ποντικού? Millipore), ERK1 /2 (Cell Signaling Technology), pERK (Cell Signaling Technology), GAPDH (Fitzgerald) και α-τουμπουλίνης (Sigma-Aldrich). Τα μονοκλωνικά αντισώματα αντι-GAK παρασκευάστηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [7]. Οι Lefty1 ειδικά siRNAs αγοράστηκαν από ΟηΟεηε Τεχνολογίες και Gene Σχεδιασμός

Χημικά και διαιτητικά συμπληρώματα

Οι παρακάτω χημικές ουσίες και συμπληρώματα διατροφής χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη:. Gefitinib (Tocris Bioscience), ερλοτινίμπη ( Kemprotec), SB203580 (LC Laboratories), LutiMax (CalComp Nutrition), Oryza λουτεολίνη (Oryza Oil & amp? Fat Chemical), λουτεολίνη (Sigma-Aldrich), ρεσβερατρόλη (Sigma-Aldrich), και DMSO (Sigma-Aldrich)

καλλιέργειας κυττάρων

κυττάρων

το PC-3 που παρέχεται από την ιαπωνική Cancer Research Τράπεζα Πόρων. Όλα τα άλλα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS, Hyclone Laboratories), 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. WT (GAK-kd

+ /+) και GAK-kd

– /- MEFs διατηρήθηκαν σε MEF μέσο (μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco συμπληρωμένο με 10% FBS, πενικιλίνη, στρεπτομυκίνη, και 50 mM 2-μερκαπτοαιθανόλη) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22].

EGF διέγερση

Μετά από δύο πλύσεις σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS), ΠΜΑ καλλιεργήθηκαν σε MEF μέσο χαμηλού ορού (που περιέχει 0,5% FBS) επί 12 h. Mouse EGF (Sigma) προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας σε τελική συγκέντρωση 10 ng /ml (για ανάλυση Western blot) ή 100 ng /ml (για ανοσοφθορισμό), και τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C για τους ενδεικνυόμενους χρόνους.

FACS ανάλυση

τα κύτταρα χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ αντιδραστηρίου Cycletest Plus DNA (BD Bioscience), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα όργανο FACS Calibur με λογισμικό CellQuest (BD Bioscience).

καμπύλη Growth ανάλυση

Περίπου 1,0 × 10

3 PC-3 κύτταρα σπάρθηκαν σε 3,5 εκ Petri πιάτο και επωάστηκαν στους 37 ° C όλη τη νύκτα. Το gefitinib, λουτεολίνη, και ρεσβερατρόλη στη συνέχεια διαλύθηκαν σε DMSO και προστέθηκαν στο μέσο καλλιέργειας στο χρόνο μηδέν.

Μέτρηση

Κυτταρική βιωσιμότητα χρησιμοποιώντας miR-630

Η έκφραση του miR-630 από την miRNASelect μύλο φορέα έκφρασης HSA-mir-630 διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Cell Biolabs). Για να προσδιοριστεί η βιωσιμότητα, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο και στη συνέχεια επεξεργασία με θρυψίνη στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. Οι αριθμοί των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας έναν μετρητή κυττάρων Countess Automated (Invitrogen).

Η ιστολογική ανάλυση

Χειρουργικά δείγματα από ασθενείς που υποβάλλονται σε ριζική προστατεκτομή σταθεροποιήθηκαν σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη, εγκλείστηκαν σε παραφίνη, και στη συνέχεια κόβονται σε 4 μm πάχους σειριακές τομές. Οι πρώτες τομές βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη και χρησιμοποιούνται για παθολογική διάγνωση του φλεγμονώδους περιοχής. Τα υπόλοιπα τρία τμήματα υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Εν συντομία, οι τομές απαλλάχθηκαν από την παραφίνη σε αυτόκλειστο σε 0.1 Μ ρυθμιστικό κιτρικού, αποκλείστηκαν με αλβουμίνη βόειου ορού, και στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα σε PBS που περιείχε 2% λευκωματίνη βόειου ορού. Δευτεροβάθμια επωάσεις αντισώματος και αντιδράσεις ενίσχυση σήματος πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το απλό κιτ Stain Histofine (Nichirei) και το χρώμα αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας aminoethlcarbazole (AEC Επιπτώσεων? Vector Laboratories). Οι τομές με αιματοξυλίνη για την πυρηνική απεικόνιση και στη συνέχεια να τοποθετηθεί χρησιμοποιώντας Ultramount Υδατικό Μόνιμη Τοποθέτηση Medium (Dako). Οι εικόνες καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο (BX51? Της Olympus) εξοπλισμένο με μια κάμερα CCD (DP72? Της Olympus).

Western ανάλυση κηλίδος

Για την παρασκευή προϊόντων λύσης ολικού κυττάρου, τα κύτταρα λύθηκαν στους 4 ° C για 30 λεπτά σε τροποποιημένο ρυθμιστικό διάλυμα ΚΙΡΑ (10 mM Tris-HCl ρΗ 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% ΝΡ-40, 1 mM διθειοθρεϊτόλη, 0,1% SDS, και 0.1% δεοξυχολικό) εμπλουτισμένο με αναστολέα πρωτεάσης 1% κοκτέιλ (Sigma-Aldrich), 1 mM NaF, 1 mM Na

3νο

4, και 10 mM β-γλυκεροφωσφορικό. Μετά από φυγοκέντρηση, τα διαυγασμένα λύματα υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE. Οι επιλυθεί πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF, οι οποίες είχαν μπλοκαριστεί και στη συνέχεια ανοσοστυπώθηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα σε Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα και Tween 20 που περιέχει 5% άπαχο γάλα. Οι ανοσοαντιδραστικές πρωτεϊνικές ζώνες έγιναν ορατές με τη χρήση αντιδραστηρίων Western Lightning Plus ECL (PerkinElmer).

Καθαρισμός των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών

Καθαρισμός της GST-tagged πρωτεΐνες για δοκιμασίες κινάσης διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Εν συντομία,

Ε. coli

κύτταρα BL21 μετασχηματισμένο με το πλασμίδιο pGEX επωάστηκαν σε ζωμό Luria-Bertani σε 37 ° C έως ότου έφτασαν σε απορρόφηση 0.4-0.8 στα 600 nm. Η έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης κάθε προκλήθηκε με ολονύκτια έκθεση των κυττάρων σε 0.5 mM IPTG σε 20 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν και λύθηκαν με κατεργασία με υπερήχους σε PBS που περιείχε 1% Triton Χ-100, 1 μg /ml λευπεπτίνη, 1 μg /ml απρωτινίνη, 1 μg /ml πεπστατίνη Α, 1 mM βενζαμιδίνη, 100 μg /ml φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο, 1 mM NaF και 1 mM Na

3νο

4. Μετά τη φυγοκέντρηση, το διαυγές κυτταρόλυμα προσροφήθηκε σε γλουταθειόνη Sepharose 4Β (Amersham Pharmacia Biotech), ξεπλύθηκαν με PBS, και στη συνέχεια εκλούεται με ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 10 mM ανηγμένη γλουταθειόνη (Nacalai Tesque).

In vitro

δοκιμασία κινάσης του GAK

In vitro

δοκιμασίες κινάσης πραγματοποιήθηκαν με χρήση GST-tagged ανθρώπινη AR (-150 μg /ml) ως το δείγμα δοκιμής και καθαρισμένη GST-tagged ανθρώπινη GAK (~ 100 μg /ml) ως κινάση δοκιμή. Ένα καθαρισμένο θραύσμα του υποτύπου B’γ3 του ποντικού ΡΡ2Α (B’γ? -10 Μg /ml) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος υπόστρωμα GAK, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Aurora Α κινάσης (~ 50 μg /ml) και /2 κινάσης Lats1 (~ 25 μg /ml? Παρουσία ή απουσία Mob1A (-50 μg /ml) ως ενεργοποιητής του) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος ένζυμα, και μια κινάση -dead (KD) μορφή της Aurora Α κινάσης (-50 μg /ml) χρησιμοποιήθηκε ως ένας αρνητικός έλεγχος για φωσφορυλίωση του AR. Οι κινάσες και οι πρωτεΐνες υπόστρωμα επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 30 ° C σε 10 μΐ ρυθμιστικού αντίδρασης (10 mM HEPES ρΗ 7.5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, 5 mM ΜηΟΙ

2, 1 mM DTT, 5 mM NaF, και 50 mM β-γλυκεροφωσφορικό) που περιείχε 5 μΜ ΑΤΡ και 10 μθί [γ-

32Ρ] ΑΤΡ (PerkinElmer). Όπου απαιτείται, gefitinib, erlotinib, SB203580, η ρεσβερατρόλη, και luteolin είχαν συμπεριληφθεί στις αναφερόμενες συγκεντρώσεις. Η αντίδραση σταμάτησε με την προσθήκη 4 ρυθμιστικού × Laemmli (0.4 Μ Tris-CI ρΗ 6,8, 8% SDS, 20% γλυκερόλη, 10% 2-μερκαπτοαιθανόλη και 0.2% μπλε βρωμοφαινόλης). Τα δείγματα αναλύθηκαν με βαθμίδα SDS-PAGE χρησιμοποιώντας μία συσκευή Multigel II Mini (Daiichi Pure Chemicals) και ανιχνεύθηκαν με αυτοραδιογραφία. Οι ποσότητες των πρωτεϊνών φορτώθηκε στο πήκτωμα παρακολουθήθηκαν με χρώση με Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad) ή SimplyBlue ™ SafeStain (Life Technologies).

Ανθρώπινο γονιδίωμα microarray ανάλυση

Microarray αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν όπως υβριδοποιήσεις μονόχρωμο χρησιμοποιώντας Agilent Σύνολο Ανθρώπινου Γονιδιώματος ολιγονουκλεοτιδίων μικροσυστοιχίες (4 × 44K? κωδικός προϊόντος: 4112F). Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα PC-3 24 ώρες μετά την αγωγή με DMSO, 60 μΜ λουτεολίνη, 60 μΜ gefitinib, ή 60 μΜ λουτεολίνη συν 60 μΜ gefitinib χρησιμοποιώντας ένα κιτ miRNeasy Mini σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Qiagen). Η ποιότητα του RNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το RNA 6000 Νανο LabChip Kit για την Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Το RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας AffinityScript ανάστροφης μεταγραφάσης (Agilent Technologies) και εκκινητές ολιγο-άΤ που περιέχει την αλληλουχία υποκινητή Τ7 RNA πολυμεράσης.

In vitro μεταγραφή

στη συνέχεια διεξήχθη χρησιμοποιώντας Τ7 RNA πολυμεράση και μία χαμηλή είσοδο Quick-Amp Labeling Kit (Agilent Technologies) για την επισήμανση των cRNAs με Cy3-CTP (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Καθαρισμένο Cy3-επισημασμένο cRNAs (1650 ng) υβριδοποιήθηκαν στους μικροσυστοιχίες. Ρούχων, σάρωση, και αναλύσεις γονίδιο διεξήχθησαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Agilent Technologies). Agilent λογισμικού Χαρακτηριστικό εκχύλισης (ν. 10.5.1) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της ποιότητας τόπου και την εξαγωγή στατιστικών στοιχείων ένταση χαρακτηριστικό. Η Πλατφόρμα Subio και Subio Βασικές Plug-in (v1.15? Subio Inc.) στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό των δειγμάτων φορές-αλλαγές, οι οποίες αναλύθηκαν από Φοιτητής ένα δείγμα του

t

-ΜΕΛΕΤΕΣ. Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών έχουν κατατεθεί στη βάση δεδομένων γονιδιακής έκφρασης Omnibus (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) με τον αριθμό πρόσβασης GSE53180.

Ανθρώπινο miRNA μικροσυστοιχιών ανάλυση

Η ανάλυση μικροσυστοιχιών miRNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Agilent SurePrint Ανθρωπίνων v18.0 συστοιχίες miRNA, τα οποία περιέχουν 20-40 διαθέτει στόχευση 1919 ανθρώπινη miRNAs καταχωρήθηκαν στην έκδοση 8.0 της βάσης δεδομένων Sanger (σχεδιασμός ID 025416). Δείγματα ολικού RNA (100 ng) χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή miRNA ανιχνευτές, σύμφωνα με το πρωτόκολλο Agilent (ν. 2.4). Εν συντομία, ολικό RNA αποφωσφορυλιώθηκε με εντερική αλκαλική φωσφατάση μόσχου, μετουσιωμένο με DMSO, και στη συνέχεια επισημαίνονται με Κυανίνη 3-pCp με την χρησιμοποίηση Τ4 RNA λιγκάσης και το miRNA Labeling Kit. Οι ανιχνευτές υβριδοποιήθηκαν συστοιχίες για 20 ώρες στους 55 ° C με περιστροφή με τη χρήση της Agilent miRNA Hybridization Kit. Διπλότυπα μικροσυστοιχίες διεξήχθησαν για PC-3 κύτταρα επεξεργασμένα με DMSO, λουτεολίνη, gefitinib, ή λουτεολίνη και gefitinib. Τα πλακίδια πλύθηκαν με Γονιδιακής Έκφρασης Wash Buffer 1 (Agilent) σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά και στη συνέχεια με Γονιδιακής Έκφρασης ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης 2 (Agilent) στους 37 ° C για περαιτέρω 5 λεπτά. Μετά τον υβριδισμό και την πλύση, τα πλακίδια σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σαρωτή Agilent (G2505C). Εικόνες εξήχθησαν χρησιμοποιώντας Agilent λογισμικού Χαρακτηριστικό εκχύλισης (ν. 10.7.3) και λογισμικού Agilent GeneSpring GX (v. 12.6). Το συνολικό σήμα γονιδίων από τα αρχεία δεδομένων GeneView (που εξάγεται με τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις στο Agilent λογισμικού Χαρακτηριστικό Extraction) χρησιμοποιήθηκε. Οι διαφορές στα επίπεδα έκφρασης miRNA ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το κατεργασμένο δείγμα DMSO PC-3 ως μάρτυρας. aFold-αλλαγές μεγαλύτερη από 2,0 και

P

-τιμές λιγότερο από 0.05 (Μαθητή

t-test

) θεωρήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών miRNA έχουν κατατεθεί στην έκφραση του γονιδίου της βάσης δεδομένων Omnibus υπό τον αριθμό ένταξης GSE53178.

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Ποσοτική RT-PCR αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός ΑΒΙ PRISM 7900 όργανο (PE Applied Biosystems) και Δοκιμασία-on-Demand ανιχνευτές TaqMan για Lefty1 (Hs00764128_s1), miR-630 (HSA-Mir-630), και miR-5703 (HSA-Mir-5703), σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή (Agilent Technologies).

η στατιστική ανάλυση

Οι μπάρες σφάλματος για όλα τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν SD από τη μέση.

P

-τιμές υπολογίστηκαν με τη χρήση του Student

t

-ΜΕΛΕΤΕΣ, εκτός αν ορίζεται διαφορετικά.

Ηθική

Ανθρώπινα δείγματα συλλέχθηκαν με βιοψία από τους προστάτες του ασθενείς με καρκίνο με σχετική κλινικά δεδομένα στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Κίνκι. Όλα τα πειράματα χρησιμοποιώντας ανθρώπινα δείγματα εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου της Οσάκα (Έγκριση # 326) και του Πανεπιστημίου Κίνκι (Έγκριση # 23-088)? επιτροπή δεοντολογίας μας δώσει απαλλαγή από την ανάγκη για συναίνεση. Χειρουργικά δείγματα από ασθενείς που υποβάλλονται σε ριζική προστατεκτομή στο Κίνκι Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο (Osaka, Japan) σταθεροποιήθηκαν σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη, ενσωματωμένο σε παραφίνη, και στη συνέχεια κόβονται σε 4 μm πάχους σειριακές τομές.

Αποτελέσματα

GAK εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων

Αν και GAK εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα σε φυσιολογικά κύτταρα όπως TIG-1, μπορούμε πρόσφατα αναφερθεί ότι ένα κλάσμα της πρωτεΐνης βρίσκεται επίσης στον πυρήνα [7 ]. Αξίζει να σημειωθεί ότι μια προηγούμενη μελέτη χρησιμοποιώντας ένα νεο-επικουρική ορμονοθεραπεία μικροσυστοιχιών ιστών έδειξε ότι η έκφραση GAK αυξάνει σημαντικά κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη σε ανδρογόνο ανεξαρτησία [8]. Για να καθοριστεί εάν η έκφραση GAK αυξάνεται στους πυρήνες των καρκινικών κυττάρων, ανοσοστυπώματα χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση των επιπέδων της πρωτεΐνης GAK σε κυτοπλασμική και πυρηνική κλάσματα διαφόρων καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη ορμόνη-insensitive (PC-3), GAK εκφράστηκε σε υψηλότερο επίπεδο από ό, τι στον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα? Αυτό το αποτέλεσμα επιβεβαιώθηκε με τη χρήση δύο διαφορετικών μονοκλωνικών αντισωμάτων (διαδρομές 3 και 4 στο Σχ. 1). Αν και η ποσότητα του GAK ήταν χαμηλή, οι πυρήνες των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του προστάτη ορμόνη ευαίσθητα (LNCaP) εξέφρασε επίσης GAK (διαδρομή 6 στο Σχ. 1). Επιπλέον, το συγκρότημα πυρηνική GAK μετανάστευσε γρηγορότερα από την κυτταροπλασματική ζώνη GAK, προτείνοντας ξεχωριστές τροποποιήσεις της πρωτεΐνης σε αυτά τα κυτταρικά διαμερίσματα. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης για MDA-ΜΒ231 και MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού, καθώς και του τραχήλου της μήτρας HeLaS3 καρκινικά κύτταρα (Σχ. 1). Αντίθετα, GAK ήταν παρούσα σε υψηλότερα επίπεδα στο κυτταροπλασματικό κλάσμα από το πυρηνικό κλάσμα του TIG-1 φυσιολογικών ινοβλαστών (Εικ. 1). Αξιοσημείωτα, ορμόνη-insensitive καρκινικά κύτταρα (PC-3 και ΜϋΑ-ΜΒ231) που εκφράζεται GAK σε υψηλότερα επίπεδα από ό, τι ορμόνη ευαίσθητα καρκινικά κύτταρα (LNCaP και MCF-7). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι GAK τροποποιείται και υπερεκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα, ιδιαίτερα μεταστατικά κύτταρα.

ανάλυση Western blot του GAK, λαμίνη A /C, και α-τουμπουλίνης (έλεγχος) στην κυτταροπλασματική (Cyt) και πυρηνική (Nuc) εκχυλίσματα από καρκίνο του προστάτη (PC-3 και LNCaP), ο καρκίνος του μαστού (MDA-ΜΒ231 και MCF-7) και κυτταρικές σειρές καρκίνου του τραχήλου της μήτρας (HeLaS3). Lamin A /C χρησιμοποιήθηκε σαν ένα πυρηνικό δείκτη. Χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικά αντισώματα αντι-GAK. Τα βέλη και αιχμές βελών δείχνουν τις ζώνες ΓΑΚ προσδιορίζονται κατά κύριο λόγο στα πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα, αντίστοιχα.

Η

Πυρηνική ΓΑΚ εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε χειρουργικά δείγματα από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη

Για να προσδιορίσετε εάν συμβεί πυρηνική υπερέκφραση του GAK

in vivo

, ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις των φυσιολογικών και καρκινικών χειρουργικά δείγματα από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη 42 διεξήχθησαν. Αν και GAK εκφράστηκε μόνο ασθενώς στους φυσιολογικούς ιστούς, η πρωτεΐνη εκφράστηκε σε υψηλά επίπεδα στους πυρήνες των καρκινικών κυττάρων (Σχ. 2Α-Ε). Ένα τεστ chi-τετράγωνο αποκάλυψε μια στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ των ΓΑΚ ανοσοχρώση και το σκορ Gleason (Πίνακας 1 και Πίνακας S1).

Α-Δ, αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ) χρώση (Α, Β) και αντι -GAK ανοσοχρώση (C, D) των αντιπροσωπευτικών ριζική προστατεκτομή τμημάτων των καρκινικών (A, C) και φυσιολογικά (Β, D) ιστών από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη (n = 42). μπαρ κλίμακας = 50 μm. Ε, μεγαλύτερη μεγέθυνση δύναμη του εγκιβωτισμένο περιοχή που εμφανίζεται στη γραμμή Γ Κλίμακα = 50 μm.

Η

Κατά τη διάρκεια ενεργοποίησης της σηματοδότησης AR συνδέεται με την εξέλιξη των ανδρογόνων που εξαρτώνται από τον προστάτη καρκίνων. Επειδή GAK αλληλεπιδρά με το AR

in vitro

[8], ανοσοχρώση χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί εάν GAK συνεντοπίζεται επίσης με το AR

in vivo

. Πυρηνικός εντοπισμός του GAK και το AR ανιχνεύθηκε στους πυρήνες των καρκινικών κυττάρων από όλες χειρουργικά δείγματα GAK-θετικό (n = 4 ασθενείς με Gleason στείλει ≤7 και n = 5 ασθενείς με βαθμολογία Gleason ≥8) (Εικ. S1) . Ωστόσο, παρά πυρηνικού εντοπισμού τους, άμεση φωσφορυλίωση του AR από ΓΑΚ δεν είχε εντοπιστεί από έναν

in vitro

δοκιμασία κινάσης (Εικ. S1E). Επιπλέον, σε τρία ανεξάρτητα δείγματα ασθενών, GAK και το AR δεν συνεντοπίζονται με Ki-67, ένα καρκινικό αντιγόνο που βρίσκεται κυρίως σε αναπτυσσόμενα κύτταρα και απουσιάζει σε κύτταρα σε ηρεμία (Εικ. S2). Αυτό το εύρημα υποδεικνύει ότι συνεντόπισης του GAK και το AR δεν σχετίζεται υποχρεωτικά με την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων.

Κυτταροπλασματικά GAK ρυθμίζει μονοπάτια σηματοδότησης EGFR μεσολάβηση

τα κάτω ρύθμιση του GAK μειώνει την τυροσινικής κινάσης δραστικότητα του EGFR και μεταβάλλει κατάντη μονοπατιών σηματοδότησης του [5]. Για να καθοριστεί εάν αυτή η ρύθμιση διαμεσολαβείται από την δραστικότητα κινάσης Ser /Thr του GAK, ερευνήσαμε την συμπεριφορά του EGFR σε GAK-κδ ΠΜΑ [12]. Μια ανάλυση ανοσοκηλίδος του άγριου τύπου (WT) και GAK-κδ ΠΜΑ αποκάλυψε την παρουσία δύο πρωτεϊνών EGFR και στα δύο δείγματα, το μεγαλύτερο από τα οποία ήταν κυρίαρχη σε GAK-κδ ΠΜΑ (Εικ. 3Α). Το μεγαλύτερο συγκρότημα εξαφανίστηκε μετά την επεξεργασία των κυττάρων με λ-φωσφατάση (Σχ. 3Β, στήλη 2), υποδηλώνοντας ότι αντιπροσώπευε μια φωσφορυλιωμένη μορφή του EGFR. Ο αναστολέας Tyr-φωσφατάσης Na

3νο

4, αλλά όχι το αναστολείς Ser /Thr φωσφατάση NaF, β-γλυκεροφωσφορικό, και το οκαδαϊκό οξύ, κατάργησε αυτήν την επίδραση του λ-φωσφατάσης, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα κατάλοιπα Tyr στην EGFR είναι ιδιοσυστατικώς φωσφορυλιωμένη σε GAK-κδ ΠΜΑ απουσία EGF ερεθίσματος (Σχ. 3Β). Ομοίως, όταν οι ΠΜΑ στερήθηκαν τον ορό για 11 ώρες, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με κυκλοεξιμίδιο για 1 ώρα για να αναστείλει νέα πρωτεϊνική σύνθεση, και στη συνέχεια διεγείρονται μέσω της προσθήκης EGF, φωσφορυλίωση του EGFR ήταν περισσότερο εμφανές στην ΠΜΑ GAK-κδ από WT MEFs (Σχ . 3C και 3D). Αξιοσημείωτα, ένα ακόμη μεγαλύτερο πρωτεΐνη EGFR ανιχνεύθηκε σε δύο WT και GAK-κδ ΠΜΑ 10 λεπτά μετά τη διέγερση EGF (Σχ. 3C και 3D), υποδηλώνοντας ότι EGF αύξησε τον αριθμό των φωσφορυλιωμένα υπολείμματα Tyr στην EGFR. Αυτό υπερ-φωσφορυλίωση επιτάχυνε την αποφωσφορυλίωση φωσφορυλιωμένης εξωκυτταρικό κινασών σήματος ρυθμίζεται 1/2 (pERK1 /2) (Σχ. 3C), τα οποία είναι κατάντη επενεργητές του EGFR, γεγονός που υποδηλώνει την πρόωρη μείωση της σηματοδότησης EGFR.

Α , ανάλυση Western blot της έκφρασης EGFR σε WT (GAK-kd

+ /+) και μεταλλαγμένου (GAK-kd

– /-) ΠΜΑ. Β, τα αποτελέσματα ενός αναστολέα Tyr-φωσφατάσης (50 mM Na

3νο

4) και αναστολείς φωσφατάσης Ser /Thr (50 mM NaF και 50 mM β-γλυκεροφωσφορικό, ή 2,5 μΜ οκαδαϊκό οξύ) επί της αναστολής της φωσφορυλίωση του EGFR με λ-φωσφατάση (λPPase? 200 U). Α, Β, τα βέλη δείχνουν την φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη EGFR. Αλφα-τουμπουλίνης (α-Tub) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (C, D) Ανάλυση κηλίδας Western των επιπέδων έκφρασης του EGFR και ERK1 /2 σε WT (+ /+) και GAK-kd (- /-) Οι MEF μετά από διέγερση EGF για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Κυκλοεξιμίδιο (50 μg /ml) προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας 1 ώρα πριν από την EGF (10 μg /ml) για την αναστολή της νέας πρωτεϊνικής σύνθεσης. Τα κλίση και οριζόντια βέλη υποδεικνύουν τις φωσφορυλιωμένες και υπερ-φωσφορυλιωμένη ζώνες EGFR, αντίστοιχα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. C, τα βέλη δείχνουν διαφορική έκφραση των φωσφορυλιωμένη ERK1 /2 στο WT και ΓΑΚ-κδ ΠΜΑ. D, NT, μη επεξεργασμένα. Ε, ανοσοχρώση της πρωτεΐνης EGFR σε WT (+ /+) και μεταλλαγμένου (- /-) Οι MEF σε επεξεργασία με ή χωρίς το MG132 αναστολέα πρωτεασώματος (50 μg /ml). Οι αξιοσημείωτες πάνελ περικυκλωμένη από τουρκουάζ και πράσινες γραμμές. F, οι αριθμοί των EGFR-θετικών κυττάρων σε WT και GAK-kd (Homo) κύτταρα παρουσία ή απουσία MG132. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM από η = 3 ανεξαρτήτων πειραμάτων σε κάθε χρονικό σημείο.

Η

Η ανοσοχρώση έδειξαν ότι τα επίπεδα του EGFR στο κυτταρόπλασμα του GAK-κδ ΠΜΑ ήταν χαμηλότερες από εκείνες της κυτταρόπλασμα των WT ΠΜΑ, γεγονός που υποδηλώνει ανώμαλη εσωτερικοποίηση του EGFR σε κύτταρα knockout (στήλη 2 πάνελ του Σχ. 3Ε). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν όταν το πείραμα επαναλήφθηκε με την παρουσία του MG132 αναστολέα πρωτεασώματος, που υποδηλώνει ότι η ανωμαλία δεν οφειλόταν στην αποδόμηση των πρωτεϊνών EGFR (στήλη 4 πάνελ του Σχ. 3Ε). Επιπλέον, ο αριθμός των EGFR-θετικών κυττάρων ήταν χαμηλότερη στην GAK-κδ ΠΜΑ από WT ΠΜΑ, και αυτό φαινότυπος ήταν επίσης ανεξάρτητος της αναστολής πρωτεασώματος (Σχ. 3F). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι συστατική υπερ-φωσφορυλίωση του EGFR που προκαλείται από την έλλειψη δραστηριότητας GAK παρεμποδίζει τον κατάλληλο εντοπισμό του υποδοχέα, οδηγώντας σε μειωμένη ενεργοποίηση του EGFR με τη μεσολάβηση σηματοδότηση ανάπτυξης. Τα αποτελέσματα που περιγράφονται παραπάνω είναι σύμφωνα με μια πρόσφατη έκθεση ότι η ΠΜΑ από ΓΑΚ ποντίκια knockout υπό όρους και ΓΑΚ νοκ ντάουν κύτταρα που παρασκευάζονται με τη χρήση μικρών RNAs φουρκέτα εμφανιστεί αλλαγμένη ενδοκυτταρική διακίνηση EGFR, υποβάλλονται σε διακοπή της ανάπτυξης, και μείωσαν pERK1 /2 σηματοδότησης [11]. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι η έλλειψη δραστηριότητας ΓΑΚ διαταράσσει τη σωστή ενεργοποίηση των μονοπατιών σηματοδότησης EGFR μεσολάβηση.

Luteolin και gefitinib αναστέλλουν τη δράση της κινάσης των ΓΑΚ

Το gefitinib αναστέλλει ΓΑΚ, το EGFR, και τον υποδοχέα που αλληλεπιδρά με κινάση σερίνης /θρεονίνης

in vitro

[14]. Για να καθοριστεί εάν gefitinib αναστέλλει τη δράση GAK άμεσα, ένα

in vitro δοκιμασία κινάσης

διεξήχθη χρησιμοποιώντας ΡΡ2Α B’γ, ένα γνωστό στόχο των GAK, ως υπόστρωμα [22]. Gefitinib ανέστειλε GAK αυτοφωσφορυλίωση και GAK μεσολάβηση φωσφορυλίωση του ΡΡ2Α B’γ με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, υποδεικνύοντας ότι το gefitinib αναστέλλει τη δράση της κινάσης GAK άμεσα (Σχ. 4Α). Οι επιδράσεις των άλλων αναστολέων κινάσης, όπως το γνωστό erlotinib αναστολέα EGFR [24] και του αναστολέα ρ38α και GAK SB203580 [25], για τη δραστηριότητα GAK εξετάστηκαν επίσης. Αμφότερες αυτές οι ενώσεις ανέστειλαν δραστικότητα GAK Ομοίως, αν και ήταν ελαφρώς λιγότερο ισχυρά από gefitinib (Σχ. 4Α).

In vitro δοκιμασίες κινάσης

χρησιμοποιήθηκαν επίσης για να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα του λουτεολίνη (ένα φλαβονοειδές) και ρεσβερατρόλη (μια πολυφαινόλη) στην δραστικότητα GAK? Αυτές οι ενώσεις αναστέλλουν την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη κυτταρικών γραμμών [20], [26]. Αξίζει να σημειωθεί, 10 μΜ luteolin αναστέλλει τη δράση ΓΑΚ δραστικά, ενώ η ίδια συγκέντρωση της ρεσβερατρόλης είχε μόνο μια μικρή ανασταλτική δράση (σχ. 4Β). Μια περαιτέρω ανάλυση αποκάλυψε ότι 2 μΜ λουτεολίνη όφειλε να αναστέλλουν δραστικότητα GAK (Εικ. 4C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι, εκτός από την gefitinib, erlotinib λουτεολίνη και είναι νέοι αναστολείς του GAK.

Α-Ο, αντιπροσωπευτική ανάλυση SDS-PAGE των πρωτεϊνών υποβλήθηκε σε

in vitro δοκιμασίες κινάσης

χρησιμοποιώντας

32Ρ-γΑΤΡ, GAK (-100 μg /ml) ως το ένζυμο, ΡΡ2Α B’γ (-10 μg /ml) ως υπόστρωμα, και τις δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του gefitinib, erlotinib, και SB203580 ως αναστολείς. Τα σήματα που ενσωματώνονται ανιχνεύτηκαν με αυτοραδιογραφία και οι ποσότητες των πρωτεϊνών που φορτώνονται αξιολογήθηκαν από Brilliant χρώση Coomassie Blue (CBB). Οι γραφικές παραστάσεις δείχνουν τις αναλογίες ένταση του φωσφορυλιωθεί ΡΡ2Α B’γ και GAK σε σχέση με εκείνη των μη-επεξεργασμένα δείγματα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM των n = 3 ανεξάρτητα πειράματα σε κάθε συγκέντρωση.

Η

Η συγχορήγηση του gefitinib και luteolin προκαλεί θάνατο του PC-3 κύτταρα

Στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση της συγχορήγησης του gefitinib και λουτεολίνη επί της ανάπτυξης PC-3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα. Χρησιμοποιήσαμε πρώτα γονιδιωματική αλληλούχιση του DNA για να εξετάσει για την παρουσία μεταλλάξεων στο γονίδιο EGFR σε κύτταρα PC-3 που αναφέρθηκαν προηγουμένως για να φιλοξενούνται συχνά από καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων [27]. Όπως φαίνεται στο Σχ. S3, βρήκαμε κανένα μεταλλάξεις σε τέτοιες θέσεις στο γονιδίωμα του PC-3, γεγονός που υποδηλώνει ότι μια χαμηλή συγκέντρωση του gefitinib (~ 1 μΜ) δεν μπορεί να είναι αποτελεσματική σε κύτταρα PC-3. Πράγματι, μια υψηλότερη συγκέντρωση του gefitinib (60 μΜ) που απαιτείται για να συλλάβουν την ανάπτυξη των PC-3 κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν οι αριθμοί των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων μετρήθηκαν μετά από έκθεση των κυττάρων σε 60 μΜ λουτεολίνη, 60 μΜ gefitinib, ή ένα συνδυασμό αυτών των φαρμάκων για 24, 48, ή 72 ώρες, βρήκαμε μια αθροιστική ανασταλτική δράση του gefitinib και luteolin επί κυτταρική ανάπτυξη (Σχ. 5Α). Κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) μόνο.