Αφηρημένο

Ένα ασφαλές και αποτελεσματικό φάρμακο, ο καρκίνος είναι αναγκαία λόγω του αυξανόμενου πληθυσμού των ασθενών με καρκίνο των οποίων οι συγκεκριμένες ασθένειες δεν μπορεί να θεραπευτεί από τη στιγμή διαθέσιμη θεραπεία. Αδενοϊό (Ad) φορείς αντιπροσωπεύουν μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική ιατρική για τη θεραπεία του ανθρώπινου καρκίνου. Ωστόσο, αρκετές βελτιώσεις ώστε για φορείς Ad να είναι αποτελεσματική θεραπευτικά του καρκίνου, οι οποίες περιλαμβάνουν, αλλά δεν περιορίζονται σε αυτά, τη βελτίωση της κυτταρικής πρόσληψης, αυξημένη δραστικότητα θανάτωσης των καρκινικών κυττάρων, και την ικανότητα της απεικόνισης φορέα και καταδίωξης μόλις εγχύεται ασθενών . Για το σκοπό αυτό, προσπαθήσαμε να αναπτύξουμε μια διαφήμιση ως ένα πολυλειτουργικό πλατφόρμα που ενσωματώνει στόχευση, απεικόνισης και θεραπευτικές μοτίβα. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τη χρησιμότητα αυτού του προτεινόμενου πλατφόρμας με τη δημιουργία ενός φορέα διαφημίσεων που περιέχει τις πολυ-λυσίνη (ΡΚ), τον ιό του απλού έρπητα τύπου 1 (HSV-1) θυμιδίνης κινάσης (ΤΚ), και το μονομερούς κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη ( mRFP1) ως στόχευση, θανάτωση των καρκινικών κυττάρων, και μοτίβα απεικόνιση, αντίστοιχα. Η μελέτη μας εδώ καταδεικνύει την δημιουργία του τριπλού ψηφιδωτό Ad φορέα με ρΚ, HSV-1 ΤΚ, και mRFP1 στα τέρματα καρβοξυλίου των Ad ελάσσονα πρωτεΐνη καψιδίου IX (ρΙΧ). Επιπλέον, οι λειτουργίες του ρΚ, HSV-1 ΤΚ, και πρωτεΐνες mRFP1 στον φορέα Ad διατηρήθηκαν όπως επιβεβαιώνεται από αντίστοιχες λειτουργικές δοκιμασίες, επισημαίνοντας τις δυνατότητες πολυλειτουργική εφαρμογή αυτού του νέου φορέα Ad για γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου. Η επικύρωση της τριπλής μωσαϊκό Ad φορείς ισχυρίζεται επίσης για την ικανότητα της ρΙΧ τροποποίηση ως βάση για την ανάπτυξη του πολυλειτουργικού Ad φορείς

Παράθεση:. Tang Υ, Wu Η, Ugai Η, Matthews QL, Curiel DT ( 2009) Παραγωγή μιας Triple Mosaic αδενοϊό για Cancer Gene Therapy. PLoS ONE 4 (12): e8526. doi: 10.1371 /journal.pone.0008526

Επιμέλεια: Maciej Lesniak, Το Πανεπιστήμιο του Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 Οκτωβρίου 2009? Αποδεκτές: έβδομης Δεκεμβρίου 2009? Δημοσιεύθηκε: 31 Δεκεμβρίου, 2009

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της δήλωσης Creative Commons Public Domain που ορίζει ότι, μόλις τοποθετηθεί στο δημόσιο τομέα, το έργο αυτό μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο σκοπό

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το NIH επιχορήγησης 5R01CA111569 (Δρ DT Curiel) και επιχορήγηση Νεανικού διαβήτη Ίδρυμα Ερευνών 1-2005-71 (Δρ H. Wu). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος παραμένει η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου παγκοσμίως, και αντιπροσώπευε περίπου 7,9 εκατομμύρια θανάτους (το 13% όλων των θανάτων) το 2007, σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (WHO, «Οι κορυφαίες 10 αιτίες θανάτου») . Η γονιδιακή θεραπεία αντιπροσωπεύει ένα νέο παράδειγμα στη θεραπεία των ανθρώπινων ασθενειών από την εισαγωγή γενετικού υλικού σε κύτταρα ατόμου για θεραπευτικούς [1] σκοπούς. Μεταξύ όλων των μεθόδων θεραπείας για τον καρκίνο, η γονιδιακή θεραπεία αντιπροσωπεύει μία νέα μοριακή μέτρο που έχει τη δυνατότητα της αποτελεσματικότητας κατά των όγκων με εκλεκτικότητα και την ασφάλεια [2].

Μέχρι σήμερα, 65,2% του συνόλου των κλινικών δοκιμών γονιδιακής θεραπείας έχουν στοχεύσει καρκίνος [3]. Μεταξύ ενός αριθμού στρατηγικές γονιδιακής θεραπείας του καρκίνου, ωστόσο, πολύ λίγοι από αυτούς έχουν δείξει μια ισχυρή θεραπευτική επίδραση σε ανθρώπους ασθενείς. Εκτός από την πολυπλοκότητα και ασάφεια της ογκογένεσης, άλλα εμπόδια που μπορεί να ευθύνεται για την αποτυχία πολλών εφαρμογές γονιδιακής θεραπείας του καρκίνου περιλαμβάνουν την χαμηλή αποτελεσματικότητα μεταγωγής των αντικαρκινικών παραγόντων και την ανικανότητα να μεταγάγει το σύνολο του πληθυσμού των κυττάρων του όγκου? η κακή επιλεκτικότητα και η έλλειψη μακροχρόνιας διάρκειας αντικαρκινικών παραγόντων σε όγκους με αποτέλεσμα την κακή θεραπευτική αποτελεσματικότητα, καθώς και θέματα ασφάλειας. Η έννοια της στόχευσης καρκινικών κυττάρων διευθύνσεις αυτών των εμποδίων και μπορεί να αντιπροσωπεύει μια σημαντική βελτίωση στην ανάπτυξη της γονιδιακής θεραπείας ως μια θεραπευτική αντι-καρκίνου. Δεδομένου αποτελεσματική στόχευση, αυτό αντικαρκινικός παράγοντας μπορεί να μην επιτευχθεί μόνο εξαιρετικά επιλεκτική και ειδική εκτελέσεις των καρκινικών κυττάρων, αλλά επίσης να αποφύγει την πρόσληψη από τα φυσιολογικά κύτταρα και την επακόλουθη τοξικότητα. Ένα

in vivo

απεικόνισης τροπικότητα, η οποία παρέχει ένα μέσο για τη μελέτη της κατανομής (π.χ. συσσώρευση, διάδοση, διατήρηση, κλπ) των θεραπευτικών κατά του καρκίνου, μπορεί να αντιμετωπίσει βασικά ζητήματα που είναι θεμελιώδη για το σχεδιασμό και τη δοκιμή νέων αντικαρκινικών θεραπειών, ειδικά για αντιγραφόμενης θεραπευτικά βασίζεται σε ιό [4] – [7]. Για να συνδυάζουν αυτές τις λειτουργικότητες, και σε μια προσπάθεια να δημιουργήσουν περισσότερο ισχυρή και αξιόπιστη θεραπευτικά αντικαρκινικά, επιχειρήσαμε να δημιουργήσει ένα πολυλειτουργικό αδενοϊικό (Ad) φορέας για την ανίχνευση και θεραπεία του καρκίνου. Αυτό Ad ενσωματώνει στόχευση, απεικόνισης και θεραπευτικές μεθόδους του καρκίνου.

Ad είναι ένα από τα συνηθέστερα χρησιμοποιούμενα ιικών φορέων σε πολυάριθμες κλινικές δοκιμές γονιδιακής θεραπείας του καρκίνου [3]. Σε αυτές τις μελέτες, η χρήση αδενοϊικών φορέων πρώτης ή δεύτερης γενιάς κατέδειξε θεραπευτική έκφραση διαγονιδίου, αλλά η συνολική κλινική αποτελεσματικότητα έχει φτωχή λόγω των προαναφερόμενων περιορισμών. Για να ξεπεραστούν οι περιορισμοί, πολλές προσπάθειες έχουν επικεντρωθεί στην τροποποίηση της καψίδιο Ad σε ατομική βάση τον τύπο του καρκίνου. Για παράδειγμα, η τροποποίηση του καψιδίου διαφήμισης με στόχευση συνδέτες που κατευθύνονται εναντίον αντιγόνων όγκου ενισχύθηκε μεταγωγής Ad σε καρκινικά κύτταρα

in vitro

και

in vivo

[8], [9]. Άλλες προσπάθειες με στόχο την οπτικοποίηση διαφημίσεων και παρακολούθηση οδήγησε σε επισήμανση του καψιδίου διαφήμισης με βιοφωταύγεια ή φθορισμού. Η στρατηγική αυτή επέτρεψε δυναμική και άμεση παρακολούθηση της φυσικής θέσης και την αντιγραφή ιικών σωματιδίων

in vivo

[4], [10], [11]. Επιπλέον, η ενσωμάτωση του ιού του απλού έρπητα τύπου 1 (HSV-1) κινάσης θυμιδίνης (ΤΚ) επί της επιφανείας καψιδίου Ad επέτρεψε την άμεση λειτουργική εφαρμογή αυτής της πρωτεΐνης σε γονίδιο αυτοκτονίας θεραπεία και microPET απεικόνισης [12].

εργαστήριο μας και άλλοι έχουν επικυρώσει την ελαστικοί ρόλος του Ad τύπος 5 ελάσσονα πρωτεΐνη καψιδίου IX (ρΙΧ) για την ενσωμάτωση και λειτουργική απεικόνιση των ετερόλογων πολυπεπτιδίων και πρωτεϊνών, όπως πολυ-λυσίνη (ρΚ) [13], πράσινο και κόκκινο πρωτεΐνες φθορισμός (GFP και RFP) [4], [10], [11], ή HSV-1 ΤΚ [12], [14]. Έχουμε αποδείξει περαιτέρω τη δυνατότητα δημιουργίας ενός τριπλού μωσαϊκό διαφήμισης παρουσιάζοντας τρία διαφορετικά ετερόλογη επιτόπων σε ρΙΧ περιοχές σε ένα μόνο φορέα διαφήμισης χρησιμοποιώντας γενετικές ή μη γενετικές τροποποιήσεις [15]. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε ρΙΧ για να εμφανιστεί τρεις λειτουργικούς επίτοπους – ΡΚ (για στόχευση), μονομερή RFP (mRFP1) (για απεικόνιση), και HSV-1 ΤΚ (για θεραπευτικούς) σε έναν μόνο φορέα Ad στην προσπάθεια μας να παράγει πολυλειτουργικού Ad φορείς.

Υλικά και Μέθοδοι

αντισώματα

Η ρΙΧ-ειδικό αντίσωμα ήταν ένα είδος δώρο από τον Δρ Ι Dmitriev (Gene Therapy Center, το Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ) . Το αντίσωμα αντι-ΤΚ πολυκλωνικό κουνελιού ήταν ένα είδος δώρο από τον Dr. J. Μ Mathis (Gene Therapy Program, Τμήμα Κυτταρικής Βιολογίας και Ανατομία, LSU Επιστημών Υγείας). Το αντι-His

6 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αγοράστηκε από Qiagen (Valencia, CA). Το πολυκλωνικό κατσίκα αντι-Ηίδ

6 αντίσωμα αγοράστηκε από την Abcam (Cambridge, ΜΑ.). Το μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-Flag Μ2 και το αντίσωμα αντι-c-myc κουνελιού πολυκλωνικό αγοράστηκαν από τη Sigma (St. Louis, ΜΟ.). Το αντίσωμα αντι-RFP πολυκλωνικό κουνελιού αγοράστηκε από την Chemicon (Temecula, CA). Η υπεροξειδάση χράνου (HRP) αντι-ποντικού κατσίκας και κατσίκας αντι-κουνελιού δευτερογενή αντισώματα, αλκαλική φωσφατάση (ΑΡ) συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού, δευτερογενή αντισώματα κατσίκας αντι-κουνελιού, και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας (ΕΜ) βαθμού 18 nm κολλοειδούς χρυσοχοΐα αντίσωμα αντι-κατσίκας συζευγμένο γαϊδάρου αγοράστηκαν από Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. (West Grove, ΡΑ.). Βαθμός EM 10 nm χρυσού-συζευγμένο γαϊδάρου αντι-ποντικού, και ΕΜ βαθμός 25 nm χρυσού-συζευγμένο γαϊδάρου αντι-κουνελιού δευτερογενή αντισώματα αγοράστηκαν από Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Science (EMS, Ft. Washington, ΡΑ.).

Cells

Τα ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα (293), κύτταρα ανθρώπινου καρκινώματος πνεύμονα (Α549), και καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου μαστού (AU-565) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA.). Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 υγροποιημένο επωαστήρα. Τα κύτταρα AU-565 καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (2 mM L-γλουταμίνη, 10 mM HEPES, πυροσταφυλικό 1 mM νάτριο, 4,5 g /L γλυκόζη, 1.5 g /L διττανθρακικό νάτριο, 100 μονάδες /ml πενικιλλίνης, 100 μg /ml στρεπτομυκίνης, 10% εμβρυϊκό βόειο ορό). Όλες οι άλλες κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο Eagle Medium-Ham F12 κατά Dulbecco (50/50) μέσο (Sigma) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (HighClone, Logan, Utah), 2 mM L-γλουταμίνη, 100 μονάδες /ml πενικιλλίνης, 100 μg /ml στρεπτομυκίνης.

Κατασκευή ανασυνδυασμένων πλασμιδίων

Δημιουργία πλασμιδίων μεταφοράς. Όλα τα πατρικά πλασμίδια αποκτήθηκαν από εμπορικές πηγές ή έχουν χαρακτηριστεί προηγουμένως: pShlpIXNhe [13], pShuttle-IX-mRFP1 [4], pShuttle-IX-flag-sr39tk [12], pShuttle-CMV και pAdEasy-1 (Stratagene, La Jolla, CA). Τα πλασμίδια μεταφοράς κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας περιορισμού και PCR κλωνοποίηση ως εξής. pShldpIX = pShlpIXNhe /BglII /NheI /αμβλύ /SL (self απολίνωση)? Το προϊόν PCR (pcrIXpK) που περιέχει την κωδικοποιητική αλληλουχία της πρωτεΐνης σύντηξης ρΙΧ-ΡΚ δημιουργήθηκε με χρήση pShlpIXNhe ως εκμαγείο και εκκινητές 5′-GGGGTACCGGGCGTGGTTAAGGGTG και 5′-GGGGTACCTTTATTTATGTTCTTGTCATCGTCATCCTTATAATC? pShlpIXflagpK = pShldpIX /Κρη + pcrIXpK /Κρη. Το προϊόν PCR (pcrH6TK) που περιέχει την αλληλουχία κωδικοποίησης του Η6-sr39tk πρωτεΐνη δημιουργήθηκε με χρήση pShuttle-IX-flag-sr39tk ως εκμαγείο και εκκινητές 5′-CTAGCTAGCCACCATCACCATCACCAT CTAGCCGGATCCGGTTC και 5′-CTAGCTAGCTCAATTAGCCTCCCCCATC? pShlpIXH6TK = pShlpIXNhe /NheI + pcrH6TK /NheI. Το προϊόν PCR (pcrMycmRFP1) που περιέχει την κωδικοποιητική αλληλουχία του c-myc-mRFP1 πρωτεΐνη δημιουργήθηκε με χρήση pShuttle-IX-mRFP1 ως εκμαγείο και εκκινητές 5′- CTAGCTAGCGGCGG AGGGAGCGAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAAGATCTGGGAAGCGCCTCCTCCGAGGACGTCAT και 5′- CTAGCTAGCTTAGGCGCCGGTGGAGTG? pShlpIXmycmRFP1 = pShlpIXNhe /NheI + pcrMycmRFP1 /NheI. Όλοι οι κλώνοι επαληθεύτηκαν με πέψη περιορισμού και αλληλούχιση.

Δημιουργία ρΙΧ-τροποποιημένο αδενοϊικό γονιδιώματα με ομόλογο ανασυνδυασμό σε

Escherichia coli

[16]. Η σαΐτα φορείς pShlpIXflagpK, pShlpIXH6TK, και pShlpIXmycmRFP1 γραμμικοποιήθηκαν με περιοριστικό ένζυμο PmeI και ενσωματωθεί με ομόλογο ανασυνδυασμό pAdEasy-1 σε ηλεκτροϊκανά BJ5183-AD1 (Stratagene, La Jolla, CA). Το παραγόμενο αδενοϊικό γονιδίωμα περιέχει IX-ΡΚ, IX-sr39tk, ή IX-mRFP1 τροποποιημένο γονίδιο ρΙΧ στην διαγραφή Ε1 περιοχή. Οι δομές των προκυπτόντων πλασμιδίων Ad pAdpIXflagpK, pAdpIXH6TK και pAdpIXmycmRFP1 επιβεβαιώθηκαν με πέψη περιορισμού και αλληλούχιση.

Η

Virus διάσωσης, Πολλαπλασιασμός και Καθαρισμός

pAdpIXflagpK, pAdpIXH6TK, και πλασμίδια pAdpIXmycmRFP1 ευθυγραμμίστηκαν με ένζυμο περιορισμού PacI και επιμολύνονται σε κύτταρα 293 αυξάνονται σε 25-cm

2 φιαλίδια χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Τα κύτταρα συλλέχθηκαν όταν παρατηρήθηκε εμφανής κυτοπαθικό αποτέλεσμα (CPE) που ακολουθείται από διάσπαση χρησιμοποιώντας τέσσερις κύκλους κατάψυξης και απόψυξης. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στις 3000 χ g για 5 λεπτά στους 4 ° C για απομάκρυνση κυτταρικών υπολειμμάτων. Οι ιοί απελευθερώνονται στο υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για περαιτέρω αναπαραγωγή μέχρι μία επαρκής ποσότητα 293 κυττάρων μολύνθηκαν (δέκα 175-cm

2 φιάλες). Το Ad σε μολυσμένα κύτταρα καθαρίστηκαν ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Εν συντομία, τα κύτταρα λύθηκαν με τέσσερις κύκλους ψύξης και απόψυξης και φυγοκεντρήθηκαν στα 3800 χ g για 30 λεπτά στους 4 ° C για απομάκρυνση κυτταρικών υπολειμμάτων. Τα κυτταρικά εκχυλίσματα που περιέχουν τους ιούς φορτώθηκαν στην κορυφή του μια σταδιακή βαθμίδα 1,33 /1,45 ΟδΟΙ και φυγοκεντρήθηκε στα 55,000 χ g για 3 ώρες στους 4 ° C. Η κατώτερη ζώνη, που περιέχει σωματίδια μολυσματικού ιού, επανα-φυγοκεντρείται σε ένα άλλο 1.33 /1.45 βήμα κλίση CsCl στα 100.000 χ g επί μία νύκτα στους 4 ° C. Η προκύπτουσα ζώνη του αδενοϊούς συλλέχθηκε και υποβλήθηκε σε διαπίδυση τέσσερις φορές έναντι 500 ml φυσιολογικού ορού ρυθμισμένου με φωσφορικά (PBS) που περιέχει 10% γλυκερίνη, 2 ώρες κάθε φορά. Τα παραγόμενα Αγγελίες ορίστηκαν ως Ad-IX-σημαία-ΡΚ, Ad-IX-Η6-sr39tk, και Ad-IX-myc-mRFP1. Ιικού σωματιδίου (VP) τίτλοι προσδιορίστηκαν με φασματομετρία σε OD260 χρησιμοποιώντας τυποποιημένες διαδικασίες [17].

Δημιουργία Triple ρΙΧ-Τροποποιημένο διαφήμισης με συνυπάρχουσα λοίμωξη

Δέκα 175 cm

2 φιάλες των 293 κύτταρα μολύνθηκαν με Ad-IX-σημαία-ρΚ, Ad-IX-Η6-sr39tk, και Ad-IX-myc-mRFP1 σε ένα σύνολο ΜΟΙ 200-300 VP /κύτταρο. Τα μολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκαν για καθαρισμό Ad όπως περιγράφεται στο παραπάνω.

Protein Ηλεκτροφόρηση και στύπωμα Western

5 × 10

9 VP καθαρισμένου ιών έβρασαν σε ρυθμιστικό δείγματος Laemmli για 5 λεπτά και διαχωρίστηκαν σε 4 έως 15% δωδεκυλο κλίση νατρίου ηλεκτροφόρηση πηκτής θειικού-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE). Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν κατόπιν σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες, οι οποίες είχαν μπλοκαριστεί σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris που περιέχει 0.05% Tween-20 (ΤΒδ-Τ) που ακολουθείται από επώαση με πρωτογενή αντισώματα (ποντικού αντι-Flag, 1 :1000? κουνελιού αντι-ΤΚ, 1:500? αντι-RFP κουνέλι, 1:500). Μετά το πλύσιμο και την εκ νέου κλείδωμα, η μεμβράνη επωάστηκε με τα κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση της ραπανίδος (HRP) σε αραίωση 1:1000. Το σήμα HRP αναπτύχθηκε με ECL συν το σύστημα αποτύπωση ανίχνευσης Western (GE Healthcare, Little Chalfont, UK), και στη συνέχεια ανιχνεύονται με BioMax MR ταινίες επιστημονικής απεικόνισης (Kodak, Chalon-sur-Saone, Γαλλία) και έναν επεξεργαστή ιατρική ταινία SRX-101A (Konica, Tokyo, Japan).

ELISA

πρόσδεσης συνδεδεμένη με ένζυμο ανοσορροφητικές δοκιμασίες στερεάς φάσης (ELISA) διεξήχθησαν ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Εν συντομία, 10

9 VP ιών υποβλήθηκαν σε διαδοχική αραίωση (1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128) σε 100 μΐ 100 mM ανθρακικού ρυθμιστικού διαλύματος (ρΗ 9,5), και ακινητοποιείται εις τριπλούν σε μια πλάκα 96 φρεατίων (Nunc Maxisorp) με ολονύκτια επώαση στους 4 ° C. Μετά από 4 πλύσεις με ΤΒδ-Τ και τον αποκλεισμό με ΤΒδ-Τ που περιέχει 2% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA), οι ιοί ανιχνεύθηκαν με πρωτογενές αντίσωμα, και στη συνέχεια, ΑΡ-συζευγμένο δευτερεύον αντισώματα σε ΤΒδ-Τ που περιέχει 0.5% BSA σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες, με εκτεταμένες πλύσεις και αποκλεισμού στο μεταξύ.

φωσφορικού ρ-νιτροφαινυλίου

(Sigma) χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη χρώματος, όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή, και η απορρόφηση του φωτός (405 nm) ελήφθη από έναν αναγνώστη μικροπλάκας (PowerWave HT 340, BioTek, Winooski, VT.) Μετά από επώαση για 150 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.

Immunoelectron μικροσκοπία

Immunoelectron μικροσκοπία διεξήχθη ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Εν συντομία, οι ιοί προσκολλώνται σε πλέγματα νικελίου 400-mesh που υποστηρίζεται με Formvar ταινία επιχρισμένες με άνθρακα (EMS). Μετά την πλύση με 1% BSA /PBS δύο φορές για 10 λεπτά το καθένα, πλέγματα ανιχνεύθηκαν με 1% BSA /PBS αραιωμένα πρωτεύοντα αντισώματα (1:200 Μ2 αντι-Flag, γίδινο αντι-His

6, και κουνελιού αντι-C- myc) και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Μετά από 2 κύκλους 1% BSA /PBS πλύσεις, πλέγματα επωάστηκαν με 1:10 αραιωμένο δευτερογενή αντισώματα (10 nm χρυσού-γαϊδάρου αντι-ποντικού, 18 nm χρυσού γαϊδάρου αντι-κατσίκας, και 25 nm χρυσού γαϊδάρου αντι-κουνελιού) σε θερμοκρασία δωματίου για 45 λεπτά. Μετά τον καθορισμό με 1% γλουταραλδεϋδη /ΡΒδ για 20 λεπτά, πλέγματα υποβλήθηκαν σε αρνητική χρώση σε 2% οξικό ουρανύλιο για 12 δευτερόλεπτα και εξετάστηκαν κάτω από μικροσκόπιο μετάδοσης ηλεκτρονίου στα 60 KV στην Εγκατάσταση UAB High Resolution Imaging.

Κυττάρων δεσμευτική δοκιμασία αναστολής

Η δοκιμασία αναστολής σύνδεσης διεξήχθη ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13]. AU-565 κύτταρα απελευθερώθηκαν από τις φιάλες χρησιμοποιώντας Versene, πλύθηκαν μία φορά με PBS, και σφαιροποιήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε 0.5 × 10

7 κύτταρα /ml σε ρυθμιστικό διάλυμα πρόσδεσης (DMEM /F12 με 1% BSA). Κλάσματα 100 μΐ των κυττάρων μεταφέρθηκαν σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα 5 ml, και προστέθηκαν με 50 μΙ ενός αναστολέα (διαλυτές CAR (SCAR), ηπαρίνη, ή PBS). Μετά από 30 λεπτά ανακίνηση στους 4 ° C, οι ιοί σε μία πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 500 VP /κύτταρο σε 50 μΐ ρυθμιστικό σύνδεσης προστέθηκαν σε κάθε σωληνάριο, και ανακινήθηκαν στους 4 ° C για 1,5 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν μια φορά με 4 ml ρυθμιστικού διαλύματος πρόσδεσης, και το συνολικό DNA τους εκχυλίζεται και υποβάλλεται σε ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (TaqMan) για τη μέτρηση του αριθμού αντιγράφων Ad5 Ε4. Ολικό DNA σε κάθε δείγμα προσδιορίστηκε ποσοτικά με OD260.

θανάτωσης κυττάρων Δοκιμασία

Η κυτταρική δοκιμασία θανάτωσης εκτελέστηκε ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Τα κύτταρα Α549 καρκινώματος πνεύμονα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκα σε πυκνότητα 10.000 κύτταρα /φρεάτιο μία ημέρα πριν από τη μόλυνση διαφημίσεων. Ad φορείς που μεταφέρουν πρωτεΐνες σύντηξης ρΙΧ-ΤΚ σε διάφορα ΜΟΙ χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για να μολύνουν κύτταρα Α549. Μετά από 2 ώρες ή 12 ώρες επώασης, το προφάρμακο, ganciclovir (GCV) (GYTOVENE-IV, Roche Laboratories, Nutley, NJ), προστέθηκε στα κύτταρα σε τελική συγκέντρωση 1 mM. Μετά από 24 ή 48 ώρες επώασης, η βιωσιμότητα των κυττάρων Α549 αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας CellTiter 96® ΑΟ

ueous μη ραδιενεργό κιτ δοκιμασίας κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Promega, Madison, WI) και μία συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (PowerWave HT 340, BioTek, Winooski , VT) σύμφωνα με τις υποδείξεις των βιοτεχνιών ».

Στατιστική ανάλυση

η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση

t

-ΜΕΛΕΤΕΣ μεταξύ των ομάδων δίπλευρη unpaired Student.

P

τιμές & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Δημιουργία ενός Triple ρΙΧ-Modified διαφήμισης με συνυπάρχουσα λοίμωξη

Για να δημιουργήσει το τριπλό ρΙΧ-τροποποιημένα Ad μεταφέρουν πολυ-λυσίνη (ρΚ), HSV-1 κινάσης θυμιδίνης μεταλλαγμένη (HSV-1 sr39tk), και μονομερή κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (mRFP1) με συν-μόλυνση, τρία γονική ιοί δημιουργήθηκαν πρώτα: Ad- ΙΧ-Flag-ρΚ, Ad-IX-Η6-ΤΚ, και Ad-IX-myc-mRFP1. Αυτές οι τρεις ιοί εκφράζουν ρΙΧ-ΡΚ, ρΙΧ-ΤΚ, ή ρΙΧ-mRFP1 πρωτεΐνη σύντηξης με Flag, His

6, ή c-myc, αντίστοιχα (Εικ. 1Α). Εκτός αν προσδιορίζεται, όλοι οι ιοί που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη είναι ανίκανος αναδιπλασιασμού (Ε1 /Ε3 διαγραφή), και η μεταγραφή των τροποποιημένων γονιδίων ρΙΧ σε κάθε γονικό ιό οδηγήθηκε από τον ενδογενή υποκινητή ρΙΧ. Επιπλέον, ρΙΧ-τροποποιημένη διαφημίσεις μόνο εκφράζουν την πρωτεΐνη σύντηξης ρΙΧ δεδομένου ότι τα φυσικά γονίδια ρΙΧ έχουν αντικατασταθεί με τα τροποποιημένα γονίδια ρΙΧ. Οι τρεις γονική ιοί χρησιμοποιήθηκαν για να συν-μολύνουν τα κύτταρα 293 που υποστηρίζουν την αντιγραφή διαφημίσεων για να δημιουργήσει το τριπλό ρΙΧ-τροποποιημένο ιό. Δεδομένου ότι οι τρεις διαφορετικές πρωτεΐνες σύντηξης ρΙΧ ήταν όλα εκφράζονται και θα μπορούσαν να συναρμολογηθούν σε κάθε σωματίδιο ιού, οι προκύπτοντες ιοσωμάτια αναμενόταν να περιέχει ένα μίγμα τριών τύπων πρωτεϊνών ρΙΧ σύντηξης (Εικ. 1Β). Τα παραγόμενα και CsCl-καθαρίζεται απογόνων Ad (ορίζεται ως coAdpIXPTM # 1) είχε μια φυσιολογική απόδοση σε σύγκριση με ενιαία ρΙΧ-τροποποιημένη διαφημίσεις στο εργαστήριο μας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η ενσωμάτωση των πρωτεϊνών σύντηξης ρΙΧ αναλύθηκε με κηλίδωση Western με αντι-Flag, αντι-RFP, και αντισωμάτων αντι-ΤΚ. Η ανίχνευση του ρΙΧ ζωνών πρωτεΐνης σύντηξης με αναμενόμενο μοριακό μάζες επιβεβαίωσε ότι τρεις πρωτεΐνες σύντηξης ρΙΧ (δηλαδή ρΙΧ-ΡΚ, ρΙΧ-ΤΚ, και ρΙΧ-mRFP1) περιέχονταν στα ιικά σωματίδια του καθαρισμένου ιικού πισίνα (Εικ. 1 C).

(Α) τα κατασκευάσματα των τροποποιημένων γονιδίων ρΙΧ σε γονιδιώματα των τριών γονικών ιών: Ad-IX-Flag-ρΚ, Ad-IX-Η6-ΤΚ, και Ad-IX-myc-mRFP1. Τροποποιημένα γονίδια ρΙΧ (tagged με τη σημαία,

6, και c-myc His, αντίστοιχα) οδηγείται από τον φυσικό προαγωγέα ρΙΧ. (Β) Διαρθρωτικά διάγραμμα της τριπλής ρΙΧ-τροποποιημένο διαφήμισης (coAdpIXPTM 1 #) που παράγεται από τη στρατηγική συν-λοίμωξη. pK, ΤΚ, και πεπτίδια mRFP1 /πρωτεΐνες ενσωματώθηκαν στην άκρα C φωτό. (C) κηλίδωση Western ανάλυση του Ad φορέα που περιέχει τριπλό τροποποιήσεις ρΙΧ. 5 × 10

9 ΠΝ του CsCl καθαρισμένου ελέγχου Ad5 (λωρίδα 1) και το τριπλό ρΙΧ τροποποιημένου coAdpIXPTM # 1 (λωρίδα 2) υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE. Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες βάφτηκαν με Gelcode Blue (Pierce, Rockford, IL.) Για την ανίχνευση του συνόλου των ιικών πρωτεϊνών (αριστερός πίνακας) ή ανιχνεύθηκαν με αντι-Flag, αντι-RFP, ή αντίσωμα αντι-ΤΚ (δεξί πάνελ).

επιφάνεια παρουσίασης των τροποποιημένων pIXs σε σωματίδια Ad

για να ελεγχθεί αν ή όχι τα πολυπεπτίδια /πρωτεΐνες ενσωματωθεί στη C-τελικό άκρο της ρΙΧ παρουσιάστηκαν στην επιφάνεια του ιού και προσιτή σε αντισώματα, εκτελέσαμε συνδεδεμένη με ένζυμο ανοσορροφητικές δοκιμασίες (ELISA). Στο πείραμα ELISA, αντι-Flag, αντι-His

6, και αντι-c-myc αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των τριών τύπων τροποποιημένων pIXs. Ο έλεγχος Ad5 που περιέχουν άγριου τύπου ρΙΧ δεν αναγνωρίστηκε από κανένα από αυτά τα αντισώματα. Οι ιοί coAdpIXPTM # 1 αναγνωρίστηκαν από αντι-Flag, και αντι-c-myc αντισώματα (Εικ. 2). Ωστόσο, οι ιοί δεν θα μπορούσαν να αναγνωρισθούν από είτε αντι-His

6 αντισώματος (Εικ. 2) ή αντι ΤΚ-αντίσωμα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι η pK και mRFP1 ενσωματώθηκαν στις τριπλό ρΙΧ-τροποποιημένους φορείς διαφημίσεων. Η ασήμαντη πρόσδεσης των αντι-His

6 ή αντι-ΤΚ αντισώματος προς τους ιούς υποδεικνύει ότι ΤΚ ήταν είτε όχι αποτελεσματικά επιφάνεια που εκτίθεται επί των ιικών καψιδίων ή την προσβασιμότητα αυτών των δύο αντισωμάτων σε πρωτεΐνες ΤΚ σε μια τέτοια διαμόρφωση ήταν ανεπαρκής για να είναι ανιχνεύονται σε ELISA. ανάλυση

ELISA του Ad φορέα που περιέχει τριπλό τροποποιήσεις ρΙΧ. 10

9 ΠΝ του CsCl καθαρισμένου Ad5 (αρνητικός έλεγχος) ή coAdpIXPTM # 1 υποβλήθηκαν σε μία σειριακή αραίωση (1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1 /64, 1/128) και ακινητοποιημένο σε μια πλάκα ELISA. Οι ιοί ανιχνεύθηκαν με αντι-Flag (1:2000), αντι-His

6 (1:1000), και αντι-c-myc αντισώματα (1:1000), ακολουθούμενη από επώαση με συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση δευτερογενή αντισώματα (1:1000). Μετά την ανάπτυξη χρώματος, η απορρόφηση του φωτός μετρήθηκε και καταρτίστηκε σε διάγραμμα επί του Υ-άξονα έναντι των ιικών συγκεντρώσεις. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει τη μέση και τυπική απόκλιση (SD) τριπλών προσδιορισμών. Μερικές γραμμές σφάλματος στέκεται για SD είναι μικρότερα από τα σύμβολά τους.

Η

μωσαικισμό του τριπλού ρΙΧ-Modified διαφήμισης

Western και ανάλυση ELISA των καθαρισμένων ιικών σωματιδίων έδειξαν ότι τρεις τύποι πρωτεΐνες σύντηξης ρΙΧ ενσωματώθηκαν μέσα στα σωματίδια Ad παράγονται από συν-μόλυνση (Σχ. 1). Να εξετάσει κατά πόσον ένα σωματίδιο ιού ενιαίο διαφήμισης θα μπορούσε να εμφανίσει και τους τρεις τύπους των λειτουργικών πρωτεϊνών, πραγματοποιήσαμε immunogold ηλεκτρονικό μικροσκόπιο για να απεικονίσει άμεσα ρΙΧ-τροποποιημένα σωματίδια διαφημίσεων. Anti-Flag, αντι-His

6 και αντι-c-myc αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση ρΙΧ-ΡΚ, ρΙΧ-ΤΚ και πρωτεΐνες ρΙΧ-mRFP1 στα ιικά σωματίδια, αντίστοιχα, που ακολουθείται από τρεις αντίστοιχες δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με 10 , 18, και 25 nm σωματίδια χρυσού, αντιστοίχως. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, κανένα σωματίδιο δεν χρυσός συνδέθηκε με τον έλεγχο Ad5 εμφανίζοντας άγριου τύπου ρΙΧ, ενώ τα ιικά σωματίδια Ad περιέχει μία μοναδική πρωτεΐνη σύντηξης ρΙΧ (Ad-IX-Flag-ΡΚ, Ad-IX-Η6-ΤΚ, και το Ad -IX-myc-mRFP1) βάφτηκαν με αντίστοιχες σωματίδια χρυσού. Τα τριπλά τροποποιημένους ιούς coAdpIXPTM # 1 αναγνωρίστηκαν από αντι-Flag, αντι-His

6 και αντι-c-myc αντισώματα και επισημάνθηκαν με 10, 18 και 25 nm σωματίδια χρυσού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τρία είδη πρωτεϊνών σύντηξης ρΙΧ μπορούν να συνυπάρξουν σε ένα μόνο σωματίδιο ιού και εκτέθηκαν στην επιφάνεια του ιού.

Control ή ρΙΧ-τροποποιημένοι φορείς Ad φορτώθηκαν πλέγματα ΕΜ, ανιχνεύθηκαν με νανοσωματίδια χρυσού συζευγμένα αντισώματα και παρατηρήθηκε κάτω από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σε 60 KV. Ποντικού αντι-Flag, γίδινο αντι-His

6, και κουνελιού αντι-c-myc πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση τριών ειδών ετικετών σε ρΚ, HSV-1 ΤΚ, και mRFP1, αντίστοιχα. αντι-ποντικού, 18 nm χρυσού γαϊδάρου αντι-κατσίκας, και δευτερεύοντα αντισώματα αντι-κουνελιού 25 nm χρυσού-γαϊδάρου 10 nm χρυσού γαϊδάρου χρησιμοποιήθηκαν για μετέπειτα επισήμανση χρυσού σωματιδίων Ad. Στερεά λεπτό βέλη δείχνουν 10 nm σωματίδια χρυσού, άδειο βέλη δείχνουν 18 nm σωματίδια χρυσού, και συμπαγές παχύ βέλη δείχνουν 25 nm σωματίδια χρυσού. Η κλίμακα μπαρ σε κάθε πίνακα αντιπροσωπεύει το 50 nm σε μήκος.

Η

Αξίζει να σημειωθεί ότι, αν και υπάρχουν 240 αντίγραφα των μορίων ρΙΧ σε κάθε σωματίδιο ιού, μόνο λίγα αντισώματα σωματίδιο συζευγμένο χρυσού δεσμεύονται σε τα ιικά σωματίδια Ad ρΙΧ-τροποποιημένα. Αυτά τα δεδομένα ήταν σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές [15], [19], [20]. Αυτό πιθανώς οφείλεται στη σχετική χαμηλή προσβασιμότητα των ρΙΧ από την επιφάνεια του καψιδίου [20] – [22] και χωρική εμπόδιο επίδραση των σωματιδίων αντισώματος συζευγμένου με χρυσό εναντίον του άλλου κατά τη διάρκεια της χρώσης. Επιλέξαμε τα μεγάλα σωματίδια χρυσού για ευκολότερη διαφοροποίηση μεταξύ τρία επιτόπια, τα οποία έχουν ακόμη υψηλότερη αναλογία αντισώματος /χρυσού και ένα υψηλότερο αποτέλεσμα χωρική εμπόδιο από εκείνη των μικρών σωματιδίων χρυσού τα οποία χρησιμοποιούνται συνήθως. Επιπλέον, αντι-His

6 αντίσωμα δεν δεσμεύει αποτελεσματικά ρΙΧ-ΤΚ, όπως φαίνεται στην Εικόνα 2. Επιπλέον, η χαμηλή απόδοση της τριπλής χρώσης μπορεί να είναι ένας άλλος λόγος της διάσπαρτα πρότυπο χρώσης φαίνεται στο Σχήμα 3. Επομένως, είναι δεν προκαλεί έκπληξη το γεγονός ότι η συχνότητα των τριπλά-επισημασμένου Ads είναι χαμηλή -. ιικά σωματίδια μόνο περίπου 1% βάφτηκαν με όλους τους τρεις τύπους σωματιδίων χρυσού (Πίνακας 1)

η

Στόχευση Δραστηριότητα του Incorporated πολυ-λυσίνη επί το Triple ρΙΧ Μωσαϊκό διαφήμισης

Αά5 έχει αποδειχθεί ότι συνδέεται με πρωταρχικό κυτταρικό υποδοχέα της, τον ιό Coxsackie Β και του υποδοχέα αδενοϊό (CAR), ως το πρώτο βήμα της λοίμωξης μέσω του διακόπτη πρωτεϊνικές ίνες του [23]. Η πολυ-λυσίνη (ΡΚ) ενσωματώνονται σε ρΙΧ περιοχές σε AdLucIXpK έχει δειχθεί ότι μεσολαβεί αλληλεπίδραση Ad με κυτταρικές πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης (HSPGs), με αποτέλεσμα CAR-ανεξάρτητη δέσμευσης ιού-κυττάρου και μεταγωγής [13]. Ως εκ τούτου, προκειμένου να εξετάσει αν τα πεπτίδια pK ενσωματωθεί στην τριπλή ρΙΧ μωσαϊκό διάνυσμα Ad είχαν παρόμοια δραστηριότητα στόχευση σε HSPGs, πραγματοποιήσαμε δεσμευτικές και αναλύσεις αναστολής με το αυτοκίνητό ανεπάρκεια (χαμηλό επίπεδο CAR) AU-565 κυττάρων παρουσία κυττάρων ή απουσία ηπαρίνης ή διαλυτό CAR (SCAR) πρωτεΐνη

Μια άλλη εκδοχή του τριπλού ρΙΧ-τροποποιημένο φορέα διαφήμισης δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας τρία προηγούμενα χαρακτηρίζεται γονική ρΙΧ-τροποποιημένους ιούς:. AdLucIXpK [13], Ad-ΟΕ1-IX- sr39tk [12], και Ad-IX-mRFP1 [4] (tags Σημαία ήταν παρούσα σε όλες τις τρεις πρωτεΐνες σύντηξης ρΙΧ). Η ενσωμάτωση του ρΙΧ-ΡΚ, ρΙΧ-ΤΚ, και πρωτεΐνες ρΙΧ-mRFP1 στην παράγωγη τριπλό μωσαϊκό Ad (ορίζεται ως coAdpIXPTM # 2) επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western επί των καθαρισμένων ιών χρησιμοποιώντας αντι-Flag, αντι-RFP, και αντι- αντισώματα ΤΚ (Εικ 4C.)

(Α) τα κατασκευάσματα των τροποποιημένων γονιδίων ρΙΧ σε γονιδιώματα των τριών γονικών ιών:. AdLucIXpK, Ad-ΟΕ1-IX-sr39tk, και Ad-IX-mRFP1. Τροποποιημένα γονίδια ρΙΧ (ετικέτα με τη σημαία) οδηγήθηκαν από τον φυσικό υποκινητή ρΙΧ. (Β) Διαρθρωτικά διάγραμμα της τριπλής ρΙΧ-τροποποιημένο διαφήμισης (coAdpIXPTM # 2) που παράγεται από τη στρατηγική συν-λοίμωξη. (Γ) 5 × 10

9 ΠΝ του CsCl καθαρισμένου ελέγχου Ad5 (λωρίδα 1) και το τριπλό ρΙΧ τροποποιημένου coAdpIXPTM # 2 (λωρίδα 2) υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE. Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες βάφτηκαν με Gelcode Blue (στα αριστερά) ή ανιχνεύθηκαν με αντι-Flag, αντι-RFP, ή αντίσωμα αντι-ΤΚ. Ένα μακράς έκθεσης του στυπώματος αντι-Flag συμπεριλήφθηκε για να δείξει ρΙΧ-ΡΚ πρωτεΐνη, η οποία ενσωματώνεται σε σωματίδια Ad σε πολύ χαμηλό επίπεδο. Το «*» αστερίσκοι υποδηλώνουν τα προϊόντα αποικοδόμησης των πρωτεϊνών σύντηξης ρΙΧ-mRFP1.

Η

Παρατηρήθηκε ότι η θετική AdLucIXpK ελέγχου, στην οποία όλα τα μόρια ρΙΧ τροποποιήθηκαν με pK, εκτίθενται όσο δύο φορές της δέσμευσης κυττάρων στο αυτοκίνητό ανεπαρκή AU-565 κυττάρων σε σύγκριση με αγρίου τύπου Ad5. Η τριπλή ψηφιδωτό Ad5 (coAdpIXPTM # 2), στην οποία μόνο ένα μέρος των μορίων ρΙΧ περιείχαν τροποποίηση ρΚ, έδειξε δραστηριότητα δέσμευσης περίπου 1,5-φορά υψηλότερη συγκριτικά με κύτταρο άγριου τύπου Ad5 (Εικ. 5). Επιπλέον, περισσότερο από το 90% ικανότητα του AdLucIXpK και 50% του coAdpIXPTM # 2 πρόσδεσης στο κύτταρο ανεστάλησαν από ελεύθερο ηπαρίνης σε τελική συγκέντρωση 500 μg /ml, ενώ πρόσδεσης στο κύτταρο του ελέγχου Ad5 δεν επηρεάστηκε σημαντικά (Σχ. 5). Η προσθήκη 200 μg /ml ουλή ανέστειλε την πρόσδεση πάνω από το 80% των κυττάρων του ελέγχου Ad5, ενώ έχει μία σχετικά μέτρια επίδραση στην AdLucIXpK (60%) και coAdpIXPTM # 2 (25%) (Εικ. 5). Μαζί, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι τα πεπτίδια εμφανίζονται σε ρΚ coAdpIXPTM # 2 κοψίδια θα μπορούσε να μεσολαβήσει CAR-ανεξάρτητες κυτταρικές στόχευση μέσω της αλληλεπίδρασης με κυτταρικούς υποδοχείς ηπαράνης θειικής.

AU-565 κύτταρα επωάστηκαν με Ad5, AdLucIXpK, ή coAdpIXPTM # 2 σε ΜΟΙ 500 VP /κύτταρο με την παρουσία 500 μg /ml ηπαρίνης ή πρωτεΐνη ουλή /ml 200 μg στους 4 ° C. Bound σωματίδια Ad ποσοτικοποιήθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR και κανονικοποιήθηκαν με ολικό κυτταρικό DNA. Κάθε μπάρα αντιπροσωπεύει τη μέση και SD προσδιορισμών εις τριπλούν, και αστερίσκοι δείχνουν σημαντική διαφορά μεταξύ των συγκεκριμένων ομάδων.

Η

ενζυματική δραστηριότητα Incorporated ΤΚ στο Τρίκλινο ρΙΧ Μωσαϊκό διαφήμισης

HSV-1 ΤΚ πρωτεΐνη μπορεί γενετικώς να ενσωματωθούν σε Ad στο ρΙΧ περιοχές με φυσική ενζυμική ενεργότητα του διατηρείται, το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου με προφάρμακο ganciclovir (GCV), και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για

in vitro

και

in vivo

απεικόνισης όταν συνδυάζεται με το σύστημα microPET [12], [14]. Για να διερευνηθεί αν οι πρωτεΐνες σύντηξης ρΙΧ-ΤΚ θα μπορούσε να λειτουργήσει κανονικά, αξιολογήσαμε ΤΚ-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα παρουσία GCV σε φαρμακολογικό συγκέντρωση με δοκιμασία MTS. Για να αξιολογηθεί η πρωτεΐνη σύντηξης ρΙΧ-ΤΚ που απελευθερώνεται απ ‘ευθείας από τα σωματίδια Ad μετά από επιτυχή κυτταρική είσοδο, κύτταρα Α549 καρκινώματος πνεύμονα χρησιμοποιήθηκαν, στην οποία η αντιγραφή του μη αναπαραγόμενου Ad και η έκφραση του γονιδίου ρΙΧ είναι ελάχιστες. κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με ενιαίο ρΙΧ-τροποποιημένο διαφήμισης (Ad-ΟΕ1-IX-sr39tk) ή τριπλό ρΙΧ μωσαϊκό αγγελία (coAdpIXPTM # 2) σε διάφορες ΜΟΙ. GCV προστέθηκε σε μολυσμένα κύτταρα στις δύο ώρες μετά τη μόλυνση, και ο θάνατος των κυττάρων που προκαλείται από πρωτεΐνη σύντηξης ρΙΧ-ΤΚ αξιολογήθηκε με δοκιμασία MTS 24 ώρες μετά. Τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι υπήρξε σημαντική GCV που σχετίζεται με κυτταροτοξικότητα που προκαλείται είτε από Ad-ΟΕ1-IX-sr39tk ή λοίμωξη coAdpIXPTM # 2 σε υψηλό MOI (10.000 VP /κύτταρο) (Εικ. 6Α). Ωστόσο, σε χαμηλότερο ΜΟΙ (5000 VPS /κύτταρο), μόνο Ad-ΟΕ1-IX-sr39tk μόλυνσης έδειξε GCV που προκαλείται σημαντική κυτταροτοξικότητα. Αυτό έδειξε ότι η δραστηριότητα ρΙΧ-ΤΚ στο τριπλό ρΙΧ-τροποποιημένα Ad ήταν χαμηλότερη από εκείνη του ενιαίου ρΙΧ-ΤΚ-τροποποιημένα Ad, που μπορεί να αποδοθεί στις διαφορές αριθμού αντιγράφων του ρΙΧ-ΤΚ ενσωματώνονται στα ιικά σωματίδια.

(Α) κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με Ad5 (αρνητικός μάρτυρας), Ad-ΟΕ1-IX-sr39tk, ή coAdpIXPTM # 2 σε διάφορα ΜΟΙ. 2 ώρες αργότερα, GCV προφάρμακο προστέθηκε επί κυττάρων με την τελική συγκέντρωση στο 1 mM. 24 ώρες αργότερα, η δραστικότητα θανάτωσης κυττάρων που επάγεται από μετατροπή GCV προκαλούνται μέσω ρΙΧ-ΤΚ αξιολογήθηκε με δοκιμασία MTS. Κύτταρα μολυσμένα με ιούς κανονικοποιήθηκαν με εκείνη των μη μολυσμένων κυττάρων ως σχετική επιβίωση των κυττάρων. (Β) κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με ενιαίο ρΙΧ-τροποποιημένα Ad-ΟΕ1-IX-sr39tk ή coAdpIXPTM # 2 σε διάφορα ΜΟΙ. 12 ώρες αργότερα, GCV προστέθηκε επί κύτταρα στην τελική συγκέντρωση 1 mM. 48 ώρες αργότερα, η δραστηριότητα θανάτωσης κυττάρων του ΤΚ /GCV αξιολογήθηκε ως ίδια όπως περιγράφεται παραπάνω.