Αφηρημένο

Ιστορικό

πλακωδών κυττάρων του πνεύμονα καρκινώματα αντιπροσωπεύουν περίπου το 25% των νέων περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα και 40.000 θανάτους ετησίως στις Ηνωμένες Πολιτείες. Αν και υπάρχουν πολλές γονιδίωμά στοχευμένες θεραπείες για το αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, δεν έχει ακόμη αναφερθεί σε πλακώδες καρκίνωμα του πνεύμονα.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Χρησιμοποιώντας ανάλυση της σειράς SNP, βρήκαμε ότι μια περιοχή του χρωμοσώματος τμήμα 8p11-12 περιέχει τρία genes-

WHSC1L1

,

LETM2

, και

FGFR1

-παρασκευάζεται ενισχύθηκε στο 3% του αδενοκαρκινώματα πνεύμονα και 21% των ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι ένα μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρική γραμμή καρκινώματος που φέρει εστιακό ενίσχυση του

FGFR1

εξαρτάται από την δραστηριότητα FGFR1 για την κυτταρική ανάπτυξη, όπως θεραπεία αυτής της κυτταρικής γραμμής είτε με

FGFR1

– Τα siRNAs ειδικές ή με FGFR μικρό μόριο ενζυματικών αναστολέων οδηγεί σε αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι το

FGFR1

ενίσχυσης είναι κοινή σε πλακώδη καρκίνο του πνεύμονα, και ότι FGFR1 μπορεί να αντιπροσωπεύει μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στόχο στο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα

Παράθεση:. Dutt Α, Ramos ΑΗ, Hammerman PS, Mermel C, Cho J, Sharifnia Τ, et al. (2011) Αναστολέας-Ευαίσθητο

FGFR1

Ενίσχυση στην Ανθρώπινη μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 6 (6): e20351. doi: 10.1371 /journal.pone.0020351

Συντάκτης: Μινγκ Μπορείτε, Ιατρικό Κολέγιο του Ουισκόνσιν, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 Δεκ του 2010? Αποδεκτές: 30 του Απρίλη, 2011? Δημοσιεύθηκε: 7 του Ιούνη του 2011

Copyright: © 2011 Dutt et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Πηγές χρηματοδότησης για το έργο αυτό περιλαμβάνει την υποστήριξη από την Novartis Pharmaceuticals, η αμερικανική ένωση πνευμόνων, Ενωμένοι κατά του καρκίνου του πνεύμονα, της Sarah Thomas Monopoli Ταμείο, το Ίδρυμα Seaman και Genentech να ΜΜ Μ.Χ. υποστηρίζεται από μια υποτροφία Ramalingaswami από το Τμήμα Βιοτεχνολογίας, Υπουργείο Επιστημών, η κυβέρνηση της Ινδίας. P.S.H. υποστηρίζεται από ένα νεαρό ερευνητή Βραβείο από την Εθνική καρκίνο του πνεύμονα εταιρικής σχέσης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Μ.Μ. είναι σύμβουλος της Novartis και λαμβάνει την υποστήριξη της έρευνας από τη Novartis, λαμβάνει στήριξη της έρευνας από την Genentech, και είναι ιδρυτικό σύμβουλος και σύμβουλος, και ο κάτοχος μετοχών στο Ίδρυμα Ιατρικής. Ν.Ο. εργαστήριο λαμβάνει χορηγία έρευνα από τη Novartis. Ωστόσο, αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

καρκίνου

πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται στις ανεπτυγμένες χώρες με θάνατοι το 2009 εκτιμάται σε περίπου 160.000 στις Ηνωμένες Πολιτείες, αντιπροσωπεύοντας περίπου το 28% όλων των θανάτων από καρκίνο [1]. Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) αντιπροσωπεύει το 75% όλων των καρκίνων του πνεύμονα και περιλαμβάνει δύο κυρίαρχα υποτύπους, αδενοκαρκίνωμα και καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (SCC), που αποτελούνται κατά 40% και 25% των NSCLCs, αντίστοιχα [2], [3] . Παρά τη σαφή ιστολογική και βιολογικές διακρίσεις, αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα και πλακώδες καρκίνωμα σε μεγάλο βαθμό σε επεξεργασία με τις ίδιες χημειοθεραπευτικούς παράγοντες με εξαίρεση την πεμετρεξίδη παράγοντα αντιφολικό το οποίο έχει εγκριθεί για τη θεραπεία του μη πλακώδους NSCLC [4].

σημαντικές εξελίξεις στη θεραπεία του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα έχουν προήλθε από λεπτομερή γονιδιωματική ανάλυση και την ανάπτυξη των μοριακά στοχευμένες παραγόντων ηγετική οι οποίες οδήγησαν σε βελτίωση των αποτελεσμάτων στον ασθενή. Παραδείγματα περιλαμβάνουν την χρήση του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) αναστολείς όπως gefitinib και erlotinib [5], [6], [7] για τα αδενοκαρκινώματα του πνεύμονα που φέρει

EGFR

μεταλλάξεις [8], [9], [ ,,,0],10], και των αναστολέων ALK όπως crizotinib [11] για τα αδενοκαρκινώματα πνεύμονα που φέρουν

EML4-ALK

μεταθέσεις [12], [13].

Ωστόσο, λίγα είναι σήμερα γνωστά για τη δυνατότητα στόχευσης γενετικές ανωμαλίες υποκείμενες πλακωδών καρκίνο του πνεύμονα. Εκτός από την

ΤΡ53

μεταλλάξεων [14], καρκινώματα πλακωδών κυττάρων του πνεύμονα έχει δειχθεί ότι φιλοξενούν ενισχύσεις του

PIK3CA

[15],

SOX2

[16], και

EGFR

[16], καθώς και

EGFR

μεταλλάξεις παραλλαγή ΙΙΙ [17]

DDR2

μεταλλάξεις [18] και σπάνια ενισχύσεις του

PDGFRA /KIT

[ ,,,0],19], [20] και

BRF2

[21]. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε εστιακό ενίσχυση των

FGFR1

τόπο επί 8ρ χρωμόσωμα που σχετίζονται με την κυτταρική εξάρτηση από το

FGFR1

και ευαισθησία προς FGFR αναστολείς [22]. Αυτή τη στιγμή δεν υπάρχουν FDA-εγκριθεί στοχευμένες θεραπείες για καρκίνο εκ πλακωδών κυττάρων του πνεύμονα.

Στόχευση ενισχύεται κινάσες τυροσίνης με αντισώματα ή με μικρά μόρια αναστολείς έχει οδηγήσει σε δραματικές βελτιώσεις στα ποσοστά ανταπόκρισης και τη συνολική επιβίωση των ασθενών με καρκίνο των οποίων οι όγκοι λιμάνι συγκεκριμένη γονιδιωματική ανωμαλίες. Ενισχύσεις του

EGFR

και

ERBB2

έχουν αναφερθεί σε μία ποικιλία κακοηθειών, συμπεριλαμβανομένου κεφαλής και λαιμού, οισοφάγου, στομάχου, του μαστού και του καρκίνου του παχέος εντέρου, καθώς και NSCLC [23]. Στόχευση αυτών των κινασών τυροσίνης, όπως η χρήση του cetuximab για τη στόχευση

EGFR

σε ορθοκολικό και καρκίνο κεφαλής και τραχήλου [24], [25] και η χρήση του trastuzumab για τη στόχευση

ERBB2

σε του καρκίνου του μαστού [26], έχει οδηγήσει σε σημαντική βελτίωση στην έκβαση των ασθενών σε κάθε μία από αυτές τις ασθένειες, αν και δεν είναι όλοι οι ασθενείς με αυτές τις ενισχύσεις ανταποκρίνεται σε παράγοντες στόχοι [27], [28], πιθανόν να οφείλεται σε πρόσθετες γενωμικό μεταβολές εντός του όγκου που προκύπτουν σε πρωτογενή αντοχή σε ειδικούς παράγοντες [29], [30].

Το 1 γονίδιο ανάπτυξης ινοβλαστών τύπος υποδοχέα παράγοντα (

FGFR1

) είναι ένα από τα πιο συχνά ενισχυμένα γονίδια στον καρκίνο του ανθρώπου [16 ]. Η (FGFR) οικογένειας κινάσης τυροσίνης υποδοχέα αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών αποτελείται από τέσσερα κινασών, FGFR1, 2, 3, και 4, που παίζουν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη, και έχει αποδειχθεί ότι είναι στόχοι για απορρύθμιση είτε με την ενίσχυση, σημειακή μετάλλαξη, ή μετατόπιση (αναθεωρηθούν [31]). Μεταθέσεις περιλαμβάνουν

FGFR3

, καθώς και την ενεργοποίηση σωματικές μεταλλάξεις σε

FGFR3

έχουν ταυτοποιηθεί σε πολλαπλό μυέλωμα και καρκίνου της ουροδόχου κύστης [32], [33], [34]. Εμείς και άλλοι έχουν προσδιορίσει την ενεργοποίηση μεταλλάξεις στο

FGFR2

στον καρκίνο του ενδομητρίου [35], [36]. Ενίσχυση ή ενεργοποίηση

FGFR1

έχει αναφερθεί σε στοματική πλακώδες καρκίνωμα [37], του οισοφάγου καρκινώματα των πλακωδών κυττάρων [38], τον καρκίνο των ωοθηκών [39], καρκίνος της ουροδόχου κύστης [40], του καρκίνου του προστάτη [41], rhabodomyosarcoma [ ,,,0],42], και του καρκίνου του πνεύμονα [16], [43], [44], [45], [46]. Σε συμφωνία με αυτό, μια παν-FGFR αναστολέας τυροσινικής κινάσης έχει αποδειχθεί να εμποδίσει τον πολλαπλασιασμό του όγκου σε ένα υποσύνολο των κυτταρικών σειρών NSCLC με ενεργοποιημένο σηματοδότηση FGFR αλλά δεν έχει καμία επίδραση στα κύτταρα που δεν ενεργοποιούν το μονοπάτι [47].

FGFR1

έχει χαρακτηριστεί ως περίπτωση οδηγό σε καρκινώματα μαστού και μη μικροκυτταρικό καρκίνο πνεύμονα, ιδιαίτερα πλακώδη καρκινώματα του πνεύμονα, που φιλοξενούν παρόμοιες ενισχύσεις του 8p11 χρωμοσωμικών τμημάτων [22], [48]

Με βάση τις SNP array ανάλυση αριθμού αντιγράφων 732 δειγμάτων, αναφέρουμε ότι

FGFR1

είναι σωματικώς ενισχύεται στο 21% των καρκινωμάτων του πνεύμονα πλακωδών κυττάρων, σε σύγκριση με 3,4% του αδενοκαρκινώματα πνεύμονα. Εμείς επικυρώνει FGFR1 ως δυνητικό θεραπευτικό στόχο, δείχνοντας ότι τουλάχιστον μία

FGFR1

-amplified NSCLC κυτταρική γραμμή όγκου είναι ευαίσθητο σε FGFR ενζυματική παρεμπόδιση και που εξαρτώνται από την

FGFR1

έκφρασης για τη βιωσιμότητα των κυττάρων όπως αποδεικνύεται από θεραπείας shRNA. Μαζί με τις προηγούμενες εκθέσεις επανεξετάζονται παραπάνω, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι FGFR1 μπορεί να είναι ένας ελκυστικός θεραπευτικός στόχος στον NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

NSCLC πρωτογενή δείγματα και κυτταρικές σειρές

NSCLC κυττάρων γραμμές, NCI-H1703 (πλακώδη), NCI-H2444 (πνευμονική), NCI-H520 (πλακώδη), HCC95 (πλακώδη), NCI-1581 (μεγάλο καρκίνωμα), Calu3 (που δεν προδιαγράφονται άλλως), NCI-H1734 (όχι αλλιώς διευκρινίζεται), Colo699 (αδενοκαρκίνωμα), NCI-H2170 (πλακώδη), NCI-H226 (πλακώδη), Α427 (αδενοκαρκίνωμα), NCI-H1563 (αδενοκαρκίνωμα), NCI-H1781 (αδενοκαρκίνωμα) και HCC15 (πλακώδη) ελήφθησαν από τη συλλογή της AF Gazdar, J. Minna, και οι συνεργάτες του [49], [50], [51], από την ATCC (Manassas, Βιρτζίνια, Ηνωμένες Πολιτείες) και /ή DSMZ (Braunschweig, Γερμανία). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 πλήρες μέσο συμπληρωμένο με 10% ορό μόσχου (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, California, United States) και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Gibco /Invitrogen). Οι NSCLC όγκου /φυσιολογικό ζεύγη που αναλύονται στην παρούσα μελέτη έχουν περιγραφεί προηγουμένως [16], [20], [45], [50], [52].

SNP δεδομένων σειρά ανάλυση

πειράματα συστοιχία SNP διεξήχθησαν σε 732 όγκου και κυτταρικής σειράς δειγμάτων NSCLC και τα δεδομένα αναλύθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16], [20], [45], [50], [52]. Τα όρια της 8p11 αμπλικονίου που ορίζεται από GISTIC ανάλυση [53] ταυτοποιήθηκαν ως αναφερθεί [52] (https://www.broadinstitute.org/tumorscape/pages/portalHome.jsf). απεικόνιση των δεδομένων έχει πραγματοποιηθεί με τη χρήση του Integrative Genomics Viewer (https://www.broadinstitute.org/igv).

Η επιμόλυνση και η μόλυνση

Phoenix 293Τ κυτταρική γραμμή συσκευασίας (Orbigen, San Diego, California, Ηνωμένες Πολιτείες) έχουν επιμολυνθεί με φορείς πύλη pBabe-Puro με βάση τη χρήση αντιδραστηρίου Fugene * 6 Επιμόλυνση (Roche, Indianapolis, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) για να δημιουργήσει την αντιγραφή ανίκανους ρετροϊούς. Τα κύτταρα-στόχοι μολύνθηκαν με αυτούς τους ρετροϊούς με την παρουσία 8 μg /ml polybrene. Δύο ημέρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2 μg /ml πουρομυκίνη (Sigma, St. Louis, Missouri, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) για δύο ημέρες. Οι προκύπτουσες σταθερές κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν για πειραματικές μελέτες.

shRNA μεσολάβηση

FGFR1

νοκ ντάουν

shRNA φορείς ελήφθησαν από TRC (Η RNAi Consortium). Οι αλληλουχίες στόχοι των κατασκευών shRNA είναι:

FGFR1

# 1 (TRCN 0000121307):. 5′-AGTGGCTTATTAATTCCGATA-3 ‘

FGFR1

# 2 (TRCN 0000121308): 5′-GCTTGCCAATGGCGGACTCAA-3 ‘

FGFR1

# 3 (TRCN 0000121309):. 5′-CTTGTATGTCATCGTGGAGTA-3′.

FGFR1

# 4 (TRCN 0000121310): 5′-CAAGATGAAGAGTGGTACCAA-3 ‘

FGFR1

# 5 (TRCN 0000121311):. 5′-GAATGAGTACGGCAGCATCAA-3′.

LETM2

# 1 (TRCN 0000040243): 5′-CGCACCTTCTACCTGATAGAT-3 ‘

LETM2

# 2 (TRCN 0000040244):. 5′ CCCAGCACAAAGGAGATAGTT-3 ‘

LETM2

# 3 (TRCN 0000040245):. 5′-CCAGTTACATCATCACCCATA-3′.

LETM2

# 4 (TRCN 0000040246): 5′-CCAGGAACTAGACTAATACAA-3 ‘

LETM2

# 4 (TRCN 0000040247):. 5′-GCATTGAGTGTATCAGAACTA-3′.

WHSC1L1

# 1 (TRCN 0000015613): 5′-CGAGAGTATAAAGGTCATAAA-3 ‘

WHSC1L1

# 2 (TRCN 0000015614):. 5′-CCATCATCAATCAGTGTGTAT-3′.

WHSC1L1

# 3 (TRCN 0000015615): 5′-CGAGAATATCATGTCCAGTTT-3 ‘

WHSC1L1

# 4 (TRCN 0000015616):. 5′-GCTTCCATTACGATGCACAAA-3′ .

WHSC1L1

# 5 (TRCN 0000015617):. 5′-GCAGGGAATTGTTTGAGTCTT-3 ‘

Η σειρά απευθύνεται το

GFP

shRNA είναι 5 «-GCAAGCTGACCCTGAAGTTCAT-3 ‘. Λεντιϊοί έγιναν από επιμόλυνση κυττάρων συσκευασίας 293Τ με αυτά τα κατασκευάσματα, χρησιμοποιώντας ένα σύστημα τριών πλασμίδιο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [54]. Κύτταρα στόχοι επωάστηκαν με φακοϊούς για 6 ώρες παρουσία 8 μg /ml polybrene και αφήνεται σε φρέσκο ​​μέσο. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για δύο ημέρες. Πενήντα μικρογραμμάρια συνολικά κυτταρολύματα παρασκευάζονται από τις μολυσμένες κυτταρικές γραμμές αναλύθηκε με κηλίδωση Western.

Δοκιμασίες

ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό

Για δοκιμασίες επιβίωσης, 2 × 10

6 κυττάρων για κάθε κύτταρο όγκου γραμμή που εκφράζει τα siRNAs κατασκευές στόχευσης

FGFR1

,

WHSC1L1

,

LETM2

ή

GFP

μαζί με μη μολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε 3 επαναλήψεις σε ένα πιάτο 6 και . Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε σε 24 ώρες χρόνο σημεία επί 4 διαδοχικές ημέρες με απαρίθμηση των κυττάρων χρησιμοποιώντας Beckman Coulter Vi-Cell Αυτοματοποιημένη Κυττάρων Η βιωσιμότητα Analyzer εξής μπλε χρώση trypan χρωστική. Το ποσοστό της κυτταρικής βιωσιμότητας παραστάθηκε γραφικά για κάθε κυτταρική σειρά αναγνώσεων που λαμβάνονται την ημέρα 4 σε σχέση με την ημέρα 1.

μαλακό άγαρ ανεξάρτητη από προσκόλληση

δοκιμασία ανάπτυξης

Για προσδιορισμούς μαλακού άγαρ, 2 × 10

4 κύτταρα που εκφράζουν NSCLC sh

FGFR1

και sh

GFP

αιωρήθηκαν σε ένα ανώτερο στρώμα του RPMI1640 που περιείχε 10% ορό μόσχου και 0,4% άγαρ Select (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, Καλιφόρνια, Ηνωμένες Πολιτείες) και τοποθετήθηκαν σε ένα κάτω στρώμα του RPMI1640 που περιείχε 10% ορό μόσχου και 0,5% άγαρ Select σε ένα πιάτο 6 φρεατίων. PD173074 ή FIIN-1 [55] προστέθηκε όπως περιγράφεται στο άγαρ κορυφής. Μετά από 3-5 εβδομάδες οι αποικίες επώαση μετρήθηκαν εις τριπλούν. IC50s προσδιορίστηκαν με μη-γραμμική παλινδρόμηση χρησιμοποιώντας Prism 5 λογισμικού (GraphPad Software).

δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας

Ανάλογα με τις καμπύλες ανάπτυξης για κάθε κυτταρική σειρά, μεταξύ 800 και 2000 κύτταρα NSCLC σπάρθηκαν σε 6 επαναλήψεις σε πλάκα 96- καλά. Μία ημέρα μετά την επίστρωση, οι αυξανόμενες δόσεις της FGFR αναστολείς PD173074 ή FIIN-1 προστέθηκαν και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε 4 ημέρες αργότερα χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία WST-1 (Roche Applied Science). Κάθε σημείο των δεδομένων αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή των έξι πανομοιότυπα φρεάτια για κάθε κυτταρική γραμμή όγκου και της συγκέντρωσης αναστολέα. IC50s προσδιορίστηκαν με μη γραμμική παλινδρόμηση χρησιμοποιώντας το λογισμικό Prism Graphpad.

Western Blots

Η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται και διαχωρίζεται με ηλεκτροφόρηση γέλης με λύση κυττάρων σε ρυθμιστικό που περιέχει 50 mM Tris-HCl (ρΗ 7.4 ), 150 mM NaCl, 2.5 mM EDTA, 1% Triton Χ-100, και 0,25% IGEPAL. αναστολείς της πρωτεάσης (Roche Applied Science) και αναστολείς φωσφατάσης (Calbiochem) προστέθηκαν πριν από τη χρήση. Πριν από τη φόρτωση στην πηκτή, τα δείγματα κανονικοποιήθηκαν για ολική περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες. Σύνολο προϊόντα λύσης πρωτεΐνης βράσθηκαν εντός ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος, διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE σε πηκτώματα 8% πολυακρυλαμιδίου, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF, και ανιχνεύθηκαν για όλη τη νύχτα με χρήση των κατάλληλων πρωτογενή αντισώματα. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοαποτύπωση ήταν: αντίσωμα αντι-FGFR1 (# 3472, Cell Signaling Technologies, Danvers, ΜΑ, ΗΠΑ), αντι-φωσφο FRS2 Y436 (# 3861, Cell Signaling Technologies, Danvers, ΜΑ, ΗΠΑ), αντι-φωσφο -FRS2 Y196 (# 3864, Cell Signaling Technologies, Danvers, ΜΑ, ΗΠΑ), αντι-FRS2 (# sc-17841, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). αντι-WHSC1L1 μονοκλωνικό αντίσωμα (# SC-130009, Santa Cruz Biotechnology), αντι-LETM2 μονοκλωνικό αντίσωμα (# ab84626, Abcam), και αντι-ακτίνης μονοκλωνικό αντίσωμα (# sc-1615, Santa Cruz Biotechnology).

Στατιστική Ανάλυση

συγκρίσεις μεταξύ των δεδομένων αριθμός SNP συστοιχία αντίγραφο για αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα (AC) και καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (SCC) όγκοι έγιναν χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher Τ να υπολογίζει δύο ουρών ρ-τιμές μεταξύ δειγμάτων που φιλοξενεί υψηλού επιπέδου ενίσχυση, που ορίζεται ως λόγος log2 & gt? 0,7 ή 3,25 κανονικοποιημένη αντίγραφα DNA. Ρ τιμές & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Για τον προσδιορισμό της IC50 για τους αναστολείς FGFR, οι μετρήσεις κυτταρικής βιωσιμότητας των έξι επαναλήψεων σε διάφορες συγκεντρώσεις των αναστολέων κανονικοποιήθηκαν προς μη κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Οι καμπύλες απόκρισης δόσης Σιγμοειδή προσαρμόσθηκαν στα δεδομένα από μη γραμμικής παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας λογισμικό GraphPad Prism. Οι τυπικές αποκλίσεις προσδιορίστηκαν για τη μέση της κάθε τιμής χρησιμοποιώντας ένα ενσωματωμένο δομοστοιχείο του λογισμικού.

Για πειράματα shRNA, που εκτελούνται σε τρεις επαναλήψεις, ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε και η μέση και τυπική απόκλιση προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας συναρτήσεις στο Microsoft Excel.

Αποτελέσματα

FGFR1

ενισχύεται σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα

Εξετάσαμε την γενωμική περιοχή 8p11-12 χρησιμοποιώντας ποικιλία Affymetrix 250K SNP δεδομένα αριθμό αντιγράφων σε ένα προηγουμένως αναφερθεί σύνολο δεδομένων 732 δειγμάτων NSCLC, (628 πρωτογενείς όγκους και 104 κυτταρικές γραμμές) (Πίνακας S1) [16], [20], [45], [50], [52]. Παρατηρήσαμε ενίσχυση υψηλού επιπέδου, που ορίζεται ως λόγος log2 & gt? 0,7 ή 3,25 κανονικοποιημένη αντίγραφα DNA, της 8p11-12 χρωμοσωμικό τμήμα που περιλαμβάνει το

FGFR1

τόπο σε 44 (6%) των δειγμάτων NSCLC (Σχήμα 1α? Πίνακας S2). Η πλειοψηφία (93%? 41/44) αυτών των ενισχύσεων ήταν σχετικά εστιακό γεγονότα (& lt? 50% του μήκους του χρωμοσώματος 8P) υποδεικνύοντας προτιμησιακή επιλογή των συγκεκριμένων γονιδίων στόχων μέσα στην περιοχή ενίσχυσης [52]. Ο συναχθεί αριθμός αντιγράφου των ενισχύσεων, κανονικοποιημένες σε ένα αριθμό αντιγράφων του 2 για κάθε δείγμα, κυμαίνονταν από 3,25 έως 25 αντίγραφα (διάμεσος = 2,8 αντίγραφα). Η εκτιμώμενη έκταση της περιοχής του εστιακού ενισχύσεις κυμάνθηκε 0,47 έως 112,7 Mb (διάμεσος = 2.74 Mb)

(Α) Αντιγραφή αριθμού εκτιμά σε 8p11-12q βραχίονα του χρωμοσώματος 44 δείγματα NSCLC (στήλες?. Παραγγείλει από την ενίσχυση της 8p11) έχει ενίσχυσης μεγαλύτερη από 3,25 αντίγραφα (αναλογία log2 0,7) από μια συλλογή 732 NSCLC πρωτογενών δειγμάτων και κυτταρικών σειρών. Η οριζόντια γραμμή δείχνει την περιοχή που περιέχει

FGFR1

,

LETM2

και

WHSC1L1

γονίδια. Η χρωματική κλίμακα κυμαίνεται από μπλε (διαγραφή) σε κόκκινο (ενίσχυση) με εκτιμώμενο αριθμό αντιγράφων εμφανίζεται. Γκρι περιοχές αντιπροσωπεύουν την απουσία των SNP δεδομένων αριθμού αντιγράφων. (Β) ιστόγραμμα που απεικονίζει τα ποσοστά των δειγμάτων που φιλοξενούν 8p11-12 ενίσχυση σε αδενοκαρκινώματα πνεύμονα (AC) και καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (SCC) αποδεικνύει ότι

FGFR1

ενίσχυση παρατηρείται σε SCC σε πολύ μεγαλύτερη συχνότητα από AC. (C) έκφραση FGFR1 (άνω πάνελ) που φαίνεται στο δέκα NSCLC κύτταρα? οκτώ κυτταρικές σειρές που φιλοξενούν

FGFR1

ενίσχυση-HCC1734, HCC95, NCI-H2444, Calu3, NCI-H2077, NCI-H1703, NCI-H1581 και NCI-H520 (υποδεικνύονται με κόκκινο οριζόντια γραμμή κάτω) -όνη NSCLC κυττάρων γραμμή που φιλοξενεί διαγραφή της HCC15 περιοχής (που υποδεικνύεται από το μπλε οριζόντια γραμμή κάτω) – και τρεις NSCLC κύτταρα χωρίς ενίσχυση-Α427, ΝΟΙ-Η226, ΝΟΙ-H2170 (υποδεικνύεται από το μαύρο οριζόντια γραμμή κάτω) – χρησιμοποιώντας ακτίνη ως μάρτυρας φόρτωσης (φαίνεται σε κατώτερο πάνελ).

FGFR1

κατάσταση αριθμό αντιγράφων και 8p11-12 καθορίζεται από σειρά SNP αμπλικόνιο μήκος υποδεικνύεται κάτω από κύτταρα που φιλοξενούν ενίσχυση. Της σημείωσης, NCI-H2077 και NCI-1581 βρέθηκαν να είναι γονοτυπικά ταυτόσημη με τη λήψη δακτυλικών αποτυπωμάτων ανάλυση.

Η

Για τον εντοπισμό περιοχών σημαντικής αριθμό αντιγράφων αλλοίωση, εφαρμόσαμε GISTIC (Γονιδιωματική προσδιορισμό των σημαντικών Στόχοι Σε Καρκίνου ) [53], και εντόπισε μια περιοχή 170 Kb στις 8p11 (38,28 – 38,45 Mb) καθώς ενισχύονται σημαντικά. Ενώ το συνολικό σχέδιο της 8p11 ενίσχυσης ήταν σύμφωνη με τη βιβλιογραφία για τον καρκίνο του πνεύμονα, όπως αναφέρθηκε, το μέγεθος του δείγματος μας και το ψήφισμα που παρέχονται περισσότερη δύναμη για να εντοπίσει με ακρίβεια και να εντοπίσουν τόσο μεγάλης κλίμακας και εστίασης χρωμοσωμικές μεταβολές σε σύγκριση με προηγούμενες εκθέσεις [45], [52 ]. Τα μόνα γονίδια εντός της περιοχής της ενίσχυσης που προσδιορίζονται στην ανάλυσή μας σε όλα τα δείγματα ήταν

FGFR1

και

LETM2

. Σε δεδομένα αριθμού αντιγράφων μας,

WHSC1L1

γενικά ενισχύθηκε με

FGFR1

και

LETM2

(41/44 δείγματα), αλλά ολόκληρη η

WHSC1L1

γονίδιο έκανε δεν εμπίπτουν στην κορυφή GISTIC (CHR8: 38,284,229-38,451,475). Συγκεκριμένα, τρία δείγματα πρωτογενούς όγκου με ενισχυμένο

FGFR1

και

LETM2

γονίδια είχαν σημεία διακοπής αμπλικόνιο στο

WHSC1L1

, εξηγώντας τον αποκλεισμό του

WHSC1L1

από την GISTIC μέγιστη ενίσχυση (Σχήμα S1? Εικόνα S2). Τα όρια ευαισθησίας αμπλικόνιο στο

WHSC1L1

συνάδουν με την έλλειψη ενίσχυση του λειτουργικού τομέα SET (CHR8: 38,265,630-38,255,125) που συνδέονται με την ενζυματική δραστηριότητα της ιστόνης μεθυλοτρανσφεράσης του γονιδιακού προϊόντος [56]. Τα αποτελέσματα αυτά δεν αποκλείουν

WHSC1L1

ως στόχο της ενίσχυσης στις 8p11, μαζί με το

FGFR1

αλλά δείχνουν ότι ιστονών μεθυλοτρανσφεράσης δραστηριότητα του δεν είναι πιθανό να στοχεύουν ειδικά για ενίσχυση.

κατά τη σύγκριση των υποτύπων του NSCLC πρωτογενών όγκων και κυτταρικές σειρές, 3,4% (20/588) των αδενοκαρκινωμάτων και το 21% (12/57) των ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα έτρεφε 8p11 πολλαπλασιασμούς, υποδεικνύοντας ότι ενώ 8p11 ενισχύεται σε αξιόλογο συχνότητες στα δύο μείζονα NSCLC υποτύπους, είναι κατά προτίμηση ενισχύεται σε κλώνοι ενός κυττάρου (

ρ

& lt? 0,001, ακριβής δοκιμή Fisher) (Σχήμα 1β). Δεν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις παρατηρήθηκαν μεταξύ της παρουσίας 8p11 ενισχύσεις και διαθέσιμες κλινικές παραμέτρους, συμπεριλαμβανομένων ιστολογία, βαθμός ιστολογικής διαφοροποίησης, το στάδιο σε χειρουργική εκτομή των όγκων και την ηλικία, το φύλο ή την εθνικότητα αναφέρθηκαν από τους ασθενείς (Πίνακας S3). Επιπλέον, στοχευμένη αλληλουχίας της περιοχής της κινάσης του

FGFR1

σε 52 κυτταρικές σειρές NSCLC και του συνόλου του

FGFR1

κωδική αλληλουχία σε τρεις κυτταρικές σειρές (NCI-H1581, NCI-H1703, H2170-NCI ) δεν αποκάλυψαν καμία ένδειξη μεταλλάξεις της περιοχής της κινάσης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Τα στοιχεία πίνακα SNP αποκάλυψε μια υπερυψωμένη

FGFR1

αριθμού αντιγράφων γονιδίου σε 11 κυτταρικές σειρές NSCLC από 104 κυτταρικές σειρές NSCLC αναλύθηκαν (Σχήμα S3) με ενισχύσεις που παρατηρήθηκαν σε 36% (4/11) των πλακωδών κυττάρων γραμμών NSCLC δοκιμάστηκαν. Εξετάσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης FGFR1 με ανάλυση ανοσοαποτύπωσης σε 8 πρωτογενείς κυτταρικές σειρές NSCLC που φιλοξενούν εστιακή ή ευρεία 8p11 ενίσχυση παραπάνω αναλογία log2 1,6 ή 6,0 κανονικοποιημένη αντίγραφα του DNA (NCI-H1703, NCI-H2444, NCI-H520, NCI-1581, NCH -H2077, Calu3, NCI-H1734, και HCC 95), 3 που έχουν περίπου ουδέτερο

αριθμό αντιγράφων FGFR1

(NCI-2170, NCI-H226 και Α427) και 3 που φιλοξενούν

FGFR1

διαγραφής (NCI-H1781, NCI-H1563 και HCC15) με ανάλυση ανοσοστυπώματος. Βρήκαμε 6 από 8

FGFR1

ενισχύεται κυτταρικές σειρές NSCLC υπερεκφράζουν FGFR1 σε σύγκριση με κυτταρικές σειρές που δεν φιλοξενούν ενίσχυση, με τις εξαιρέσεις του NCI-H1703 και τα κύτταρα Calu3 (Σχήμα S4? Σχήμα 1γ). Συνεπής με αυτή τη διαπίστωση, NCI-H1703, το οποίο φιλοξενεί μια ενίσχυση 8p11, έχει αποδειχθεί ότι δεν είναι εξαρτάται από την

FGFR1

[44], αλλά για ενισχυμένο

PDGFRA

[19], [20] . Επιπλέον, παρατηρήθηκε ένα αυξημένο επίπεδο της φωσφορυλίωσης του υποστρώματος FRS2 FGFR1 σε κύτταρα καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου NCI-H1581 μεταφέρουν εστιακό ενίσχυση του

FGFR1

, αλλά όχι σε κύτταρα που φιλοξενούν σχετικώς ευρύτερο επίπεδα

FGFR1

ενίσχυση (Σχήμα S4).

FGFR1

απαιτείται για την επιβίωση μιας κυτταρικής σειράς NSCLC υπόθαλψη εστιακό ενίσχυση

με βάση την ανάλυση του αριθμού αντιγράφων μας,

FGFR1

και

LETM2

εμπίπτει στο GISTIC καθορισμένη περιοχή στατιστικά σημαντική ενίσχυση με

WHSC11

ακριβώς δίπλα. Για τον προσδιορισμό της κυτταρικής απαίτηση για τα γονίδια στην περιοχή στοχεύει η ενίσχυση, εκτιμήσαμε την απαίτηση του

WHSC1L1

,

LETM2

και

FGFR1

έκφραση για τη συντήρηση του όγκου κατά καταστρέφουν τους μεμονωμένα χρήση shRNA. Η επιμόλυνση με πέντε shRNA κατασκευές στόχευσης είτε

WHSC1L1

ή

LETM2

είχε καμία διαφορετική επίδραση στην επιβίωση των κυττάρων που φιλοξενούν εστιακή ή ευρείας 8p11-12 ενίσχυση σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου χωρίς την ενίσχυση (τα δεδομένα δεν φαίνεται).

σε αντίθεση, τρεις από τους πέντε shRNA κατασκευές στόχευσης

FGFR1

, τα οποία οδήγησαν σε 3- έως 5-φορές μείωση σε επίπεδα πρωτεΐνης FGFR1 σχέση με τους ελέγχους shRNA (Εικόνα 2α), ανέστειλε σημαντικά την επιβίωση των κυττάρων σε μια κυτταρική γραμμή NSCLC που μεταφέρουν ένα εστιακό

FGFR1

ενίσχυση (NCI-H1581? Εικόνα 2b). shRNA κατασκευάζει # 3 και # 4, η οποία δεν οδήγησε σε σημαντική εξουδετέρωση των επιπέδων της πρωτεΐνης FGFR1, δεν επηρέασε την επιβίωση των κυττάρων που φιλοξενούν 8p11 ενίσχυση (Σχήμα 2β). Δεν υπήρξαν επιδράσεις που παρατηρούνται επιβίωση του

FGFR1

shRNA σε κυτταρικές σειρές που φιλοξενούν σχετικά ευρύτερο

FGFR1

ενίσχυση (NCI-H1703, HCC95, HCC1734, Calu3? δεν απεικονίζεται) ή χωρίς

FGFR1

ενίσχυση (NCI-H2170?. Σχήμα 2c HCC15, NCI-H1563 και ΝΟΙ-H1781? δεν φαίνεται). Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν ότι

FGFR1

έκφρασης είναι απαραίτητη για τη βιωσιμότητα της κυτταρικής σειράς τουλάχιστον ένα NSCLC μετέφερε

FGFR1

ενίσχυσης.

(Α) Επίδραση των πέντε

FGFR1

shRNA κατασκευάσματα για έκφραση πρωτεΐνης σε κύτταρα FGFR1 NCI-H1581 όπως προσδιορίζεται με ανοσοκηλίδωση. Τα siRNAs # 1, # 2 και # 5 αποτελεσματικά γκρεμίζω ενδογενούς έκφρασης FGFR1 σε κύτταρα NCI-H1581 μολυνθεί με shRNA εκφράζουν φακοϊούς ενώ Τα siRNAs # 3 και # 4 δεν το κάνουν. Actin παρουσιάζεται ως έλεγχος φόρτωσης (κάτω πάνελ).

(Β

και

C)

, μόλυνση με τρία ανεξάρτητα φουρκέτες FGFR1-καταστολή (# 1, # 2 και # 5) αναστέλλει την επιβίωση των κυττάρων NCI-H1581 υπερεκφράζουν

FGFR1

(Β), αλλά δεν αναστέλλει την επιβίωση των κυττάρων που δεν φιλοξενούν

FGFR1

ενίσχυση, NCI-H2170 (Γ), όπως αξιολογείται με δοκιμασία WST. NI, καμία μόλυνση. shGFP, έχασε φουρκέτα ειδικό για πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη χρησιμοποιείται ως αρνητικός μάρτυρας. Όλα τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν για την επιβίωση των κυττάρων που έχουν μολυνθεί με shGFP.

Η

Για να επικυρώσετε περαιτέρω η ειδικότητα των αλλαγών κυτταρικής βιωσιμότητας που συνδέεται με shRNA που προκαλείται FGFR1-εξάντληση, εξετάσαμε την ικανότητα των έκτοπη έκφραση του

FGFR1

cDNA για να διασώσει τα αποτελέσματα της FGFR1 γκρεμίζω. Άγριου-τύπου

FGFR1

cDNA, που δεν έχει την 3′-αμετάφραστη περιοχή (UTR) του mRNA ενδογενούς FGFR1 στοχεύονται από FGFR1 shRNA # 1, ήταν υπερ-εκφράζεται σε κύτταρα NCI-H1581 επιμολυσμένα με αυτή την κατασκευή shRNA. Ανασυσταθούν τα επίπεδα της πρωτεΐνης άγριου τύπου FGFR1 οδήγησε σε σημαντική διάσωση του φαινοτύπου αναστολή επιβίωσης (Σχήμα 3α, γ), αλλά δεν είχε καμία επίπτωση στο

FGFR1

ανεξάρτητη από κύτταρα NCI-H2170 (Σχήμα 3β). Συλλογικά, αυτά τα πειράματα εμπλέκουν

FGFR1

ως κρίσιμο ογκογόνο στόχο της 8p11-12 ενίσχυσης.

(Α) Μπαρ γράφημα για προσδιορισμό διάσωσης. Θνησιμότητα λόγω της εξάντλησης των επιπέδων στο ενδογενές επίπεδο FGFR1 σε NCI-H1581 διασώζεται από υπερέκφραση του άγριου τύπου (Wt) πλήρους μήκους

FGFR1

κωδικοποιητική αλληλουχία. (Β) Καμία επίδραση στην επιβίωση των κυττάρων NCI-H2170 παρατηρήθηκε οφείλονται στην υπερβολική έκφραση του άγριου τύπου μορφή του FGFR1. NCI-H2170 δεν εξαρτάται από την δραστηριότητα FGFR1. NI, καμία μόλυνση. shGFP, έχασε φουρκέτα ειδικό για πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη χρησιμοποιείται ως αρνητικός μάρτυρας. Όλα τα αποτελέσματα κανονικοποιούνται για την επιβίωση των κυττάρων που έχουν μολυνθεί με shGFP. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται είναι ως μέσος όρος των τριών επαναλήψεων. (Γ) Επικύρωση των FGFR1 διάσωσης από ανοσοαποτύπωση. Απεμπλουτισμένο επίπεδα της ενδογενούς επιπέδου FGFR1 στα κύτταρα NCI-H1581 μολυνθεί με

FGFR1

shRNA εκφράζουν φακοϊούς στοχεύουν στην FGFR1 3’ΙΙΤΡ (λωρίδα 1) διασώζεται από υπερέκφραση του άγριου τύπου μορφή του FGFR1 cDNA λείπει η 3’UTR (γραμμή 2) με ταυτόχρονη μέτρια διάσωσης στο επίπεδο της τυροσίνης υπολειμμάτων φωσφορυλίωση του υποστρώματος FRS2 FGFR1 (μεσαίο πάνελ). Ακτίνης παρουσιάζεται ως έλεγχος φόρτωσης (κάτω πάνελ).

Η

Είναι ενδιαφέρον, μια κυτταρική σειρά NSCLC που μεταφέρουν ένα κομβικό

FGFR1

ενίσχυση, NCI-H2444 (Σχήμα S3), δεν ήταν ευαίσθητη να knockdown του FGFR1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτή η κυτταρική σειρά φιλοξενεί επίσης μια ενεργοποίησης

KRAS

G12V μετάλλαξη [57], [58], η οποία συνδέεται με την αντίσταση του παχέος εντέρου στον EGFR-κατευθυνόμενη θεραπεία cetuximab [25]. NCI-H2444 δεν δείχνει φωσφορυλίωση FRS2 (Σχήμα S4). Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει ότι η συνύπαρξη άλλων ογκογονιδίων ενεργοποίηση μπορεί να ανακουφίσει

FGFR1

εξάρτηση και συγκεκριμένα ότι πρωτογενή αντοχή στην αναστολή FGFR1 μπορεί να διέπεται από το

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης.

FGFR οι αναστολείς κινάσης αναστέλλει την ανάπτυξη του

FGFR1

ενισχυμένα κύτταρα NSCLC

Για να αξιολογηθεί η πιθανότητα ότι η στόχευση

FGFR1

στην 8p11 ενισχυμένο ΤΣΡ θα μπορούσε να αποτελέσει μια νέα θεραπευτική στρατηγική στην ΕΕΑΚ μελετήσαμε το επιδράσεις του αναστολέα PD173074 παν-FGFR σε κυτταρικές σειρές NSCLC. Η

FGFR1

-amplified κύτταρα NCI-H1581 ήταν ευαίσθητα στη θεραπεία με PD173074 όπως προσδιορίζεται με σχηματισμό αποικιών σε μαλακό άγαρ με IC

’50 στην περιοχή των 10-20 ηΜ (Σχήμα 4α και η Εικόνα S5). Σε αντίθεση, τα κύτταρα NCI-H2170 με άγριου τύπου

FGFR1

αριθμός αντιγράφων ήταν ευαίσθητα στην PD173074 (Σχήμα 4α). Πραγματοποιήσαμε επίσης καμπύλες απόκρισης δόσης PD173074 επί της επιβιώσεως των κυττάρων σε υγρή καλλιέργεια για να συγκριθεί η ευαισθησία των κυττάρων που φιλοξενούν

FGFR1

ενίσχυση και εκείνων χωρίς και πάλι βρέθηκε ότι τα κύτταρα NCI-H1581 θανατώθηκαν σε τιμές IC50 από 14 ηΜ, ενώ εκείνα χωρίς ενίσχυση απαιτείται περισσότερο από 100 φορές υψηλότερες δόσεις PD173074 να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό (σχήμα 4β). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα αυτά, παρατηρήσαμε επίσης ότι μια δεύτερη FGFR μη αναστρέψιμο αναστολέα, FIIN-1, αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων NCI-H1581 με εστιακή

FGFR1

ενίσχυσης σε σύγκριση με το NCI-H2170 χωρίς να

FGFR1

ενίσχυση, με τιμές IC50 2,5 ηΜ έναντι μεγαλύτερη από 10 micromolar, αντιστοίχως (Σχήμα S6).

(Α) η θεραπεία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις τηγάνι FGFR αναστολέα PD173074 ανέστειλε μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικίας από το NCI-H1581 κυτταρικές σειρές NSCLC φιλοξενούν

FGFR1

ενίσχυσης, σε σύγκριση με τη γραμμή NCI-H2170, η οποία δεν τρέφουν

FGFR1

ενίσχυσης. Οι αποικίες φωτογραφήθηκαν και ποσοτικοποιήθηκαν μετά από 4 εβδομάδες. (Β) Η θεραπεία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις PD173074 ανέστειλε επιβίωση των κυττάρων NCI-H1581, αλλά όχι των κυττάρων NCI-H2170, όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία WST πραγματοποιείται μετά τη θεραπεία 4 ημερών. IC50s υποδεικνύονται.

Η

Συζήτηση

Εδώ έχουμε δείξει ότι

FGFR1

συχνά ενισχύεται σε καρκινώματα του πνεύμονα και ότι αυτή η ενίσχυση είναι εμπλουτισμένο σε ΤΣΡ πνεύμονα. Τουλάχιστον ένα NSCLC κυτταρική σειρά με εστιακά ενισχυμένο

FGFR1

απαιτεί το γονίδιο, όπως αποδεικνύεται από την εξάντληση shRNA, και είναι επίσης ευαίσθητη στην αναστολή με αναστολείς κινάσης FGFR.

Τα γονίδια εκτός από

FGFR1

έχουν προταθεί για να είναι η λειτουργική στόχος της ενίσχυσης για το τμήμα του χρωμοσώματος 8p11-8p12, κυρίως

WHSC1L1

[44] και

BRF2

[21]. Ωστόσο, πιστεύουμε ότι τα αποδεικτικά στοιχεία που παρουσιάζονται εδώ, καθώς και σε μια πρόσφατη έκθεση [22] υποστηρίζει για

FGFR1

ως λειτουργικό στόχο της ενίσχυσης σε τουλάχιστον μία κυτταρική σειρά NSCLC. Επιπλέον, σε ρυθμίσετε τα δεδομένα μας

WHSC1L1

δεν ενισχύεται σε όλες τις

FGFR1

ενισχυμένα δείγματα, υποστηρίζοντας ότι είναι απίθανο να είναι η μόνη σχετική ενισχυμένο γονίδιο στο 8p11-12 αμπλικόνιο. Η κυτταρική γραμμή που φάνηκε να απαιτεί

WHSC1L1

για την επιβίωσή του, ΝΟΙ-H1703 [44], δεν υπερεκφράζουν FGFR1 (σχήμα 1c), δεν δείχνει φωσφορυλίωση FRS2 (Σχήμα S4) και εξαρτάται από ένα άλλο ενισχυμένο ογκογονιδίου κινάσης τυροσίνης,

PDGFRA

[19], [20]. Αντίθετα, νοκ ντάουν του

WHSC1L1

δεν είχε καμία επίδραση στο

FGFR1

-amplified,

FGFR1

εκφράζοντα κύτταρα NCI-H1581, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ενίσχυση είτε γονιδίου μπορεί να συμβάλει στην κυτταρική μετατροπή στο κατάλληλο κυτταρικό περιβάλλον.

μια πρόσφατη μελέτη που χαρακτηρίζουν την ενίσχυση του DNA σε NSCLC πρότεινε ότι

BRF2

, το οποίο κωδικοποιεί ένα έναρξης της μεταγραφής σύνθετη υπομονάδα της RNA πολυμεράσης III, είναι ο στόχος της ενίσχυσης στην 8p11 αμπλικόνιο [21]. Συγκρίναμε

FGFR1

ενίσχυσης για

BRF2

ενίσχυση υπό το φως της έκθεσης αυτής και διαπίστωσε ότι 12 δείγματα με την υψηλότερη ενίσχυση της

FGFR1

στο σύνολο δεδομένων (αναλογία log2 & gt μας?