Abstract

εισβολή κυττάρων του καρκίνου είναι το κρίσιμο πρώτο βήμα της μετάστασης, όμως, λίγα είναι γνωστά για το πώς τα καρκινικά κύτταρα εισβάλλουν και να κινήσει τη μετάσταση σε ένα σύνθετο εξωκυτταρική μήτρα. Χρησιμοποιώντας μια κυτταρική γραμμή από μετάσταση στα οστά του καρκίνου του προστάτη (PC3), αναλύσαμε το πώς κύτταρα καρκίνου προστάτη μεταναστεύουν σε ένα φυσιολογικά σχετικό 3D Matrigel. Βρήκαμε ότι τα κύτταρα PC3 μετανάστευσαν πιο αποτελεσματικά ως πολυκύτταρων συστάδες από απομονωμένα απλά κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι η παρουσία προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου βελτιώνει μετανάστευση 3D κυττάρων. Η διαταραχή της λειτουργίας Ν-καντερίνης με επιμόλυνση είτε του Ν-καντερίνης κυτταροπλασματικής περιοχής ή shRNA ειδικό σε Ν-cadherin καταργούνται συλλογικές κυτταρική μετανάστευση. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα PC3 δεν εκφράζουν α-κατενίνης, μια πρωτεΐνη ακτίνη δέσμευσης στο σύμπλοκο καντερίνη. Όταν εισαχθεί εκ νέου η πλήρους μήκους α-κατενίνης, ο φαινότυπος των κυττάρων PC3 επανήλθε σε μια πιο επιθηλιακό φαινότυπο με μειωμένο ρυθμό μετανάστευσης κυττάρων σε 3D Matrigel. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι το Ν-τερματικό ήμισυ του α-κατενίνης ήταν επαρκής για να καταστείλει επεμβατική φαινότυπο. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι ο σχηματισμός κόμβων Ν-καδερίνης προωθεί 3D κυτταρική μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη, και αυτό οφείλεται εν μέρει σε μία ανώμαλη ρύθμιση του συμπλόκου Ν-καντερίνης απουσία του α-κατενίνης.

Παράθεση: Cui Υ, Yamada S (2013) Ν-καδερίνη εξαρτημένων Συλλογική κυττάρων διείσδυση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη ρυθμίζεται από το Ν-τελικό άκρο της α-κατενίνης. PLoS ONE 8 (1): e55069. doi: 10.1371 /journal.pone.0055069

Επιμέλεια: Chih-Hsin Tang, η Κίνα Ιατρικού Πανεπιστημίου, Ταϊβάν

Ελήφθη: 12 του Οκτώβρη του 2012? Αποδεκτές: 24η Δεκεμβρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 24η του Ιανουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Cui, Yamada. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ένα Beckman Νέων Ερευνητών βραβείο, ένα Hellman Οικογένεια Βραβείο Νέα Σχολή, μια ΝΙΗ EUREKA GM094798, και τα κονδύλια από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια Cancer Research Συντονιστικής Επιτροπής. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

εισβολή των κυττάρων του καρκίνου είναι το κρίσιμο πρώτο βήμα της μετάστασης και η φαινοτυπική μετάβαση από καλοήθη όγκο σε διηθητικό καρκίνο απαιτεί αλλαγές στο προφίλ της γονιδιακής έκφρασης. Για καρκίνους επιθηλιακής προερχόμενο, αυτή η μετάβαση επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά ενεργοποιείται από παράγοντες μεταγραφής που ρυθμίζουν προς τα κάτω καταστολείς όγκων και ρυθμίζουν ογκογονίδια, και πιστεύεται ότι ρυθμίζουν μετάστασης του καρκίνου [1]. Τα βασικά δείκτες επιθηλιακών και μεσεγχυματικών που καθορίζουν τις αντίστοιχες φαινότυποι είναι επιθηλιακά (Ε) και των νευρώνων (Ν) καδερίνων, και αυτός ο διακόπτης cadherin συχνά συμπίπτει με τη μετάβαση από καλοήθη σε επιθετικών καρκίνων [2].

Σε διάφορες καρκίνο κύτταρα, η μη φυσιολογική έκφραση του Ν-cadherin συσχετίζεται με την επαγωγή της κυτταρικής κινητικότητας. Για παράδειγμα, η έκφραση του Ν-καντερίνης επάγει κυτταρική μετανάστευση σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [3] – [7], το μελάνωμα [8], του καρκίνου του προστάτη [9], γαστρικού καρκίνου [10] και πλακώδες καρκίνωμα [11]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η υπερέκφραση του Ν-καντερίνης ενισχύει κυτταρική κινητικότητα και εισβολή χωρίς μείωση των επιπέδων της Ε-καδερίνης [4], προτείνοντας ότι η αυξημένη κινητικότητα των κυττάρων οφείλεται στην έκφραση του Ν-καδερίνης παρά την έλλειψη Ε-καδερίνης. Ως εκ τούτου, η σφιχτή ρύθμιση της έκφρασης Ν-καδερίνης είναι απαραίτητη φυσιολογική λειτουργία των επιθηλιακών κυττάρων. Σύμφωνα με αυτή την αντίληψη, τη ρύθμιση των Ν-καντερίνης με microRNA-145 έχει δειχθεί ότι καταστέλλει την εισβολή και τη μετάσταση σε καρκίνο του στομάχου [10].

Ενώ η κανονική λειτουργία του Ν-καντερίνης είναι να καθιερώσει κυττάρου-κυττάρου προσκόλληση, η παρουσία του Ν-καντερίνης επάγει επίσης προμεταναστευτικές σηματοδότηση. Η εξωκυτταρική περιοχή του Ν-cadherin αλληλεπιδρά με FGF υποδοχέα 1 [12], και αυτή η αλληλεπίδραση ελαχιστοποιεί την εσωτερίκευση του υποδοχέα, παρατείνοντας έτσι την ενεργοποίηση ΜΑΡΚ-ΕΚΚ [5], [6]. Περαιτέρω, Ν-καντερίνης-επαγόμενη μετανάστευση των κυττάρων εξαρτάται από μειωμένο επίπεδο Akt3 και ενεργοποίηση σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [7]. Αντίθετα, ο ρόλος της Ν-καδερίνης μεσολάβηση προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου σε μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων είναι ασαφής. Εάν διασταυρώσεις Ν-cadherin λειτουργούν παρόμοια με κόμβους Ε-καδερίνης με σταθεροποίηση των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-κυττάρου και την πρόληψη της κυτταρικής μετανάστευσης (αναστολή επαφής), τότε κόμβων Ν-cadherin θα εμπόδιζε τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Ως εκ τούτου, όπως κυτταρική διασταυρώσεις θα ήταν αντιπαραγωγικό να Ν-cadherin που προκαλείται προμεταναστευτικές σήματα.

Χρησιμοποιώντας κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη ως ένα πρότυπο σύστημα, επιδιώξαμε να αναλύσει τον τρόπο με N-cadherin ρυθμίζει καρκινικών κυττάρων εισβολής. Στον καρκίνο του προστάτη, η έκφραση Ν-καντερίνης είναι επάνω ρυθμισμένη και έκφραση Ε-καδερίνης ρυθμίζεται προς τα κάτω [13], [14]. Μια παρόμοια διακόπτης καντερίνης συνδέεται επίσης με την κλινική υποτροπή [15], και ταυτοποιήθηκε σε μεταστατικές αλλοιώσεις [16]. Επιπλέον, τα επίπεδα Ν-καδερίνης αυξήθηκε σε ευνουχισμό ανθεκτικά όγκων σε ασθενείς με εγκατεστημένη μεταστάσεις [17]. Επιπλέον, αυξημένα επίπεδα Ν-καδερίνης παρατηρήθηκαν σε όγκους του προστάτη υψηλής ποιότητας σε σύγκριση με χαμηλού βαθμού όγκους [18]. Η θεραπεία με ένα Ν-καντερίνης-ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα μείωσε τον πολλαπλασιασμό, την προσκόλληση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων του προστάτη

in vitro

, και επιβράδυνε την ανάπτυξη των πολλαπλών εγκατεστημένων ξενομοσχευμάτων, μπλοκάρει τοπική εισβολή και τη μετάσταση και, σε υψηλότερες δόσεις, οδήγησε για να ολοκληρωθεί παλινδρόμησης [9]. Λαμβανόμενες μαζί, αυτές οι μελέτες υπογραμμίζουν τη σχέση μεταξύ της έκφρασης Ν-καδερίνης και της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη, ωστόσο, ο ειδικός ρόλος της κόμβων Ν-καντερίνης κατά τη διάρκεια της εισβολής των καρκινικών κυττάρων δεν είναι γνωστή.

Προηγούμενες μελέτες επικεντρώθηκαν στη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων σε ένα δύο διαστάσεων (2D) υποστρώματος, ενώ λίγα είναι γνωστά σχετικά με το πώς κύτταρα καρκίνου προστάτη μεταναστεύουν σε μια πιο φυσιολογικώς σχετικό τρισδιάστατη (3D) μήτρας. Χρησιμοποιώντας μικροσκοπία time-lapse, διαπιστώσαμε ότι σε 3D Matrigel, καρκίνος του προστάτη (PC3) κύτταρα μεταναστεύουν σε πολυκύτταρους συστάδες, και αυτή η συλλογική κυτταρική μετανάστευση των κυττάρων PC3 ενισχύεται με την παρουσία προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου. Ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα που υπερεκφράζουν το Ν-cadherin κυτταροπλασματική περιοχή ή Ν-καντερίνης knockdown κύτταρα δεν μεταναστεύουν σε μία μήτρα 3D. Επιπλέον, όπως τα κύτταρα PC3 έλλειψη ενδογενούς α-κατενίνης, την εκ νέου έκφραση του α-κατενίνης προώθησε ένα επιθηλιακό φαινότυπο σε μια μήτρα 3D. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι κόμβους Ν-καντερίνης προώθηση 3D συλλογική κυτταρική μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη εν μέρει λόγω της απουσίας του α-κατενίνης.

Αποτελέσματα

Collective κυτταρική μετανάστευση είναι ένα μοναδικό ιδιοκτησία των κυττάρων PC3 σε 3D μήτρα

σε αντίθεση με τα άκαμπτα 2D καλυπτρίδες χρησιμοποιούνται συχνά για να μελετήσει τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, 3D Matrigel παρέχει μια μαλακή μήτρα ότι η καλύτερη μιμείται το μικροπεριβάλλον του όγκου. Συγκρίναμε τη μεταναστευτική φαινότυπο του καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές (PC3, 22Rv1, LNCaP, RWPE-1 και RWPE-2) σε 3D μήτρα. Μόνο τα κύτταρα PC3 εισέβαλαν στην περιβάλλουσα μήτρα αποτελεσματικά, ενώ 22Rv1, LNCaP, RWPE-1 και RWPE-2 κύτταρα παρέμειναν γύρο και σχηματίζονται σφαιρικές συστάδες κυττάρων που δεν έχουν προφανείς προεκτάσεις μεμβράνη (Εικόνα 1Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε 3D μήτρας, τα κύτταρα PC3 μετανάστευσαν μόνο όταν έρχονται σε επαφή με τα γειτονικά κύτταρα (Εικόνα 1Α, λευκό αιχμές βελών δείχνουν μόνο μη-μεταναστευτικά κύτταρα). Επιπλέον, τα κύτταρα PC3 ήταν άκρως μεταναστευτικών στην επιφάνεια του Matrigel επικαλυμμένα καλυπτρίδες (Σχήμα 1Β, Ταινία S1), όμως, τα κύτταρα δεν διατηρούν επαφές κυττάρου-κυττάρου επί της επιφανείας 2D και μεταναστευτικά κύτταρα πέρασαν ο ένας τον άλλον χωρίς να σχηματίζει σταθερά σε κύτταρα συμφύσεις κυττάρων (Σχήμα 1Β).

(Α) Μορφολογία των κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη σε 3D Matrigel. PC3 κύτταρα σχηματίζουν πολυκύτταρων επεμβατική συμπλέγματος αλλά 22Rv1, LNCaP, RWPE-1 και RWPE-2 κύτταρα σχηματίζουν πολυκύτταρων σφαιροειδή και δεν είναι επεμβατική. Αιχμές βελών δείχνουν ενιαία, μη-μεταναστευτικά κύτταρα PC3. Δεξιός πίνακας δείχνει ανοσοστυπώματα για Ν-καντερίνης (Ncad), Ε-καδερίνης (ECAD), α-κατενίνη (α-cat) και τουμπουλίνης (Tub) κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη. (Β) Η μετανάστευση των κυττάρων σε 2D επιφάνεια. Κόκκινο αστέρι και το μαύρο βέλος ξεχωριστά σηματοδοτήσει και να παρακολουθείτε δύο γειτονικά κύτταρα περνούν ο ένας τον άλλο χωρίς να σχηματίζει και τη διατήρηση της επαφής μεταξύ κυττάρων. Χρόνος σε λεπτά. (C) εικόνες Time-lapse των συλλογικών κυτταρικής μετανάστευσης των κυττάρων PC3 σε 3D Matrigel. Χρόνος σε ώρες. (D) Αντιπροσωπευτική τροχιές (αριστερά), μέση ταχύτητα (μέση) και από άκρο σε άκρο μετατόπισης (δεξιά) μεμονωμένων κυττάρων (Ν = 33) και πολυκύτταρων συστάδες (Ν = 43) σε 3D Matrigel (**, ρ & lt? 0,01 ). (Ε) προσθήκη EDTA διασπά αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου. Προστέθηκε ΕϋΤΑ σε τελική συγκέντρωση 1,4 mM. Χρόνος σε λεπτά. (F) Η ανοσοχρώση για Ν-καδερίνης σε κύτταρα PC3 σπάρθηκαν σε 3D Matrigel. Ν-cadherin (κλώνος 6G11) συνεντοπίζεται με ακτίνη (φαλλοϊδίνη) σε επαφές κυττάρου-κυττάρου. Το βέλος δεικνύει την επαφή κυττάρου-κυττάρου. Όλες οι μπάρες κλίμακας είναι 10 μm.

Η

Σε 3D Matrigel, επίμηκες συστάδες κυττάρων PC3 μετανάστευσαν σε μια επίμονη κατεύθυνση (Σχήμα 1 C, D, Movie S2), ενώ μόνο τα κύτταρα μετανάστευσαν τυχαία με χαμηλότερη μέση ταχύτητα και καθαρή μετατόπιση από τα μεμονωμένα κύτταρα εντός συστάδων κυττάρων (Σχήμα 1D). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η συλλογική κυτταρική μετανάστευση των κυττάρων PC3 είναι μοναδικές για τα κύτταρα που μεταναστεύουν σε 3D Matrigel, και η παρουσία των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-κυττάρου μπορεί να προωθήσει την αποτελεσματική μετανάστευση κυττάρων (ταχύτητα κυττάρου και ανθεκτικότητας) σε 3D Matrigel.

καντερίνες είναι δυναμικό ρυθμιστές της συλλογικής κυτταρικής μετανάστευσης

Δεδομένου ότι πολλές πρωτεΐνες προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου είναι το ασβέστιο-εξαρτώμενη, αναλύσαμε τις συλλογικές μετανάστευση των κυττάρων σε 3D Matrigel υπό συνθήκες χαμηλού ασβεστίου. Κατά χηλικούς ασβέστιο με EDTA, PC3 κύτταρα σε επιμήκη συστάδες διαχωριστεί από γειτονικές κυψέλες κατά τη διάρκεια των 30 λεπτών (Σχήμα 1Ε, Ταινία S3). Αυτό υποδηλώνει ότι οι πρωτεΐνες προσκόλλησης εξαρτάται από ασβέστιο (π.χ. καντερίνες) είναι πιθανό υπεύθυνοι για τις αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου PC3. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα PC3 εξέφραζαν υψηλότερα Ν-καντερίνης και χαμηλότερα επίπεδα Ε-καδερίνης σε σύγκριση με τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου 22Rv1, LNCaP, RWPE-1 και RWPE-2 του προστάτη (Σχήμα 1Α). Επιπλέον, μόνο PC3 κύτταρα εισέβαλαν στην μήτρα 3D ενώ οι άλλες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη δεν το έκανε (Σχήμα 1Α). Σε 3D Matrigel, Ν-cadherin εντοπίζεται στην κυττάρου-κυττάρου επαφή των κυττάρων PC3 (Εικόνα 1 F), γεγονός που υποδηλώνει ότι η Ν-καντερίνης μεσολαβεί αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου σε 3D μήτρα.

Η ανοσοσήμανση των Ν και Ε-καδερίνης αποκάλυψε ότι τα περισσότερα κύτταρα PC3 ήταν Ν-cadherin θετικά (Σχήμα 2Α), αλλά πολύ λίγα κύτταρα PC3 ήταν Ε-καδερίνης θετικό (Εικόνα 2Α). Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε ότι, ενώ η πλειονότητα των κυττάρων PC3 συλλογικά μετανάστευσαν σε 3D Matrigel, μερικά κύτταρα παρέμειναν σε σφαιρικά συμπλέγματα κυττάρων. Έχουμε την υποψία ότι μη-μεταναστευτικά κύτταρα PC3 μπορούν να εκφράζουν E-cadherin. Για να εκτιμηθεί με ακρίβεια ο ρόλος των δύο καντερίνες στη μετανάστευση 3D κυττάρων, τα κύτταρα PC3 υποκλωνοποιήθηκαν προς απομόνωση Ε-καδερίνης κύτταρα που εκφράζουν PC3. Είκοσι ενός υποκλώνους PC3 που δημιουργείται, οι περισσότεροι είχαν υψηλότερα υποκλώνοι ή συγκρίσιμο επίπεδο Ν-καντερίνης στα γονικά κύτταρα (βλέπε Σχήμα S1). Δύο υπο-κλώνοι επιλέχθηκαν (PC3E και PC3n) για την χαρακτηριστική έκφραση καντερίνης τους. PC3E είχαν υψηλότερο επίπεδο έκφρασης Ε-καδερίνης τόσο από το γονικό PC3 και PC3n, ενώ PC3n είχε υψηλότερο επίπεδο έκφρασης του Ν-καδερίνης (Εικόνα 2Β, C, S1). πρωτεΐνες Ε και Ν cadherin εντοπίζεται στην κυττάρου-κυττάρου επαφές PC3E και PC3n κλώνους, αντίστοιχα (Σχήμα 2C). Επιπλέον, η ανάλυση της έκφρασης καδερίνης αποκάλυψε ότι η γονική και PC3n κλώνος εξέφρασε επίσης ένα υψηλό επίπεδο της καντερίνης 11, ενώ PC3E εκφράζεται κυρίως Ε και Ρ-καδερίνης (Εικόνα 2Ε). Σε 3D Matrigel, κύτταρα PC3E δεν μεταναστεύουν και παρέμεινε ως σφαιρικές συστάδες (Σχήμα 2D, Movie S4). Σε αντίθεση, PC3n είχε μια επιμηκυμένη μορφολογία και μετανάστευσαν σε μια επίμονη κατεύθυνση παρόμοια με τα γονικά κύτταρα PC3 (Εικόνα 2D, Movie S5). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα επίπεδα έκφρασης του Ε /Ρ και Ν /11-καντερίνες αντιστοιχούν με το σφαιρικό και επιμήκη φαινότυπο σε 3D μήτρα, αντίστοιχα.

(Α) Ανοσοκηλίδωση των Ν-καντερίνης με φαλλοϊδίνη (άνω πάνελ) και Ε-καδερίνη με φαλλοϊδίνη (κάτω πίνακας) του γονικών κυττάρων PC3 απλώθηκαν σε καλυπτρίδες. (Β) Δύο αντιπροσωπευτικά υποκλώνων από τα γονικά κύτταρα PC3, PC3E και PC3n, ανοσοστυπώθηκαν για το E-cadherin και N-cadherin. Τουμπουλίνης παρουσιάζεται ως έλεγχος φόρτωσης. Οι αρχικές κηλίδες εμφανίζονται στο συμπληρωματικό σχήμα S1. (C) Ανοσο-κηλίδωση των υποκλώνων PC3 για Ε-καδερίνη και Ν-καδερίνης (κλώνος 32). (D) μορφολογίες Cell, ταχύτητα κυττάρων και κατεύθυνσης επιμονή του PC3E (Ν = 19) και PC3n (Ν = 20) κλώνους σε 3D Matrigel (**, Ρ & lt? 0,01? Ν = 11-42). Όλες οι μπάρες κλίμακας είναι 20 μm. (Ε) Heat χάρτη της ανάλυσης μικροσυστοιχιών για όλα τα επίπεδα έκφρασης καντερίνης γονική PC3, PC3E και PC3n κύτταρα.

Η

Η έκφραση της κυτταροπλασματικής περιοχής Ν-cadherin καταργεί τις συλλογικές μετανάστευση των κυττάρων

Για να αναλύσει το ρόλο του Ν-καδερίνης σε συλλογικές κυτταρική μετανάστευση, επιμολύναμε Ν-καντερίνης κυτταροπλασματική περιοχή (Ν-κυτταρο), και υποκλωνοποιήθηκε των σταθερών μορφομετατροπέων με αυξανόμενα επίπεδα Ν-κυτταροπροστατευτικές (Σχήμα 3Α). Με την παρουσία του Ν-CYTO, η ενδογενής έκφραση Ν-καδερίνης ρυθμισμένα προς τα κάτω, ενώ η ενδογενής Ε-καδερίνης ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω (Σχήμα 3Β). ανάλυση μικροσυστοιχιών επιβεβαίωσε την μειωμένη Ν-καντερίνης και αυξημένη Ε-καδερίνης προφίλ έκφρασης σε κύτταρα Ν-κυτταροπροστατευτικές (Σχήμα 3C), και περαιτέρω αποκάλυψε την προς τα πάνω ρύθμιση της Ρ-καδερίνης (Εικόνα 3C). Αμφότερα τα Ε και Ρ-καδερίνης ήταν επίσης πάνω ρυθμισμένα στο μη μεταναστευτικά PC3E κλώνος (Σχήμα 2Ε). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η ρύθμιση προς τα κάτω των αποτελεσμάτων Ν-καδερίνης στο πάνω ρύθμιση τόσο του Ε και Ρ-καντερίνες σε κύτταρα PC3. Είναι ενδιαφέρον ότι η καντερίνη 11 ήταν κάτω ρυθμισμένα σε ένα από τα Ν-κυτταρο κύτταρα που εκφράζουν (# 1) αλλά όχι σε άλλες (# 4, Εικόνα 3C).

(Α) Σχηματική απεικόνιση της πλήρους μήκους Ν -cadherin και η κυτταροπλασματική Ν-καντερίνη (Ν-κυτταρο) κατασκευάζει. Ν-cadherin κυτταροπλασματική περιοχή συντήκεται με επικράτεια στόχευσης μεμβράνης από Lyn κινάσης (μαύρο) στο Ν-άκρο και σειρά διμερές-ντομάτα (κόκκινο) στο Ο-άκρο. (Β) Τα ανοσοστυπώματα για Ν-καντερίνης εξωκυτταρική περιοχή (κλώνος 8C11), Ν-cadherin κυτταροπλασματική περιοχή (κλώνος 32), και Ε-καδερίνη (κλώνος 36) σε Ν-κυτταρο εκφράζουν υποκλώνων PC3 κυττάρων. # 1, # 2, # 3, # 4 είναι τέσσερις πληθυσμοί Ν-CYTO κυττάρων με βαθμιαία αυξημένα επίπεδα Ν-cyto. (C) Heat χάρτη της ανάλυσης μικροσυστοιχιών για όλα τα επίπεδα καντερίνης PC3, Ν-κυτταρο # 1 και Ν-κυτταροπροστατευτικές # 4 κύτταρα. (D) Ανοσο-χρώση εξωκυτταρικής περιοχής του Ν-καδερίνης (κλώνος 8C11), με φαλλοϊδίνη σε γονικά κύτταρα PC3 (άνω πλαίσιο) και Ν-κυτταροπροστατευτικές # 4 κύτταρα (κάτω πίνακας). Ν-κυτταρο εντοπισμός ανιχνεύθηκε με το σήμα tandem-ντομάτα (κάτω πίνακας). μπαρ κλίμακα 10 μm. (Ε) Η στατιστική ανάλυση των Ν-κυτταρο εκφράζει PC3 κυττάρων 3D μετανάστευσης. Μέση ταχύτητα και από άκρο σε άκρο απόσταση δείχνονται (**, Ρ & lt? 0,01? Ν = 42 για γονικά κύτταρα και N = 11 για Ν-κυτταρο κύτταρα). Οι ράβδοι σφαλμάτων είναι τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής. μπαρ κλίμακα, 40 μm.

Η

Αντί για μια χαλαρά οργανωμένη και elongatged μορφολογία σε 2D επιφάνεια, Ν-κυτταρο κύτταρα που εκφράζουν είχε στενότερη επαφή μεταξύ κυττάρων από τα γονικά κύτταρα. Η ανοσοχρώση για την εξωκυττάρια περιοχή του Ν-καντερίνης ανιχνεύονται χαμηλά επίπεδα ενδογενούς Ν-καντερίνης που δεν είχαν εντοπιστεί στο κύτταρο-κύτταρο επαφές (Σχήμα 3D). Σε 3D Matrigel, τόσο Ν-κυτταρο # 1 και # 4 κύτταρα σχηματίζονται σφαιρικά σμήνη και δεν ήταν επεμβατική (Σχήμα 3Ε, Movie S6). Αν και αυτά τα δύο Ν-κυτταρο κλώνους έκφρασης μοιράζονται το ίδιο μη επεμβατική φαινότυπο σε 3D Matrigel, έχουν διακριτά καντερίνης 11 επίπεδα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η έκφραση της καντερίνης 11 είναι ανεξάρτητη από τον φαινότυπο μετανάστευση PC3 κυττάρων και συμπεριφορά σε 3D Matrigel.

κατασιγάσει Ν-cadherin καταργεί τη μετανάστευση των κυττάρων σε 3D Matrigel

Για να καθοριστεί περαιτέρω εάν Ν-cadherin είναι ο κύριος ρυθμιστής της μετανάστευσης 3D κυττάρων, είμαστε σταθερά σιγήσει Ν-καντερίνης στα κύτταρα PC3. Από τις τρεις Ν-cadherin ειδικές αλληλουχίες shRNA δοκιμαστεί και 44 επιμολυσμένους κλώνους που αναλύθηκαν, δύο κλώνους με 50% (Kd1) και μείωση 99% (Kd2) ενδογενούς Ν-cadherin απεικονίζεται. Η ομάδα ελέγχου με αντίστοιχες περιπλεγμένο αλληλουχίες (sCR1, SCR2) έδειξε παρόμοια επίπεδα Ν-καντερίνης για γονικά κύτταρα PC3 (Εικόνα 4Α, Β). Υπολειμματική ενδογενούς Ν-καδερίνης παρατηρήθηκε σε κύτταρα Kd1, αλλά όχι σε κύτταρα Kd2 (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, αποσιώπηση του Ν-καντερίνης δεν άλλαξε Ε-καδερίνης και καντερίνη 11 επίπεδα σε κύτταρα Kd1 και Kd2 (Σχήμα 4Α).

(Α) ανοσοστυπώματα για Ν-cadherin, Ε-καδερίνης και καντερίνη 11 σε Ν -cadherin knockdown κύτταρα και κύτταρα επιμολυσμένα με περιπλεγμένο αλληλουχίες. Τουμπουλίνης παρουσιάζεται ως έλεγχος φόρτωσης. Kd1, Kd2 είναι δύο νοκ ντάουν κλώνους. SCR1, SCR2 είναι δύο κλώνοι επιμολυσμένων με αντίστοιχες κωδικοποιημένα ακολουθίες. (Β) Η ανοσοχρώση Ν-καντερίνης στα κύτταρα ελέγχου (άνω πλαίσιο) και knockdown κυττάρων (κάτω πίνακας). (C) Cell συνολικό σχηματισμό knockdown κυττάρων και των κυττάρων ελέγχου επί 3 ώρες σε εναιώρημα. Στο ώρα 0, 1, 2, 3 σε εναιώρημα, οι αριθμοί των κυτταρικών συσσωματωμάτων αναλύθηκαν ήταν 144, 101, 133, 62 για τα γονικά κύτταρα PC3, 147, 117, 107, 81 για τα κύτταρα Kd1, 142, 121, 107, 73 για κύτταρα Kd2, 146, 115, 87, 88 για τα κύτταρα sCR1, 131, 147, 107, 68 για τα κύτταρα SCR2, αντίστοιχα. μετανάστευση (D) 3D κυττάρων αναλύσεις της γονικής (Ν = 17), σκαρφάλωμα shRNA (Ν = 17 για το sCR1, Ν = 20 για SCR2) και knockdown κυττάρων (Ν = 37 για Kd1, Ν = 33 για Kd2). Η στατιστική ανάλυση της μέσης ταχύτητας εμφανίζεται (**, Ρ & lt? 0,01). Όλες οι γραμμές σφάλματος είναι το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής. Όλες οι ράβδοι κλίμακας είναι 20 μm.

Η

Παρά το μειωμένο επίπεδο του Ν-καδερίνης, τα κύτταρα knockdown ακόμη σχηματίζεται κυτταρικών συσσωματωμάτων παρόμοια σε μέγεθος με γονικά κύτταρα PC3 σε εναιώρημα (Σχήμα 4C), προτείνοντας ότι η παρουσία άλλων καντερίνες, π.χ. καντερίνης 11, μπορεί να είναι επαρκής για το σχηματισμό επαφή κυττάρου-κυττάρου. Ωστόσο, σε 3D Matrigel, το μερικώς knockdown κυττάρων (Kd1) επιμηκύνεται όμοια με τα μητρικά κύτταρα, αλλά σχηματίζονται πολύ πιο χαλαρές συστάδες κυττάρων (Εικόνα 4D). Τα κύτταρα πλήρες νοκ ντάουν (Kd2) παρέμεινε γύρο με ελάχιστη επεκτάσεις μεμβράνη σε 3D Matrigel (Σχήμα 4D). Σε αντίθεση με τις γονικές ή ομελέτα shRNA επιμολυσμένα κύτταρα, τα κύτταρα αυτά δεν αναπτύσσουν μεγάλες επίμηκες κελί συμπλέγματα (Σχήμα 4D).

Σε 3D Matrigel, τα δύο νοκ ντάουν κυτταρικές σειρές δεν μεταναστεύουν τόσο γρήγορα όσο η γονική ή ως κωδικοποιημένο shRNA επιμολυσμένα κύτταρα. Ενώ τα κύτταρα Kd1 μετανάστευσαν με μείωση κατά 50% στην ταχύτητα, τα κύτταρα Kd2 ήταν σχεδόν ακίνητος (Σχήμα 4D, Ταινία S7). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι, σε 3D Matrigel, Ν-cadherin ρυθμίζει τόσο την επιμήκη μορφολογία και την ανάπτυξη του κυττάρου συμπλέγματα, εκτός από την κυτταρική μετανάστευση.

Η έκφραση της α-κατενίνης επανέρχεται PC3 κυττάρων σε φυσιολογικά επιθηλιακά φαινότυπο

καντερίνες παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στο σχηματισμό και τη διατήρηση ισχυρές συγκολλήσεις μεταξύ κυττάρων και απαιτούν υποστήριξη από το υποκείμενο ακτίνης κυτταροσκελετό να διατηρήσει επαφές κυττάρου-κυττάρου. Ένα βασικό μέλος του συμπλέγματος καδερίνης, α-κατενίνης, περιέχει μια περιοχή σύνδεσης στο Ο-άκρο ακτίνης. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε αντίθεση με 22Rv1 ή LNCaP κύτταρα, κύτταρα PC3 δεν εκφράζουν α-κατενίνης (Σχήμα 1Α, 5Α). Για να κατανοήσουμε πώς η έκφραση α-κατενίνης επηρεάζει Ν-cadherin εξαρτώμενη συλλογική κυτταρική μετανάστευση, έχουμε σταθερά επιμολυσμένα GFP-tagged α-κατενίνης σε κύτταρα PC3 (Εικόνα 5Α, Β). Οι GFP- α-κατενίνης που εκφράζουν κύτταρα είχαν μια ελαφρά αύξηση στο επίπεδο Ν-καντερίνης και μια ελαφρά μείωση στο επίπεδο Ε-καδερίνης σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα (Σχήμα 5Α). Είναι ενδιαφέρον ότι η α-κατενίνη που εκφράζουν κύτταρα σχηματίζονται αυστηρότερο επαφές κυττάρου-κυττάρου σε πιο συμπαγή συστάδες κυττάρων σε σύγκριση με τα χαλαρά οργανωμένη, επιμήκη γονικά κύτταρα επί 2D επιφάνεια (Σχήμα 5Β). Επιπλέον, η GFP ετικέτα α-κατενίνης εντοπισμένη σε επαφές κυττάρου-κυττάρου (Σχήμα 5Β), και συν-εντοπισμένη με Ν-καδερίνης (Εικόνα 5C).

(Α) ανοσοστυπώματα για α-κατενίνης, Ν-cadherin και Ε-καδερίνης σε α-κατενίνης εκφράζοντα κύτταρα. Τουμπουλίνης παρουσιάζεται ως έλεγχος φόρτωσης. LNCaP χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για α-κατενίνης και της Ε-καδερίνης. (Β) Εντοπισμός του α-κατενίνης σε γονικά κύτταρα PC3 και GFP-tagged α-κατενίνης κύτταρα που εκφράζουν σε πάνελ πυθμένα. (C) Συν-εντοπισμός της GFP-tagged α-κατενίνης με Ν-cadherin. ανάλυση (Δ) κυτταρική συσσωμάτωση των γονικών και εκφράζουν α-κατενίνης κύτταρα σε εναιώρημα. Ένθετο: διευρυμένη απόψεις των κυτταρικών σχηματισμών. σήμα GFP επιστρώνεται πάνω φωτεινού πεδίου εικόνα GFP-tagged α-κατενίνης κύτταρα που εκφράζουν. Οι μέσες μεγέθη συνάθροιση σε κάθε χρονικά σημεία φαίνεται στο γράφημα μπαρ. (Ε) Η μετανάστευση των κυττάρων αναλύσεις σε 3D Matrigel. κανάλι GFP του GFP-tagged α-κατενίνης κύτταρα που εκφράζουν στο λευκό πλαίσιο (κάτω αριστερό πλαίσιο) δείχνεται στο κάτω δεξιά πάνελ. Στατιστική ανάλυση της ταχύτητας μετανάστευσης κυττάρου δείχνεται (**, Ρ & lt? 0,01? Ν = 35 για τα γονικά κύτταρα, Ν = 31 για GFP-α-κατενίνης που εκφράζουν κύτταρα). Όλες οι μπάρες κλίμακας είναι 20 μm.

Η

Στην ανάρτηση, α-κατενίνης συσσωματώματα κυττάρων που εκφράζουν ήταν συγκρίσιμες σε μέγεθος με γονικά κύτταρα PC3 (Εικόνα 5D). Ωστόσο, οι επαφές κυττάρου-κυττάρου του α-κατενίνης που εκφράζουν τα κύτταρα ήταν πολύ αυστηρότερο χωρίς προφανή όρια κυττάρου-κυττάρου από τα πιο χαλαρές γονική συσσωματώματα PC3 κυττάρων (Σχήμα 5D). Η συμπύκνωση των κυτταρικών συσσωματωμάτων σε α-κατενίνης κύτταρα που εκφράζουν υποδεικνύει ότι η Ν-καντερίνη προσκόλλησης διαμεσολαβείται κυττάρου-κυττάρου είναι πιθανή ενισχύεται από την παρουσία του α-κατενίνης.

Παρά την ικανότητα να σχηματίζουν προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου σε εναιώρημα ( Σχήμα 5D), α-κατενίνης κύτταρα που εκφράζουν PC3 δεν επιμηκύνονται για να σχηματίσουν μεγάλες συστάδες κυττάρων σε 3D Matrigel ως γονικά κύτταρα PC3 έκανε. Αυτά τα κύτταρα παρέμειναν ως απλά κύτταρα ή μικρά συμπλέγματα με μια πιο στρογγυλή μορφολογία (Σχήμα 5Ε). Σε 3D Matrigel, α-κατενίνης εντοπίζεται στην κυττάρου-κυττάρου επαφή των μικρών συστάδων κυττάρων (Σχήμα 5Ε). Σύμφωνα με αυτή την μορφολογία, τα κύτταρα α-κατενίνης δεν ήταν κινητικά σε 3D Matrigel (Σχήμα 5Ε, Ταινία S8). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η έκφραση α-κατενίνης ενισχυθεί Ν-καντερίνης μεσολάβηση προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου και παρεμπόδισε τη μετανάστευση των κυττάρων σε 3D Matrigel, και ότι κάτω ρύθμιση α-κατενίνης μπορεί να είναι ένα σημαντικό βήμα στη μετάσταση του καρκίνου του προστάτη.

κατασκεύασμα Το Ν-τερματικό ήμισυ της α-κατενίνης είναι επαρκής για την καταστολή της επεμβατικής φαινότυπο

για να δοκιμαστεί τους ρόλους των α-κατενίνης στη ρύθμιση προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου, μπορούμε σταδιακά περικοπεί α-κατενίνης (Σχήμα 6Α) και σταθερώς επιμολυσμένα κύτταρα PC3. Το C-τελικό άκρο της α-κατενίνης αποτελείται από ανασταλτικής περιοχής δέσμευσης βινκουλίνης (ΑΑ 509-633), και περιοχή δέσμευσης της ακτίνης (ΑΑ 697-906), η οποία απαιτεί τη σύντομη Ο-τερματικό άκρο (ΑΑ 848 – 906) για την πρόσδεση της ακτίνης [ ,,,0],19]. Το πλήρους μήκους α-κατενίνης και οι κομμένες μεταλλάξεις ήταν συγκρίσιμες σε επίπεδα έκφρασης τους (Σχήμα 6Β, S2), και η έκφραση των κολοβωμένων μεταλλάξεων δεν άλλαξε το προφίλ έκφρασης καδερίνης (Εικόνα 6Β). Ενώ όλες οι συντετμημένες μεταλλάξεις εντοπισμένες στις θέσεις της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου (Σχήμα 6C), το ακρωτηριασμένο μεταλλαγμένο κύτταρα που εκφράζουν σχηματίζεται χαλαρότερη συστάδες κυττάρων από εκείνη της πλήρους μήκους α-κατενίνης κύτταρα που εκφράζουν σε 2D επιφάνεια (Σχήμα 6C). Είναι ενδιαφέρον ότι οι μεταλλάξεις αποκοπής α-κατενίνης 1-509 και α-κατενίνης 1-848 εκφράζει κύτταρα σχηματίζονται σχετικά συμπαγή σμήνη από α-κατενίνης 1 έως 670 κύτταρα που εκφράζουν σε 2D επιφάνεια (Σχήμα 6C).

(Α ) Σχηματική πλήρους μήκους α-κατενίνης και C-τελικό κουτσουρεμένο μεταλλάξεις του. ετικέτα GFP, βινκουλίνης δεσμευτική (Vin), ανασταλτική της (Αναστέλλουν), F-ακτίνης πρόσδεσης (ακτίνη) τομέων εμφανίζεται. (Β) Τα ανοσοστυπώματα για α-κατενίνης, Ν-καντερίνης και Ε-καδερίνης σε διάφορες εκφράζουν α-κατενίνης κύτταρα. Τουμπουλίνης παρουσιάζεται ως έλεγχος φόρτωσης. 22Rv1 χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για α-κατενίνης και της Ε-καδερίνης. Οι αρχικές κηλίδες εμφανίζονται σε συμπληρωματική Εικόνα S2. (Γ) μορφολογία κυττάρων (άνω πλαίσιο) και τον εντοπισμό της α-κατενίνης (κάτω πίνακας) σε διάφορα α-κατενίνης κύτταρα που εκφράζουν PC3. ανάλυση (Δ) κυτταρική συσσωμάτωση της γονικής, διάφορα α-κατενίνης εκφράζοντα κύτταρα, και τα επεξεργασμένα κύτταρα 10 μΜ κυτοχαλασίνης D (CD). Ένθετο: διευρυμένη απόψεις των κυτταρικών σχηματισμών. σήμα GFP επιστρώνεται πάνω φωτεινού πεδίου εικόνα GFP-tagged α-κατενίνης /αποκοπής μεταλλαγμένα κύτταρα που εκφράζουν. μέγεθος συσσωμάτωση των κυττάρων σε κάθε χρόνο σημεία φαίνονται στη μέση ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου? ANOVA ανάλυση σε συνδυασμό με την δοκιμή posthoc Tukey HSD χρησιμοποιήθηκαν μεταξύ των ομάδων σε χρονικό σημείο την ώρα 3 (**, Ρ & lt? 0,01). (Ε) Η μετανάστευση των κυττάρων αναλύσεις σε 3D Matrigel για παρεντερική (Ν = 35), το πλήρους μήκους α-κατενίνης (Ν = 31), α-κατενίνης 1-509 (Ν = 73), α-κατενίνης 1-670 (Ν = 39), και α-κατενίνη 1-848 (Ν = 52) που εκφράζουν κύτταρα. Μέση ταχύτητα και την απόσταση του τελικού σημείου της μετανάστευσης φαίνονται στη μέση ± τυπικό σφάλμα του μέσου όρου? ANOVA και τεστ Tukey HSD posthoc χρησιμοποιήθηκαν (***, Ρ & lt? 0.001). Όλες οι ράβδοι κλίμακας είναι 20 μm.

Η

Τα μορφολογικά φαινοτύπους σε μια επιφάνεια 2D ήταν σύμφωνα με τα αποτελέσματα της ανάλυσης κυτταρικής συσσωμάτωσης σε εναιώρημα. Ενώ περικοπεί κύτταρα μεταλλαγμένα που εκφράζουν σχηματίζονται συσσωματώματα κυττάρων συγκρίσιμες σε μέγεθος με αυτό της γονικής και πλήρους μήκους α-κατενίνης κύτταρα που εκφράζουν, τα συσσωματώματα κυττάρων έδειξαν διαφορετικούς φαινοτύπους (Σχήμα 6D). Παρόμοια με την πλήρους μήκους α-κατενίνης εκφράζοντα κύτταρα, α-κατενίνης 1-509 κύτταρα που εκφράζουν σχηματίζεται στενή επαφή κύτταρο-κύτταρο χωρίς εμφανή κύτταρο όρια (Σχήμα 6D), υποδηλώνοντας ότι το Ν-άκρο της α-κατενίνης είναι απαραίτητη για αυτό το σφιχτό προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου. Αυτό είναι σύμφωνο με το μεταλλαγμένο α-κατενίνης που στερούνται το Ο-τερματικό άκρο απαραίτητη για δέσμευση (1-848) ήταν επίσης ικανή να επάγει σφιχτά συμπλέγματα κυττάρων, αν και πιο χαλαρή συστάδες από τα πλήρους μήκους α-κατενίνης κύτταρα που εκφράζουν ακτίνης (Σχήμα 6D ). Σημειώστε ότι η οργάνωση της ακτίνης είναι ακόμη απαραίτητη για το σχηματισμό προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου, όπως τη θεραπεία κυτοχαλασίνη εξαλειφθεί σχηματισμό συσσωμάτωση κυττάρων (Σχήμα 6D). Παραδόξως, όμως, α-κατενίνης 1-670 κύτταρα που εκφράζουν σχηματίζεται χαλαρά συσσωματώματα κυττάρων παρόμοια με εκείνη του γονικών κυττάρων (Σχήμα 6D).

Επειδή η μεταλλαγμένη α-κατενίνης που στερούνται το Ο-τερματικό άκρο απαραίτητη για ακτίνη πρόσδεσης (1-848) έντυπα σχετικά σφιχτή συστάδες κυττάρων (Σχήμα 6D), η άμεση σύνδεση κατά α-κατενίνης ακτίνης έχει μόνο έναν δευτερεύοντα ρόλο στη ρύθμιση της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου. Επιπλέον, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι, απουσία του τομέως δεσμεύσεως της ακτίνης (ΑΑ 697-906), η ανασταλτική περιοχή βινκουλίνης δέσμευσης καταστέλλει την ικανότητα να σχηματίζουν σφικτές συνδέσεις κυττάρου-κυττάρου, η οποία είναι συνεπής με την έννοια ότι βινκουλίνης απαιτείται για την ενίσχυση της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου [20], [21]. Προς υποστήριξη αυτού του μοντέλου, ελάχιστη πρόσληψη βινκουλίνης παρατηρήθηκε κατά μήκος των κυττάρου-κυττάρου επαφές του α-κατενίνης 1-670 που εκφράζουν κύτταρα (Σχήμα S3).

Παρά διαφορετικούς φαινοτύπους σε εναιώρημα, όλα περικομμένο μετάλλαγμα που εκφράζουν τα κύτταρα που λαμβάνονται παρόμοιες επιθηλιακή μορφολογία με εκείνη της πλήρους μήκους α-κατενίνης κύτταρα που εκφράζουν σε 3D Matrigel (Σχήμα 6Ε). Τα κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένη α-κατενίνης παρέμειναν ως απλά κύτταρα ή μικρά συμπλέγματα που σχηματίζονται με ελάχιστες επεκτάσεις μεμβράνη, και δεν ήταν κινητικά σε 3D Matrigel (Σχήμα 6Ε). Ενώ αυτά τα κύτταρα μεταλλάκτη που εκφράζουν α-κατενίνης έχουν διαφορετικά επίπεδα κυττάρου-κυττάρου συμφύσεις (Σχήμα 6D), η έκφραση του Ν-τερματικό ήμισυ του α-κατενίνης ήταν επαρκής για την ελαχιστοποίηση των κυττάρων εισβολή σε 3D Matrigel, υποδηλώνοντας ότι κυτταρική διεισδυτικότητα καθορίζεται από η πρωτεΐνη αλληλεπιδράσεις στο Ν-τερματικό ήμισυ της α-κατενίνης (π.χ. β-κατενίνης).

Συζήτηση

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η Ν-καντερίνης επάγει προμεταναστευτικές σηματοδότηση με άμεση αλληλεπίδραση με FGF υποδοχείς στην εξωκυτταρική περιοχή [5], ενεργοποιεί το μονοπάτι σηματοδότησης ΜΑΡΚ /ΕΚΚ [5], [6], και καταστέλλει Akt3 σηματοδότηση [7]. Ωστόσο, ο ρόλος του Ν-καδερίνης μεσολάβηση προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου σε προστάτη εισβολή των καρκινικών κυττάρων δεν έχει διερευνηθεί. Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η παρουσία Ν-καδερίνης μεσολάβηση προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου προάγει αποδοτική κυτταρική μετανάστευση με την αύξηση της ταχύτητας των κυττάρων σε μια επίμονη μεταναστευτικά μονοπάτι σε 3D Matrigel.

Αυτή η συλλογική κυτταρική μετανάστευση των κυττάρων PC3 είναι ένα μοναδικό μετανάστευση φαινότυπο εμφανίζεται μόνο σε μία μήτρα 3D. Ενώ Ν-cadherin εντοπίζεται στην κυττάρου-κυττάρου επαφή των κυττάρων PC3 επιστρώνονται σε 2D επιφάνεια (Σχήμα 2Α, 3D και 4Β), αυτά τα κύτταρα δεν διατηρούν σταθερές επαφές κυττάρου-κυττάρου και μεταναστεύουν ως απλά κύτταρα (Εικόνα 1Β). Δεδομένου ότι η έκφραση των βασικών μορίων σηματοδότησης είναι διαφορετικά σε 2D vs 3D περιβάλλον [22], όπως οι παράγοντες μπορούν να μεταβάλλουν προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου και φαινότυπο μετανάστευση. Εναλλακτικά, η διαφορά σε 2D vs 3D προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου μπορεί να είναι τα αποτελέσματα της ελαστικότητας μήτρας. Για παράδειγμα, σε αντίθεση με 3D μήτρα, δύο επαφή κυττάρων κινείται σε αντίθετη κατεύθυνση μπορεί συχνά μηχανικά διαταράξει συμφύσεων μεταξύ κυττάρων σε μια 2D επιφάνεια. Αυτό συμβαίνει επειδή το άκαμπτο υπόστρωμα 2D παρέχει μια καλύτερη πρόσφυση από μαλακό 3D μήτρα. Η διακριτή φαινότυπος μετανάστευση σε 3D μήτρα υποδηλώνει ότι κόμβους Ν-καντερίνης μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην εισβολή του προστάτη καρκινικών κυττάρων

in vivo

.

Σε αντίθεση κυττάρου-κυττάρου συμφύσεις Ε-καδερίνης μεσολάβηση που εμποδίζουν μετανάστευση κυττάρων (αναστολή επαφής, δείτε 22Rv1, LNCaP και RWPE στην Εικόνα 1Α), Ν-cadherin μεσολάβηση μεταξύ κυττάρων συμφύσεις την προώθηση της συλλογικής μετανάστευση των κυττάρων. Ένα μοναδικό χαρακτηριστικό της πρόσφυσης Ν-καντερίνης είναι η καταστολή τυχαία προεξοχές μεμβράνης των κυττάρων ακολούθου, έτσι ώστε μόνο τα κύτταρα leader μπορεί να επεκτείνει τα χείλη προσβολής. Αυτή η τοπική αναστολή επαφής διατηρεί κυτταρική πολικότητα, με διακριτή αιχμή για τη μετανάστευση των κυττάρων? Ως εκ τούτου, την εξασφάλιση της ανθεκτικότητας των συλλογικών μετανάστευση των κυττάρων. Καντερίνη-μεσολάβηση προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου έχει δειχθεί να παράγει πολωμένη μορφολογία των κυττάρων σε κύτταρα σε Xenopus mesendoderm [23] και μετασχηματισμένα επιθηλιακά κύτταρα σε μια μήτρα 3D [24]. διασταυρώσεις Ν-καντερίνης που προέρχονται επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα παρέχουν ένα σύνθημα πόλωση απαραίτητη για κατευθυντική μετανάστευση των κυττάρων σε μια μήτρα 3D.

Είναι ενδιαφέρον, cadherin 11, έναν καντερίνη τύπου II, είναι επίσης ρυθμίζεται προς τα πάνω στην ιδιαίτερα επεμβατική κλώνο του PC3 κύτταρα (PC3n, Σχήμα 2Ε), και μπορεί να είναι υπεύθυνη για το σχηματισμό των κυττάρου-κυττάρου συμφύσεων σε ελλειμματικά κύτταρα Ν-cadherin (Σχήμα 4C). Αυτό καντερίνης 11 πάνω ρύθμιση θεωρείται ότι προάγει κυτταρικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και καντερίνη 11 εκφράζουν οστεοβλάστες που είναι χαρακτηριστικό των οστών μετάσταση [25] – [27]. Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι η έκφραση της καντερίνης 11 shRNA μειώνει κυτταρική μετανάστευση των κυττάρων PC3 [26]. Ωστόσο, η παρουσία της καντερίνης 11 από μόνη της δεν είναι επαρκής για την μετανάστευση 3D κυττάρων. Για παράδειγμα, Ν-καντερίνης με ανεπάρκεια αλλά καντερίνης 11 κύτταρα που εκφράζουν δεν είναι μεταναστευτικά σε μια μήτρα 3D (βλέπε σχήμα 4). Ως εκ τούτου, η έκφραση και των δύο Ν-καντερίνης και καντερίνης 11 ή τις πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ αυτών των δύο διακριτών καντερίνες μπορεί να είναι απαραίτητη για τη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη.

Ο διακόπτης καντερίνης E-to-N παρατηρήθηκε σε κύτταρα PC3 είναι συνήθως παρατηρήθηκε σε διάφορους καρκίνους [2]. Συχνά, τα καρκινικά κύτταρα ρυθμίζουν προς τα κάτω κανονικά εκφράζεται καντερίνες (Ε-καδερίνης στην περίπτωση του προστάτη), και ρυθμίζουν μεσεγχυματικά καντερίνες (π.χ. Ν-καντερίνης, η καντερίνη 11 κλπ).