Αφηρημένο

Η ενεργοποίηση της Wnt σηματοδότησης, λόγω της αδυναμίας να υποβαθμίσει β-κατενίνης βρίσκεται σε & gt? 85% των καρκίνων του παχέος εντέρου. Περίπου το ήμισυ των καρκίνων του παχέος εντέρου εκφράζουν μια ουσιαστικά δραστική πρωτεΐνη KRAS. Ένα σημαντικό ποσοστό των ασθενών εμφανίζουν τις δύο ανωμαλίες. Αναφέραμε προηγουμένως ότι η ταυτόχρονη ρύθμιση προς τα κάτω των δύο β-κατενίνης και KRAS ήταν αναγκαία για την επαγωγή σημαντικής κυτταρικό θάνατο και την ανάπτυξη του όγκου αναστολή του ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα. Αν και ελκυστική, μια θεραπευτική προσέγγιση RNAi που βασίζονται απέχει ακόμη πολύ από το να απασχολούνται σε κλινικό περιβάλλον. Ως εκ τούτου, επιδιώξαμε να ανακεφαλαιώσουμε προηγούμενα ευρήματα μας με τη χρήση των αναστολέων μικρών μορίων της β-κατενίνης και KRAS. Δείχνουμε εδώ ότι η β-κατενίνης αναστολείς PKF115-584 και pyrvinium παμοϊκή μπλοκ β-κατενίνης-εξαρτώμενη μεταγραφική δραστηριότητα και συνεργούν με τον αναστολέα KRAS

S-trans, trans

-farnesylthiosalicylic οξύ (FTS, salirasib) στο παχύ έντερο καρκινικών κυττάρων οδηγείται από Wnt και KRAS ογκογόνα σήματα, αλλά όχι σε κύτταρα που φέρουν BRAF μεταλλάξεων. Η συνδυασμένη χρήση αυτών των ενώσεων ήταν ανώτερη από τη χρήση οποιουδήποτε φαρμάκου μόνος στην επαγωγή διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων, κυτταρικός θάνατος, MYC και survivin κάτω διαμόρφωση, και η αναστολή της ανεξάρτητο από αγκύρωση ανάπτυξη. Η ανάλυση έκφρασης των επιλεγμένων καρκίνο σχετικών γονιδίων αποκάλυψε κάτω ρύθμιση CD44 ως κοινή απάντηση στις συνδυασμένες θεραπείες. Τα στοιχεία αυτά παρέχουν μια απόδειξη της αρχής για ένα συνδυασμό θεραπευτική στρατηγική σε καρκίνο του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Mologni L, Brussolo S, M Ceccon, Gambacorti-Passerini C (2012) Synergistic επιπτώσεις της συνδυασμένης Wnt /KRAS Αναστολή στην Παχέος καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 7 (12): e51449. doi: 10.1371 /journal.pone.0051449

Επιμέλεια: Neil A. Hotchin, Πανεπιστήμιο του Birmingham, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 16 Αυγ 2012? Αποδεκτές: 31 του Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 5, Δεκεμβρίου, 2012

Copyright: © 2012 Mologni et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Ένωση ιταλική Έρευνας για τον Καρκίνο (AIRC), Cariplo Ίδρυμα, το Υπουργείο Υγείας της Ιταλίας και Λομβαρδία περιφερειακή κυβέρνηση. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι πρόσφατες πρόοδοι στην κατανόηση της βιολογίας του όγκου έχουν δείξει ότι, παρά τη μεγάλη ετερογένεια τους, τα καρκινικά κύτταρα συχνά εξακολουθούν να εξαρτώνται σε περιορισμένο υποσύνολο των γενετικών ελαττωμάτων για την επιβίωσή τους. Η επιτυχία των στοχευμένων θεραπειών στη ΧΜΛ, GIST και υποομάδες των NSCLC δείχνει σαφώς ότι ακόμη και προχωρημένη νόσο χρειάζεται την λειτουργία των ιδρυτικών ογκογονιδίων του να αναπτυχθούν και να επιβιώσουν [1], [2]. Το φαινόμενο αυτό, που αναφέρεται ως «ογκογονίδιο εθισμός», προσφέρει τη βάση για στοχευμένη θεραπεία του καρκίνου, η οποία θα πρέπει ιδανικά να είναι άνευ ανεπιθύμητων παρενεργειών σε φυσιολογικά κύτταρα [3].

καρκίνος του παχέος (CRC) χαρακτηρίζεται από καλά ονομαστές γενετικά ελαττώματα: η μεγάλη πλειοψηφία (70-95%) των σποραδικών CRCs φέρουν μεταλλάξεις που υπερ-ενεργοποίηση του μονοπατιού Wnt, τελικά, οδηγεί σε ανώμαλη έκφραση του γονιδίου της β-κατενίνης-εξαρτώμενη [4], [5], [6], [7]. Αυτές οι αλλαγές συμβαίνουν νωρίς κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου [8] και πιθανόν αντιπροσωπεύουν addicting βλάβες για τον όγκο. Πράγματι, τα κάτω ρύθμιση β-κατενίνης επάγει αναστολή της ανάπτυξης και διαφοροποίησης σε κύτταρα CRC [9]. Ωστόσο, η στόχευση β-κατενίνης αποτυγχάνει να σκοτώσει τα κύτταρα [9], [10], [11]. Αυτό μπορεί να σχετίζεται με το γεγονός ότι CRCs φέρει μια ποικιλία επιπρόσθετων μεταλλάξεων που εμφανίζονται επίσης να είναι σημαντικές για την επιβίωση. Για παράδειγμα, KRAS ενεργοποιώντας μεταλλάξεις είναι παρούσα σε περίπου 35-50% των καρκίνων του παχέος εντέρου [4], [6], [12], [13], [14]. Εάν ληφθεί η πλήρης συμπλήρωμα των μελών οδού Ras υπόψη, συμπεριλαμβανομένων των ΕΡΑ BRAF, NF1, RASSF1A και ανάντη κινάσες τυροσίνης υποδοχέα, τότε το 60-80% των όγκων παρουσιάζουν μεταβολή της οδού [7], [15], [16 ]. αποκάλυψαν δεδομένα αλληλούχισης του γονιδιώματος ότι περίπου 30-60% των δειγμάτων CRC φιλοξενούν τις δύο μεταλλάξεις μονοπάτι Wnt και Ras ταυτόχρονα [6], [7], [16]. Πρόσφατες διαγονιδιακά μοντέλα ποντικών της CRC υπογράμμισε τη σημασία της τόσο Wnt και KRAS σηματοδότησης στην ογκογένεση του παχέος εντέρου [15], [17], [18]. Ως εκ τούτου, ενδέχεται να απαιτείται διπλή στόχευση, προκειμένου να επιτευχθεί σημαντική θεραπευτική δράση.

Σε προηγούμενη εργασία μας, δείξαμε ότι το συνδυασμένο shRNA μεσολάβηση αποσιώπηση της β-κατενίνης και KRAS σε κύτταρα CRC οδήγησε σε μαζική επαγωγή απόπτωσης

in vitro

και καταστολή της ανάπτυξης του όγκου

in vivo

, ενώ ατομικά στόχευση είτε από τις δύο οδούς παρουσίασαν μέτρια αποτελέσματα [19]. Εδώ, θα προσπαθήσει να μεταφράσει τα ευρήματά μας σε μια φαρμακολογική προσέγγιση. Δύο μη συνδεδεμένοι ενώσεις με διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης, PKF115-584 και pyrvinium παμοϊκό, χρησιμοποιήθηκαν για να εμποδίσει β-κατενίνης εξαρτώμενη μεταγραφή. PKF115-584 είναι ένας ισχυρός και ειδικός αναστολέας μικρού μορίου της αλληλεπίδρασης β-κατενίνης /TCF4 και έχει επικυρωθεί ως αναστολέας της σηματοδότηση Wnt σε διάφορα μοντέλα καρκίνου του [20], [21], [22], [23]. Pyrvinium είναι ένα ανθελμινθικό φάρμακο [24] που έχει δειχθεί ότι επάγει αποικοδόμηση της β-κατενίνης και της συν-παράγοντα pygopus της, μέσω της ενεργοποίησης του 1α κινάσης καζεΐνης [25].

S

–

trans

,

trans

-farnesylthiosalicylic οξύ (FTS, salirasib) έχει περιγραφεί ως ειδικός αναστολέας RAS [26]. FTS μιμείται την καρβοξυ-τερματική

S

-farnesylcysteine ​​μεσολάβηση στρατολόγηση των RAS πρωτεϊνών στην κυτταρική μεμβράνη. Κατά συνέπεια, FTS διαταράσσει επιλεκτικά τη σύνδεση των χρονίως δραστικού RAS με τη μεμβράνη, μπλοκάροντας έτσι τη λειτουργία του [27], [28], [29].

Βρήκαμε ότι ο συνδυασμός της β-κατενίνης αναστολείς PKF115 -584 και pyrvinium παμοϊκή με τον αναστολέα RAS FTS προκαλεί συνεργικά αναστολή της ανάπτυξης και την απόπτωση στα κύτταρα CRC φιλοξενούν τόσο Wnt και KRAS ανώμαλη ενεργοποίηση. Τα στοιχεία αυτά αντιπροσωπεύουν μια απόδειξη της αρχής για τη συνδυασμένη αναστολή Wnt /RAS στον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές, αντισώματα και αναστολείς

SW837 ήταν ένα είδος δώρο Ο Δρ Manuela Gariboldi (IFOM, Μιλάνο, Ιταλία) που τους λαμβάνονται αρχικά από την ATCC. Μονάδα Βιολογίας Κυττάρου IFOM επιβεβαίωσαν την ταυτότητά τους με μικροδορυφόρων του γονότυπου. Όλες οι άλλες κυτταρικές γραμμές αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection, όπου συνήθως επαληθεύεται με χρησιμοποίηση γενοτυπικών και φαινοτυπικών δοκιμών για την επιβεβαίωση της ταυτότητάς τους. LS174T και HCT-116 κύτταρα φέρουν μεταλλάξεις στο γονίδιο CTNNB1 που σταθεροποιούν πρωτεΐνη β-κατενίνης [30]. DLD-1, SW480, LoVo και SW837 κύτταρα έχουν μια περικομμένη APC γονίδιο [31], [32]. Αυτές οι έξι κυτταρικές σειρές εκφράζουν μια μόνιμα ενεργοποιημένη KRAS πρωτεΐνη [33], [34], [35]. κυτταρικές σειρές Colo-201 HT-29 και έχουν άγριου τύπου KRAS, αλλά φιλοξενούν μια μετάλλαξη BRAF

αλληλόμορφο V600E [33], [36]. Πλήρης σχολιασμό αυτών των μεταλλάξεων αναφέρεται στον Πίνακα S1. κύτταρα LS174T σταθερά επιμολυσμένα με δοξυκυκλίνη επαγόμενο κατασκευάσματα shRNA περιγράφηκαν προηγουμένως [19]. Όλα τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (εκτός DLD-1, η οποία αναπτύχθηκαν σε DMEM και LoVo σε F12 θρεπτικό του Ham) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, 100 μg /mL στρεπτομυκίνη και 2 mmol /L L -γλουταμίνη, και επωάστηκαν στους 37 ° C με

2 ατμόσφαιρα 5% CO. LS174T κυττάρων με επαγώγιμο β-κατενίνης και KRAS shRNA περιγράφηκαν προηγουμένως [19]. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη: anti-KRAS (Abnova, κλώνος 4F3, αραιώνεται 1:1000), αντι-pygopus (Santa Cruz Biotechnology, Η-216, 1:200), αντι-myc (Santa Cruz Biotechnology, 9Ε10 , 1:200), αντι-ακτίνης (Sigma-Aldrich, 1:2000), αντι-survivin (Santa Cruz Biotechnology, D-8, 1:200), αντι-β-κατενίνης (Millipore, 2H4A7, 1:1000) . PKF115-584 παρασχέθηκε ευγενώς από τη Novartis, Inc. (Basel, Ελβετία).

S

–

trans

,

trans

-farnesylthiosalicylic οξύ (FTS) συνετέθη όπως περιγράφεται [26]. Pyrvinium παμοϊκό αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich. Όλοι οι αναστολείς διαλύθηκαν σε DMSO και αποθηκεύτηκαν σε μικρές ποσότητες στους -20 ° C.

Η κυτταρική ανάπτυξη και τον κυτταρικό θάνατο προσδιορισμούς

Η κυτταρική ανάπτυξη και η βιωσιμότητα αξιολογήθηκε στους υποδεικνυόμενους χρόνους χρησιμοποιώντας την CellTiter 96® υδατική Λύση Κυττάρου Πολλαπλασιασμού σύστημα προσδιορισμού (Promega Corporation) ακολουθώντας τις οδηγίες, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [37]. Για να αξιολογηθεί η επαγωγή της απόπτωσης, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων μία νύκτα και έπειτα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αναστολείς ή όχημα. Μετά από 72 ώρες, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με θρυψίνη, πλύθηκαν και απόπτωση προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το αννεξίνης V-FITC Apoptosis Detection Kit (Bender MEDSYSTEMS), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλα τα γραφήματα και IC

50 τιμές παρήχθησαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad.

Διπλή λουσιφεράσης δοκιμασία

Τα κύτταρα σε πλάκα 6 φρεατίων υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αναστολείς ή όχημα και επιμολύνθηκαν με 2 μg TOPflash ή πλασμίδια FOPflash και 0.1 μg του phRL-CMV (που κωδικοποιεί για το

λουσιφεράση της Renilla

, χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για αποτελεσματικότητα μορφομετατροπής) χρησιμοποιώντας 3 μΙ FuGENE

TM 6 αντιδραστήριο. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν και λύθηκαν. Λουσιφεράσης σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το Dual-Luciferase® σύστημα προσδιορισμού ανταποκριτή (Promega). Firefly ένταση λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε πάνω από το σήμα της λουσιφεράσης της Renilla

Ενεργά KRAS pull-down δοκιμασία

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με FTS ή DMSO για 15 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε λύση σε μαγνήσιο Ρυθμιστικού Λύσης (MLB: 25. mM Hepes, ρΗ 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, 1% ΝΡ-40, 0,25% δεοξυχολικό νάτριο, 10% γλυκερόλη) που περιείχε αναστολείς πρωτεάσης (10 mmol /L βενζαμιδίνη-ΗΟΙ και 10 μg /mL το καθένα απροτινίνης, λευπεπτίνη και πεπστατίνη Α). Τα προϊόντα λύσης διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση στη μέγιστη ταχύτητα και ποσοτικά με δοκιμασία Bradford. Ίση ποσότητα ολικών πρωτεϊνών (1 mg) στη συνέχεια επωάστηκαν με 10 μg του Raf-1 σφαιρίδια αγαρόζης RBD (Millipore) για 45 λεπτά στους 4 ° C σε έναν περιστρεφόμενο τροχό. Μετά από 3 πλύσεις με MLB, τα σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος 2Χ Laemmli, βράζονται και φορτώθηκαν σε SDS-PAGE. Ενεργό, τράβηξε προς τα κάτω KRAS αποκαλύφθηκε από αντι-KRAS αντισώματος. Σύνολο KRAS (είσοδος) αξιολογήθηκε από το ακατέργαστο λύμα.

Συνέργια ανάλυση

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ή αναστολείς, μονά ή σε συνδυασμό σε διαφορετικές συγκεντρώσεις και διαφορετικές αναλογίες. Μετά από 3 ημέρες, τα κύτταρα χωρίστηκαν 1:10 και επανακαλλιεργήθηκαν σε παρουσία αναστολέων. Την ημέρα 6, κυτταρικής καλλιέργειας ανάπτυξη /βιωσιμότητα παρακολουθήθηκε με δοκιμασία MTS. Σχετική αύξηση, σε σύγκριση με ελέγχους που δέχτηκαν φορέα, χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του κλάσματος που επηρεάζεται και το δείκτη συνδυασμού για κάθε πειραματικό συνδυασμό, χρησιμοποιώντας το λογισμικό CalcuSyn.

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλένεται με παγωμένο PBS και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης όπως περιγράφεται [19]. Σύνολο κυτταρικά εκχυλίσματα φορτώθηκαν σε SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και διερευνήθηκαν με τα υποδεικνυόμενα πρώτα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Οι πρωτεΐνες αποκαλύφθηκαν με χημειοφωταύγεια μετά από επώαση με συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα (GE Healthcare, αραιωμένο 1:2500).

Soft-αγάρ δοκιμασίας αποικίας

Δέκα χιλιάδες κύτταρα ενσωματωμένα σε RPMI που περιέχει την ενδεικνυόμενη ενώσεις και 0,3% χαμηλής τήξης αγαρόζη τύπου VII (Sigma-Aldrich) και σπάρθηκαν πάνω σε ένα 0,5% στρώμα υποστήριξης αγαρόζης /RPMI σε πλάκες των 6 φρεατίων. Φρέσκα αναστολείς προστέθηκαν κάθε 7 ημέρες στην κορυφή στρώμα άγαρ. Οι αποικίες μετρήθηκαν μετά από 20 ημέρες.

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα ή αναστολείς για 24 ή 72 ώρες και η συγκομιδή. Ολικό RNA εκχυλίστηκε με το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) και αναδρομικά μεταγραφομένων με τυχαία εξαμερή χρησιμοποιώντας μία τυποποιημένη διαδικασία. Για το σύνολο των 96 φρεατίων γονίδιο συστοιχίας, προς τα εμπρός και αντίστροφο εκκινητή μίγμα (5 pmol το καθένα) επισημάνθηκε στην αντίστοιχη υποδοχή για κάθε γονίδιο στόχο και οι πλάκες διατηρήθηκαν κατεψυγμένα στους -80 ° C μέχρι να χρειαστεί. Το μείγμα αντίδρασης (2 cDNA μΙ, 10 μΙ Brilliant III Ultra-Fast SYBR® Πράσινο QPCR Master Mix και 7 μΙ ύδατος, ανά φρεάτιο) προστέθηκαν στα προ-made πλάκες και ποσοτική PCR διεξήχθη σε ένα σύστημα ανίχνευσης Stratagene MX3000P, υπό οι ακόλουθες προϋποθέσεις: 95 ° C, 3 λεπτά (1 κύκλος)? 95 ° C, 10 sec, 60 ° C, 20 sec (40 κύκλοι). Η κίνηση επιβεβαίωση πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν χρησιμοποιώντας το πρότυπο πρωτόκολλο PCR πραγματικού χρόνου που συνιστώνται από τον κατασκευαστή. Το γονίδιο GAPDH housekeeping πάντοτε χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερική αναφορά. Εκκινητές για GAPDH ήταν TGCACCACCAACTGCTTAGC (προς τα εμπρός) και GGCATGGACTGTGGTCATGAG (reverse). Οι εκκινητές για όλους τους άλλους γονίδια που παρατίθενται στον Πίνακα S2.

Αποτελέσματα

έχουν

PKF115-584 (σχήμα 1Α) και pyrvinium παμοϊκό (σχήμα 1Β) έχουν δειχθεί ότι παρεμποδίζουν την β-κατενίνης -associated μεταγραφικό συγκρότημα μέσω διαφορετικών μηχανισμών. Προκειμένου να επαληθευτεί η δραστικότητα των δύο φαρμάκων σε κύτταρα CRC, χαρακτηρίσαμε τα αποτελέσματά τους στην κυτταρική σειρά LS174T, που μεταφέρουν β-κατενίνης και KRAS μεταλλάξεις ενεργοποίησης [30], [33]. Αυτή η κυτταρική γραμμή είχε αρχικά επιλεγεί ως πρότυπο, επειδή προηγουμένως είχε χρησιμοποιηθεί για τον χαρακτηρισμό των αποτελεσμάτων των siRNA μεσολάβηση γονιδιακή σίγηση [19]. Όπως αναφέρεται στο σχήμα 1D-E, και τα δύο φάρμακα ανέστειλαν την ανάπτυξη των κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Παρόμοια αναστολή της ανάπτυξης ελήφθη σε κύτταρα DLD-1, που εκφράζουν κολοβωμένη APC αλλήλιο (σχήμα S1A-Β). Ταυτοχρόνως, οι δύο ενώσεις ανέστειλαν μεταγραφή από τον β-κατενίνης /TCF4 αποκρίνεται πλασμίδιο ανταποκριτή TOPflash (σχήμα 1G-Η). Τα IC

50 τιμές που παρατηρήθηκαν για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τις καμπύλες TOPflash είναι σε συμφωνία, γεγονός που υποδηλώνει ότι η διακοπή της ανάπτυξης διαμεσολαβείται από την αναστολή της β-κατενίνης. Όπως ήταν αναμενόμενο, προκάλεσε απώλεια της έκφρασης pygopus pyrvinium (σχήμα 1K). Το ίδιο αποτέλεσμα ελήφθη σε κύτταρα DLD-1 (σχήμα S1E). Επιπλέον, pyrvinium έχει αναφερθεί να αναγκάσει β-κατενίνης αποικοδόμηση [25]. Παραδόξως, η έκφραση της β-κατενίνης ήταν αμετάβλητη στα κύτταρα pyrvinium επεξεργασμένα DLD-1 (σχήμα S1E), ενώ μειώθηκε ελαφρώς στα κύτταρα LS174T (σχήμα 1K). ανάλυση αλληλουχίας του γονιδίου β-κατενίνης επιβεβαίωσε την παρουσία της υποκατάστασης S45F σε κύτταρα LS174T και αλληλουχία άγριου τύπου σε κύτταρα DLD-1 εντός της Ν-τερματικής περιοχής φωσφορυλίωσης (σχήμα S2). Και τα δύο φάρμακα μπλοκαριστεί η ενδογενής έκφραση του MYC, ένα πολύ γνωστό β-κατενίνης μεταγραφικό στόχο και ενός ισχυρού υποκινητή της κυτταρικής ανάπτυξης (σχήμα 1 J-K και το σχήμα S1D-Ε). Για να επιβεβαιωθεί η αναστολή της οδού Wnt, έκφραση δύο επιπλέον γνωστά γονίδια-στόχους αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR. Τόσο AXIN2 και CCND1 (κωδικοποίηση για κυκλίνη D1) γονίδια κάτω ρυθμισμένα με κατεργασία με PKF115-584 και pyrvinium (Σχήμα 1 Μ-Ν).

(Α-Γ) Χημικές δομές των PKF115-584, pyrvinium και FTS, όπως περιγράφηκε προηγουμένως (βλέπε ref. 20-29) (D-F) επιδράσεις δόσης-απόκρισης του PKF115-584, pyrvinium και FTS στην ανάπτυξη κυττάρων LS174T. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε αυξανόμενες δόσεις του κάθε αναστολέα για 72 ώρες. δοκιμασία MTS χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η επίδραση των ενώσεων επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. IC

Οι 50 τιμές που εμφανίζονται για κάθε ένωση. (G-Η) δραστικότητα λουσιφεράσης από το πλασμίδιο TOPflash προσδιορίστηκε μετά από επώαση για 24 ώρες με PKF115-584 ή pyrvinium. Οι τιμές είναι Σχετικές Μονάδες Φωτός (RLU) με κύτταρα DMSO-αντιμετωπίζονται οριστεί ως 1.00. (Ι) ανάλυση κηλίδας Western των δραστικών GTP-φορτωμένο KRAS pull-down (άνω πάνελ) και η συνολική KRAS (κάτω) από κύτταρα LS174T σε επεξεργασία με FTS. (J-L) Western ανάλυση κηλίδας δείχνει c-myc έκφραση σε κύτταρα LS174T σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις κάθε ένωσης για 48 ώρες. Από κύτταρα pyrvinium επεξεργασμένα, pygopus και έκφραση β-κατενίνης δείχνονται επίσης (Κ). Actin εμφανίζεται πάντα ως έλεγχος φόρτωσης. (Μ-Ν) ανάλυση ποσοτικής PCR της έκφρασης AXIN2 και D1 CCND1 /κυκλίνης μετά τη θεραπεία με αυξανόμενες δόσεις (0,125 έως 1,0 μΜ) του PKF115-584 (Μ) και pyrvinium (Ν). ανάλυση (O) Western στύπωμα της φωσφορυλίωσης ΜΕΚ σε FTS-επεξεργασμένα κύτταρα. Σύνολο ΜΕΚ και ακτίνης εμφανίζονται ως έλεγχοι. (Ρ-Q) καμπύλες δόσης-απόκρισης και PKF115-584 pyrvinium απουσία (κενοί κύκλοι) ή παρουσία (μαύροι κύκλοι) από 100 μΜ FTS. Κάθε ατομική καμπύλη ομαλοποιείται στο αντίστοιχο δείγμα χωρίς αναστολέα της β-κατενίνης.

Η

Οι αναστολέα RAS FTS (σχήμα 1Γ) ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων σε υψηλές συγκεντρώσεις micromolar (σχήμα 1F και να καταλάβω S1c), σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές [38], [39], [40]. FTS εξαντληθεί το GTP-φορτωμένο (ενεργό) πισίνα KRAS, αφήνοντας συνολικό ποσό KRAS αμετάβλητο (σχήμα 1Ι). Αυτή η δραστηριότητα αντι-KRAS μεταφράζεται σε αξιοσημείωτη μείωση των επιπέδων MYC πρωτεΐνη (σχήμα 1 λίτρο) και φωσφορυλίωση ΜΕΚ (σχήμα 1ο), αλλά όχι της έκφρασης FOS (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) σε κύτταρα LS174T. Ωστόσο, η θεραπεία FTS οδήγησε σε διαφορετικές μοριακές αντιδράσεις στα κύτταρα DLD-1: σήμα φωσφο-ΜΕΚ ήταν αμετάβλητη και MYC επηρεάστηκε μόνο ελάχιστα, ενώ η έκφραση FOS μειώθηκαν σημαντικά (σχήμα S1F). Για να εκτιμηθεί εάν η αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα των αναστολέων β-κατενίνης θα μπορούσε να ενισχυθεί από την FTS, καμπύλες δόσης-απόκρισης δημιουργήθηκαν με έκθεση των κυττάρων LS174T σε αυξανόμενες δόσεις PKF115-584 (σχήμα 1Ρ) και pyrvinium παμοϊκό (σχήμα 1Q) απουσία ή παρουσία 100 μΜ FTS. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, η προσθήκη FTS μετατοπίστηκε σημαντικά την καμπύλη. Ειδικότερα, ευαισθησία στο pyrvinium αυξήθηκε κατά περίπου 10 φορές (IC

50 pyrvinium, 0.1 μΜ? IC

50 pyrvinium + FTS, 0,01 μΜ). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι συνολικά οι αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις των δύο αναστολέων β-κατενίνης και τα RAS αναστολέα FTS συσχετίζονται με ειδική αναστολή της β-κατενίνης και δραστηριότητες KRAS, αντίστοιχα, σε κύτταρα LS174T. Επιπλέον, FTS ενισχύει την κυτταροτοξικότητα των αναστολέων της β-κατενίνης στα κύτταρα αυτά.

Για να καθοριστεί καλύτερα η συνεργασία της β-κατενίνης και αναστολή KRAS σε κύτταρα CRC, τη δραστηριότητα των PKF115-584 και pyrvinium, μεμονωμένα και σε διάφορους συνδυασμούς με FTS, ελέγχθηκε με δοκιμασία MTS σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών CRC που φέρουν διαφορετικές μεταλλάξεις ογκογόνες (πίνακας S1). Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν σε σταθερές συγκεντρώσεις που φαίνονται στο σχήμα 2 ως γραφικές παραστάσεις bar (PKF115-584: 125 ή 250 ηΜ? pyrvinium: 50 ηΜ? FTS: 100 μΜ). Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ η ευαισθησία σε απλούς παράγοντες διέφεραν μεταξύ των διαφόρων κυτταρικών σειρών, σε όλα τα κύτταρα KRAS μεταλλαγμένο οι συνδυασμένες θεραπείες που προκαλούνται σημαντικά υψηλότερη αναστολή της ανάπτυξης σε σύγκριση με ενιαία θεραπείες. Η συνέργεια στη συνέχεια μελετήθηκε εκτενέστερα σε ένα εύρος συγκεντρώσεων αναστολέων, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Chou και Talalay, με βάση την αρχή του νόμου μάζας-δράσης [41]. τιμές δείκτη συνδυασμού (CI) υπολογίστηκαν από τα πειραματικά δεδομένα κατά μήκος όλο το φάσμα των κλασματικών αποτελεσμάτων και παρουσιάζονται ως XY οικόπεδα στο σχήμα 2. Ειδικές τιμές CI σε ED50, ED75 και ED90 αναφέρονται στον Πίνακα 1. Όπως προβλέπεται από την κατάσταση ογκογονίδιο μετάλλαξης, όλες οι κυτταρικές σειρές που φέρουν μεταλλάξεις σε αμφότερα Wnt μονοπάτι (APC ή β-κατενίνης) και KRAS παρατηρήθηκαν συνεργιστικές αλληλεπιδράσεις (CI & lt? 1), εκτός από ακραία σημεία του κλάσματος που επηρεάζονται, όπου τα αποτελέσματα είναι είτε αμελητέα ή πολύ ισχυρή. Σε αντίθεση, ΗΤ-29 κύτταρα (που φέρουν άγριου τύπου KRAS και ένα μεταλλαγμένο γονίδιο BRAF

αλληλόμορφο V600E) δεν έδειξε συνέργεια. Αντίθετα, ανταγωνιστικές δράσεις (CI & gt? 1) παρατηρήθηκαν. Ωστόσο, ο συνδυασμός του PKF115-584 με έναν αναστολέα BRAF (PLX-4032) έδειξε ασθενές συνέργεια σε κύτταρα ΗΤ-29 σε υψηλές δόσεις (σχήμα S3). Πρόσθετα δεδομένα που ελήφθησαν με pyrvinium /FTS σε δύο κυτταρικές σειρές μία BRAF μεταλλαγμένο KRAS- και φαίνεται στο σχήμα S4. Συνολικά, η ανάλυση των τιμών CI στην ED50 (pyrvinium /FTS) δείχνει συσχέτιση μεταξύ KRAS /BRAF μεταλλάξεων καθεστώς και συνεργιστική αλληλεπίδραση (p = 0,0021): όλες οι KRAS μεταλλαγμένα κύτταρα έδειξαν συνέργεια, ενώ κανένα από τα δύο μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές BRAF έκανε (σχήμα S5) , αν και τον περιορισμένο αριθμό των μεταλλαγμένων κυτταρικών σειρών BRAF δοκιμαστεί δεν επιτρέπει να εξαχθούν οριστικά συμπεράσματα. Σε αντίθεση, οι επιδράσεις δεν σχετίζονται με την ρ53 ή κατάσταση MSI (πίνακας 1). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι PKF115-584 και pyrvinium μπορεί να συνδυαστεί με FTS σε κύτταρα CRC φιλοξενούν ταυτόχρονη Wnt /KRAS γενετικών ανωμαλιών, για την επίτευξη καλύτερης θεραπευτικά αποτελέσματα.

Οι ενδεικνυόμενη κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν για 6 ημέρες σε παρουσία αναστολέων σαν απλούς παράγοντες ή σε συνδυασμό, ή φορέα μόνο. δοκιμασία MTS χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθούν οι επιπτώσεις της κάθε θεραπείας στην κυτταρική ανάπτυξη και η βιωσιμότητα καλλιέργειας. (Α) PKF115-584 /FTS και (Β) pyrvinium /FTS συνδυασμό. Για κάθε κυτταρική σειρά, η γραφική παράσταση ράβδου (αριστερά) δείχνει τη δράση σε μία μόνο δόση (PKF115-584, 0.25 μΜ [LS174T και DLD-1], ή 0,125 μΜ [SW480 και HCT-116]? Pyrvinium, 50 ηΜ? FTS, 100 μΜ). Το γράφημα XY (δεξιά) δείχνει συνδυασμός δεικτών ως συνάρτηση του κλάσματος που επηρεάζεται (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). Για κάθε κυτταρική σειρά, τα γονίδια που είναι μεταλλαγμένες, επηρεάζοντας οδούς Wnt και Ras, υποδεικνύονται σε παρενθέσεις. CTRL = έλεγχος? Pyrv = pyrvinium. Σε όλους τους πίνακες, τα σύμβολα αριθμού (#) δείχνουν τη σημασία έναντι του αναστολέα της β-κατενίνης (PKF115-584 ή pyrvinium)? αστερίσκους (*) δείχνει τη σημασία έναντι FTS? ένα σύμβολο, σ & lt? 0,05? δύο σύμβολα, σ & lt? 0,01? τρία σύμβολα p & lt?. 0.001

Η

Στη συνέχεια χαρακτηρίζεται περαιτέρω τις συνεργιστικές συνδυασμούς χρησιμοποιώντας επιπλέον ανεξάρτητες δοκιμασίες (σχήμα 3 και το σχήμα S6). Η κυτταρική ανάπτυξη παρακολουθήθηκε κατά τη διάρκεια αρκετών ημερών, μετά την έκθεση LS174T και DLD-1 κυττάρων στα τρία φάρμακα, μόνα τους ή σε συνδυασμό, δείχνοντας ότι FTS ενισχύεται PKF115-584 και pyrvinium τοξικότητα ήδη μετά από 3-4 ημέρες (σχήμα 3Α και το σχήμα S6a). Η αναστολή της ανάπτυξης συνοδεύτηκε από επαγωγή απόπτωσης: ο αριθμός των πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερη στα δείγματα συνδυασμού σε σύγκριση με κάθε ένα φάρμακο μόνο του (Σχήμα 3Β και Σχήμα S6B). Ως σύγκριση, η απόπτωση σε κύτταρα LS174T εκτιμήθηκε παράλληλα μετά την επαγωγή των αντι-β-κατενίνης και αντι-KRAS Τα siRNAs, φθάνοντας σε συγκρίσιμο επίπεδο πρώιμη απόπτωση στο διπλό σιγήσει δείγμα (σχήμα 3Β). Αποσιώπηση των πρωτεϊνών στόχων παρουσιάζεται στο σχήμα S7. Στη συνέχεια, όπως και οι τρεις ενώσεις είναι ικανές να αναστείλουν MYC έκφραση σε κύτταρα LS174T (σχήμα 1J-L), προσδιορίσαμε αν συνδυάζοντας υποβέλτιστες συγκεντρώσεις των φαρμάκων θα μπορούσε να προκαλέσει μια καλύτερη παρεμπόδιση της μεταγραφής MYC. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τόσο KRAS και β-κατενίνης είναι σε θέση να ρυθμίζουν την έκφραση σε MYC καρκινικά κύτταρα κόλου [19], [42], [43]. Πράγματι, ο συνδυασμός θεραπειών για 24 ώρες έδειξε μία σημαντική βελτίωση σε MYC αναστολή έκφρασης σε σύγκριση με ενιαία θεραπείες (σχήμα 3C). Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι MYC είναι ένα κοινό τελεστής των δύο οδών και ρύθμιση προς τα κάτω του συσχετίζεται με την ανάπτυξη των κυττάρων και η αναστολή της βιωσιμότητας σε αυτά τα κύτταρα. Σε αντίθεση, παρατηρήσαμε καμία επίδραση των συνδυασμών για τα επίπεδα MYC σε κύτταρα DLD-1 (σχήμα S6C), σύμφωνα με την έλλειψη MYC ρύθμιση προς τα κάτω από την FTS σε αυτά τα κύτταρα. Επιπλέον, σε συνδυασμό αναστολή που προκαλείται ισχυρή κάτω διαμόρφωση της έκφρασης της survivin, ενώ ελάχιστη ή μηδενική μεταβολή ελήφθη με ενιαία θεραπείες (σχήμα 3D και το σχήμα S6D). Survivin είναι ένας μεταγραφικός στόχος των δύο οδών Wnt και KRAS [19], [44], [45] και έχει ένα κρίσιμο ρόλο στην επιβίωση του KRAS γνώμονα καρκίνο [46]. Τέλος, για να μελετήσει τις μακροπρόθεσμες επιπτώσεις της β-κατενίνης και KRAS σε συνδυασμό αναστολή, αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη εκτιμήθηκε μετά από μία μόνο προσθήκη υπο-θανατηφόρες δόσεις PKF115-584 ή pyrvinium και FTS. Όπως φαίνεται στο σχήμα 3Ε-F και στο σχήμα S6E-F, συνδυασμός του κάθε αναστολέα β-κατενίνης με FTS είχε μια βαθιά επίδραση στο μαλακό άγαρ ανάπτυξη των LS174T και DLD-1 κύτταρα.

Κύτταρα (Α) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μΜ FTS, 0,25 μΜ PKF115-584 ή 50 ηΜ pyrvinium, μόνος ή σε συνδυασμούς, ή όχημα, για 6 ημέρες. βιωσιμότητα κυτταρικής καλλιέργειας αξιολογήθηκε τις ημέρες 3, 4 και 6 με MTS. Η σχετική OD σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου υπό αγωγή με όχημα καταγράφηκε ως επιζών κλάσμα. (Β) κύτταρα LS174T καλλιεργήθηκαν για 3 ημέρες παρουσία των υποδεικνυόμενων ενώσεων (ίδιες συγκεντρώσεις όπως στο [Α])? Παράλληλα, κύτταρα LS174T μεταφέρουν επαγώγιμη siRNAs (Sint, μη-στόχευσης? siBC, αντι-β-κατενίνης? siKR, αντι-KRAS) κατεργάστηκαν με ντοξυκυκλίνη για το ίδιο χρονικό διάστημα. Η απόπτωση προσδιορίστηκε με αννεξίνη V /ιωδιούχο προπίδιο διπλή χρώση. Το ποσοστό των πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων (αννεξίνη V-θετικών /ιωδιούχο προπίδιο-αρνητικά) αναφέρεται στο γράφημα. (C) κύτταρα LS174T υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PKF115-584 (0,5 μΜ), pyrvinium (50 ηΜ) και FTS (100 μΜ), μόνο του ή σε συνδυασμό, για 24 ώρες και c-myc έκφραση αξιολογήθηκε με πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας ΟΑΡϋΗ ως ένα γονίδιο αναφοράς. Έκφραση ομαλοποιήθηκε σε κύτταρα ελέγχου υπό αγωγή με όχημα. (D) Τα κύτταρα επωάστηκαν για 72 ώρες με αναστολείς και τα κυτταρολύματα ανιχνεύθηκαν με αντι-survivin και β-ακτίνη αντισώματα. (Ε-Ρ) Δέκα χιλιάδες κύτταρα LS174T αναπτύχθηκαν σε μαλακό άγαρ παρουσία PKF115-584 (0,1 μΜ), pyrvinium (25 ηΜ), FTS (50 μΜ), μόνα ή σε συνδυασμό. Μεγάλες αποικίες μετρήθηκαν 20 ημέρες αργότερα. Ο αριθμός των αποικιών που σχηματίστηκαν από μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου ορίζεται ως 100% (Ε). Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες φαίνεται στο πάνελ (Ρ). Στατιστική ανάλυση: βλέπε επεξήγηση του σχήματος 2.

Η

Για να αποκτήσουν περαιτέρω πληροφορίες για τις μεταγραφικές τροποποιήσεις που προκαλείται από τις συνδυασμένες θεραπείες, η έκφραση ενός επιλεγμένου πίνακα των γονιδίων που σχετίζονται με Wnt και KRAS σηματοδότησης, του παχέος εντέρου καρκίνο και την απόπτωση, μελετήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σπιτικό ποσοτική συστοιχία PCR. Η θερμικός χάρτης στο σχήμα 4Α δείχνει σχετικές μεταβολές στην έκφραση μετά από 72 ώρες επεξεργασίας με μονές ή σε συνδυασμό φαρμάκων, σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου υπό αγωγή με όχημα. Όπως ήταν αναμενόμενο, μόνο υπάλληλοι αποχώρησαν από τα περισσότερα γονίδια αμετάβλητες, ενώ οι συνδυασμοί που προκαλείται από μια γενική καταστολή του επιλεγμένου σετ γονιδίων. Ειδικότερα, CD44, COX2, CTBP2, κυκλίνες D1 και D2, ITF2, p70S6K2 και RASSF7 ήταν έντονα κάτω-ρυθμίζονται από δύο συνδυασμούς, σε σύγκριση με μόνο θεραπείες. Επιπλέον, η pyrvinium /FTS συνδυασμός προκάλεσε μειορύθμιση των επιπλέον γονιδίων όπως BCL2, BCL2L1 (κωδικοποίηση για το Bcl-X

L αντι-αποπτωτικό παράγοντα), BCL9L, KRAS, CDKN1A (ρ21

WAF1) και PRKCA. Για να πιάσει νωρίς μεταγραφική αλλαγές που συμβαίνουν πριν από οποιοδήποτε σημείο του κυτταρικού στρες, ένας παλμός 24-ωρη είχε τρέξει με το /FTS συνδυασμό pyrvinium. Ο συνδυασμός αυτός προτιμήθηκε από την μια με PKF115-584 για την ανάλυση αυτή, καθώς pyrvinium παρουσίασαν υψηλότερο βαθμό γονιδίου ρύθμιση προς τα κάτω. Τα στοιχεία που αναφέρονται στην δεξιά στήλη του Heatmap. Παρά ορισμένες διαφορές με τη μεγαλύτερη έκθεση στο φάρμακο, πολλές από τις αλλαγές συντηρημένα, συμπεριλαμβανομένων κάτω ρύθμιση CD44, COX2, BCL2 και κυκλίνες D. Επιπλέον, προς τα πάνω ρύθμιση της προ-αποπτωτική πρωτεΐνη σημειώθηκε APAF1. Είναι ενδιαφέρον, ρ21

WAF1 ήταν παροδικά up-ρυθμίζονται σε 24 ώρες πριν να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε 72 ώρες. Για την περαιτέρω επιβεβαίωση αυτών των δεδομένων, μερικά γονίδια αναλύθηκαν ανεξάρτητα με πρότυπες PCR πραγματικού χρόνου σε τέσσερις κυτταρικές σειρές. Το Σχήμα 4Β δείχνει τα αποτελέσματα από τα κύτταρα LS174T, επιβεβαιώνοντας τη γονιδιακή ρύθμιση που παρατηρήθηκε στην αρχική σειρά δεδομένων. Τα δεδομένα από τις τέσσερις κυτταρικές σειρές αναλύθηκαν περαιτέρω για τον εντοπισμό συνεργιστική ρύθμιση έκφρασης γονιδίου, που ορίζεται ως & gt? 2-φορές μεταβολή της έκφρασης σε ένα συνδυασμό σε σύγκριση με ενιαία αγωγές (Σχήμα 4C). Είναι ενδιαφέρον ότι, η έκφραση BCL2 ήταν συνεργικά κάτω-ρυθμίζονται σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές σειρές από pyrvinium /συνδυασμό FTS (συμπληρώθηκε γκρι κουτιά). Η κυκλίνη D1 και CD44 σημείωσε συνεργιστική σε τρεις από τις τέσσερις κυτταρικές γραμμές. CD44 ήταν επίσης κάτω-ρυθμίζονται σε κύτταρα DLD-1, αλλά ο βαθμός της διαφοροποίησης δεν φτάσει το όριο για μια συνεργιστική δράση (σχήμα S8). Ο συνδυασμός PKF115-584 /FTS αποδειχθεί λιγότερο αποτελεσματική σε αυτή την ανάλυση, μόνο με CD44 δείχνει συνεργιστική ρύθμιση προς τα κάτω σε τουλάχιστον δύο κυτταρικές σειρές (LS174T και SW480). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν CD44 ως κοινή απάντηση στην διπλή β-κατενίνης /στόχευση KRAS.

κύτταρα LS174T έλαβαν θεραπεία για 24 ή 72 ώρες με αναστολείς και μια ομάδα γονιδίων που επικεντρώθηκε στην Wnt, Ras και απόπτωση οδούς μελετήθηκε με QPCR χρησιμοποιώντας μια συστοιχία 96 φρεατίων (Α) ή πρότυπο πραγματικού χρόνου PCR (Β). Οι γραφικές παραστάσεις στο (Β) δείχνουν αλλαγή φορές έκφραση σε σύγκριση με ελέγχους που δέχτηκαν φορέα. (C) Συνοπτικός πίνακας αναφοράς σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση των δεδομένων από όλες τις κυτταρικές σειρές. Γεμιστά κουτιά υποδεικνύουν συνεργιστική δράση επί της έκφρασης γονιδίου (& gt? 2-φορές μεταβολή έναντι κάθε θεραπεία). PY = pyrvinium.

Η

Αφού απέδειξε την αποτελεσματικότητα της διπλής αναστολής Wnt /KRAS

in vitro

, προσπαθήσαμε να μεταφράσουμε αυτές τις διαπιστώσεις σε μια νέα θεραπευτική στρατηγική

in vivo

. Ωστόσο, PKF115-584 δεν παράγεται πλέον από την Novartis και της σύνθεσης αυτού σε μεγάλη κλίμακα αποδείχθηκε εξαιρετικά προκλητική και χρονοβόρα. Όσο για pyrvinium παμοϊκό, έχει αναφερθεί να απορροφάται πτωχά [47]. Ωστόσο, η στοματική χορήγηση του pyrvinium περιγράφηκε από δύο ομάδες [48], [49]. Ως εκ τούτου, ένα πιλοτικό πείραμα διεξήχθη για να ελέγξει εάν το φάρμακο θα μπορούσε να επιτευχθεί ο στόχος σε άτριχα ποντίκια, κοιτάζοντας την έκφραση pygopus σε ξενομοσχεύματα LS174T μετά από τρεις ημερήσιες χορηγήσεις από το στόμα των 10 mg /kg pyrvinium. Τα αποτελέσματα ήταν αρνητικά (εικόνα S9), ως εκ τούτου, δεν είχαμε επιχειρήσει περαιτέρω

in vivo

αναλύσεις.

Συζήτηση

Σχεδόν όλοι οι καρκίνοι του παχέος δείχνουν αλλοίωση του μονοπατιού Wnt που ελέγχει της β-κατενίνης ενεργοποίησης. Ως εκ τούτου, η αναστολή της β-κατενίνης μπορεί να οδηγήσει σε σημαντική πρόοδο στην αντιμετώπιση αυτής της ασθένειας. Ωστόσο, τα τελευταία στοιχεία έδειξαν ότι περισσότερα από ένα «οδηγό» ογκογόνο οδό συχνά ενεργοποιείται σε ένα ενιαίο όγκο [50], [51]. Ως εκ τούτου, πολλαπλές ογκογονίδιο στόχευση είναι πιθανό να χρειαστούν για την εξάλειψη της νόσου. Σε ένα σημαντικό κλάσμα των όγκων παχέος εντέρου, Wnt και KRAS μονοπάτι μεταβολές συνυπάρχουν [6], [13], [14]. Παρά το γεγονός ότι έχει γίνει γνωστό για σχεδόν 30 χρόνια, το ογκογονίδιο KRAS έχει ένα απατηλό στόχο μέχρι τώρα. Παράγοντες που αποκλείουν KRAS μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις υπήρξαν αναποτελεσματικά σε κλινικές δοκιμές [52]. Στρατηγικές για τη στόχευση κατάντη δράστες του KRAS [53], [54], [55] ή για τη δημιουργία συνθετικών θανατηφόρες αλληλεπιδράσεις [56], [57], [58] έχουν δείξει διαφορετικές απαντήσεις από περίπτωση σε περίπτωση, πιθανώς λόγω της πολυπλοκότητας των η οδός KRAS. Αυτό τονίζεται επίσης από τη διαφορετική μοριακή αποτέλεσμα της αναστολής KRAS παρατηρήθηκε σε δύο κυτταρικές σειρές CRC στη μελέτη μας. Λαμβάνοντας μια διαφορετική προσέγγιση, η FTS παρεμβαίνει ειδικά με KRAS σύνδεσης με την κυτταρική μεμβράνη, μιμούμενοι τμήμα farnesylcysteine ​​της [29].

Σε αυτή την εργασία, διερευνήθηκε η επίδραση της συνδυασμένης β-κατενίνης και KRAS αναστολή από μικρά μόρια . Η συνέργεια ήταν εμφανής σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών CRC που φέρουν διαφορετικούς τύπους μεταλλάξεων που επηρεάζουν τις οδούς στόχου, χρησιμοποιώντας διάφορες ανεξάρτητες δοκιμασίες. Συνδυάζοντας υπο-βέλτιστες δόσεις β-κατενίνης και αναστολείς KRAS παρατηρήθηκε σημαντική αναστολή της ανάπτυξης και της απόπτωσης, οι οποίες αντικατοπτρίζονται από ισχυρές μειορύθμιση της έκφρασης της survivin. Survivin αναστέλλει την ενεργοποίηση των κασπασών τελεστών και είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε πολλούς καρκίνους. Με το χτύπημα δύο οδούς που ελέγχουν την έκφραση του σε κύτταρα CRC, λάβαμε πλήρη καταστολή της αντι-αποπτωτική δραστηριότητα και ως εκ τούτου, η επαγωγή της απόπτωσης.