Αφηρημένο

Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι πολλοί συμπαγείς όγκοι είναι ιεραρχικά οργανωμένη με τα κύτταρα του όγκου χύμα που έχουν περιορισμένες δυνατότητες αντιγραφής, αλλά υπέστη μια βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν που διαιωνίζει τον όγκο. Αυτά τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα διατυπωθεί η υπόθεση ότι προέρχονται από μετασχηματισμό του ενήλικα βλαστικά κύτταρα των ιστών, ή μέσω της εκ νέου απόκτηση των ιδιοτήτων του στελέχους που μοιάζει με προγονικά κύτταρα. Αδενοχοληδωτό καρκίνωμα (ASC) είναι μια επιθετική μορφή καρκίνου του πνεύμονα που περιέχει ένα μίγμα κυττάρων με φαινοτύπους πλακώδους (κυτοκερατίνη 5+) και το αδενοκαρκίνωμα (κυτοκερατίνη 7+). Η προέλευση αυτών των μειγμάτων είναι ασαφής ως είναι καρκινώματα πλακωδών πιστεύεται ότι προκύπτουν από βασικά κύτταρα στην ανώτερη αναπνευστική οδό, ενώ τα αδενοκαρκινώματα πιστεύεται ότι σχηματίζουν από βλαστοκύτταρα στο βρογχικό κυψελιδικό διασταύρωση. Έχουμε απομονώσει και χαρακτηρίσει τον καρκίνο πληθυσμοί βλαστικών-σαν από ASC μέσω της εφαρμογής του επιλεκτικού μέσου καλλιέργειας καθορισμένων αρχικά χρησιμοποιείται για την ανάπτυξη ανθρώπινου πνεύμονα βλαστοκύτταρα. Ομοιογενές κύτταρα επιλέγονται από δείγματα ASC όγκου σταθερά επεκτάθηκε

in vitro

. Πρωτοβάθμια ξενομοσχεύματα και μεταστατικές βλάβες που προέρχονται από αυτά τα κύτταρα σε ποντίκια NSG ανακεφαλαίωση πλήρως τόσο το αδενοκαρκίνωμα και το πλακώδες χαρακτηριστικά του όγκου του ασθενούς. Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ η CSLC όλα συν-εκφράζεται κυτοκερατίνες 5 και 7, τα περισσότερα κύτταρα εξέφρασαν ξενομοσχεύματος είτε το ένα, είτε ούτε με & lt? 10% που απομένει διπλό θετικό. Δείξαμε επίσης τη δυνατότητα της CSLC να διαφοροποιούνται σε δομές πολλαπλών καταγωγή με διακλάδωση μορφολογία του πνεύμονα εκφράζουν βρογχικό, κυψελιδικά και νευροενδοκρινείς δείκτες in vitro. Στο σύνολό τους οι ιδιότητες αυτών των ASC προερχόμενων CSLC υποδηλώνει ότι ASC μπορεί να προκύψουν από ένα πρωτόγονο πνεύμονα βλαστοκυττάρων διακρίνεται από τις βρογχικές-κυψελοειδείς ή βασικών βλαστικά κύτταρα.

Παράθεση: Mather JP, Roberts ΡΕ, Παν Ζ, Chen F, Hooley J, Νέοι P, et al. (2013) Απομόνωση καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν από Ανθρωπίνων αδενοχοληδωτό καρκίνωμα του πνεύμονα Υποστηρίζει ένα μονοκλωνικό Καταγωγή από πολυδύναμων ιστού Stem Cell. PLoS ONE 8 (12): e79456. doi: 10.1371 /journal.pone.0079456

Επιμέλεια: Alan P Πεδία, Mayo Clinic College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 του Απρίλη 2013? Αποδεκτές: 23, Σεπτεμβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 4 Δεκεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Mather et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Δεν υπάρχει τρέχουσα εξωτερικές πηγές χρηματοδότησης για τη μελέτη αυτή. Το έργο χρηματοδοτήθηκε εξ ολοκλήρου από MacroGenics, Inc. μέσω της εταιρικής συγκέντρωση χρημάτων από ιδιωτικά επενδυτικά κεφάλαια. Χρηματοδότες δεν συμμετείχαν σε οποιαδήποτε πτυχή του σχεδίου ή διεξαγωγή της έρευνας

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν τα εξής ενδιαφέροντα: το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε εξ ολοκλήρου από MacroGenics, Inc. μέσω της εταιρικής συγκέντρωση χρημάτων από ιδιωτικά επενδυτικά κεφάλαια. Όλοι οι συγγραφείς είχαν προσληφθεί από MacroGenics, Inc., όταν το έργο αυτό έγινε και το δικό προαίρεσης αγοράς μετοχών ή /και μετοχών στην εταιρεία. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος των βλαστικών κυττάρων υπόθεση δηλώνει ότι οι καρκίνοι προκύπτουν από μεταλλάξεων ή επιγενετικές μεταβολές σε κύτταρα ιστού του στελέχους (ή προγονικά), οι οποίες επιτρέπουν αυτά τα κύτταρα να ξεφύγουν από ενδογενείς και εξωγενείς ελέγχους της ανάπτυξης και να εξαπλώνονται [1]. Εκτός από την ισχυρή ενδείξεις που υποστηρίζουν αυτή την υποθετική περίπτωση κατά αιμοποιητικά καρκίνους, υπάρχει ένα αυξανόμενο σώμα αποδείξεων ότι ορισμένοι συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένων του εγκεφάλου, του παχέος εντέρου, του μαστού και του πνεύμονα [2] Οι ιεραρχικά οργανωμένη με ένα υποσύνολο της αυτο-ανανέωσης STEM- όπως τα κύτταρα. Επιπλέον, υπάρχει πρόσφατη άμεση απόδειξη από ζωικά μοντέλα που μπορούν να προκύψουν παχέος εντέρου, του εγκεφάλου, και καρκίνους του δέρματος από ιστό βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν παρούσα στις ιστούς ενηλίκων [3-5]. Τα χαρακτηριστικά στέλεχος που μοιάζει με της αυτο-ανανέωση, ογκογονικότητα, αντοχή φαρμάκου, και την ικανότητα να ανακεφαλαιώνουν όλους τους τύπους κυττάρων του όγκου, έχουν επιτρέψει στους ερευνητές να αντιμετωπίσει σημαντικά ζητήματα σχετικά με τη βιολογία του πληθυσμού αυτού κύτταρο, το οποίο φέρει άμεσα στη θεραπεία ασθενών [3,6].

υπάρχουν στοιχεία από τις δύο ζωικά μοντέλα και ανθρώπινη ασθένεια που καρκίνων του πνεύμονα είναι μεταξύ εκείνων που προκύπτουν από βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με [7-10]. Ωστόσο, η πηγή βλαστικών κυττάρων (SC) που συμμετέχουν στην φυσιολογική ανάπτυξη των πνευμόνων, συντήρηση, επισκευή και μετά από τραυματισμό είναι κάπως πιο περίπλοκη από ό, ιστούς, όπως το δέρμα ή κόλον (για επισκοπήσεις βλέπε: [11,12]), όπου πολλαπλά «υπό όρους οι «βλαστικά κύτταρα έχουν πιστεύεται ότι εμπλέκονται στην επιδιόρθωση των διαφόρων τμημάτων του πνεύμονα μετά από τραυματισμό [13]. Αυτά μπορεί, ή δεν μπορεί, να είναι τα ίδια τα βλαστικά κύτταρα που είναι υπεύθυνα για τη συντήρηση των ιστών [14]. Έχει προταθεί ότι εντός καρκίνων του πνεύμονα, NSCLC (μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα) αδενοκαρκινώματα προκύπτουν από SC στο βρογχικό φατνιακή διασταύρωση (BASC), καρκινώματα πλακωδών προκύπτουν από την βασική SC των βρόγχων και της τραχείας, και τα μικρά κυτταρικά καρκινώματα προκύπτουν από πνευμονική νευροενδοκρινείς κυττάρων [11,12].

αδενοχοληδωτό καρκίνωμα (ASC) του πνεύμονα είναι ένα σπάνιο υποτύπου καρκίνου NSLC διαγνωστεί με όγκους που περιέχουν και τις δύο κυττάρων με πλακώδους και αδενοκαρκίνωμα (AC) ιστολογική φαινοτύπους (που ορίζεται ως & gt? 10% από το καθένα). ASC περιλαμβάνει 4-8% του NSCLC, αλλά είναι πολύ επιθετική, έτσι ώστε οι ασθενείς με ASC έχουν χειρότερη πρόγνωση ότι εκείνοι με είτε πλακωδών κυττάρων ή αδενο-καρκινώματα [15]. Έχει υποτεθεί ότι αυτοί οι όγκοι προκύπτουν είτε από μίγματα των κυττάρων που προέρχονται από τους δύο όγκους διαφορετικών τύπων, ο περαιτέρω μετάλλαξη ενός τύπου που οδηγεί στην άλλη, ή ένα μονοκλωνικό καταγωγής, όταν και οι δύο προέρχονται από ένα κοινό, ακόμη αγνώστων, πρόδρομος [16-19]. Μελέτες σε όγκους ASC από ασθενείς έδειξαν ότι κύτταρα από το αδενο και πλακώδη τμήματα ενός όγκου έχουν παρόμοια, αλλά όχι απαραίτητα ταυτόσημη, χρωμοσωμικές ανωμαλίες [16], ή μεταλλάξεων [17] προτείνοντας ένα μονοκλωνικό προέλευσης για αυτόν τον τύπο όγκου. Ωστόσο, αυτό δεν αποτελεί απόδειξη της ικανότητας αυτών των δύο φαινοτύπους να προκύψουν από ένα μόνο κύτταρο, και το κύτταρο από το οποίο ASC μπορεί να προέρχονται παραμένει άγνωστος.

Στην έκθεση αυτή, περιγράφουμε τα βλαστικά κύτταρα του καρκίνου, όπως (CSLC ) απομονώθηκαν από ασθενείς με ASC χρησιμοποιώντας καθορισμένες συνθήκες καλλιέργειας χωρίς ορό. Επιπλέον, έχουμε καταδείξει ότι αυτά τα κύτταρα έχουν τις ιδιότητες της αυτο-ανανέωση, ογκογονικότητα, και μετάσταση. Οι όγκοι που παράγονται από αυτά τα κύτταρα, που ορίζονται LUCA22 και LUCA35, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που προέρχονται από κλωνοποιημένα μονά κύτταρα και από μεταστάσεις περιείχε δύο συστατικά με αδενικό (αδενο) διαφοροποίηση και περιοχές του πλακώδους διαφοροποίησης, υποστηρίζοντας ένα μονοκλωνικό προέλευσης αυτού του όγκου. Η CSLC ιδιότητες ανάπτυξης, η γονιδιακή έκφραση και την ικανότητα να σχηματίζουν διακλάδωσης δομές σε 3D συγκαλλιέργεια με πνεύμονα στρώμα περαιτέρω υποστηρίζουν την υπόθεση ότι αυτά τα CSLC έχουν βλαστικών κυττάρων, όπως ιδιότητες. Επιπλέον, οι ξενομοσχεύματα που προέρχονται από αυτά CSLC περιέχουν κύτταρα θετικά για chromagranin Α, Μουκίνη 5Α, βιμεντίνη, επιφανειοδραστική πρωτεΐνη D, ακουαπορίνη 5 και κυτοκερατίνες 5, 7, 14 και 20, αποδεικνύοντας την ικανότητα αυτών των κυττάρων να υποστούν διαφοροποίηση multi-γενεαλογία. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ASC είναι μονοκλωνικά προέλευσης και, ενδεχομένως, να προκύψει από ένα πρωτόγονο πνεύμονα βλαστοκυττάρων διακριτή από την βρογχιολιδικού φατνιακή βλαστοκυττάρων (BASC) ή της βασικής βλαστικών κυττάρων των ανώτερων αεραγωγών.

Υλικά και Μέθοδοι

δήλωση Ηθικής

πνεύμονα καρκινικούς ιστούς αποκτήθηκαν μέσω της Εθνικής έρευνας για τις ασθένειες Interchange, 1880 John F. Kennedy Boulevard, 6ος όροφος, Philadelphia, PA 19103 (url: https://ndriresource.org/) . Θεσμική IRBs ενέκρινε τα πρωτόκολλα NDRI για την απόκτηση του ιστού και τη χρήση, και κατάλληλα ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από ασθενείς με NDRI. Δεν υπήρχαν διαθέσιμες πληροφορίες που θα μπορούσαν με οποιοδήποτε τρόπο να θέσει σε κίνδυνο την ανωνυμία των ασθενών. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Η φροντίδα των ζώων και τη χρήση επιτροπής MacroGenics Δύση ενέκρινε όλα τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιούν τα ποντίκια. Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις έγινε υπό αναισθησία, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Τα ζώα ελέγχονται καθημερινά και τα άρρωστα ζώα απομακρύνονται και ευθανασία. Όλα τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία στο τέλος του πειράματος, πριν συλλογή ιστού. Ευθανασία ήταν από ασφυξία CO2 παραδοθεί σε ένα συμπιεσμένο κύλινδρο αερίου.

CSLC επιλογή, την επέκταση και τον χαρακτηρισμό

πνεύμονα καρκινικούς ιστούς αποκτήθηκαν μέσω της Εθνικής έρευνας για τις ασθένειες Interchange, 1880 John F. Kennedy Boulevard, 6ος όροφος, Philadelphia, PA 19103. Θεσμικών IRBs εγκριθεί η πρωτόκολλα για την απόκτηση του ιστού και τη χρήση, και κατάλληλα ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από ασθενείς με NDRI. Ο καρκίνος του πνεύμονα που προέρχεται κυτταρικές γραμμές επεκτάθηκαν από ASC και AC όγκων (ή στρώματος του όγκου) και master και την εργασία τράπεζες κυττάρων προετοιμασμένοι. Σύντομη διαδοχική επανάληψη ανάλυση (STR) χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση.

Οι καθορισμένες συνθήκες κατάλληλες για φυσιολογικό ανθρώπινο εμβρυϊκό επιθηλιακά πνευμονικό ιστό βλαστικών /προγονικών κυττάρων [20] χρησιμοποιήθηκαν αρχικά και στη συνέχεια βελτιστοποιείται εμπειρικά για την απομόνωση και την ανάπτυξη του καρκινικού ιστού όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Ορό χωρίς όρους προήλθαν που εμπλουτίζουν για, και να επιτρέψει την επέκταση της, ένα μικρό πληθυσμό κυττάρων από ASC και AC (αλλά όχι καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (SCC)) του πνεύμονα. Η προσθήκη 1-2% ορό στα συμπληρώματα ορμόνη ή η συμπλήρωση με υψηλή 10% (ν /ν) ορό οδήγησε σε μη ογκογόνα πληθυσμός των κυττάρων με περιορισμένη ικανότητα ανάπτυξης

in vitro

και τις ιδιότητες των στρωματικών κυττάρων . Βλέπε μεθόδους S1 και τον Πίνακα S1 για λεπτομερείς μεθόδους για την απομόνωση κυττάρων από όγκους? και ορίζονται τα μέσα ενημέρωσης και τις συγκεντρώσεις συμπλήρωμα για την επιλογή, την επέκταση, την κλωνοποίηση και τη διαφοροποίηση του ASC-CSLC? και επέκταση των στρωματικών κυττάρων. Οι προϋποθέσεις για τη διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων του πνεύμονα σε 3 διαστάσεων Matrigel

πολιτισμών TM τροποποιήθηκαν από Delgado, et al όπως περιγράφεται στις μεθόδους S1. Τα δείγματα όγκων και απομονωμένες CSLC γραμμές εμπορικά χαρακτηρίζεται από μοναδική Επαναλάβετε τα μοτίβα Short Tandem τους χρησιμοποιώντας 16 STR περιοχές. Η ανάλυση αυτή περιγράφεται στο Μέθοδοι S1 και συνοψίζονται στον Πίνακα S2.

Ο τύπος του όγκου και το στάδιο (από τις εκθέσεις παθολογίας) των 4 CSLC όγκου και 3 στρωματικά CSLC πολιτισμούς συνοψίζονται στον Πίνακα S3. Πέντε κυτταρικές σειρές ATCC, που προέρχεται από την AC, SC και ASC χρησιμοποιώντας μέσα που περιέχουν ορό, χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι σε έναν αριθμό πειραμάτων. Τα χαρακτηριστικά αυτών των γραμμών συνοψίζονται στον Πίνακα S4

Γενετικές αναλύσεις

ανάλυση

ανάστροφης μεταγραφάσης (RT-PCR).

DNA απομονώθηκε από δείγματα ζώο χρησιμοποιώντας τον Οδηγό SV Genomic κιτ καθαρισμού DNA ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Promega). Ανθρώπινο DNA ποσοτικοποιήθηκε με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές και ανιχνευτές [22] γονίδιο RPL 19 ειδική ανθρώπου. Οι εκκινητές αγοράστηκαν από την Α.Ε. Βιοεπιστημών ως «RT

2 qPCR Primer Ανιχνεύσεις». Ο κατάλογος των εκκινητών και τους αριθμούς καταλόγου δίνεται στον Πίνακα S5. Για την αξιολόγηση της έκφρασης συγκεκριμένων γονιδίων, οι αντιδράσεις RT-PCR διεξήχθησαν σε cDNA που δημιουργείται από ολικό RNA που απομονώνεται από τις μεμονωμένες CSLC καλλιέργειες χρησιμοποιώντας RT² qPCR Primer Δοκιμασίες και

GAPDH

(γλυκεραλδεΰδης 3-φωσφορική αφυδρογονάση) ως ένα ιδιοσυστατικά ενεργό γονίδιο ελέγχου και RT² SYBR® Πράσινο /ROX qPCR βασικού μείγματος (Qiagen). Η έκφραση των επιλεγμένων γονιδίων προσδιορίστηκε επίσης σε φυσιολογικό ανθρώπινο πνεύμονα και απομονωμένα φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα. Κύκλος κατωφλίου (Ct) για κάθε σετ εκκινητή προσδιορίστηκε εκτελώντας αντιδράσεις RT-PCR με τον ΑΒΙ PRISM® 7000 Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Life Technologies Corporation). DCt για κάθε γονίδιο ISC προσδιορίστηκε ως (Ct [γονιδίου] – Ct [GAPDH]).., Στη συνέχεια σχετική έκφραση για να GAPDH προσδιορίζεται ως 2

-DCt

ανάλυση Σύντομη διαδοχική επανάληψη (STR)

Δεκαέξι-locus σύντομο διαδοχικών επαναλήψεων (STR) ανάλυση διεξήχθη στα αρχικά δείγματα όγκων, αν επαρκές υλικό ήταν διαθέσιμο (7/9 περιπτώσεις), σχετικά με τον πλοίαρχο και κυττάρων εργασίας των τραπεζών, και κατά μήκος σε διάφορα χρονικά διαστήματα για κάθε γραμμή, και σε ιστούς αποκόπηκε από ξενομοσχεύματα όγκου ποντικού για την αξιολόγηση της ταυτότητας. STR Η ανάλυση διεξήχθη με τη AmpFℓSTR® Identifiler® Ενίσχυση PCR Kit (Applied Biosystems, Foster City CA). Ενισχύεται τόποι φορτώθηκαν σε 3730xl της Applied Biosystems για αυτόματη συσκευή προσδιορισμού αλληλουχίας και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας την έκδοση του λογισμικού GeneMapper της Applied Biosystems του 4. MSI-H διαγνώστηκε με την παρουσία των αλληλομόρφων αστάθειας σε περισσότερα από 5 15 αυτοσωματικό STR θέσεις [23].

ανάλυση μετάλλαξης.

ανάλυση μετάλλαξης στις κυτταρικές σειρές διεξήχθη με δύο συμπληρωματικές μεθόδους. Ανάλυση του

KRAS

εξόνιο 2,

BRAF

εξόνιο 15,

PIK3CA

εξώνια 9 και 23, και η Cluster Περιφέρεια Μετάλλαξη (MCR) του

APC

εξόνιο 15 διεξήχθη με αλληλούχηση ενισχυμένου γενωμικού DNA, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24,25]. Η πλατφόρμα φασματομετρίας μάζας MALDI-TOF και πάνελ OncoCarta χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση μεταλλάξεων σε 238 θέσεις σε 19 γονιδιακούς τόπους, συμπεριλαμβανομένων εκείνων παραπάνω, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26].

Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Τα καλλιεργημένα κύτταρα απομακρύνθηκαν με κολλαγενάση /δισπάση (Roche Applied Science) ή τρυψίνη /ΕϋΤΑ (Invitrogen), πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε F12 /DMEM μέσο (Gibco /Invitrogen) + 1.0% BSA (Rockland Immunochemicals). μετρήσεις κυττάρων ελήφθησαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια γκουάβα ViaCount (γκουάβα Technologies). Πενήντα χιλιάδες βιώσιμα κύτταρα κλασματοποιήθηκαν σε στρογγυλού πυθμένα, χαμηλή HTS πρόσδεσης πλάκες 96-φρεατίων (Beckton Dickinson), επωάστηκαν με αντίσωμα σε 4 ° C για 20 λεπτά., Πλύθηκαν σε ρυθμιστικό ανάλυσης, και αντι-βάφτηκαν, όταν είναι αναγκαίο, με 2 μg /mL GAM-IgG (H + L) συζευγμένο με Alexafluor532 ή ΡΕ (Invitrogen). Τα κύτταρα πλύθηκαν και είτε σταθερά εντός ρυθμιστικού ανάλυσης + 0.1% φορμαλδεΰδης (Polysciences), ή αιωρούνται εκ νέου σε ρυθμιστικό διάλυμα ανάλυσης, τότε αναλύονται σε γκουάβα-PCA96 ή ένα FACScan (Becton Dickinson). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό FlowJo (TreeStar Inc.). Τα αποτελέσματα υπολογίζονται ως δεσμευτική ένταση (log

10 [βάφονται] – log

10 [έλεγχος ισοτόπου]). Δείτε Μέθοδοι S1 για περισσότερες λεπτομέρειες. ΑίϋΗ αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη ροή με βάση ALDEFLUOR

® δοκιμασία (Stem τεχνολογίες κυψελών) [27] με το υπόστρωμα τιτλοποιηθεί από 1:10 έως 1:. 100 αραίωση

Για διπλή ανοσοχρώση ανάλυση του CK5 /7 δεσμευτική, συρρέουσες πλάκες κύτταρα διαχωρίστηκαν με 0,05% θρυψίνη /ΕϋΤΑ, εξουδετερώθηκαν με αναστολέα θρυψίνης σόγιας, και πλύθηκαν με φυγοκέντρηση. Το προκύπτον ίζημα σταθεροποιήθηκε σε 4% παραφορμαλδεΰδη (PFA) που ακολουθείται από permeablization σε 0,1% Triton-X 100. Primary αντιορός προστέθηκε σε μία αραίωση 1:50 ποντικού αντι-ανθρώπου cytokeratin 7 (EPR1619Y) (Abcam, Ad68459), προστέθηκε συγχρόνως ως 0,5 μg /ml του ποντικού αντι-ανθρώπινου κυτοκερατίνης 5 (Biocare Medical, # PM234AA). Δευτερογενής αντιορός ήταν 1 μg /ml αντισώματος κατσίκας αντι-κουνελιού Alex Fluor 488 (Life Technologies ™) προστέθηκε ταυτόχρονα με 1 μg /ml κατσίκα αντι-ποντικού Κ-φυκοερυθρίνη (Life Technologies ™). Μη προετοιμασμένο δείγματα, δευτερεύουσα μόνο δείγματα, και μόνο οι έλεγχοι πρωταρχικό δείγμα χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση.

In vivo ογκογονικότητα

CSLC γραμμές εμφυτεύθηκαν υπό τη νεφρική κάψα (SRC) του ανοσοποιητικού ανεπάρκεια NOD SCID κοινή γ ποντικούς υποδοχέα της αλυσίδας (NSG) ποντικούς ως κολλαγόνο ενσωματωμένο κύτταρα όπως περιγράφεται προηγουμένως [ ,,,0],22,28] και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για έως και 32 εβδομάδες. Τα ζώα εξετάστηκαν σε 2-8 μήνες για όγκους και μεταστάσεις. Οι όγκοι αφαιρέθηκαν και τα ενσωματωμένα για IHC, ή διαχωρίζονται σε μονά κύτταρα και χρησιμοποιήθηκαν για PCR ή ανάλυση δείκτη όπως υποδεικνύεται.

Η ανοσοϊστοχημεία

Σταθερή ιστούς.

εκτομή ιστό ξενομοσχεύματος όγκου ορίστηκε σε 10% ουδέτερη φορμόλη (Sigma), ενσωματωμένο σε ένα μπλοκ παραφίνης και τομές 5 μm κόβονται. Τα σλάϊντς-παραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν, προκατεργασμένο με διάλυμα ανάκτηση αντιγόνου (κιτρικό ρυθμιστικό ρΗ 6) σε ένα θάλαμο decloaking (Biocare Medical), και χρωματίστηκαν για 1 ώρα με υποδεικνύεται αντι-ανθρώπινα αντισώματα (π.χ. CD34, CD44) χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο του προμηθευτή ( Biocare Ιατρική). Τα πλακίδια ξεπλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν για 30 λεπτά με HRP κατσίκας αντι-ποντικού (MACH2, Biocare Medical) και υπόστρωμα διαμινοβενζιδίνης χρωμογόνο, τότε ελαφρά με αιματοξυλίνη και ηωσίνη.

Κατεψυγμένα ιστούς.

Για τα κατεψυγμένα τμήματα ανθρώπινου φυσιολογικού πνεύμονα και τον καρκίνο του πνεύμονα, LUCA που προέρχονται από ξενομοσχεύματα, τα κυτταρικά ιζήματα από 2D καλλιέργειες, ή organoids από 3D καλλιέργεια ενσωματωμένα σε OCT, τότε κρυοστάτη χωρισμένο σε 7 μm. Διαδοχικές τομές στερεώθηκαν σε 4 ° C ακετόνη για 10 λεπτά, και ξηραίνεται στον αέρα για 30 λεπτά. Τα πλακίδια επωάστηκαν σε 3% Η

2O

2 για 10 λεπτά που ακολουθείται από δύο εκπλύσεις σε ρυθμιστικό διάλυμα. 5% φυσιολογικό ορό κατσίκας εφαρμόστηκε στις διαφάνειες για 10 λεπτά και στη συνέχεια βγαίνει από τη θέση. Τα πλακίδια επωάστηκαν με τα αντισώματα της δοκιμής (συγκεντρώσεις και χρόνοι επώασης καθορίζονται από προηγούμενες βελτιστοποιημένα πρωτόκολλα) και πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα. Οι έλεγχοι επωάστηκαν με ένα αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου που αντιστοιχεί σε κάθε πειραματική αντίσωμα δοκιμάστηκε. Μετά την επώαση πρωτογενές αντίσωμα, τα πλακίδια επωάστηκαν με Dako Envision HRP αντι ποντικού ή πολυμερές κουνέλι για 30 λεπτά που ακολουθείται από δύο εκπλύσεις σε ρυθμιστικό διάλυμα. Διαμινοβενζιδένιο τετραϋδροχλωρική (DAB) χρησιμοποιήθηκε ως χρωμογόνο να απεικονίσει τη χρώση.

ανοσοφθορισμού σε καλλιέργειες μονοστοιβάδας.

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε είτε γυάλινα καλύμματα ή διαφάνειες θάλαμο γυαλί (Lab-Tek), στη συνέχεια, σταθεροποιήθηκαν με 4% PFA και κατέστησαν διαπερατά με 0.1% TritonX-100. Πρωτογενής αντιορός 1 μg /ml του ποντικού αντι-ανθρώπινου κυτοκερατίνης 5 (Biocare Medical, # PM234AA), προστέθηκε κατά τον ίδιο χρόνο όπως αραίωση 1: 100 του κουνελιού αντι-ανθρώπινης κυτοκερατίνης 7 (EPR1619Y) (Abcam, Ad68459). Δευτερογενής αντιορός ήταν 2 μg /ml αντι-ποντικού κατσίκας Alex Fluor 488 (Life Technologies ™) προστέθηκε ταυτόχρονα με 2 μg /ml αντισώματος κατσίκας αντι-κουνελιού ροδαμίνης Red ™ -Χ (Life Technologies ™). Mouse IgG1 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος ισοτύπου, και του δευτερογενούς μόνο συνθήκες χρησιμοποιήθηκαν για μη-ειδικούς ελέγχους χρώση. Ανοσοχρώση οπτικοποιήθηκε σε ένα μικροσκόπιο Nikon TE300 με Φίλτρο ET Sedat Quad Set και μια φωτογραφική μηχανή CCD Retiga EXI. λογισμικό ΖΩΩΝ χρησιμοποιήθηκε για να συλλάβει τις εικόνες.

Αποτελέσματα

LUCA CSLC χαρακτηρισμό

όγκου των ιστών, τα οποία απεστάλησαν στον πάγο, ελήφθη από μια σφηνοειδής εκτομή των πρωτοπαθών όγκων του πνεύμονα. Ο ιστός διασπείρεται και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε συνθήκες άνευ ορού (ή μέσα τα οποία περιέχουν ορό για την επέκταση των στρωματικών κυττάρων). Αυτό καθορισμένο μέσο που επιλέγεται και να επεκταθεί ένα μικρό ποσοστό των επιθηλιακών κυττάρων από 3 από 4 αδενοκαρκινώματα πνεύμονα (AC) (LUCA 32, LUCA33) και 2 από 2 αδενοχοληδωτό καρκινωμάτων (ASC) (LUCA22, LUCA35) ιστούς. Σε αντίθεση, κανένα επιτυχημένο καλλιέργειες που λαμβάνονται από δείγματα ιστών πλακώδους καρκινώματος (4 χωριστές προσπάθειες) χρησιμοποιώντας αυτό το ίδιο μέσο. Η προσθήκη του ορού κατά την έναρξη των πρωτογενών καλλιεργειών από τα αποτελέσματα του όγκου στην πρώιμη επέκταση των στρωματικών κυττάρων σε 3 από 3 περιπτώσεις (π.χ. LUCA11 (1% ορός + ορμόνη πρόσθετα), LUCA36 (10% ορός)), που μπορεί να είναι επεκταθεί για περιορισμένη διέλευση και κλίση. Αυτά τα στρωματικά κύτταρα έχουν μια ινοβλαστική εμφάνιση σε 10% FBS και δεν είναι ογκογονικά όταν εμφυτεύονται σε 5×10

5 κάτω από το υπο-νεφρική κάψα ενός ποντικού με ανοσοανεπάρκεια.

STR Χαρακτηρισμός και ανάλυση μεταλλάξεων των κυτταρικών καλλιεργειών που προέρχονται από όγκους

Short διαδοχική επανάληψη (STR) ανάλυση σε 16 τοποθεσίες έδωσε ένα μοναδικό πρότυπο για κάθε μία από τις 6 γραμμές, οι οποίες ήταν διαφορετικές η μία από την άλλη και από τυχόν γραμμές ATCC (βλέπε πίνακα S2). Τρεις από 4 γραμμές έδειξαν κάποια απώλεια της ετεροζυγωτίας κατά τη σύγκριση του δείγματος του όγκου (η οποία θα περιλαμβάνει μη καρκινικά κύτταρα) και το CSLC. Μερικά αύξηση της ετεροζυγωτίας παρατηρήθηκε με εκτεταμένο απόσπασμα (ρ47 = & gt? 150 διπλασιασμούς πληθυσμού)

Οι αναλύσεις μετάλλαξης αποκάλυψε ότι το 100% του ASC (LUCA22) CSLC εκθέματα ένα ενιαίο σημείο G12V μετάλλαξη εντός των περιοχών κωδικοποίησης του

KRAS

, με βρεθούν μεταλλάξεις στο

APC

ή

PIK3CA

. Οι γραμμές εναλλασσόμενου ρεύματος (LUCA32 και LUCA33) είχε επίσης ένα ενιαίο σημείο μετάλλαξη στο γονίδιο KRAS μόνο (G12V και G12C, αντίστοιχα) (Πίνακας S3).

Ογκογονικότητα και μεταστάσεις

Για να ελέγξετε για ογκογόνο δυναμικό, τα κύτταρα LUCA22 σε διάφορα εμβόλια (5x10e4, 5x10e3, ή 5x10e2) έχουν ενσωματωμένα κουμπιά κολλαγόνου και εμφυτεύεται κάτω από το υπο-νεφρική κάψα (SRC) σοβαρά το ανοσοποιητικό ανεπαρκή ποντίκια NSG. Όγκοι παρατηρήθηκαν σε όλες τις κυτταρικές εμβολίων από 31 εβδομάδες (Σχήμα 1, Πίνακας S6). Σε υψηλότερες κυττάρων παρατηρήθηκαν μεταστάσεις εμβόλια σε πολλαπλά όργανα μόλις σε 10 εβδομάδες μετά την εμφύτευση SRC. Οι μεταστάσεις αυξήθηκαν σε κατανομή και το μέγεθος με το χρόνο με όλα τα ζώα εμβολιάστηκαν με το μεγαλύτερο αριθμό των κυττάρων που δείχνει μεταστάσεις σε 16 εβδομάδες ή και περισσότερο. Μεταστάσεις παρατηρήθηκαν στο ήπαρ, σπλήνα, πάγκρεας, μεσεντέριο, το διάφραγμα και, περιστασιακά, σε απομακρυσμένες θέσεις όπως τον πνεύμονα και τον εγκέφαλο (Σχήμα 1). Κύτταρα εμβολιάσθηκαν υποδορίως μεγάλωσε σε όγκους αλλά δεν είχε μεταστάσεις (5x10e5, έως 24 εβδομάδες).

σύγκριση της μορφολογίας και ιστοπαθολογία του αρχικού όγκου του ασθενούς από τα οποία προέρχεται LUCA22 και ξενομοσχεύματα και μεταστάσεις που προέρχονται από το LUCA22 CSLC. Τα τμήματα των όγκων χρωματίστηκαν με Η &? Ε για να δείξει αδενοκαρκίνωμα (πάχους βέλη) και πλακωδών (λεπτό βέλη) μορφολογίες (κορυφή 2 σειρές, αριστερά). Επάνω δεξιά 2 σειρές δείχνει μεταστάσεις στον πνεύμονα και το ήπαρ (βέλη) και Η &? Ε τμημάτων αυτών των οργάνων που εμφανίζουν μεταστατικών οζιδίων (βέλη). Τα πρόσθετα τμήματα βάφονται στις κερατίνες 5 (CK5), 7 (CK7) και 18 (CK18), ή βιμεντίνη (VIM). Η κατώτατη γραμμή είναι διπλή χρώση για τον παράγοντα βλαστοκυττάρων (SCF-καφέ) και c-kit (CD117 (κόκκινο). Το πλαίσιο ένθετο στην κάτω δεξιά δείχνει την αύξηση μεγεθύνσεις των ανθρώπινων κυττάρων LUCA22 (κουτί, βέλη) που έχουν κάνει μετάσταση από ένα δευτερεύον νεφρική όγκου στον εγκέφαλο, χρώση για τον πνεύμονα όγκου συγκεκριμένη ναψίνης (κόκκινο) /TTF1 (καφέ) διπλή χρώση.

η

ένα στοιχείο που καθορίζει ΚΕΠ είναι ότι μπορούν να σχηματίσουν έναν όγκο από ένα μόνο κύτταρο και ανακεφαλαίωση η μορφολογία του αρχικού όγκου του ασθενούς. για να δοκιμαστεί εάν ένα μόνο κύτταρο θα μπορούσε να προκαλέσει διαφοροποιημένοι όγκοι, οκτώ μεμονωμένοι κλώνοι κυττάρων που προέρχονται από LUCA22 επιλέχθηκαν για επέκταση και εμφύτευση στο SRC. οι όγκοι αυξήθηκαν από όλους τους 8 κλώνους που επιλέχθηκαν για τις δοκιμές (Σχήμα 2 , Πίνακας S6). Δύο από τους κλώνους έδειξε μεταστάσεις από 8 εβδομάδες

in vivo

. Ετσι, η γραμμή LUCA22 είναι ικανή να δημιουργήσει μια μεταστατικού όγκου από ένα και μόνο κύτταρο. Έχουμε επόμενη Συγκρίναμε τα ξενομοσχεύματα που προέρχονται από LUCA22 ASC με τον αρχικό όγκο του ασθενούς χρησιμοποιώντας IHC να δούμε δείκτες χαρακτηριστικό του ASC.

Τα κλωνοποιημένα κύτταρα LUCA22 να οδηγήσει σε ξενομοσχεύματα χρώση όπως αδενο- και ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα. Τα ξενομοσχεύματα που προκύπτουν από την LUCA22 CSLC, 5 LUCA22 κλώνους, και μετάσταση από τον κλώνο 2G1 δείχνεται χρωματίστηκαν με Η &? Ε, ναψίνης /TTF1, ή ρ63 /CK5 μετά από 8 εβδομάδες στο ζώο (Α). Οι κλώνοι που κάνει μετάσταση υποδεικνύεται με *. Β Ξενομοσχεύματα που προέρχεται από τον όγκο του ασθενούς (κορυφή) του LUCA 22 και ξενομοσχεύματα που προέρχονται από LUCA22 κλώνο 5E11 στους χρόνους και μεγεθύνσεις ενδείκνυται. Τα τμήματα αυτά είναι διπλή χρώση για CK5 (κόκκινο) και CK7 (καφέ).

Η

Συγκριτική ανάλυση των όγκων των ασθενών και ξενομοσχεύματος από την IHC

Από CK5 και έκφραση CK7 σε διαφορετικά τμήματα του ίδιου όγκου είναι παθογνωμονικό για ASC, συγκρίναμε την κατανομή της χρώσης CK5 και CK7 εντός του αρχικού όγκου του ασθενούς, ξενομοσχεύματα που προέρχονται από LUCA22 κύτταρα, LUCA22 κλώνοι, και οι μεταστάσεις από αυτές ξενομοσχεύματα. LUCA 22 προέρχονται ξενομοσχεύματα εμφανίστηκε ως πτωχά διαφοροποιημένο ASC που έμοιαζε στενά την ιστολογία του αρχικού όγκου του ασθενούς (Σχήμα 1). Ορισμένες περιοχές του όγκου είχε την εμφάνιση ενός αδενοκαρκινώματος και ήταν θετικά για χρώση CK7, ενώ άλλες περιοχές του όγκου είχε χαρακτηριστικά ενός πλακώδους καρκινώματος και χρωματίστηκαν θετικά για CK5, αναπαράγοντας έτσι τον φαινότυπο ASC φαίνεται στο του αρχικού όγκου του ασθενούς. Ακόμη και οι όγκοι που προέρχονται από 500 κύτταρα εμφάνισαν το μοτίβο ASC τόσο CK5 και χρώση CK7 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι μεταστάσεις στον πνεύμονα και το ήπαρ περιείχαν επίσης κύτταρα τα οποία ήταν και τα δύο θετικά για CK5 και χρώση CK7 (Σχήμα 1).

Για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό αυτών των όγκων, μπορούμε βάφονται τους ιστούς με δύο συνδυασμούς αντίσωμα που χρησιμοποιείται από παθολόγους να διαφοροποιηθούν τα αδενοκαρκινώματα του πνεύμονα (ναψίνης Α + TTF1) [29] και καρκινώματα πλακωδών κυττάρων (p63 + CK5) [30]. Αυτά τα δύο σύνολα των αντισωμάτων παρατηρήθηκαν να λεκιάζουν διαφορετικές περιοχές του γονικού όγκου και τα 8 κλωνικά προέρχονται ξενομοσχεύματα και μεταστάσεις (Σχήμα 2 Α, Σχήμα S1). Κλωνικά προέρχονται ξενομοσχεύματα, διπλό χρωματίστηκαν για CK5 και CK7, επίσης εκφράστηκαν σε διακριτές, αλλά παρακείμενες περιοχές του όγκου (Σχήμα 2 Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, ο όγκος του ασθενούς, καθώς και ξενομοσχεύματα, εκφράζεται CK18, ένα επιθηλιακό δείκτη, και βιμεντίνη, έναν δείκτη μεσεγχυματικά (Σχήμα 1), με το τμήμα στρωματικά του όγκου ασθενούς, αλλά όχι το ξενομόσχευμα, επίσης χρωματίζονται θετικά με το αντι ανθρώπινο αντίσωμα vimentin.

Επιπλέον, εξετάσαμε τους όγκους για τον παράγοντα βλαστοκυττάρων (SCF) και είναι υποδοχέας CD117 (c-ΚΙΤ) και ALDH1A1 [9], πρωτεΐνες αναφερθεί ότι παίζει ένα ρόλο στην ογκογένεση του πνεύμονα. Τόσο όγκου του ασθενούς και οι όγκοι ξενομοσχεύματος ήταν θετικά τόσο για SCF και CD117, που βρέθηκαν σε παρακείμενες περιοχές του όγκου (Σχήμα 1) αν και χρώση SCF ήταν πιο εκτεταμένη από χρώση CD117 (Σχήμα S2 Α). ALDH1A1 επίσης βρέθηκε σε τόσο όγκο και ξενομοσχεύματα που προέρχονται από LUCA22 καθώς και μεταστάσεις στον πνεύμονα (Εικόνα S2 Α, Β) του ασθενούς. Η LUCA22 CSLC ήταν θετικά για δραστηριότητα ALDH, ένα τμήμα των οποίων θα μπορούσε να εξουδετερωθεί από την ΑΙ_ϋΗ1 ειδικό ϋΕΑΒ αναστολέας (Εικόνα S2 C)

έκφραση Cytokeration σε CSLC

Δεδομένου ότι η έκφραση των δύο CK5 και CK7, μέσα σε διαφορετικές περιοχές του όγκου, είναι χαρακτηριστικό της ASC διπλασιάζουμε βάφονται LUCA22 και LUCA35 CSLC μονοστιβάδες για CK5 και CK7 χρήση ροδαμίνης ή FITC σημασμένα αντισώματα. Παραδόξως, οι περισσότεροι CSLC κύτταρα ήταν διπλά θετικά CK5 + CK7 +. Τα διπλά χρωματισμένα κύτταρα φάνηκαν να έχουν μεταβλητά επίπεδα CK5 και CK7 στα κύτταρα (Σχήμα 3). Αυτό ήταν, επίσης, ισχύει και για την κλωνική προέρχεται γραμμή 5E11 (Σχήμα 3 D). Ο ποσοτικός προσδιορισμός των διπλών προετοιμασμένα κύτταρα CK5 και CK7 πραγματοποιήθηκε με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής διαπερατά, σταθεροποιήθηκαν και βάφτηκαν κύτταρα (Σχήμα 4 Α). Και πάλι, ο LUCA 22, κλωνοποιημένα κύτταρα LUCA22 -5E11 και LUCA35 όλα ήταν κυρίως διπλά θετικά για CK5 και CK7. Ως έλεγχοι, τέσσερα ATCC ορό κύτταρα προερχόμενα γραμμές διπλό χρωματίστηκαν για IHC και ανάλυση ροής (βλέπε αποτελέσματα S1). Κανείς δεν παρουσίασε αυτό το διπλό πρότυπο χρώσης του CSLC. Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν η LUCA22 CSLC (συμπεριλαμβανομένων των ενιαίων κλώνοι κυττάρων) επιτρέπεται να σχηματίζουν όγκους του CK5 και έκφραση CK7 ταξινομεί σε διαφορετικούς πληθυσμούς κυττάρων (Σχήμα 2 Β). Έτσι, υπάρχουν CK5 + /CK7-, CK5- /CK7 +, και ένας μικρός πληθυσμός του + /CK7 + κύτταρα CK5 στους όγκους (Σχήμα S4). Το μεγάλο πληθυσμό CK5- /CK7- δει στο διασκορπισμένα SQ και όγκους SRC μπορούν να μολύνουν στρωματικά κύτταρα ποντικού, επειδή δεν είχαμε επιλέξει ενεργά εναντίον αυτών των κυττάρων για την ανάλυση αυτή.

ανοσοφθορισμού (πάνελ AG) και αντίθεσης φάσης (H) διαπερατοποιημένων καλλιέργειες μονοστοιβάδας βάφτηκαν για CK5 (κόκκινο), CK7 (πράσινο), ή και τα δύο. LUCA22 (Α-Γ) ο LUCA22 κλώνος 5E11 (D) και LUCA35 (E-G) δείχνονται. Πίνακες Α-Γ και Ε-G δείχνουν το ίδιο πεδίο ατομικά βάφονται και την επικάλυψη των δύο. Πάνελ Η δείχνει το ίδιο πεδίο (E-G) ως εικόνα αντίθεσης φάσης. Όλες οι εικόνες είναι 40Χ.

Η

Πίνακας Α είναι τα δεδομένα από την ανάλυση της ροής των διαπερατά LUCA22 κλώνου 5E11 και LUCA 35 κύτταρα ASC διπλή χρώση για CK5 και CK7. Τα θετικά κύτταρα% και συνδεθείτε σήμα από την ανάλυση της ροής των πρωτεϊνών κυτταρικής επιφάνειας (Β) εμφανίζεται για 2 ASC-προέρχεται CSLC (LUCA22 (σκούρο πράσινο μπάρες), LUCA35 (πράσινο φως)), 2 AC-προέρχεται CSLC (LUCA32 ( κίτρινο), LUCA33 (πορτοκαλί)) και του καρκίνου του πνεύμονα στρωματικά κύτταρα (LUCA11 (σκούρο μπλε), LUCA36 (γαλάζιο)) στον πίνακα B. Το αρχείο καταγραφής σύνδεσης (σύμβολα) και δεσμευτικές για τον έλεγχο ισοτόπου τοις εκατό (μπάρες) εμφανίζεται για το καθένα. Πίνακας Γ δείχνει ένα ενιαίο πληθυσμό ότι η διπλή ετικέτες με CD44 και CD24 αντισώματα για τα κύτταρα LUCA22 και LUCA35.

Η

κυτταρικής επιφάνειας ανάλυση δείκτη

Για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό των πληθυσμών επιλεκτικά προέρχονται από πνεύμονα όγκους, τα κύτταρα από τις γραμμές 4 CSLC (ASC: LUCA22, LUCA35? AC: LUCA32, LUCA33) και 2 γραμμές στρωματικών (LUCA11, LUCA36) αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής για την πρόσδεση ενός πάνελ των αντισωμάτων στην ανθρώπινη δείκτες που χρησιμοποιούνται συχνά για την επιλογή, ή να προσδιορίζουν, CSLC από συμπαγείς όγκους (Σχήμα 4 Β). CD44 και CD29 ήταν παρόντες σε όλες τις γραμμές, συμπεριλαμβανομένων των γραμμών του στρώματος. CD24 ήταν παρόν σε όλες τις 4 των CSLC γραμμές, αλλά όχι τα στρωματικά κύτταρα. Καμία από τις γραμμές δεσμεύεται είτε των μονοκλωνικών αντισωμάτων CD133 που έχουν αναφερθεί για την επιλογή CSC σε μερικούς όγκους, αν και έχει αμφισβητηθεί η καθολικότητα του CD133 ως δείκτη βλαστικών κυττάρων σε καρκίνους του πνεύμονα [12]. Η βλεννίνη 1 (MUC1) και το στάδιο ειδικό εμβρυϊκό αντιγόνο 1 (SSEA1) εκφράστηκαν σε υψηλότερο επίπεδο στις γραμμές εναλλασσόμενου ρεύματος από τις γραμμές ASC ενώ ABCG2 βρίσκεται σε LUCA22, αλλά όχι τις άλλες γραμμές. Για να αναζητήσετε ομοιογένεια των πληθυσμών, ο κλώνος LUCA22-5E11 και η κυτταρική γραμμή LUCA35 ήταν διπλά επισημασμένου για CD24 /CD44 (Σχήμα 4 C). Η διπλή σήμανση έδειξε ότι ένας πληθυσμός δεσμεύονται και τα δύο αντισώματα. επιλέχθηκαν και αναλύθηκαν παράλληλα με την γονική γραμμή LUCA22 Τέσσερις κλώνοι του LUCA22. Δεσμευτική ήταν πολύ παρόμοια για τους κλώνους και γονική γραμμή για πιο δείκτες με μονοτροπικές διανομές, αν και η σύνδεση παρατηρήθηκε κάποια μεταβολή στην κορυφή. (Σχήμα S5 A-C). Δεδομένου ότι ο δείκτης βλαστικών κυττάρων CD117 βρέθηκε σε ένα μικρό μόνο τμήμα του CSLC, επιχειρήσαμε να εμπλουτίσει για αυτόν τον πληθυσμό, χρησιμοποιώντας FACS. Μετά από 4 διαδοχικές είδη, ήμασταν σε θέση να αυξήσει το ποσοστό των κυττάρων που είναι θετικά για CD117, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα κύτταρα δεν αντιπροσωπεύουν ένα διαχωρίσιμο υποπληθυσμού κυττάρων στο CSLC (Σχήμα S5 D).

Η γονιδιακή έκφραση σε CSLC γραμμές

Για να χαρακτηρίσουμε εκτενέστερα γονιδιακής έκφρασης σε αυτά CSLC, κοιτάξαμε ένα σύνολο 23 γονιδίων που επιλέγονται από εκείνα που φέρεται να εκφράζεται σε καρκίνους του πνεύμονα AC και SCC και διαφοροποιημένη κανονικούς τύπους κυττάρων των πνευμόνων από RTPCR. Το πρότυπο έκφρασης των γραμμών ASC ήταν μοναδική στο ότι συν-εκφράζονται (συμπεριλαμβανομένων κλώνοι) πολλαπλά γονίδια πιστεύεται ότι είναι χαρακτηριστικό των AC και SCC, καθώς και ένα αριθμό φυσιολογικών δεικτών πνεύμονα γενεαλογίας. Η έκφραση ενός αριθμού γονιδίων ήταν έντονα τα πάνω ρυθμισμένη στις γραμμές ASC σε σύγκριση με τις γραμμές εναλλασσόμενου ρεύματος (Σχήμα 5), συμπεριλαμβανομένων:

MAGEA3, MAGEA6, CSTA, TFPI2

,

KRT5, TWIST1

και

PTHLH

. Από αυτά, μόνο η έκφραση MAGEA3 /A6 εξ ολοκλήρου περιορίζεται στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα (& gt? 30X υψηλότερη σε ASC από AC) και που δεν φαίνεται καθόλου στο στρώμα του όγκου ή κανονικών δειγμάτων πνεύμονα. Μαρκαδόροι για άλλους διαφοροποιημένων κυτταρικών τύπων εκφράστηκαν σε χαμηλά επίπεδα στο CSLC (

SCGB1A1

, τα κύτταρα Clara?

MUC5AC

, Κύπελλο κελιά?

AQP5

, τύπου Ι πνευμονοκύτταρα? Και

SFTPC

, BASC) ή σε πολύ χαμηλά επίπεδα (

SFTPD

, πνευμονοκύτταρα τύπου ΙΙ?

CHGA

, νευροενδοκρινείς κύτταρα).