Αφηρημένο

Ο καρκίνος είναι ένα μείζον πρόβλημα δημόσιας υγείας σε όλο τον κόσμο. Μόνο στις Ηνωμένες Πολιτείες, 1 στους 4 θανάτους οφείλεται σε καρκίνο και για το 2013 συνολικά 1.660.290 νέες περιπτώσεις καρκίνου και 580.350 θάνατοι σχετίζονται με τον καρκίνο προβάλλονται. Περιεκτική προφίλ πολλαπλών γονιδιωμάτων καρκίνο έχει αποκαλύψει ένα εξαιρετικά πολύπλοκο γενετικό τοπίο στο οποίο ένας μεγάλος αριθμός γονιδίων μεταβάλλεται, που κυμαίνονται από όγκο σε όγκο, επηρεάσει πυρήνας βιολογικών οδών και διεργασίες. Αυτό έχει επιπτώσεις για τη θεραπευτική στόχευση των δικτύων σηματοδότησης στην ανάπτυξη θεραπειών για συγκεκριμένες μορφές καρκίνου. Ο παράγοντας μεταγραφής ΝΡκΒ είναι ουσιαστικά δραστική σε έναν αριθμό αιματολογικών και συμπαγών όγκων, και πολλά μονοπάτια σηματοδότησης που εμπλέκονται στον καρκίνο είναι πιθανό συνδέονται με την ενεργοποίηση του ΝΡκΒ. Μια κρίσιμη μεσολαβητής της δραστικότητας του ΝΡκΒ είναι ΤΟΡβ-ενεργοποιημένη κινάση 1 (TAK1). Εδώ, έχουμε εντοπίσει TAK1 ως νέου πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης και στόχος του υποδοχέα αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών 3 (FGFR3) δραστικότητα κινάσης τυροσίνης. Έχουμε αποδείξει περαιτέρω ότι η ενεργοποίηση μεταλλάξεων σε FGFR3 σχετίζονται τόσο με πολλαπλό μυέλωμα και καρκίνου της ουροδόχου κύστης μπορεί να διαμορφώνει την έκφραση των γονιδίων που ρυθμίζουν σηματοδότηση ΝΡκΒ, και προώθηση τόσο ΝΡκΒ μεταγραφική δραστηριότητα και προσκόλλησης κυττάρου με τρόπο που εξαρτώνται από την έκφραση TAK1 στους δύο τύπους καρκινικών κυττάρων. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν TAK1 ως δυνητικό θεραπευτικό στόχο για καρκίνους FGFR3 που σχετίζονται, και άλλες κακοήθειες στις οποίες TAK1 συμβάλλει στην συστατική ενεργοποίηση ΝΡκΒ

Παράθεση:. Salazar L, Kashiwada Τ, Krejci Ρ, Meyer AN, Casale Μ, Hallowell M, et al. (2014) Ινοβλαστών Growth Factor Receptor 3 αλληλεπιδρά με και ενεργοποιεί ΤGFβ-ενεργοποιημένη κινάση τυροσίνης 1 φωσφορυλίωση και ΝΡκΒ Σηματοδοσίας στο πολλαπλό μυέλωμα και καρκίνο της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 9 (1): e86470. doi: 10.1371 /journal.pone.0086470

Επιμέλεια: Hari Κ Κοαΐ, Louisiana State University Κέντρο Επιστημών Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19, Αύγ του 2013? Αποδεκτές: 9 Δεκεμβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 23 Γενάρη του 2014

Copyright: © 2014 Salazar et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα Πολλαπλές μυέλωμα Έρευνας, Chao Οικογένεια Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου στο UCI, Έλσα Ίδρυμα U. Pardee, Υπουργείο Παιδείας, Νεολαίας και Αθλητισμού της Δημοκρατίας της Τσεχίας (KONTAKT LH12004), Ίδρυμα Τσεχική Επιστήμη (P305 /11/0752). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι μια πολύπλοκη ασθένεια που προκύπτει από την απόκτηση των σωματικών μεταλλάξεων που dysregulate μονοπάτια κεντρικής σημασίας για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση, αγγειογένεση και μετάσταση σηματοδότησης. Δυσλειτουργία του σηματοδότηση FGFR3 έχει ενοχοποιηθεί σε διάφορους τύπους καρκίνου, καρκίνωμα κυρίως ουροθηλιακό κύτταρο (UC) και πολλαπλό μυέλωμα (ΜΜ). Ουροθηλιακά καρκινώματα αντιπροσωπεύουν περισσότερο από το 90% των καρκίνων της ουροδόχου κύστης, η οποία έχει μια παγκόσμια επίπτωση πάνω από 350.000 νέες ετήσιες διαγνώσεις και την κατάταξη ως η τρίτη πιο κοινή κακοήθεια στους άνδρες και η δέκατη πιο συχνή στις γυναίκες στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Η υπερέκφραση ή ενεργοποίηση μετάλλαξη του FGFR3 είναι η πιο συχνή γενετική μεταβολή σε UC (που επισκοπείται στο [2]). Πολλαπλό μυέλωμα, μια μορφή καρκίνου του τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα Β, είναι η δεύτερη πιο κοινή μορφή καρκίνου αιματολογικές με εκτίμηση Αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία των 22.350 νέων περιπτώσεων για το 2013. Μεταξύ των υποθέσεων του ΜΜ με τις φτωχότερες πρόγνωση είναι εκείνοι 15% με το t (4? 14) μετατόπιση, η οποία στοχεύει τόσο FGFR3 και MMSET (κριτική στο [3] – [5]). Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι αυτό μετατόπιση μπορεί να είναι ο μείζων κλώνος στη διάγνωση ή, αντιθέτως, παρατηρήθηκε μόνο κατά τη στιγμή της υποτροπής [6]. Ωστόσο, ο μηχανισμός που υπογραμμίζει την επιθετικότητα του t (4? 14) μυελώματος παραμένει ασαφής και η σχετική συνεισφορά του FGFR3 και MMSET ως υποτιθέμενο ογκογονίδια είναι αμφιλεγόμενη, καθώς το 25% του t (4? 14) όγκων δεν έχουν έκφραση FGFR3. Η απόκτηση των μεταλλάξεων FGFR3 ενεργοποίησης (5-10% του t (4? 14) περιπτώσεις) με την εξέλιξη της νόσου υποδηλώνει έναν ρόλο για FGFR3 σε ΜΜ παθογένεση, και οι πρώτες μελέτες αποδεικνύουν την ογκογόνο δυναμικό των ενεργοποιημένων μεταλλαγμένου FGFR3 [4]. Αποδείχθηκε επίσης πρόσφατα ότι άγριου τύπου FGFR3, όπως εκφράζεται στις περισσότερες FGFR3-θετικών Τ (4? 14) όγκους, μπορεί να συμβάλει στην Β κυττάρου ογκογένεση [7]. Επιπλέον, μια πληθώρα προκλινικών δεδομένων καταδεικνύουν την αποτελεσματικότητα των αναστολέων κινάσης τυροσίνης υποδοχέα και εξουδετερωτικό αντίσωμα ενάντια σε κύτταρα που εκφράζουν MM μεταλλάξεις FGFR3 ενεργοποίησης και του υποδοχέα άγριου τύπου (που επισκοπείται στο [3] – [5]). Ομοίως, η αναστολή της FGFR3 μπορεί να διεγείρει διακοπή κύκλου κυττάρου ή /και απόπτωση σε UC [8], [9] και οι δύο

in vitro

και

in vivo

, παρέχοντας την επικύρωση ότι FGFR3 και οδοί κατάντη σηματοδότησης αντιπροσωπεύουν δυνητικώς σχετική θεραπευτικοί στόχοι για την αγωγή καρκίνων FGFR3-συνδέονται.

FGFR3 είναι ένα από τα τέσσερα υποδοχέων κινάσης τυροσίνης που διαμεσολαβούν τις επιδράσεις της FGFs επί διάφορες κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων πολλαπλασιασμού, διαφοροποίησης και μετανάστευσης. ενεργοποίηση του υποδοχέα πυροδοτεί μονοπάτια μεταγωγής σήματος εμπλέκονται στην ογκογένεση, συμπεριλαμβανομένης της Ras /ERK /ΜΑΡΚ, ΡΙ_Ογ /PKC, ΡΙ3Κ, και μονοπάτια STAT [10]. Πιο πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι η σηματοδότηση του υποδοχέα FGF μπορεί επίσης να ενεργοποιήσει ΝΡκΒ [11], [12], η ανώμαλη ενεργοποίηση των οποίων παρατηρείται συχνά σε ανθρώπινα καρκινικά [13], [14] και στενά συσχετίζεται με σφραγίδες καρκίνο [15]. Ένα ενδιάμεσο κλειδί στη ΝΡκΒ σηματοδότηση, ΤGFβ-ενεργοποιημένη κινάση 1 (TAK1), λειτουργίες κατάντη των πολλαπλών οδών σηματοδότησης, που ρυθμίζουν την κυτταρική επιβίωση, διαφοροποίηση, και φλεγμονώδεις αποκρίσεις [16], και στέκεται ως βασικό ΙΚΚ-κινάσης της οδού κανονικών ΝΡκΒ [ ,,,0],17]. Η χημική και γενετική αναστολή της TAK1 προάγει απόπτωση σε όγκους του δέρματος [18] και ένα υποσύνολο των καρκίνων του παχέος εντέρου [19], καθώς επίσης ελαττώνει χημειοαντίσταση στα κύτταρα του μαστού και του καρκίνου του παχέος εντέρου [20] και χημειοαντίσταση και δραστηριότητα του ΝΡκΒ σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε καλλιέργεια [ ,,,0],21]. Επιπλέον, η καταστολή της TAK1 σηματοδότησης μειώνει την ενεργοποίηση ΝΡκΒ σε ανθρώπινο κεφάλι και το λαιμό πλακώδους καρκινώματος κυτταρικές γραμμές [22], τα κύτταρα καρκινώματος ωοθηκών [23], και κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού [24], και μπλοκ κυτταρικής προσκόλλησης του καρκίνου του μαστού, εισβολή, και μετάσταση in vitro [25]. TAK1 δεν έχει διερευνηθεί στο πλαίσιο της ΜΜ ή καρκίνου της ουροδόχου κύστης? Ωστόσο, είναι προς τα κάτω στόχος, ΝΡκΒ, έχει αναδειχθεί ως ένα από τα πλέον ισχυρά οδηγοί της ογκογένεσης σε mm, με όσο το 82% των δειγμάτων ΜΜ που εκφράζουν μόρια ενεργοποίησης υπογραφή [26], [27]. Συνεπής με αυτό το κλειδί ογκογόνο ρόλο, διάφορα φάρμακα που είναι αποτελεσματικά κατά ΜΜ, συμπεριλαμβανομένων bortezomib, θαλιδομίδη, και λεναλιδομίδη, η ενεργοποίηση του ΝΡκΒ μπλοκ (που επισκοπείται στο [28]). Σε UC, η καταστολή της δραστικότητας του ΝΡκΒ ενισχύει τα αποπτωτικά επιδράσεις χημειοθεραπευτικών παραγόντων και κυτοκινών [29], [30].

Χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό από δύο υβριδίων ζύμης και γενετική εξέταση μικροδέσμης σε συνδυασμό με ανάλυση μονοπάτι συστήματα, εντοπίζουμε TAK1 ως νέο αλληλεπίδρασης και στόχος της δράσης κινάσης τυροσίνης FGFR3. Έχουμε περαιτέρω επιδεικνύουν ένα ρόλο για TAK1 ως θετικός ρυθμιστής της δραστικότητας του ΝΡκΒ κατάντη του FGFR3 τόσο του πολλαπλού μυελώματος και καρκίνωμα ουροθηλίου κυττάρων, δύο καρκίνοι με αποδεδειγμένη εμπλοκή FGFR3 [10], [31], με ρυθμιστικά αποτελέσματα επί προσκόλλησης κυττάρου.

Μέθοδοι

Cell Culture και διαμόλυνση

FGFR3 αρνητικά (RPMI-8226) και άγριου τύπου (LP1) ανθρώπινες κυτταρικές σειρές ΜΜ ελήφθησαν από τη γερμανική Συλλογή μικροοργανισμών και Κυτταροκαλλιεργειών [DSMZ? Braunschweig, Γερμανία]? FGFR3 μεταλλαγμένα ΜΜ κύτταρα (KMS-11? Y373C) που προέρχεται από έναν ασθενή MM και με έδρα το Kawasaki Ιατρική Σχολή του [32], τα γενναιόδωρα από τον Dr. Ρ Leif Bergsagel. Το μεταλλαγμένο FGFR3 κύστης κυτταρική σειρά καρκίνου, MGHU3 (Y375C), ένα είδος δώρο από τον Δρ Margaret Knowles (Πανεπιστήμιο του Leeds, Leeds, UK), προήλθε από ένα βαθμό 1 όγκου [33]. ΜΜ και UC κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Hyclone? Thermo Scientific, Rockford, IL) και HeLa και κύτταρα ΗΕΚ293 (ATCC) σε ϋΜΕΜ (Hyclone), και οι δύο μέσα συμπληρωμένα με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen). Παροδική διαμόλυνση κυττάρων HeLa και ΗΕΚ293 επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Life Technologies? Grand Island, ΝΥ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και ΜΜ και UC επιμολύνονται γραμμές χρησιμοποιώντας το σύστημα Νέον (Life Technologies). Ακολουθώντας τη διαδικασία του κατασκευαστή, 1 × 10

6 UC ή 2 × 10

6 mm κύτταρα εναιωρήθηκαν σε διάλυμα εναιώρημα 100 μΐ που περιείχε 5 μg siRNA (Dharmacon) ή πλασμίδιο και παλμικά υπό προγράμματος 3 για UC και το πρόγραμμα 15 ( KMS-11) ή 20 (RPMI-8226) για τα κύτταρα του ΠΜ.

αντισώματα και Αντιδραστήρια

FGFR3 αντίσωμα (Β-9, C-15) και /4.2 αντισώματα FGFR1 ήταν από Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Αντισώματα προς TAK1, ΕΚΚ, φωσφο-ΕΚΚ, φωσφο-τυροσίνη (4G10), ρ65 και ρ84 ήταν από την Millipore (Billerica, ΜΑ), όπως ήταν φυσιολογική IgG κουνελιού. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη FGF1 ελήφθη από R &? D Systems (Minneapolis, ΜΝ) και PD173074 από την Sigma (St. Louis, ΜΟ). Μη στόχευση και TAK1 ειδικά siRNA (τόσο ON-TARGETplus SMART-pool) αγοράστηκαν από Dharmacon (Thermo Scientific). Ανθρώπινο κολλαγόνο τύπου IV ήταν από τη Sigma.

Το πλασμίδιο Κατασκευάσματα

χωρίς ετικέτα ή C-τερματικά έχουν FLAG-tagged κατασκευάσματα FGFR3 έχουν περιγραφεί προηγουμένως [34], όπως και οι κατασκευές για FGFR2, και -4 [ ,,,0],35], [36]. Ο φορέας που εκφράζει FGFR1 παράχθηκε με κλωνοποίηση πλήρους μήκους ανθρώπινο FGFR1 ORF στον φορέα pcDNA3.1 (Life Technologies), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. ΗΑ-tagged TAK1 ποντικού παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Hiroaki Sakurai (Πανεπιστήμιο της Toyama, Toyama, Ιαπωνία). ΝΡ-κΒ-Luc ήταν από την Agilent Technologies (Santa Clara, CA), και ο έλεγχος ρΡΙ_-ΤΚ

Renilla

από την Promega (Madison, WI).

ζυμομύκητα 2-υβριδίων

Ένα δύο-υβριδίων ζυμομύκητα οθόνη διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37]. Εν συντομία, άγριου τύπου ή ουσιαστικά δραστική (K650E) αλληλουχία του ανθρώπινου FGFR3 κυτταροπλασματική περιοχή αμινοξέων 399-806) έχουν συγκολληθεί με τον τομέα LexA DNA δέσμευσης στο πλασμίδιο ρΒΤΜ116 και χρησιμοποιήθηκε για τη διαλογή μίας ανθρώπινες πρωτεΐνες σύντηξης βιβλιοθήκη χονδροκυττάρων κωδικοποίηση με το πεδίο ενεργοποίησης GAL4 (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) στο στέλεχος L40 της

Saccharomyces cerevisiae

. Οι μετασχηματισμοί αναπτύχθηκαν 3-4 ημέρες σε επιλεκτικά μέσα και τις προκύπτουσες αποικίες υποβλήθηκαν σε μία δοκιμασία ανελκυστήρα φίλτρο β-γαλακτοσιδάσης. Μεταγενέστερες domain-χαρτογράφηση πραγματοποιήθηκε όμοια, χρησιμοποιώντας αποκομμένες αλληλουχίες κυτταροπλασματική περιοχή FGFR3 ως δόλωμα, σε συνδυασμό με πλήρους μήκους ή C-τερματικές αλληλουχίες TAK1 ως λεία.

Ανοσοκαταβύθιση και Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως

Τα κύτταρα πλύθηκαν σε ψυχρό PBS που περιέχει 1% ορθοβαναδικό νάτριο και υπέστησαν λύση σε 1% ρυθμιστικό Nonidet Ρ-40 λύσης (20 mMTris-HCI, ρΗ 7.5, 137 mM NaCl, 1% Nonidet Ρ-40, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο, 10 μg /ml απροτινίνη). Τα λύματα προ-καθαριστεί με σφαιρίδια πρωτεΐνης A-Sepharose (Millipore) και ανοσοκαταβυθίσεις πραγματοποιήθηκαν όλη τη νύκτα με 2 μg αντισώματος. Τα ανοσοϊζήματα πλύθηκαν 3 φορές με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, βρασμένα 5 λεπτά σε ρυθμιστικό δείγματος και αναλύθηκαν με 10% SDS-PAGE. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν με Ξεκινώντας ρυθμιστικό αποκλεισμού Block (Thermo Scientific) και ανιχνεύθηκαν όπως υποδεικνύεται. σύνδεση αντισώματος ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας SuperSignal West Pico ή SuperSignal West Dura χημειοφωταυγές υπόστρωμα (Thermo Scientific). Για να ανιχνεύσει εκ νέου με άλλα αντισώματα, μεμβράνες γδύθηκαν των δεσμευμένων αντισωμάτων χρησιμοποιώντας την Επαναφορά απογύμνωση ρυθμιστικό (Thermo Scientific). Όπου ενδείκνυται, πυκνομετρία διεξήχθη χρησιμοποιώντας ImageJ. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η συν-ανοσοκαθιζήσεις από το Σχήμα 1 Ε διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας 30 μΐ πλύθηκε Dynabeads (Life Technologies) αντί των σφαιριδίων πρωτεΐνης Α-Sepharose και χωρίς ένα πρηκλήαρ βήμα, αλλά ήταν αλλιώς αγωγή όπως περιγράφεται ανωτέρω.

( Α) Σχηματική του FGFR3 και TAK1 τομέων που χρησιμοποιούνται για τον ζυμομύκητα δύο-υβριδίων και επακόλουθη χαρτογράφηση της αλληλεπίδρασης σε ζυμομύκητες. (Β) Ενδογενής TAK1 αλληλεπιδρά με την κινάση-νεκρή (K508M), άγριου τύπου, και ουσιαστικά δραστική (K650E) FGFR3 σε κύτταρα HeLa. Οι αριθμητικές τιμές αντιπροσωπεύουν την αναλογία του TAK1 συν-καθιζάνει με FGFR3. (C) FGFR3 και TAK1 (τόσο ενδογενείς) αλληλεπιδρούν σε LP1 (FGFR3WT) και KMS-11 (FGFR3Y373C) πολλαπλές κυτταρικές σειρές μυελώματος. Η γραμμή 8226 είναι αρνητικό για FGFR3. (D) Ενδογενής TAK1 αλληλεπιδρά με FGFR3 σε MGHU3 καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρα επιμολυσμένα με άγριου τύπου FGFR3. MGHU3 εκφράζουν επίσης την FGFR3 ενεργοποίηση μετάλλαξη, Y375C. (Ε) TAK1 (ενδογενείς) αλληλεπιδρά με υπερεκφραζόμενο FGFR1, -2, -4 και σε κύτταρα ΗΕΚ293. TAK1 στο FGFR1 επιμολυσμένα συνολικό προϊόν λύσης είναι ανιχνεύσιμο κατά την μεγαλύτερη έκθεση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για όλες τις κηλίδες (Β-Ε), ανοσοκατακρημνίσεις διεξήχθησαν από 1mg σύνολο λύμα χρησιμοποιώντας το αντίσωμα που υποδεικνύεται. Τα στυπώματα πρώτα ανιχνεύθηκαν για τον εταίρο αλληλεπίδρασης που δοκιμάζεται, τότε απογυμνώνεται και την εκ νέου ανιχνεύθηκαν για το ανοσοκαταβυθισμένο πρωτεΐνη. 20 μg ολικού λύμα παρομοίως διερευνήθηκε για τον έλεγχο για την έκφραση και τη φόρτωση. Βέλος δείχνει TAK1. Πολλαπλές ζώνες FGFR3 αντιπροσωπεύουν διάφορα ενδιάμεσα γλυκοζυλίωσης και εμφανίζονται όπως προγενέστερα είχαν δημοσιευθεί [45], [85]. Τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα για κάθε πίνακα.

Η

Ανάλυση Φασματομετρίας Μάζας

ΗΕΚ293 κύτταρα επιμολύνθηκαν με πλασμίδια έκφρασης για TAK1 και ουσιαστικά δραστική (K650E) FGFR3. Μετά από 24 ώρες, κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται [38], [39]. TAK1 ανοσοσύμπλοκα καταβυθίσθηκαν με αντι-TAK1 αντίσωμα σε 4 ° C όλη τη νύκτα, συλλέχθηκαν με πρωτεΐνη Α-Σεφαρόζη για επιπλέον 2 ώρες, και στη συνέχεια σε πέψη με θρυψίνη. Τα πεπτίδια αναλύθηκαν από το Μηχανισμό Πρωτεομική της Sanford-Burnham Ιατρικού Ερευνητικού Ινστιτούτου χρησιμοποιώντας ακινητοποιημένα χρωματογραφία /χρωματογραφία /φασματομετρία ηλεκτροψεκασμού ιονισμού νανο-υγρό μέταλλο συγγένεια μάζας (ΣΕΕΑ /νανο-LC /ESI-MS) [38], [39].

FGFR3

In-vitro

δοκιμασίας κινάσης

Οι δοκιμασίες κινάσης FGFR3 διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [40]. Εν συντομία, κινάση αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε 50 μΐ ρυθμιστικού κινάσης (60 mMHepes-NaOH ρΗ 7,5, 3 mM MgCl

2, 3 mM ΜηΟΙ

2, 3 μΜ Na

3νο

4, 1,2 mM DTT) συμπληρωμένο με 2.5 μg PEG, 100 μΜ ΑΤΡ και ανασυνδυασμένη ανθρώπινη TAK1 (500 ng? Abnova, Taipei City, Ταϊβάν) ως υπόστρωμα. Το ανασυνδυασμένο ενεργός FGFR3 ενδοκυτταρική περιοχή (397-End? SignalChem, Richmond, CA) χρησιμοποιήθηκε σε 300 ng ανά αντίδραση

Διαδικασίες Microarray και Ανάλυση

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 5 μg μη στόχευσης. ή TAK1 ειδικό siRNA και αφέθηκαν να ανανήψουν επί μία νύκτα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα παρέμειναν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν 100 ηΜ PD173074 επί 48 ώρες πριν την απομόνωση RNA. Κάθε αγωγή παρασκευάστηκε ως δείγματα εις τριπλούν. Ολικό RNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως συνιστάται από Affymetrix, Inc. Εν συντομία, RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Life Technologies) και πέρασε μέσα από στήλες spin RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) για περαιτέρω καθαρισμό. Η διευκόλυνση της UCI DNA μικροσυστοιχιών πυρήνα συνέχεια ποσοτικά το ολικό RNA από NanoDrop (Thermo Scientific) και ελέγχονται για την καθαρότητα με τη χρήση της Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Το κιτ Ambion έκφραση WT (Life Technologies) χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή δειγμάτων RNA για ανάλυση ολόκληρο μεταγραφικό μικροσυστοιχιών. Δύο ug του επισημασμένου, κατακερματισμένη μονόκλωνο cDNA στη συνέχεια υβριδοποιήθηκε με ανιχνευτή ζευγών σε μία συστοιχία Ανθρώπινα AffymetrixGeneChip 1.0ST. Συστοιχίες σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας το σαρωτή GeneChip 3000 7 G και Command Console λογισμικού v. 3.2.3. Τα αποτελέσματα είναι διαθέσιμα μέσω του Gene Expression Omnibus (GEO) αποθετήριο (ένταξη αριθμός GSE52452)

Τα δεδομένα εισήχθησαν Partek Γονιδιωματική Σουίτα Έκδοση 6.6 του λογισμικού με τις ακόλουθες εργασίες που γίνονται για την προετοιμασία των δεδομένων για στατιστική ανάλυση:. 1) RMA Ιστορικό Διόρθωση, 2) ποσοστημόριο Κανονικοποίηση, 3) Σύνδεση βάσης 2 μετασχηματισμού, και 4) Περίληψη της Probe θέτει χρησιμοποιώντας μέση τιμή. Η στατιστική ανάλυση αποτελούνταν από μονόδρομη ANOVA με ένα ενιαίο κατηγορηματική μεταβλητή, και λίστες γονίδιο παρήχθησαν για αυτά τα γονίδια με πτυσσόμενο αλλαγή μεγέθους & gt? 2 και p-value με ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) & lt?. .05

καταλόγους Gene στη συνέχεια εισάγονται στην Ingenuity Ανάλυσης Συστημάτων Pathway (ΜΠΒ), το λογισμικό, το οποίο διαθέτει λειτουργίες για τη δημιουργία δικτύων γονιδίων, διαλογή γονιδίων σε διάφορες λειτουργικές και άλλες κατηγορίες, και για τη μεταβίβαση των γονιδίων σε γνωστά μονοπάτια σηματοδότησης, χρωματισμός από φορές αλλαγή ή κάποια άλλη τιμή.

Ποσοτική RT-PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από MGHU3 και KMS-11 κύτταρα χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Life Technologies) και πέρασε μέσα από στήλες spin RNeasy (Qiagen) για περαιτέρω καθαρισμό. σύνθεση με τυχαίο έναυσμα cDNA εκτελέστηκε σε 1 μα ολικού RNA χρησιμοποιώντας το Superscript RT III Kit (Life Technologies). Όλα τα ζεύγη εκκινητών εσώνια που εκτείνονται και κανένας έλεγχος RT είχε συμπεριληφθεί. Primer ζευγάρια έχουν ως εξής: ακτίνης αντίστροφη AGGTGTGGTGCCAGATTTTC και διαβιβάζει GGCATGGGTCAGAAGGATT, GAPDH αντίστροφη GCCAGTGGACTCCACGAC και προς τα εμπρός CAACTACATGGTTTACATG, DFNA5

αντίστροφη

CAGGTTCAGCTTGACCTTCC και

προς τα εμπρός

ACCAATTTCCGAGTCCAGTG, GSTA1 αντίστροφη CCGTGCATTGAAGTAGTGGA και προς τα εμπρός ACGGTGACAGCGTTTAACAA, PSCA αντίστροφη GTTCTTCTTGCCCACGTAGT και προς τα εμπρός CAGGTGAGCAACGAGGAC, BAMBI αντίστροφη GAAGTCAGCTCCTGCACCTT και διαβιβάζει TGCACGATGTTCTCTCTCCT, TNFAIP3 αντίστροφη CGCTGTTTTCCTGCCATTTC και διαβιβάζει GATAGAAATCCCCGTCCAAGG, SGK1 αντίστροφη TGTCAGCAGTCTGGAAAGAGAAGT και διαβιβάζει CGGAATGTTCTGTTGAAGAATGTG.

NFκB Δοκιμασία λουσιφεράσης

τα κύτταρα επιμολυσμένα με 5 μg μη-στόχευσης ή TAK1 -εξειδικευμένης siRNAs. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ΝΡ-κΒ-Luc και ελέγχου ρΡΙ_-ΤΚ

Renilla

σε αναλογία 3:01 και αφέθηκαν να αναρρώσουν για 24 ώρες. Όπου υποδεικνύεται, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν ταυτόχρονα με τα υποδεικνυόμενα πλασμίδια FGFR3. Τα κύτταρα στη συνέχεια στερήθηκαν ορού όλη τη νύκτα, που ακολουθείται από μια κατεργασία 8 ώρα με 40 ng /ml FGF1. Η δραστικότητα λουσιφεράσης ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία ανταποκριτή διπλής λουσιφεράσης (Promega: Madison, WI). Οι διαφορές στη δραστηριότητα του ΝΡκΒ παρακάτω TAK1 φίμωση κάτω από κάθε συνθήκη θεραπείας αναλύθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας ένα αταίριαστο δύο-tailed t-test.

τηλέφωνα κλασματοποίηση

κύτταρα MGHU3 επιμολύνονται με 5 μg μη-στόχευσης ή TAK1 -εξειδικευμένης siRNAs. Σαράντα οκτώ ώρες αργότερα, τα κύτταρα στερήθηκαν ορού όλη τη νύκτα, στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 40 ng /ml FGF1 για 0, 5 ή 60 λεπτά. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά κλασματοποιείται, χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο προσαρμοσμένο από [41].

Πρόσφυση Κυττάρων Δοκιμασία

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 5 μg μη στόχευση ή TAK1 ειδικό siRNA και αφέθηκαν να ανανήψουν επί μία νύκτα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα παρέμειναν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν 50 ηΜ PD173074 επί 48 ώρες πριν από την επίστρωση της δοκιμασίας προσκόλλησης. Κύτταρα κατεργασμένα με FGF1 ήταν άνευ ορού επί μία νύκτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με συνδέτη 1 ώρα πριν από την επιμετάλλωση και καθ ‘όλη τη διάρκεια της δοκιμασίας. ανιχνεύσεις προσφύσεως πραγματοποιήθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Εν συντομία, πλάκες ενενήντα έξι φρεάτων επικαλύφθηκαν επί μία νύκτα στους 4 ° C με 1 μg /ml κολλαγόνο IV, δεσμεύτηκαν με 1% BSA για 1 ώρα στους 37 ° C, και πλύθηκαν δύο φορές με PBS και μια φορά με μέσο χωρίς ορό. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και σπάρθηκαν στα 5 χ 10

4 σχετικά με τις προ-επικαλυμμένες πλάκες, με την παρουσία του τη θεραπεία υποδεικνύεται. Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν 3 ώρες στους 37 ° C, τα φρεάτια πλύθηκαν 3 φορές με PBS για να απομακρυνθούν τα μη-προσκολλημένα κύτταρα, και προσκόλληση προσδιορίστηκε μετά 4 ώρες επωάσεως με Calcein-ΑΜ (Life Technologies) με μέτρηση της έντασης φθορισμού στα Ex /Em 490 /520 nm. Η στατιστική ανάλυση των διαφορών στην κυτταρική προσκόλληση παρακάτω TAK1 φίμωση κάτω από κάθε συνθήκη κατεργασίας διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα αταίριαστο δύο-tailed t-test.

Αποτελέσματα

FGFR3 αλληλεπιδρά με TAK1

Η ταυτοποίηση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης μπορεί να παρέχει σημαντικές πληροφορίες σχετικά με συγκεκριμένες οδούς σηματοδότησης και ταυτοποίηση νέων πιθανών θεραπευτικών στόχων. Σε MM, ο ειδικός ρόλος των εκτοπικά εκφράζεται FGFR3 σε ένα υποσύνολο των περιπτώσεων παραμένει αμφιλεγόμενη, ενώ στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, FGFR3 έχει πρόσφατα ενοχοποιηθεί ως ένα σημαντικό παράγοντα πολλαπλασιασμού [42]. Πήραμε μια συστηματική προσέγγιση για την καλύτερη κατανόηση των FGFR3 σηματοδότησης σε συνδεδεμένη καρκίνους μέσα από τον εντοπισμό νέων πρωτεϊνών FGFR3 αλληλεπιδράσεων χρησιμοποιώντας δύο υβριδικά (Y2H) δοκιμασία μαγιά. Η κυτταροπλασματική περιοχή του ανθρώπινου FGFR3 (αμινοξέα 399 έως 806), που περιέχει την αλληλουχία άγριου τύπου ή το ισχυρά ενεργοποίηση μετάλλαξη K650E, χρησιμοποιήθηκε ως δόλωμα για τη διαλογή μιας βιβλιοθήκης πρωτογενή ανθρώπινα cDNA χονδροκυττάρων (Σχ. 1Α) όπως περιγράφεται [37]. Αυτή η βιβλιοθήκη επιλέχθηκε ως FGFR3 εκφράζεται υψηλά στα χονδροκύτταρα, και το ισχυρώς ενεργοποίησης K650E μετάλλαξη, παρούσα σε ένα υποσύνολο των δύο MM και UC [43], είναι παρόν στο ενδοκυτταρική περιοχή κινάσης τυροσίνης. Πιθανές αλληλεπιδράσεις εντοπίστηκαν από τη δοκιμασία β-γαλακτοσιδάσης ανελκυστήρα φίλτρο, αλληλουχία, και επανελέγχονται για την αλληλεπίδραση στο ζυμομύκητα. Μεταξύ των αλληλεπιδράσεων που εντοπίστηκαν ήταν οι πρωτεΐνες μεταγωγής σήματος, συμπεριλαμβανομένου του p85 ρυθμιστικής υπομονάδας της ΡΙ3-κινάσης [37], και TAK1. Το πλασμίδιο λεία ζύμη αποτελούνταν από τα Ο-τερματικά 138 αμινοξέα του TAK1 (αμινοξέα 441 έως 579), υποδεικνύοντας ότι αυτή η περιοχή του TAK1 εμπλέκεται στη δέσμευση FGFR3. Έχουμε περαιτέρω προσδιορίζεται με Y2H χρησιμοποιώντας κατασκευάσματα περιοχής FGFR3 (Εικ. 1Α) ότι η περιοχή που περιλαμβάνει το δεύτερο μισό της περιοχής κινάσης τυροσίνης του FGFR3, που περιέχει τον βρόχο ενεργοποίησης του υποδοχέα και C-τερματική ουρά του FGFR3 (αμινοξέα 589 έως 806) , είναι αρκετή για την αλληλεπίδραση FGFR3-TAK1. Για να επιβεβαιωθεί η αλληλεπίδραση FGFR3-TAK1 σε κύτταρα θηλαστικών και, ειδικότερα, FGFR3 σχετίζεται με κυτταρικές σειρές καρκίνου, τα ανθρώπινα κατασκευάσματα FGFR3, συμπεριλαμβανομένων άγριου τύπου, κινάση-νεκρή και ουσιαστικά δραστική (K650E) ακολουθίες, εκφράστηκαν παροδικά σε κύτταρα HeLa. TAK1 συν-ανοσοκαταβυθίζεται με όλες τις αλληλουχίες FGFR3 δοκιμάστηκαν? αποδεικνύοντας ότι FGFR3 και TAK1 αλληλεπιδρούν σε κύτταρα θηλαστικών και ότι η ενεργοποίηση του υποδοχέα δεν απαιτείται (Εικόνα 1Β). Ενδογενής FGFR3 σε δύο t (4? 14) κυτταρικές σειρές ΜΜ, LP-1 (wt) και KMS-11 (Y373C) [44], [45], επίσης αλληλεπίδρασε με TAK1 με συν-ανοσοκαταβύθιση (Σχήμα 1 C). Όπως παρατηρήσαμε επίπεδα FGFR3 ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε MGHU3 από τις γραμμές ΜΜ, FGFR3

WT ήταν υπερεκφράζεται για την επαρκή ανίχνευση μιας αλληλεπίδρασης TAK1-FGFR3 σε MGHU3 (Σχήμα 1D). Σημειώστε ότι τα κύτταρα MGHU3 UC φέρουν την ίδια FGFR3 μετάλλαξη όπως τα KMS-11 κύτταρα ΜΜ. Μια αλληλεπίδραση FGFR3-TAK1 αξιολογήθηκε επίσης σε κύτταρα RT-112 UC, τα οποία εκφράζουν κολοβωμένη άγριου τύπου FGFR3 (αμινοξέα 1-758) σε σύντηξη με το μετασχηματισμό οξύ συσπειρωμένη σπείρα 3 (TACC3) αλληλουχίες (κατάλοιπα 433-838) [46 ]. Δεν μπορέσαμε να ανιχνεύσουν πειστικά την αλληλεπίδραση σε αυτή τη γραμμή, υποστηρίζοντας περαιτέρω τη σημασία της FGFR3 αλληλουχιών Ο-τερματικού στην αλληλεπίδραση με TAK1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τέλος, χρησιμοποιείται επίσης φασματομετρία μάζας για τον χαρακτηρισμό των πρωτεϊνών που ανακτώνται TAK1 ανοσοκαταβύθισης. Μετά την έκφραση και των δύο ενεργοποιημένων FGFR3-K650E και TAK1 σε κύτταρα ΗΕΚ293, TAK1 ανοσοϊζήματα αναλύθηκαν με συνάφειας ακινητοποιημένου μετάλλου χρωματογραφία /νανο-υγρή χρωματογραφία /φασματομετρία μάζας ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (IMAC /νανο-LC /ESI-MS) [38], [39 ]. Σε τρία ανεξάρτητα δείγματα, εκτός από την σημαντική κάλυψη του ΤΑΚΗ όπως αναμενόταν, FGFR3 προερχόμενα πεπτίδια που αντιπροσωπεύουν κάλυψη 48% συνολικά ήταν σαφώς προσδιοριστεί, όπως παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν ενδείξεις ενός νέου αλληλεπίδρασης μεταξύ FGFR3 και TAK1 που κάνει δεν απαιτούν ενεργοποίηση του υποδοχέα. Υπάρχει προτεραιότητα γι ‘αυτό με τον προσαρμογέα FRS2, η οποία αλληλεπιδρά με τους υποδοχείς FGF συστατικά, αλλά ενεργοποιεί μόνο κατάντη σηματοδότησης (ΕΚΚ /ΜΑΡΚ) με την ενεργοποίηση του υποδοχέα [47]. Έχουμε αποδείξει περαιτέρω ότι FGFR1, 2 και 4 εκφράζεται παροδικά σε κύτταρα ΗΕΚ293, επίσης αλληλεπιδρούν με TAK1 (Σχήμα 1Ε), υποδηλώνοντας ότι η αλληλεπίδραση είναι γενικά σχετίζονται με σηματοδότηση υποδοχέα FGF.

Η

FGFR3 μπορεί Τυροσίνη φωσφορυλιώνει TAK1

in vitro

η

ενεργοποίηση TAK1 απαιτεί Ser /Thr φωσφορυλίωση σε πολλαπλά υπολείμματα στον βρόχο ενεργοποίησης (που επισκοπείται στο [48], [49]). Παρά το γεγονός ότι η φωσφορυλίωση τυροσίνης του TAK1 δεν έχει αναφερθεί προηγουμένως, FGFR3 λειτουργεί ως κινάση της τυροσίνης? Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε την πιθανότητα ότι θα μπορούσε να FGFR3 τυροσίνη φωσφορυλιώνει TAK1. Πράγματι, διαπιστώσαμε ότι TAK1 είχε φωσφορυλιωμένη τυροσίνη στα κύτταρα ΗΕΚ293 παροδικά εκφράζουν ιδιοσυστατικά ενεργό FGFR3 (K650E), αλλά όχι την κινάση-νεκρή υποδοχέα (K508M), υποδεικνύοντας ότι η ενεργοποιημένη FGFR3 μπορούν είτε άμεσα είτε έμμεσα τυροσίνης φωσφορυλιώνουν TAK1 (Σχήμα 2Α). φωσφορυλίωση τυροσίνης TAK1 παρατηρήθηκε περαιτέρω σε έναν προσδιορισμό κινάσης ελεύθερο κυττάρων χρησιμοποιώντας ανασυνδυαστικό TAK1 και την ενδοκυτταρική περιοχή κινάσης-ενεργό του FGFR3, υποδεικνύοντας ότι TAK1 μπορεί να είναι ένας άμεσος στόχος του FGFR3 δραστικότητα κινάσης τυροσίνης (Σχήμα 2Β).

ΗΕΚ293 κύτταρα (Α) επιμολυσμένα με FGFR3

K508M ή FGFR3

K650E. Εικοσιτέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα λύθηκαν και ανοσοκατακρημνίσθηκαν TAK1 από σύνολο λύμα 1 mg. Ανοσοκαταβύθισης αναλύθηκαν με SDS-PAGE, κηλιδώθηκαν, και ανιχνεύτηκαν με 4G10 αντίσωμα. Βέλος δείχνει TAK1. Εκπρόσωπος των έξι πειραμάτων. (Β) Ένα δοκιμασία κινάσης ελεύθερο κυττάρων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένο ανθρώπινο TAK1 έχει ένα υπόστρωμα για ανασυνδυασμένη ανθρώπινη FGFR3 (τυροσίνη πεδίο κινάσης). Η φωσφορυλίωση τυροσίνης οπτικοποιήθηκε με ανοσοστύπωμα με αντίσωμα 4G10. Εκπρόσωπος των τεσσάρων πειραμάτων.

Η

γονιδιακής έκφρασης ανάλυση εντοπίζει NFκB ως Σηματοδοσίας Hub για FGFR3 και TAK1 Ενσωμάτωση

TAK1 αποτελεί βασικό μεσολαβητή των καταρρακτών σηματοδότησης που οδηγούν στην ενεργοποίηση του ΝΡκΒ και AP -1 παράγοντες μεταγραφής, που κάθε ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην ογκογένεση και την απόπτωση (που επισκοπείται στο [16], [50]). Για να αρχίσει η διερεύνηση της ενσωμάτωσης των TAK1 και FGFR3 σηματοδότηση στα καρκινικά κύτταρα, πραγματοποιήσαμε μια συγκριτική ανάλυση μικροσυστοιχιών της γονιδιακής έκφρασης στην κυτταρική σειρά καρκίνου MGHU3 της ουροδόχου κύστης, η οποία εκφράζει την Y375C FGFR3 ενεργοποίηση μετάλλαξης και εμφανίζει ισχυρές αντιδράσεις με τον υποδοχέα-ειδικό PD173074 FGF αναστολέα, όπως εκτιμάται από την φωσφορυλίωση ERK [9]. Για τον εντοπισμό γονιδίων τα οποία εξαρτώνται από τα δύο σήματα FGFR3 και TAK1, MGHU3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με μη στόχευση ή TAK1 ειδικό siRNA, και κάθε υποσύνολο περαιτέρω αγωγή με PD173074, ή ελέγχου του οχήματος. Ένας τρόπος ANOVA με την αλλαγή φορές το μέγεθος & gt? 2 και p-value με FDR & lt? .05 Χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσετε λίστες γονίδιο. TAK1 siRNA έναντι δειγμάτων μη στόχευση siRNA απέδωσε 39 γονιδιακές αλλαγές αντανακλούν TAK1 ειδικών γονιδίων με την παρουσία του FGFR3 σηματοδότησης. TAK1 siRNA συν PD173074 έναντι δειγμάτων μη στόχευση siRNA συν PD173074 απέδωσε 105 γονιδιακές αλλαγές αντανακλούν TAK1 συγκεκριμένα γονίδια εν απουσία FGFR3 σηματοδότησης. Για να διακρίνουμε τις αλλαγές που εξαρτώνται τόσο FGFR3 και TAK1, τα γονίδια που δείχνουν στατιστικώς σημαντικές μεταβολές γονίδιο που προκύπτουν από TAK1 knockdown μόνο με την παρουσία του FGFR3 σηματοδότησης, αλλά όχι απουσία αυτού επελέγησαν. Τα επικαλυπτόμενα γονίδια από το σύνολο των 105 TAK1 γονιδίου αλλαγές εν απουσία FGFR3 σηματοδότηση απομακρύνθηκαν από τα 39 TAK1 γονίδιο αλλαγές στην παρουσία της δραστηριότητας FGFR3. Τα 13 μοναδικά γονίδια που παρέμεινε ως σημαντικά μεταβληθεί σε αυτές τις συνθήκες αντιπροσωπεύουν γονίδια τα οποία αντικατοπτρίζουν τόσο TAK1 και FGFR3 σηματοδότησης (Πίνακας 2).

Η

Εμείς επιλέξαμε 6 γονίδια από τον κατάλογο των 13 για την επικύρωση με βάση τη συνάφειά τους στον καρκίνο, και διαπίστωσαν ότι οι παρατηρούμενες αλλαγές ήταν επαναλήψιμα με qPCR, τόσο στην MGHU3 και η γραμμή MM KMS-11 υποβάλλεται σε επεξεργασία με TAK1 knockdown ή /και την αναστολή του υποδοχέα FGF όπως περιγράφεται παραπάνω για την ανάλυση μικροσυστοιχιών (Πίνακας 2). Η μόνη εξαίρεση είναι GSTA1, η οποία έχει πολύ χαμηλά επίπεδα έκφρασης σε κύτταρα ΜΜ. Τέλος, η συμβολή της λίστας των 13 γονιδίων σε Ingenuity Συστήματα Διαδρομή εργαλείο ανάλυσης (IPA) οδήγησε σε ένα ενιαίο δίκτυο γονίδιο (σκορ δικτύου 40) με ένα σημαντικό κόμβο γύρω από NFκB (Σχήμα 3). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν μια κρίσιμη διασταύρωση μεταξύ FGFR3 και σηματοδότηση TAK1 που μπορεί να επηρεάσουν ΝΡκΒ ενεργοποίηση και έτσι παθογένεση του καρκίνου σε καρκίνους FGFR3 που σχετίζονται. Ένα δεύτερο κόμβο επικεντρώθηκε γύρω ΡΙ3Κ είναι συνεπής με τα προηγούμενα αποτελέσματα μας δείχνουν μία αλληλεπίδραση μεταξύ FGFR3 και της ρ85 ρυθμιστική υπομονάδα της ΡΙ3Κ [37].

Το 13 μοναδικό FGFR3 και TAK1 εξαρτώμενων γονιδίων (Πίνακας 1) εκτιμήθηκαν με Ingenuity μονοπάτι Ανάλυση (ΜΠΒ), το λογισμικό, που παράγουν ένα ενιαίο δίκτυο (βαθμολογία δίκτυο 40) περιέχει σημαντικές πλήμνες σε NFκB και PI3K. IPA μοριακά σχήματα περιλαμβάνουν: συγκρότημα /ομάδα (ΝΡκΒ, PI3K), κυτοκίνη /αυξητικός παράγοντας (IKBKG, SGK1), ένζυμο (ACSL1, GSTA1, MGAT4A, PDXP, TNFAIP3, UBC), το κανάλι ιόντων (SCNNIG), μεταγραφικό ρυθμιστή (TEAD1, VGLL1), μεταφορέα (SLC6A8, SLC15A1, SLC15A2, SLC38A3), και άλλα (ARRB1, BAMBI, DFNA5, FSH, GST κατηγορίας Α, HDGFRP2, ins1, ινσουλίνη, MT2A, PKC (s), PSCA, RPAIN, TRIM31, ZFAND5) . IPA Σχέσεις: συμπαγείς γραμμές υποδεικνύουν την άμεση αλληλεπίδραση? διακεκομμένες γραμμές δείχνουν έμμεση αλληλεπίδραση? συμπληρώθηκε βέλη δείχνουν «πράξεις για»? ανοιχτή βέλη δείχνουν «μετατοπίζεται»? –