Abstract

ιρινοτεκάνη, ένα ανάλογο της καμπτοθεκίνης, χρησιμοποιείται συχνά ως μονοθεραπεία ή σε συνδυασμό με άλλα αντικαρκινικά φάρμακα για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου. Ωστόσο, η αντοχή φαρμάκου των όγκων είναι ένα σημαντικό εμπόδιο για την επιτυχή θεραπεία του καρκίνου. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι τα κύτταρα αποκτούν χρόνιο αντίσταση στην ιρινοτεκάνη. Εμείς προφίλ τους έκφραση γονιδίων διαφορική χρήση μικροσυστοιχιών. Μετά γονίδιο οντολογίας (GO) και η ανάλυση μονοπατιού KEGG των δεδομένων μικροσυστοιχιών, ερευνήσαμε ειδικά αν Sestrin3 θα μπορούσε να μειώσει ιρινοτεκάνη αντίσταση. Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ότι Sestrin3 ενίσχυσε την αντικαρκινική δράση των ιρινοτεκάνη

in vitro

στα κύτταρα LoVo που είχαν αποκτήσει ανθεκτικότητα στην ιρινοτεκάνη. Η ιρινοτεκάνη-ανθεκτικά κύτταρα LoVo έδειξε χαμηλότερη αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παραγωγή από ιρινοτεκάνη ευαίσθητα γονικά κύτταρα τους. παραγωγή ROS αυξήθηκε κατά Sestrin3 νοκ ντάουν στην ιρινοτεκάνη-ανθεκτικά κύτταρα LoVo. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι Sestrin3 θα μπορούσε να είναι ένας καλός στόχος για την ανάπτυξη θεραπευτικών που μπορεί να βοηθήσει να ξεπεραστεί η αντίσταση στην ιρινοτεκάνη

Παράθεση:. Choi SH, Χονγκ Χονγκ Κονγκ, Cho YB, Lee WY, Yoo ΗΥ (2015) Προσδιορισμός των Sestrin3 που εμπλέκονται στην

In vitro

αντίσταση των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου με την ιρινοτεκάνη. PLoS ONE 10 (5): e0126830. doi: 10.1371 /journal.pone.0126830

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 4 Νοέμ, 2014? Αποδεκτές: 8 Απριλίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: May 14, 2015

Copyright: © 2015 Choi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα δεδομένα μικροσυστοιχιών αρχεία είναι διαθέσιμα από τη βάση δεδομένων GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) μέσω του αριθμού ένταξη GSE59501

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από την τεχνολογία Κορέα Υγείας Ε & amp? D έργου μέσω του Ινστιτούτου Βιομηχανίας Υγείας Ανάπτυξης Κορέα (KHIDI), που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Υγείας & amp? Πρόνοιας, Δημοκρατία της Κορέας (HI14C3418), το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών της Κορέας (NRF-2013R1A1A2060410) και επιχορήγηση Samsung Medical Center. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η συχνότητα του καρκίνου του παχέος εντέρου είναι πάνω από ένα εκατομμύριο ετησίως σε όλο τον κόσμο, με ποσοστό θνησιμότητας έως και 33% στις αναπτυγμένες χώρες [1]. Καρκίνο του παχέος εντέρου είναι η πέμπτη πιο κοινή μορφή καρκίνου. Η χημειοθεραπεία έχει αναγνωριστεί ως αποτελεσματική στη θεραπεία μετάσταση καρκίνου του παχέος εντέρου. Τυπικά, φθοροουρακίλη (5-FU) έχει χρησιμοποιηθεί ως ένα ενιαίο θεραπεία. Ωστόσο, κατά τις δύο τελευταίες δεκαετίες, η κλινική πρακτική χρησιμοποιεί κυτταροτοξικά φάρμακα όπως φθοροπυριμιδίνη, ιρινοτεκάνη, και οξαλιπλατίνη. Πρότυπο σχήματα χημειοθεραπείας συνδυασμός είναι FOLFIRI (φολινικό οξύ, φθοριοουρακίλη, και ιρινοτεκάνη), CapIri (καπεσιταβίνη και ιρινοτεκάνη), FOLFOX (φολινικό οξύ, φθοριοουρακίλη, και οξαλιπλατίνη), ή CapOx (καπεσιταβίνη και οξαλιπλατίνη). Αντικαθιστώντας ιρινοτεκάνη με οξαλιπλατίνη συνέβαλε στη βελτίωση ποσοστό επιβίωσης [2, 3]. Η ιρινοτεκάνη (CPT-11), ένα παράγωγο του φυσικού καμπτοθεκίνης, είναι μια σημαντική θεραπευτικό φάρμακο για μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο (CRC) ασθενείς [4]. Η ιρινοτεκάνη είναι χημικά μετατρέπεται στην ενεργή μορφή της, η 7-αιθυλ-10-υδροξυκαμπτοθεσίνη (SN-38), η οποία αναστέλλει την τοποϊσομεράση DNA. Η στασιμότητα της τοποϊσομεράσης στη διχάλα αντιγραφής από SN-38 επάγει μια μόνιμη DNA διπλής έλικας διάλειμμα, η οποία παράγει μια απάντηση βλάβες στο DNA (DDR). βλάβη του DNA είναι κατά κύριο λόγο αισθητή από τις κινάσες ATR και ΑΤΜ, η αυξημένη δραστηριότητα των οποίων οδηγεί στην ενεργοποίηση του σημείου ελέγχου κινασών Chk1 /Chk2 και την επακόλουθη φωσφορυλίωση της ρ53. Η φωσφορυλιωμένη ρ53 είναι πιο σταθερό, το οποίο μπορεί να ενεργοποιήσει απόπτωση ή να ρυθμίσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου. p53 παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην αντιοξειδωτική απάντηση, η οποία ανακαλύφθηκε μέσω του εντοπισμού ενός νέου Sestrin (

SESN

) οικογένεια γονιδίων, που εμπλέκονται σε αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) Ο κανονισμός [5]. Με βάση την πρωτογενή και δευτερογενή ανάλυση της δομής χρησιμοποιώντας το PSI-BLAST και προγράμματα 3DPSSM, η

SESN

οικογένεια φέρεται να κωδικοποιήσει αντιοξειδωτικές πρωτεΐνες [6, 7]. Sestrin πρωτεΐνες έχουν υψηλό βαθμό ομολογίας με το

Mycobacterium tuberculosis

πρωτεΐνη AhpD, ομοιότητες κατανομή σε Ν-τελικές περιοχές τους [5]. Είναι υπεύθυνοι για την κατάλυση της μείωσης του peroxiredoxins (Prdx) που μεταβολίζουν υπεροξείδια [8]. Η πρωτεΐνη AhpD, ένα συστατικό του αλκυλ-υδροϋπεροξειδίου αναγωγάσης που συμμετέχουν στην άμυνα κατά των ROS, είναι υπεύθυνη για την αναγέννηση της AHPC, μέλος μιας οικογένειας διατηρημένων θειόλη ειδικών υπεροξειδάσες (Prxs) [9]. Η

Sestrin1

και

Sestrin2

γονίδια τα μεταγραφικά ρυθμίζονται υπό τον έλεγχο του p53, ενώ

Sestrin3

ρυθμίζεται από τον άξονα AKT /FOXO, μέσω FOXO1 /γονιδίου FOXO3a μεσολάβηση έκφραση [5, 10].

Sestrin3

συμμετέχει επίσης σε ROS αποτοξίνωση, καθώς και στην καθυστέρηση της κυτταρικής γήρανσης μέσω FOXO [11]. Από τα τρία μέλη της οικογένειας Sestrin, το τρίτο μέλος,

Sestrin3

, έχει αναφερθεί στην βιβλιογραφία και σε μικρότερο βαθμό από ό, τι οι άλλες δύο.

Αν και ιρινοτεκάνη εμφανίζει ισχυρή δραστικότητα έναντι μιας ευρείας φάσμα των όγκων, συμπεριλαμβανομένων των όγκων του παχέος εντέρου, η αντίσταση των ναρκωτικών εξακολουθεί να αποτελεί σημαντικό εμπόδιο για την αποτελεσματική χημειοθεραπεία. Ως εκ τούτου, οι νέες στόχους για να ξεπεράσει την αντίσταση του φαρμάκου που απαιτείται για την επιτυχή θεραπεία του καρκίνου. Αρκετές υποθέσεις έχουν προταθεί όσον αφορά τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην αντοχή στην CPT, συμπεριλαμβανομένης της μειωμένης κυτταρική συσσώρευση της CPT λόγω ενεργό εκροή από κασέτα σύνδεσης ΑΤΡ (ABC) μεταφορείς, ενζυμικά συστήματα που σχετίζονται με μεταβολική μετατροπή, αλλοίωση της δομής ή της τοποθεσίας της τοποϊσομεράσης Ι , και μεταβολές στην κυτταρική απόκριση στο σχηματισμό CPT-TOPI-DNA τριπλό σύμπλοκο [7]. Αν και έχουν πολλαπλές πειραματικές προσεγγίσεις έχουν επιχειρηθεί κλινικά να ξεπεράσουν επιμέρους μηχανισμούς αντίστασης [7], δεν έχει ακόμη επιτευχθεί αξιοσημείωτη επιτυχία.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε δημιουργήσει μια κυτταρική γραμμή που αποκτήθηκε χρόνια αντίσταση στην ιρινοτεκάνη. Στόχος μας ήταν να συγκριθεί η μεταγραφική προφίλ στην ιρινοτεκάνη ανθεκτικό ορθοκολικού καρκίνου κυτταρική γραμμή με αυτήν των γονικών ιρινοτεκάνη ευαίσθητα κύτταρα, την αναζήτηση νέων δεικτών για την αύξηση της ευαισθησίας σε ιρινοτεκάνη. Ερευνήσαμε επίσης εάν Sestrin3 θα μπορούσε να ενισχύσει την αντικαρκινική δράση των ιρινοτεκάνη

in vitro

, στην ιρινοτεκάνη ανθεκτικό καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και τον πολιτισμό συνθήκες

το ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές σειρές HCT116, HCT15, HCT29, KM12SM, SW620, DLD1, ΟοΙο205, και LoVo ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC). Οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο, και 2,05 mM Ε-γλουταμίνη στους 37 ° C. Οι κυτταρικές σειρές τακτικά δοκιμάστηκαν για την ταυτότητα και τη μόλυνση μυκοπλάσματος, χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης MycoAlert μυκοπλάσματος (Lonza).

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (50 mM Tris, 150 mM NaCl , 1% ΝΡ-40, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, και 0,1% δωδεκυλοθειικό νάτριο) συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης και αναστολείς φωσφατάσης. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοαποτύπωση ήταν μονοκλωνικό αντι-ATM (D2E2, κυτταρική σηματοδότηση), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-φωσφο-Chk1 (Ser317, Cell σηματοδότησης), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-ATR, TopBP1, CtIP (εργαστήρια Bethyl), και το ποντίκι μονοκλωνικά αντι- NBS1 (1D7, Novus Biologicals). Πολυκλωνικά αντισώματα εναντίον Sestrin3 αγοράστηκαν από Abcam. Mouse μονοκλωνικό αντι-Chk1 (G-4) και αντι-α τουμπουλίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology. Αντισώματα έναντι AMPKα (23A3), φωσφο-AMPKα (Thr72-, 40H9), p70S6K και φωσφόρου-p70S6K (Thr389, 108D2), mTOR (7C10), και φωσφο-mTOR (Ser2448) αγοράστηκαν από Cell Signaling.

Ανάπτυξη της ιρινοτεκάνης ανθεκτική κυτταρική γραμμή

για να δημιουργηθεί ένα σταθερό ορθοκολικού καρκίνου κυτταρική γραμμή ανθεκτική σε χρονίως ιρινοτεκάνη, τα κύτταρα LoVo εκτέθηκαν σε ιρινοτεκάνη σε αρχική συγκέντρωση 0,1 μmol /l σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS. Όταν καλλιεργημένα κύτταρα κατέληξε σε συρροή 80%, 20% των κυττάρων ανακαλλιεργήθηκαν για το επόμενο πέρασμα. Τα κύτταρα περάστηκαν 3 φορές στην ίδια συγκέντρωση της ιρινοτεκάνης για την εξασφάλιση της προσαρμογής τους και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 2 φορές υψηλότερη συγκέντρωση της ιρινοτεκάνης. Η συγκέντρωση της ιρινοτεκάνης διαδοχικά αυξάνεται μέχρις ότου έφθασε μία τελική συγκέντρωση 8 μmol /l. Ιρινοτεκάνη αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich.

Κυττάρων Η βιωσιμότητα και δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας

Ο ορθοκολικός καρκίνος κυτταρικές γραμμές σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων καλλιέργειας κυττάρων σε RPMI 1640, συμπληρωμένο με 10% FBS. Μετά από 24 ώρες επώασης, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει ιρινοτεκάνη. Διάφορες συγκεντρώσεις της ιρινοτεκάνης χρησιμοποιήθηκαν για την κατεργασία των κυττάρων για 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ή κυτταροτοξικότητα εκτιμήθηκε με τη χρήση του Κυττάρου Μετρώντας Kit-8 (CCK-8) προσδιορισμό, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 10 μΐ CCK-8 διάλυμα προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Οι πλάκες επωάστηκαν για 2 ώρες στους 37 ° C. Οι τιμές απορρόφησης μετρήθηκαν στα 450 nm.

κλωνογονιδιακή επιβίωση δοκιμασία

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ένα μέσο που περιέχει ιρινοτεκάνη σε συγκεντρώσεις 0,05, 0,1, 0,4, 0,8, 1,5, και 3 μΜ, αντίστοιχα . Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν και σπάρθηκαν επάνω σε δίσκους καλλιέργειας 60-mm. Μετά από 14 ημέρες, οι υπόλοιπες αποικίες πλύθηκαν με PBS, χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες, και μετά μετρήθηκαν σύμφωνα με καθορισμένα μεγέθη αποικιών. Όλα τα πειράματα ανεξάρτητα επανειλημμένα τουλάχιστον 3 φορές. Η στατιστική σημαντικότητα της διαφοράς σε αριθμούς αποικίας προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας t-τεστ δύο ουρών Student.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Για τις αναλύσεις του κυτταρικού κύκλου, κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε με τη χρήση κυττάρων LoVo κατεργασία με ή χωρίς την ιρινοτεκάνη. Εν συντομία, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν με θρυψίνη, πλύθηκαν με PBS, και επαναιωρήθηκαν σε 0.5 ml PBS. Μετά από στερέωση με 4,5 ml 70% αιθανόλης, τα κύτταρα επωάστηκαν σε πάγο για 2 ώρες. Σταθερή κύτταρα πλύθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε 1 ml ενός διαλύματος χρώσης με ιωδιούχο προπίδιο που περιέχει 0,1% (ν /ν) Triton Χ-100, 0,2 mg /ml RNase Α, και 20 μg /ml ΡΙ, επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 min, και στη συνέχεια διατηρήθηκαν σε πάγο έως ότου έγινε η ανάλυση με κυτταρομετρία ροής.

παρεμβολή RNA (RNAi)

για την παροδική RNA σίγηση, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA που στοχεύει Sestrin3 (siSESN3) ή με μη-στόχευση siRNA (siControl), χρησιμοποιώντας το Lipofectamine RNAiMAX αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Life Technologies).

Μέτρηση της κυτταρικής ROS

Η παραγωγή ενδοκυτταρικής ROS αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο CellRox πράσινο οξειδωτικό στρες ( Invitrogen). Εν συντομία, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με τα siRNA για 48 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν με 5 μΜ του αντιδραστηρίου CellRox στους 37 ° C για 30 λεπτά. Μετά το πλύσιμο δύο φορές με PBS, η ένταση φθορισμού μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού.

Απομόνωση RNA και Gene Expression Profiling

Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε η έκφραση του γονιδίου της παγκόσμιας αναλύσεις χρησιμοποιώντας Affymetrix GeneChip Human Gene 1.0 συστοιχίες ολιγονουκλεοτίδιο ST χρησιμοποιώντας κύτταρα LoVo και ιρινοτεκάνη ανθεκτικά κύτταρα LoVo-R8 καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς ιρινοτεκάνη (8 μΜ). Τα δείγματα παρασκευάστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες και τις συστάσεις που παρέχονται από τον κατασκευαστή. Το συνολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας στήλες RNeasy Mini Kit (Qiagen). Η ποιότητα του RNA εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας την Agilent 2100 BioAnalyzer με ένα RNA 6000 Νανο Chip (Agilent Technologies). Η ποσότητα του RNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το ND-1000 Φασματοφωτόμετρο (NanoDrop Technologies, Inc.). Δείγματα RNA (300 ng έκαστος) χρησιμοποιήθηκαν ως είσοδος για τη διαδικασία Affymetrix, όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο. Εν συντομία, 300 ng ολικού RNA από κάθε δείγμα μετατράπηκε σε δίκλωνο cDNA, χρησιμοποιώντας ένα τυχαίο εξαμερές που ενσωματώνει έναν υποκινητή Τ7. Τα ενισχυμένα RNA παράχθηκε από την μήτρα δίκλωνου cDNA όμως

in vitro μεταγραφή

και καθαρίστηκε με τη μονάδα καθαρισμού δείγμα Affymetrix. cDNAs αναγεννήθηκαν με αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας τυχαία εναύσματα και ένα μίγμα dNTP που περιέχει dUTP. cDNA μετά κατακερματισμένη από UDG και APE 1 ενδονουκλεάσες περιορισμού και τους τελικούς επισημαίνονται με ένα τερματικό αντίδραση τρανσφεράσης που ενσωμάτωσε βιοτινυλιωμένο διδεοξυνουκλεοτίδιο. Οι κατακερματισμένες και τέλος σημασμένο cDNAs υβριδοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τα GeneChip Human Gene 1,0 συστοιχίες ST για 16 ώρες στους 45 ° C και 60 rpm, όπως περιγράφεται στην (WT) Επισήμανση Δοκιμασία Gene Chip Σύνολο μεταγραφής με νόημα Target Manual (Affymetrix). Μετά την υβριδοποίηση, τα τσιπ χρωματίστηκαν και πλένονται στο ρευστών Station GeneChip 450 (Affymetrix) και σαρώθηκε χρησιμοποιώντας ένα GeneChip Array σαρωτή 3000 7G (Affymetrix). Για τη στατιστική ανάλυση, μια κλήση ανίχνευσης (Παρούσα /Απών) δημιουργήθηκε από τον μικροσυστοιχιών σουίτα Affymetrix 5 (MAS5) αλγόριθμο. Τα σαρωμένα αρχεία RAW εισήχθησαν στην στατιστική περιβάλλον προγραμματισμού R (Version2.3), για περαιτέρω ανάλυση με τα εργαλεία που διατίθενται από το Πρόγραμμα Bioconductor. δεδομένα Έκφραση ομαλοποιήθηκαν και log2-μετασχηματισμένα, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ισχυρή μέσος multichip (RMA) που υλοποιούνται στο Bioconductor πακέτο RMA (Μ2, Μ3). Για τη μείωση του θορύβου κατά την ανάλυση σημασία, μετρήστε σύνολα που δεν δείχνουν ένα ποσοστό κλήσεων ανίχνευση τουλάχιστον το 50% των δειγμάτων διηθήθηκαν. Επελέγησαν γονίδια υψηλής έκφρασης που έδειξε μια αλλαγή 2 φορές στην έκφραση. Τα αποτελέσματα ταξινομούνται με ιεραρχική αλγορίθμων ομαδοποίησης εφαρμόζονται στο λογισμικό TMEV 4.0. δεδομένων Array είχαν κατατεθεί στο Gene Expression Omnibus με τον αριθμό προσχώρησης GSE59501.

Η στατιστική ανάλυση

In vitro

πειραματικά δεδομένα ελήφθησαν από τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές εις τριπλούν. Οι μέσες τιμές υπολογίστηκαν, και η σημασία προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δύο ουρών δοκιμή Student.

P

τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα

Ίδρυση ιρινοτεκάνη ανθεκτικές κυτταρικές σειρές

Πριν από τη δημιουργία ενός καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή με επίκτητη αντοχή στην ιρινοτεκάνη, εξετάσαμε την κυτταροτοξικότητα της irinotecan σε αρκετές ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές για να προσδιοριστεί η πλέον ευαίσθητη. Από οκτώ κυτταρικές σειρές, ο LoVo κυτταρική γραμμή ήταν η πιο ευαίσθητη σε ιρινοτεκάνη (Εικ 1Α). Η κυτταροτοξικότητα της ιρινοτεκάνης σε κύτταρα γονικών και ανθεκτικά LoVo (LoVo-R) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό CCK-8. Τα κύτταρα LoVo-R ήταν πιο ανθεκτικά στην ιρινοτεκάνη από τα γονικά κύτταρα LoVo. Τα IC

50 τιμές των LoVo-R και γονικών LoVo ήταν 10 μΜ και 1,5 μΜ, αντίστοιχα. Δημιουργήσαμε αρκετές ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας διαφορετικές τελικές συγκεντρώσεις της ιρινοτεκάνης. Ωστόσο, παρόμοια επίπεδα IC

50 βρέθηκαν σε όλη την ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές με διαφορετικές τελικές συγκεντρώσεις ιρινοτεκάνη (Σχήμα 1Β). Η αντίσταση της γραμμής κυττάρων LoVo-R8 επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας ένα κλωνογονική δοκιμασία (Σχήμα 1 C). Η κυτταρική γραμμή LoVo-R8 προσαρμοσμένο να ιρινοτεκάνη σε μια τελική συγκέντρωση 8 μΜ. Είναι καλά γνωστό ότι η ιρινοτεκάνη αναστέλλει ειδικά την αντιγραφή του DNA με την παγίδευση τοποϊσομεράσης Ι σε κλώνους του DNA, επάγοντας διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην G

2 φάση. Για να διερευνηθεί η επίδραση της ιρινοτεκάνης για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων LoVo-R8, αναλύσαμε περαιτέρω τον κυτταρικό κύκλο αυτής της κυτταρικής γραμμής (Εικόνα 1D). Τα γονικά κύτταρα LoVo τα οποία υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ του ιρινοτεκάνης έδειξαν σοβαρή G

2 /M σύλληψης. Μετά από 24 ώρες θεραπεία με ιρινοτεκάνη (5 μΜ), η διακοπή του κυτταρικού κύκλου κατά την G

2 /Μ-φάση παρατηρήθηκε μόνο στα γονικά κύτταρα LoVo, αλλά τα κύτταρα LoVo-8R σε επεξεργασία με ή χωρίς ιρινοτεκάνη έδειξε καμία διαφορά στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου τους.

(Α) Η ευαισθησία του οκτώ κόλου καρκινικές κυτταρικές γραμμές να ιρινοτεκάνη μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία CCK-8. Για την δοκιμασία CCK-8, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε ιρινοτεκάνη σε δεδομένες συγκεντρώσεις για 72 ώρες πριν από τη μέτρηση. Η βιωσιμότητα των κυττάρων παρουσιάστηκε ως το ποσοστό σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. (Β) Η αντοχή των καθιερωμένων κυττάρων LoVo να ιρινοτεκάνη μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το CCK-8 δοκιμασίας και (Γ) η δοκιμασία κλωνογονική επιβίωση. Οι αποικίες που επιβίωσαν της δοκιμασίας κλωνογονική επιβίωση μετρήθηκαν μετά από περαιτέρω επώαση για επιπλέον 14 ημέρες. (Δ) την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου των LoVo-R8. *

σ

≤ 0,05.

Η ανάλυση

Η γονιδιακή ποικιλία έκφρασης ιρινοτεκάνη ανθεκτικά κύτταρα LoVo-R8

Μετά τον καθορισμό των ιρινοτεκάνη ανθεκτικές κυτταρικές σειρές LoVo-8R, ερευνήσαμε προφίλ γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιώντας τους DNA μικροσυστοιχίας. Χρησιμοποιώντας ένα κριτήριο φίλτρου τουλάχιστον ένα 2-φορές αλλαγή με

σ

& lt? 0.05, ο αριθμός των γονιδίων με τις αλλαγές στην έκφραση στα κύτταρα LoVo-8R, σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα LoVo τους, προσδιορίστηκε. Ένα σύνολο 599 και 566 γονίδια ρυθμίστηκαν προς τα πάνω και προς τα κάτω ρυθμισμένα, αντίστοιχα, αντιπροσωπεύοντας το 3,5% του συνόλου των γονιδίων ανιχνεύθηκαν (Σχ 2Α και 2Β). Ένα λειτουργικό σχολιασμός των γονιδίων αυτών διεξήχθη, χρησιμοποιώντας ένα γονίδιο οντολογία που βασίζεται ανάλυση των βιολογικών ιδιοτήτων. Τα γονίδια κατηγοριοποιήθηκαν σε 15 λειτουργικές ομάδες (Σχ 2Α και 2Β). Τα περισσότερα από αυτά τα γονίδια που σχετίζονται με την φλεγμονώδη απόκριση, η αγγειογένεση, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, ή κυτταρική μετανάστευση.

Επιλεγμένο

Genes χρησιμοποιούσαν ένα κριτήριο φίλτρου τουλάχιστον ένα 2-φορές μεταβολή σε σύγκριση με ελέγχους με

ρ

& lt? 0.05. Γονίδια με αλλοιωμένη έκφραση στον ιρινοτεκάνη ανθεκτική κυτταρική γραμμή LoVo, σε σύγκριση με την αρχική κυτταρική γραμμή LoVo, κατηγοριοποιούνται σε 15 λειτουργικές ομάδες βασίζονται στη γονιδιακή οντολογία. Οι αριθμοί γονίδιο εμφανίζονται σε γραφήματα (Α) και διερευνήθηκαν οι αριθμοί γονιδίου σε αυτή την ανάλυση συστοιχία και ποσοστιαίες τιμές των μεταβλήθηκαν σημαντικά γονίδια παρουσιάζονται σε έναν πίνακα (Β). (C) Ιεραρχική ανάλυση διασποράς των ιρινοτεκάνη ανθεκτικά μικροσυστοιχίες έκφρασης κυττάρων LoVo. Ένα σύμπλεγμα που βασίζεται αναπαράσταση μεταβάλλεται γονιδίων σε ιρινοτεκάνη ανθεκτικά κύτταρα με ένταση, ομαλοποιούνται στη γονική κυτταρική γραμμή LoVo. Τα γονίδια που ρυθμίστηκαν προς τα πάνω σε σχέση με τα γονικά κύτταρα LoVo εμφανίζονται με κόκκινο χρώμα, και αυτές που ρυθμίζεται προς τα κάτω φαίνονται στο πράσινο. Τα επίπεδα έκφρασης αυτών των γονιδίων μεταβλήθηκε ≥1.5 φορές ή ≤0.6-φορές σε ιρινοτεκάνη ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές LoVo, σε σύγκριση με την αρχική κυτταρική γραμμή LoVo. σύμβολα Gene εμφανίζονται στη δεξιά σειρά.

Η

Μια ιεραρχική συσταδοποίηση χάρτης θερμότητας (Σχήμα 2C) απεικονίζει τα μοτίβα της αλλαγής στα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης παρατηρείται στις ιρινοτεκάνη ανθεκτικά κύτταρα LoVo. Ένα σύνολο 24 γονιδίων φαίνεται να εμπλέκεται στην ιρινοτεκάνη μονοπάτι ή να είναι γονίδια που σχετίζονται με τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου, με βάση την ανάλυση των βιολογικών ιδιοτήτων διεξάγονται χρησιμοποιώντας γονίδιο οντολογία. Ένα σύνολο 53 διόδων βρέθηκαν, με βάση την ανάλυση μονοπάτι KEGG. Ολόκληρος ο χάρτης ομαδοποίησης θερμότητα παρουσιάζεται ως συμπληρωματικά στοιχεία στο S1 Σχ. Αναλύσαμε επίσης τις λειτουργίες των γνωστών γονιδίων που εμπλέκονται στην οδό ιρινοτεκάνης του ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα. CYP3A4 και CYP3A5 εμπλέκονται στο σχηματισμό καρβονυλοξυκαμπτοθεκίνη, ενός ανενεργού μεταβολίτη της ιρινοτεκάνης. Τα επίπεδα του RNA του δύο ΑΤΡ-συνδετικές πρωτεΐνες διαμεμβράνης κασέτας (ABC), ABCG2 (γνωστή ως πρωτεΐνη αντοχής στον καρκίνο του μαστού) και ABCB1, ήταν δραματικά τα επάνω ρυθμισμένη στα ιρινοτεκάνη ανθεκτικά κύτταρα (Σχ 2C και S1 πίνακα). Αυτό δεν αποτελεί έκπληξη, λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι εκροή ιρινοτεκάνης σε καρκινικά κύτταρα αποκαλύπτεται ως μια πιθανή στρατηγική για να ξεπεράσει την αντίσταση του φαρμάκου.

Η έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην οδό της βλάβης του DNA οδοφράγματος

Για βρουν νέους δείκτες που σχετίζονται με την ιρινοτεκάνη αντίσταση, ερευνήσαμε την έκφραση αρκετών γονιδίων που εμπλέκονται σε σηματοδότηση σημείο ελέγχου βλάβης του DNA. Οι ιρινοτεκάνη ευαίσθητων κυττάρων LoVo έδειξε ένα ίδια επίπεδα σε CtIP (CtBP αλληλεπιδρά πρωτεΐνης) και TopBP1 (τοποϊσομεράση (DNA) II πρωτεΐνης συνδέσεως 1) έκφραση, με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Σε ιρινοτεκάνη ανθεκτικά κύτταρα LoVo, η έκφραση CtIP ήταν περισσότερο ή λιγότερο αυξημένη. Ωστόσο, η έκφραση του TopBP1 δεν άλλαξε. CHK1 (CHEK1, οδοφράγματος κινάση 1) ενεργοποιήθηκε με 5 μΜ ιρινοτεκάνης στα γονικά κύτταρα LoVo. Ωστόσο, CHK1 δεν ενεργοποιήθηκε στα κύτταρα LoVo-8R θεραπεία με την ίδια συγκέντρωση ιρινοτεκάνη (σχήμα 3Α). Συνεπώς, μόνο φωσφορυλιωμένο CHK1 έδειξε ένα πρότυπο έκφρασης απόκλιση σε ιρινοτεκάνη ευαίσθητη έναντι ανθεκτικών κυττάρων (S2 Εικ). Η ενεργοποίηση του CHK1 κατά την έκθεση σε ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) ή υπεριώδη ακτινοβολία ήταν φυσιολογική και στις δύο ιρινοτεκάνη ευαίσθητα και ανθεκτικά κύτταρα (Σχ 3Β). Ωστόσο, το επίπεδο φωσφορυλίωσης CHK1 σε απόκριση σε IR και UV ήταν υψηλότερη σε ιρινοτεκάνη ευαίσθητων κυττάρων LoVo. Αυτά τα αποτελέσματα μας έκανε να διερευνήσουμε περαιτέρω γονίδια που σχετίζονται με τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου, για την εξεύρεση νέων δεικτών για την ιρινοτεκάνη αντίσταση.

(Α) έκφραση αρκετών γονιδίων που εμπλέκονται στην απόκριση σε βλάβη του DNA ιρινοτεκάνη ανθεκτικά κύτταρα. CHK1 ενεργοποιήθηκε στα 5 μΜ σε γονικά κύτταρα LoVo, αλλά ανθεκτικών κυττάρων LoVo δεν έδειξε την ενεργοποίηση του CHK1. (Β) βλάβη στο DNA, όπως IR και UV που προκαλείται από την ενεργοποίηση των CHK1 στα κύτταρα LoVo και LoVo-8R. Η φωσφορυλίωση του CHK1 σε απόκριση σε IR (10 Gy) και υν (50 J /m

2) ήταν μεγαλύτερη σε κύτταρα LoVo από ότι στα κύτταρα LoVo-8R. Γράφημα δείχνει το επίπεδο φωσφορυλίωσης της CHK1. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές σε

σ

& lt? 0.05 με t-test. *, Η σύγκριση μεταξύ των κυττάρων LoVo vs κύτταρα LoVo-R8.

Η

Sestrin3 νοκ ντάουν ενισχυμένη ιρινοτεκάνη κυτταρική κυτταροτοξικότητα σε ανθεκτικά κύτταρα LoVo

Για να βρείτε δείκτες για την ιρινοτεκάνη αντίσταση, αναλύσαμε το up-ρυθμίζονται γονίδια βρέθηκαν να εμπλέκονται σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου, με βάση τα δεδομένα μικροσυστοιχίας. Sestrin3 δραματικά τα επάνω ρυθμισμένη στα κύτταρα LoVo-R8 (Πίνακας 1). Sestrin3 knockdown δεν επηρέασε την τοξικότητα της ιρινοτεκάνης στα γονικά κύτταρα LoVo. Η σχετική ποσότητα του επιπέδου Sestrin3 mRNA αυξήθηκε στα κύτταρα LoVo-R8, και ανάλυση στυπώματος western έδειξε επίπεδο πρωτεΐνης Sestrin3 ήταν επίσης αυξημένη στα κύτταρα LoVo-R8 (Σχήμα 4Α και 4Β). Χρησιμοποιώντας την ανάλυση qPCR, Sestrin3 μεταγραφής επιβεβαιώθηκε ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω μέσω επιμόλυνσης siSESN3, αλλά η βιωσιμότητα των κυττάρων LoVo δεν επηρεάστηκε από τη θεραπεία siSESN3 (σχήμα 4Γ). Sestrin3 νοκ ντάουν μείωσε την αντίσταση των κυττάρων LoVo-R8 με ιρινοτεκάνη, μειώνοντας IC

50 αξία του σε 4 μΜ (Σχήμα 4D). Sestrins, μια οικογένεια στρες επαγόμενο πρωτεΐνες, μοιράζονται έναν υψηλό βαθμό ομολογίας με την βακτηριακή πρωτεΐνη AhpD που είναι υπεύθυνη για την κατάλυση της αναγωγής peroxiredoxins. Μετρήσαμε συσσώρευση ROS υπό ελεγχόμενες επίπεδα Sestrin3 σε κάθε κυτταρική σειρά (Εικόνα 4Ε). κύτταρα LoVo-R8 έδειξε μια χαμηλότερη συσσώρευση ROS από γονικά κύτταρα LoVo τους. Sestrin3 νοκ ντάουν αυξημένη παραγωγή ROS και στους δύο τύπους κυττάρων.

(Α) Η σχετική ποσότητα του επιπέδου Sestrin3 mRNA αυξήθηκε σε LoVo-R8 κυττάρων από πραγματικό χρόνο PCR. (Β) Σύμφωνα με απορυθμίζεται Sestrin3 μεταγραφή, ανάλυση κηλίδας western έδειξε επίπεδο πρωτεΐνης Sestrin3 ήταν επίσης αυξημένη σε LoVo-R8. Θεραπεία της Sestrin3 siRNA (siSESN3) αποτελεσματικά κάτω-ρυθμίζονται πρωτεϊνικό επίπεδο της αυξημένης Sestrin3 σε LoVo-R8. (C) Sestrin3 μεταγραφής κάτω ρυθμίζονται από την επιμόλυνση siSESN3 στην ανάλυση qPCR (αριστερά). κύτταρα LoVo ήταν ευαίσθητα σε ιρινοτεκάνη με δοσοεξαρτώμενη, και η βιωσιμότητα των LoVo δεν επηρεάστηκε ακόμα και υπό θεραπεία siSESN3 (δεξιά). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siSESN3 για 48 ώρες. Τα μέσα καλλιέργειας αλλάχθηκαν με το μέσο που περιείχε την ενδεικνυόμενη συγκέντρωση ιρινοτεκάνη και περαιτέρω επωάστηκαν για 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων παρουσιάζεται σαν το ποσοστό σε σχέση με εκείνη των μη επεξεργασμένων κυττάρων. (D) Sestrin3 απομαγνητοφώνηση επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω σε LoVo-R8 με επιμόλυνση siSESN3 στην ανάλυση qPCR (αριστερά). κύτταρα LoVo-R8 ήταν ανθεκτική σε ιρινοτεκάνη, αλλά άλλαξε σε να είναι επιρρεπή σε ιρινοτεκάνη με κατεργασία siSESN3 (δεξιά). εικόνων (Ε) φθορισμού του ενδοκυτταρικού ROS χρώση με το CellRox πράσινο αντιδραστήριο. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με έλεγχο siRNA ή siSESN3. Το ROS μετρήθηκε μετά από 48 ώρες. (F) κηλίδα Western που δείχνει τα επίπεδα πρωτεΐνης του ΑΜΡΚ, ρ-ΑΜΡΚ, mTOR, ρ-mTOR, p70S6K, και π-p70S6K σε LoVo και LoVo-R8, με ή χωρίς την ιρινοτεκάνη. (G) Διάγραμμα που δείχνει τα επίπεδα των πρωτεϊνών. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές σε

σ

& lt? 0.05 με t-test. *, Η σύγκριση μεταξύ της ομάδας χωρίς ιρινοτεκάνη vs ομάδα με 10 μΜ ιρινοτεκάνη σε LoVo και LoVo-R8? #, Η σύγκριση μεταξύ LoVo vs LoVo-R8.

Η

Στη συνέχεια, εξετάσαμε τη φωσφορυλίωση της ΑΜΡΚ, mTOR και p70S6K να διερευνήσει κατά πόσον Sestrin3 επηρεάζει την αντίσταση στην ιρινοτεκάνη μέσω της οδού ΑΜΡΚ /TORC1 ( Σχήμα 4F και 4G). κύτταρα LoVo-R8 έδειξε υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του ΑΜΡ ενεργοποιημένης κινάσης πρωτεΐνης (ΑΜΡΚ) και της φωσφορυλίωσης ΑΜΡΚ από γονικά κύτταρα LoVo. Η φωσφορυλίωση του mTOR και S6K (p70S6 κινάση), ένα υπόστρωμα mTORC1 αυξήθηκε σε κύτταρα LoVo-8R. Επιπλέον, τα κύτταρα LoVo-8R έδειξε συστατική ενεργοποίηση του ΑΜΡΚ και mTOR με ή χωρίς ιρινοτεκάνη σε σύγκριση με τα κύτταρα LoVo.

Συζήτηση

Η ιρινοτεκάνη έχει αξιολογηθεί ευρέως ως μονοθεραπεία καθώς και σε συνδυασμό σχήματα με άλλα χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Μετά την έγκριση για τη θεραπεία του μεταστατικού κολοορθικού καρκίνου, ιρινοτεκάνη έχει χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία ενός αριθμού άλλων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα, γαστρικό καρκίνο, οι όγκοι του εγκεφάλου, και του καρκίνου του μαστού. Ωστόσο, αντοχή φαρμάκου του όγκου σε ιρινοτεκάνη έχει περιορισμένη αποτελεσματικότητα της στην κλινική θεραπείες. Έχουμε δημιουργήσει μια σταθερή κυτταρική γραμμή που είναι ανθεκτική σε ιρινοτεκάνη. Το πιο ευαίσθητο κυτταρική γραμμή που επιλέγεται από οκτώ κυτταρικές σειρές ορθοκολικού, με βάση τις δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας. Εμείς επάγεται χρόνιας αντίσταση από έκθεση των κυττάρων σε μια αύξηση της δόσης της ιρινοτεκάνης. Για να επιβεβαιωθεί η προσαρμογή τους, τα κύτταρα που επίκτητη αντοχή καλλιεργήθηκαν σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου για τρία περάσματα. Μετά από καλλιέργεια στο μέσο ελεύθερο φαρμάκου, τα κύτταρα LoVo-R8 που είχαν αποκτήσει ανθεκτικότητα σε ιρινοτεκάνη διατηρούσε στο ίδιο επίπεδο με τα πρόσφατα καθιερωμένων κυττάρων. Τα δεδομένα μικροσυστοιχιών αναλύθηκαν για να προσδιοριστούν τα βασικά γονίδια που παίζουν σημαντικό ρόλο στην αντίσταση στην ιρινοτεκάνη. Ελήφθησαν συνολικά 1165 διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων (βαθμούς με). Μια ανάλυση του εμπλουτισμού Γονιδιακή Οντολογία αποκάλυψε ότι το επίπεδο της Sestrin3 αυξήθηκε δραματικά. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης των άλλων δύο μελών της οικογένειας Sestrin, Sestrin1 και Sestrin2, ήταν ελαφρώς αλλάξει. Sestrins είναι μια οικογένεια εντόνως διατηρημένη, στρες αποκρίνονται πρωτεΐνες. Sestrin1 και Sestrin2 τα μεταγραφικά ρυθμίζονται από ρ53. Sestrin3, ρυθμίζεται από forkhead μεταγραφικό παράγοντα, παρουσιάζει δραστικότητα οξειδοαναγωγάσης

in vitro

. Έχει αναφερθεί ότι SESN3 μπορεί να προστατεύσει τα κύτταρα από το οξειδωτικό στρες με διαμόρφωση peroxiredoxin (Prx) αναγέννηση [10]. Αναμέναμε ότι η έκφραση Sestrin1 και Sestrin2 θα είναι επάνω ρυθμισμένη επειδή οι διάφοροι παράγοντες βλάβης του DNA που είναι γνωστό ότι επηρεάζουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μέσω της ενεργοποίησης p53. Από τα δεδομένα μας συστοιχία, S2 πίνακας παρουσιάζει τα επίπεδα έκφρασης του Sestrins καθώς και τα γονίδια που σχετίζονται με την οδό ρ53. Από τους 24 γονίδια που ταυτοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ως εμπλεκόμενο στην ιρινοτεκάνη μονοπάτι του ορθοκολικού καρκίνου, τα επίπεδα έκφρασης του

CES1

και

CES2

(που εμπλέκονται στην μετατροπή του προ-φαρμάκου προς ιρινοτεκάνη ) έχουν μειωθεί κατά περίπου 25%. Από τους 24 γονίδια, αυτά που κωδικοποιούν πρωτεΐνες δέσμευσης ΑΤΡ κασέτας (ABC) που συμμετέχουν στην εκροή, όπως

ABCB1

και

ABCG2

, ήταν τα πιο υψηλά up-ρυθμιζόμενα γονίδια. Αντίσταση στην ιρινοτεκάνη επηρεάζεται από τα συστήματα επιδιόρθωσης του DNA.

ERCC1

και

ERCC2

, τα οποία συμμετέχουν στην επιδιόρθωση νουκλεοτιδίων εκτομή, έδειξαν κάποια αύξηση στην έκφραση τους. Ωστόσο, η έκφραση του

MLH1

και

MLH6

(που εμπλέκονται στη διαδικασία επισκευής αναντιστοιχία) αλλάξει πολύ λίγο. Από τους 24 γονίδια, όσοι εμπλέκονται στην αποπτωτική οδό δεν έδειξε καμία διαφορά στην έκφραση μεταξύ των ιρινοτεκάνη ευαίσθητα και ιρινοτεκάνη ανθεκτικά κύτταρα. Λαμβάνοντας υπόψη αυτές τις παραλλαγές στην γονιδιακή έκφραση, η επίκτητη αντοχή στην ιρινοτεκάνη σε κύτταρα LoVo-R8 μπορεί να οφείλεται σε μειωμένη κυτταρική συσσώρευση της ιρινοτεκάνης, ή σε μετατροπή της ιρινοτεκάνης σε έναν ενεργό μεταβολίτη επειδή SN-38 μειώθηκε σε κάποιο βαθμό.

θεραπεία με ιρινοτεκάνη συνδέεται με τη σύλληψη G2 του κυτταρικού κύκλου. Ερευνήσαμε την κατηγορία διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη Γονιδιακή Οντολογία, για να βρείτε τους βασικούς στόχους του κύκλου μεσολάβηση αντίσταση των κυττάρων. Sestrin3 δείχθηκε να ρυθμίζουν Prx αναγέννηση σε καρκινικά κύτταρα. Το επίπεδο έκφρασης των Sestrin3 αυξήθηκε μέσω μεταγραφικής ενεργοποίησης από FOXO1. Ενώ η οικογένεια Sestrin εμπλέκεται στον έλεγχο της οξειδοαναγωγικής [5, 8, 12], πρόσφατες μελέτες έχουν καταδείξει το ρόλο του Sestrins στη σηματοδότηση mTORC1. mTORC1 αναστέλλεται από μέλη της οικογένειας Sestrin (SESN1 /2), μέσω του ΑΜΡΚ μεσολάβηση ενεργοποίηση του συμπλέγματος TSC1 /2 [12]. Sestrin3 έχει αναφερθεί ότι παρεμποδίζουν mTORC1, βασίζεται στο εύρημα ότι FOXO1 /3α μεσολάβηση μεταγραφική άνω ρύθμιση του Sestrin3 προχωρά για την ενεργοποίηση ΑΜΡΚ /TSC1 /2, η οποία τελικά αναστέλλει την δραστικότητα mTORC1 [13]. Επιπλέον, η ενεργοποίηση mTORC1 οδηγεί στη συσσώρευση των ROS, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της JNK σηματοδότησης /FOXO, και μια θετική βρόχο ανάδρασης της έκφρασης Sestrin [5, 14]. Ωστόσο, ο ρόλος του Sestrin3 στην ογκογένεση και την αντίσταση στα φάρμακα καρκίνος παραμένει ασαφής. Εξέταση της ΑΜΡΚ /mTOR μονοπάτι στο LoVo και LoVo κυττάρων-R8 έδειξε ότι το σήμα AMPK ενεργοποιήθηκε στην ιρινοτεκάνη επεξεργασμένα κύτταρα ή ιρινοτεκάνη ανθεκτικά κύτταρα (Σχήμα 4F). Σε γενικές γραμμές, αναμένεται ότι mTOR σηματοδότησης υπό αναστολή από την ενεργό AMPK θα προκαλέσουν αυτοφαγία [15]. Στη μελέτη μας, όμως, η ενεργοποίηση ΑΜΡΚ δεν αναστέλλει την πρωτεΐνη mTOR. Αν και σηματοδότηση mTOR είναι στενά συνδεδεμένη με το σήμα ΑΜΡΚ και είναι στην πραγματικότητα κάτω-ροή σε ΑΜΡΚ, TSC1 /2 και Rheb είναι μόρια κόμβο της mTOR μονοπάτι σηματοδότησης ενσωμάτωση διαφορετικών εισόδων [16, 17]. Η μελέτη μας αποκαλύπτει μια θετική και όχι αρνητική ρυθμιστική σχέση μεταξύ ΑΜΡΚ και mTOR.

αποτελέσματα και οι ερμηνείες μας επικεντρώθηκαν στην αντιοξειδωτική δράση της Sestrin3 για την αντίσταση στα φάρμακα κατά του καρκίνου. Σε γενικές γραμμές, τα καρκινικά κύτταρα υποβάλλονται σε αερόβια γλυκόλυση να ικανοποιήσουν την υψηλή ζήτηση σε θρεπτικά συστατικά που επιβλήθηκε στην κυτταρική και εξωκυτταρικό περιβάλλον από ταχύ πολλαπλασιασμό τους. Οι απαιτήσεις για αυξημένη παραγωγή ενέργειας φέρει τα καρκινικά κύτταρα να αντιμετωπίζουν σοβαρά οξειδωτικό στρες, το οποίο ενεργοποιεί διάφορους μηχανισμούς άμυνας και επισκευής κατά γονοτοξική ναρκωτικών, αν και ROS μπορούν επίσης να λειτουργήσουν ως ειδικά δεύτεροι αγγελιοφόροι σε καταρράκτες που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση των κυττάρων σηματοδότησης. Σε καρκινικά κύτταρα, η συσσώρευση των ROS μπορούσε διεγείρουν κυτταρικό πολλαπλασιασμό, μεταλλαξογένεση, και γενωμική αστάθεια [18, 19]. Κατά συνέπεια, η συσσώρευση μεγάλων ποσοτήτων ROS ανιχνεύεται σε κύτταρα μετασχηματισμένα με το

RAS ογκογονίδιο

[18, 20, 21].