Αφηρημένο

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα είναι ένα άλυτο πρόβλημα υγείας με σχεδόν το 75% των ασθενών που διαγιγνώσκονται με προχωρημένη νόσο και ένα συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών κοντά στο 5%. Παρά την ισχυρή σχέση μεταξύ θνησιμότητας και κακοήθεια, οι μηχανισμοί πίσω από παγκρέατος διάδοσης του καρκίνου και μετάσταση είναι ελάχιστα κατανοητή. Correlative παθολογικά και κυτταρικής καλλιέργειας αναλύει προτείνουν τη υποδοχέα χημειοκινών CXCR4 παίζει ένα βιολογικό ρόλο σε παγκρεατικά εξέλιξης του καρκίνου.

In vivo

ρόλους για το CXCR4 συνδέτη CXCL12 σε παγκρεατικά κακοήθεια καρκίνο διερευνήθηκαν. CXCR4 και CXCR7 εκφράστηκαν σταθερά σε φυσιολογικό και καρκινικό παγκρεατικό επιθήλιο πόρου, καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές, και τα πρωτογενή καρκινικά κύτταρα που λαμβάνονται από ασθενή. Σε σχέση με τους υγιείς αγωγούς εξωκρινείς, έκφραση CXCL12 ήταν παθολογικά κατασταλεί σε παγκρεατικά δείγματα καρκινικού ιστού και κυτταρικές σειρές που λαμβάνονται από ασθενή. Για να ελέγξετε τις λειτουργικές συνέπειες του CXCL12 αποσιώπηση, παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές σταθερά expressingthe χημειοκινών κατασκευάστηκαν. Συνεπής με ένα ρόλο για CXCL12 ως καταστολέας όγκου, κύτταρα που παράγουν την χημειοκίνη wereincreasingly προσκολλημένα και μετανάστευση ανεπάρκεια

in vitro

και κακώς μεταστατικό

in vivo

, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Περαιτέρω, CXCL12 επαναφορά μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου

in vitro,

με σημαντικά μικρότερους όγκους

in vivo

, οδηγώντας σε μια έντονη πλεονέκτημα επιβίωσης σε ένα προκλινικό μοντέλο. Μαζί, αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ένα λειτουργικό ρόλο κατασταλτική του όγκου για την κανονική έκφραση των CXCL12 σε παγκρεατικά αγωγούς, που ρυθμίζει τόσο την ανάπτυξη του όγκου andcellulardissemination να μεταστατικές θέσεις

Παράθεση:. Roy I, Zimmerman ΝΡ, Mackinnon AC, Tsai S, Evans DB, Dwinell MB (2014) CXCL12 έκφραση των χημειοκινών Καταστέλλει τα Ανθρώπινα καρκίνο του παγκρέατος ανάπτυξη και η μετάσταση. PLoS ONE 9 (3): e90400. doi: 10.1371 /journal.pone.0090400

Επιμέλεια: Jeffrey K. Harrison, το Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 Νοεμβρίου του 2013? Αποδεκτές: 29 Γενάρη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 4 του Μάρτη, 2014

Copyright: © 2014 Roy et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από τον Α υγιέστερη Ουισκόνσιν και το Κέντρο Καρκίνου MCW. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Έχουμε τα εξής ενδιαφέροντα. Ο Δρ Dwinell είναι αποδέκτης ενός διπλώματος ευρεσιτεχνίας (# 8404640) για τη χρήση CXCL12 στη θεραπεία των κακοήθων καρκίνων και είναι συν-ιδρυτής της πρωτεΐνης Χυτήριο, LLC. Δεν υπάρχουν περαιτέρω διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει προσήλωση μας σε όλα τα PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς. Ο τίτλος του διπλώματος ευρεσιτεχνίας είναι: «Μέθοδος διάγνωσης και θεραπείας του καρκίνου του παχέος εντέρου»

Εισαγωγή

παγκρέατος αδενοκαρκίνωμα του πόρου (PDAC) είναι anunrelenting μορφή καρκίνου στον άνθρωπο, χωρίς αποτελεσματική τεχνική για την έγκαιρη διάγνωση. ή θεραπεία, και μια συχνότητα σχεδόν ίσο με θνησιμότητα [1], [2]. Οι περισσότεροι ασθενείς, κατά τη στιγμή της διάγνωσης, έχουν ήδη τοπικά προχωρημένο ή μεταστατικό νόσο, καθιστώντας χειρουργική εκτομή του πρωτογενούς όγκου του περιορισμένη θεραπευτική αξία [3] .Current φαρμακευτικές θεραπείες για PDAC είναι ανεπαρκείς ως η συντριπτική πλειοψηφία των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος πεθαίνουν από μικρο – ή μακρο-μεταστατική νόσο [4]. Μια βελτιωμένη κατανόηση των βιολογικών μηχανισμών που διέπουν την επιθετικότητα των PDAC είναι απαραίτητη. Παρά το γεγονός ότι πρόσφατες μελέτες έχουν καθορίσει τα μοριακά παράγοντες που εμπλέκονται στην εξέλιξη του PDAC [5] – [7], λίγα είναι γνωστά σχετικά με τους μηχανισμούς που ρυθμίζουν τη βιολογική κυτταρική κινητικότητα και, με τη σειρά του, μετάσταση. Χημειοτακτικές κυτοκίνες, χημειοκίνες ή, παίζουν keyroles στην κυτταρική μετανάστευση, και είναι σε θέση να συντονίζει πολλαπλές πλευρές των μηχανών κυτταρική μετανάστευση. Μέσω ενεργοποίηση των υποδοχέων τους, chemokinesregulate πολλές έδρες του κανονική φυσιολογία, συμπεριλαμβανομένης της εμπορίας των λευκοκυττάρων, μετανάστευση των επιθηλιακών κυττάρων που απαιτούνται για το κλείσιμο των πληγών, η αγγείωση του ιστού, και την ανάπτυξη των οργάνων κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης [8] – [10]. Προηγουμένως, το εργαστήριο μας revealedthe σημασία της διπλής έκφρασης της χημειοκίνης CXCL12 και τον συγγενή υποδοχέα της CXCR4 στην μετανάστευση εντεροκυττάρων, επούλωση πληγών, και την αγγειογένεση [11] – [16]

Αρκετές μελέτες έχουν εμπλέξει ένα ρόλο για χημειοκίνης. υποδοχείς, ιδίως CXCR4 και CCR7, σε εξέλιξη του καρκίνου και μετάσταση [9], [17] – [22]. έκφραση CXCR4 έχει συνδεθεί με την κακοήθεια πάνω 20different καρκίνων [17], [23]. Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι CXCL12 εκφράζεται σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα σε έντερο και μαστικούς αδένες, αλλά επιγενετικώς σιγήσει στο μητρικό και του παχέος εντέρου [24], [25] .Αυτή πρότυπο γονίδιο CXCL12 repressionresults σε καρκινικά κύτταρα των οποίων η χημειοκίνη – profilesmirror υποδοχέα ότι από μεγάλη κινητικότητα λευκοκυττάρων, τα οποία εκφράζουν τους υποδοχείς CXCR4 και CXCR7 αλλά όχι ο συνδετήρας. Δείξαμε ότι η εκ νέου έκφραση του CXCL12 μείωσε την ικανότητα των κυττάρων του μαστού και του παχέος εντέρου σε μετάσταση [24] – [26] .Several μελέτες haveextended αυτές τις διαπιστώσεις σπερματικό να δείξει ευεργετικά αποτελέσματα του αυτοκρινούς CXCL12 σε μαστού, του πνεύμονα, του στομάχου, του και το κεφάλι και καρκίνους του αυχένα [27] – [30]. Απώλεια CXCL12expression στο οστεοσάρκωμα και καρκίνος του μαστού όγκου του ασθενούς specimenswas συσχετίζονται με χειρότερη πρόγνωση [31] – [34]. Στον καρκίνο του παγκρέατος, αντικρουόμενες και ελλιπείς εκθέσεις δείχνουν είτε ότι η έκφραση CXCL12 είναι αυξημένη ή CXCL12 δεν εκφράζεται στη συντριπτική πλειοψηφία των ασθενών [35], [36]. Έτσι, ενώ ένα αυξανόμενο σώμα της στοιχεία δείχνουν ένα ρόλο όγκου-κατασταλτικό για CXCL12 στην ανθρώπινη κακοήθεια καρκίνο, μηχανιστικό ρόλο της στην PDAC παραμένουν ελάχιστα κατανοητή.

Η επικρατούσα μοντέλο της μετάστασης του καρκίνου είναι ότι οι κακοήθεις όγκοι εξαπλωθεί σε απομακρυσμένα ιστούς μέσω η υπερ-έκφραση του CXCR4 [22], [37], [38], ευαισθητοποιώντας έτσι κακοήθη κύτταρα να εξαπλωθούν σε απόκριση σε μακρινές κλίσεις του CXCL12 που παράγεται από μεταστατικά όργανα προορισμού. Αυτό το μοντέλο έχει επίσης χρησιμοποιηθεί για να εξηγήσει PDAC μετάσταση, καθώς πολλές εκθέσεις τεκμηριώνει την έκφραση των CXCR4 με παγκρεατική κυτταρικές σειρές καρκινώματος ανθρώπινου ιστού και [39] – [42]. Ωστόσο καμία από αυτές τις μελέτες έχουν εξετάσει αυστηρά την παράλληλη έκφραση του CXCL12 ή CXCR7 στο πλαίσιο του CXCR4 ή καθορισμένες έκφραση οποιουδήποτε από τα τρία συστατικά αυτού του άξονα χημειοκίνης σε φυσιολογικά στόχους παγκρεατικού epithelium.The της μελέτης μας ήταν να προσδιοριστεί το προφίλ έκφρασης και λειτουργικός ρόλος του άξονα CXCL12-CXCR4-CXCR7 τόσο σε υγιή φυσιολογικά και κακοήθη πάγκρεας. Στο παρόν, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι ενώ η έκφραση του υποδοχέα είναι αυξημένη, η έκφραση CXCL12 είναι σημαντικά μειωμένη σε εκτομή ιστού PDAC και μια μπαταρία ofpancreatic καρκινικές κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με το φυσιολογικό πάγκρεας. έκφραση CXCL12 παροδικά αποκατασταθεί χρησιμοποιώντας αναστολείς επιγενετικών repression.Stable επαναφορά των CXCL12 σε κύτταρα PDAC εμπόδισε κατευθυνόμενη μετανάστευση των κυττάρων και ηπατική μετάσταση και επιβράδυναν την ανάπτυξη του όγκου

in vitro

και

in vivo

, με αποτέλεσμα την αύξηση επιβίωση σε προκλινικά μοντέλα.

Υλικά και Μέθοδοι

δήλωση Ηθικής

Εκπίπτουν, de-εντοπίστηκαν φυσιολογικό πάγκρεας, δείγματα ιστών PDAC και μοναδική PDAC κύτταρα που λαμβάνονται από ασθενή ελήφθησαν από η Χειρουργικής Ογκολογίας Biorepository χρησιμοποιώντας ένα Ιατρικό Κολέγιο του Ουισκόνσιν (ΥΣΕ) InstitutionalReview Διοικητικό # 4 εγκεκριμένο πρωτόκολλο. Οι ιστοί και τα κύτταρα στο εσωτερικό της βιοτράπεζα ελήφθησαν από ασθενείς μετά υπογράψει έγγραφη συγκατάθεση και κωδικοποιούνται και αποχαρακτηρίζονται, με προσωπικές πληροφορίες αναγνώρισης δεν μοιράζεται με την έρευνα οι ερευνητές. Οι προκλινικές μελέτες ξενομοσχεύματος ποντικού ολοκληρώθηκαν χρησιμοποιώντας τα πρωτόκολλα και τις διαδικασίες τεκμηριώνεται σε μια καθιερωμένη Εφαρμογή των ζώων Χρήση (AUA076) που εγκρίθηκε από την φροντίδα των ζώων και τη χρήση επιτροπής MCW θεσμικές και σε συμμόρφωση με τις κατευθυντήριες γραμμές που καθορίζονται από το Γραφείο του Εργαστηρίου καλή μεταχείριση των ζώων και σύμφωνα με τον οδηγό για τη Φροντίδα και τη χρήση των LaboratoryAnimals. Όλοι οι ποντικοί στεγάστηκαν κάτω από συνθήκες ελεύθερες παθογόνων, έλαβαν τροφή και νερό κατά βούληση, και διατηρήθηκαν σε 10 ώρες: φως σκότους σε ένα ελεγχόμενης θερμοκρασίας δωματίου 14-hr /(25 ± 2 ° C) .Animals υποβλήθηκαν σε ευθανασία κατά την ολοκλήρωση της μελέτης ή μετά από συμπτώματα δυσφορίας ή κακή κατάσταση του σώματος, όπως εκτιμάται από εκπαιδευμένο εργαστηριακό προσωπικό και επιβεβαιώθηκε από κτηνιάτρους προσωπικό MCW Βιοϊατρικής Resource Center για να βελτιώσει τον πόνο και την αγωνία που σχετίζεται με το σχηματισμό όγκων.

Ανθρώπινο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές

PANC1 (CRL-1469), MIAPaCa2 (CRL-1420), Capan2 (ΗΤΒ-80), και HPAFII (CRL-1997) κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την ATCC. κυτταρικές σειρές PANC1 και MIAPaCa2 διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS). Οι κυτταρικές γραμμές Capan2and HPAFII διατηρήθηκαν σε 10% (ν /ν) FBS συμπληρωμένο μέσο 5Aor ΜΕΜ του McCoy, αντίστοιχα. Σε μερικά πειράματα, κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε κανονικό μέσο υπέστησαν αγωγή ημερησίως με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα) ή τριχοστατίνη Α (EMD Biosciences). κυτταρικές γραμμές MIAPaCa2 επιμολύνθηκαν με Firefly-λουσιφεράση υπό ζεοκίνη επιλογής. Τα προκύπτοντα λουσιφεράσης κύτταρα που εκφράζουν MIAPaCa2 στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με πλασμίδια που κωδικοποιούν είτε eGFP ή ανθρώπινο CXCL12, και οι κλώνοι αναπτύσσονται υπό συνθήκες επιλογής νεομυκίνης [26]. Οι κυτταρικές σειρές ήταν de-εντοπίστηκαν όλων των παραμέτρων προσδιορισμού από μεμονωμένους ασθενείς που συναινούν με καρκίνο του παγκρέατος και επιβεβαιώθηκαν να είναι PDAC προέλευσης παρακάτω καρυότυπος DNA και ανάλυση της πρωτεϊνικής έκφρασης.

Ανθρώπινο παγκρέατος tissuespecimens

Κανονική αγωγούς και PanIN βλάβες απομονώθηκαν αποκλειστικά από παρακείμενο φυσιολογικό ιστό των απορρίψεων της μεταμόσχευσης οργάνων ή του παγκρέατος πράξεις που δεν συνεπάγονται PDAC ή άλλες κακοήθειες εξωκρινών. της κατάστασης της νόσου αυτών των φυσιολογικών και καρκινικών tissueswas επιβεβαιώνεται από ένα σύνολο pathologist.A πίνακας-επικυρωμένο από 25 ιστών από 21 διαφορετικούς ασθενείς χρησιμοποιήθηκαν για την κανονική αναλύσεις. Ένα σύνολο από 82 ιστών από 29 διαφορετικούς ασθενείς χρησιμοποιήθηκαν για τις αναλύσεις του όγκου. Από τους 29 ασθενείς που παρέχουν PDAC ιστού, 11 ασθενείς είχαν λάβει νεο-επικουρική θεραπεία.

RT-PCR

RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα και δείγματα ιστών χρησιμοποιώντας το κιτ RNAeasy (Qiagen) και υποβάλλεται σε επεξεργασία με DNase (Ambion), μετατράπηκε σε cDNA, και CXCL12, CXCR4, CXCR7, και έκφραση GAPDH μεταγραφής αναλύονται όπως ορίστηκε προηγουμένως και βελτιστοποιηθεί για καλύτερη απόδοση σε μία γραμμική κλίμακα [24], [43] .A περιοχή του 5′-αμετάφραστη περιοχή του η σύνδεση μαννόζης γονίδιο λεκτίνης ενισχύθηκε για να ανιχνεύσει γενωμικού DNA προσμείξεις [12]

Immunoanalyses

Μη προετοιμασμένο πλάκες δημιουργήθηκαν από δείγματα παγκρεατικού όγκου και CXCL12 ανοσοχρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα από R &?. D Systems (mab350 ). Cytokeratin-19 (CK19) (ab7754), CXCR4 (ab2074), CXCR7 (ab38089 & amp? Ab72100) και Ki-67 (ab15580) ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας αντισώματα από Abcam.Visualization έγινε χρησιμοποιώντας ραφανιδική-υπεροξειδάση-συζευγμένο δευτερεύον αντισώματα και ο 3,3′-diaminobenzidinePeroxidase Substrate Kit (Vector Labs). Για την αποφυγή παρεμβολών διαφάνειες φόντο δεν Ακολούθησε χρώση. επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης βαθμολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μια τυποποιημένη κλίμακα 4 σημείων [0 = απούσα, 1 = ασθενής, 2 = μικτά, και 3 = ισχυρή ένταση χρώσης] [44]. Οι αναλύσεις ανεξάρτητα συμπληρωθεί από έναν ερευνητή τύφλωσε με την κατάσταση της νόσου και το πρωτόκολλο ανοσοχρώση. Η εκκρινόμενη πρωτεΐνη CXCL12 από υπερκείμενο από παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα καλλιεργούνται σε μέσα άνευ ορού ανιχνεύθηκε με ourpreviously εγκατεστημένος σάντουιτς μέθοδο ELISA χρησιμοποιώντας αντισώματα από R &? D Systems (μονοκλωνικά ποντικού και ανθρώπου CXCL12 (MAB350) και κατσίκα αντι-ανθρώπινο CXCL12 (BAF310) [24 ] .Cell επιφάνεια CXCR4 ή CXCR7was ανιχνεύεται με τη χρήση των προαναφερθέντων αντισωμάτων (Abcam) κατά μήκος withFITC-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα χρησιμοποιώντας προηγουμένως καθιερωμένη μέθοδος μας [43]. εν συντομία, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε κανονικό μέσο ανάπτυξης, ανυψώνεται χρησιμοποιώντας ένζυμο χωρίς ρυθμιστικό διάστασης, πλύθηκε χρησιμοποιώντας παγωμένο στείρο PBS, και μετά επωάστηκαν σε διάλυμα αποκλεισμού που περιέχει BSA και δευτερογενούς αντισώματος στον ορό. Μετά τον αποκλεισμό, τα κύτταρα επωάστηκαν πρώτα με πρωτογενές αντίσωμα και κατόπιν με συζευγμένο με FITC δεύτερο αντίσωμα. Τέλος, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής ( LSR II, BD Biosciences).

In vitro δοκιμασίες

ογκογένεση

τα κύτταρα τοποθετήθηκαν στο ανώτερο φρεάτιο με χημειο-ελκυστικών προστίθενται στο κάτω φρεάτιο και Transwell μετανάστευση ή χημειοεισβολή απαριθμούνται σε ένα αντιπροσωπευτικό σύνολο των εικόνων που λαμβάνονται μετά την φθορίζουσα χρώση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [43], [45]. Η άνω μεμβράνη καλά επικαλύφθηκε με κολλαγόνο σε προσδιορισμούς μετανάστευσης και με Matrigel (BD Biosciences) σε εισβολή assays.Panc1 και HPAFII μετανάστευση κυττάρων μετρήθηκε μετά από 24 ώρες διέγερσης σε transwells ενώ μετανάστευση MIAPaCa2 κυττάρων μετρήθηκε μετά από 6 ώρες.

Αρχικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση των κυτταρικών γραμμών PDAC ορίστηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό κυτταρομετρίας ροής Viacount (Millipore), ή την κασπάση-3/7 δοκιμασία Glo (Promega) .Briefly, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 10% (ν /ν) ορό που περιέχει μέσο, ​​και μία φορά προσκολλημένα (όλη τη νύχτα) μεταφέρθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού. ανάλυση κυτταρικού κύκλου έγινε χρησιμοποιώντας βαφή ιωδιούχου προπιδίου και ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, όπως έγινε προηγουμένως [43]. Σε μερικά πειράματα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 1% (ν /ν) μέσο που περιέχει ορό μετά από 24 ώρες starvation.Gemcitabine ορού (GEM), μια καθιερωμένη χημειοθεραπευτικό φάρμακο σε ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για μειωμένη ανάπτυξη και αυξημένη απόπτωση.

In vivo

μελέτες και βιοφωταύγεια απεικόνισης

Μια καθιερωμένη ετεροτοπικό ενδοσπληνική μοντέλο έγχυσης [46] ήταν usedto αξιολογήσει μεταστατικό παλιννόστησης και εξαγγείωση στο ήπαρ. Έξι εβδομάδων ανοσοκατεσταλμένους SCID ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν και 1 × 10

6MiaPaCa2luciferasecells εγχύθηκαν στο spleenthrough ένα πλευρικό τοίχωμα εκτομή και την ανάπτυξη του όγκου και την μετάσταση παρακολουθείται χρησιμοποιώντας απεικόνιση βιοφωταύγειας κάθε 7 ημέρες χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση που περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Μετά από 28 ημέρες, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και ο σχηματισμός όγκου στο σπλήνα και το ήπαρ μετράται

ex vivo

χρησιμοποιώντας απεικόνιση βιοφωταύγειας. Ένα πρότυπο ορθοτοπικής χρησιμοποιήθηκε όπως καθορίστηκε προηγουμένως [47], με 1 × 10

6 κύτταρα εγχέεται στο πάγκρεας των ποντικών SCID και την εξέλιξη της νόσου παρακολουθείται. Ποντίκια απομακρύνθηκαν από τη μελέτη, όταν thetumor μέγεθος έφτασε τα 1000 mm

3 όγκου και 1 × 10

9p /sec /cm

2 /steradianradiance.Three ποντίκια με εμφυτευμένα κύτταρα CXCL12 εκφράζουν αφαιρέθηκαν για κτηνιατρική μη λόγοι μελέτη λόγω κλουβί-φαγωμάρα.

Στατιστικές αναλύσεις

οι πολλαπλές συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ANOVA και

post-hoc ανάλυση

Dunnett που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό ζεύγη διαφορές (GraphPad Prism 4). Αξιόπιστες αναλύσεις υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας είτε ένα Mann-Whitney ή δοκιμασία log-rank όπου ενδείκνυται. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε ως

P

≤0.05.

Αποτελέσματα

Αμοιβαίες CXCL12, έκφραση CXCR4, και CXCR7 σε πορογενές αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος

Οι λειτουργίες του CXCR4 , CXCR7 ή CXCL12 σε παγκρεατικά εξέλιξης του καρκίνου παραμένουν βασίζεται σε περιορισμένα αναλύσεις χωρίς ταυτόχρονη ανάλυση των τριών χημειοκίνης συστατικά και σε φυσιολογικά και νοσούντα tissue.Immunostaining ειδικών αντισωμάτων σειριακών ιστού sectionswith, revealedrobust χρώση CXCL12 σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του πόρου σηματοδότησης, με τις ίδιες epitheliaalso χρώση θετικό για CXCR4 και CXCR7 (Fig.1A & amp? Εικ. 2Α). έκφραση CXCL12 χημειοκίνης ειδικώς περιορίζεται στο διαμέρισμα πόρου και να απουσιάζει από acinar και ενδοκρινή κύτταρα, τα οποία αμφότερα χρωματίστηκαν για τους υποδοχείς των χημειοκινών CXCR4 και CXCR7 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η επώαση των παράλληλων τμημάτων με αντισώματα ελέγχου ισοτύπου confirmedspecificity (Εικ. 2Α). Εξετάσαμε την επόμενη έκφραση σε προ-κακοήθεις αλλοιώσεις του παγκρέατος, γνωστά ως παγκρέατος Intra-επιθηλιακών νεοπλασιών (PanINs) [48] – [51]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2C-D, CK19 + PanINsexpressed τόσο CXCR4 και CXCR7. Συγκριτικά, η μεταβλητή CXCL12 χρώση wasmore, με ανάμεικτα tomarkedly μειωμένη έκφραση σε PanINs σε σύγκριση με φυσιολογικά παγκρεατικό πόρο (Fig.2C-D). Σε μια περιορισμένη ανάλυση, θα μπορούσε να ανιχνευθεί καμία σημαντική διαφορά στην έκφραση CXCL12 μεταξύ PanIN1, PanIN2, και PanIN3 αλλοιώσεων.

Διαδοχικές τομές των φυσιολογικών και νοσούντων παγκρεατικού ιστού χρωματίστηκαν για CXCL12, CXCR4, CXCR7, και CK19. χρώση CXCL12 εμφανής στην κανονική αγωγούς εξωκρινών είχε μειωθεί σε PDAC ιστό. χρώση CXCR4 αυξήθηκαν σε PanIN και PDAC σε σχέση με το φυσιολογικό επιθήλιο του πόρου. έκφραση CXCR7 ήταν μεταβλητή σε φυσιολογικό επιθήλιο, PanIN αλλοιώσεις, και PDAC. (Α) Η κανονική ιστός από έναν ασθενή με υγιή πάγκρεας αντιπροσωπεύει παρατηρήσεις από 25 διαφορετικούς φυσιολογικούς ιστούς από 21 μεμονωμένους ασθενείς. (Β) PDAC ιστού από έναν ασθενή αντιπροσωπεύει παρατηρήσεις από 82 διαφορετικούς ιστούς από 29 διαφορετικούς ασθενείς. 1000 × μεγέθυνση αντιπροσωπεύει κουτί ένθετο σε 200 ×. (Γ) Η χρώση ποσοτικοποιήθηκε με τύφλωσε βαθμολόγηση των διαδοχικών τομών σε σχέση με χρώση CK19. (***) Δηλώνει

P

≤0.001.

Η

Εκπρόσωπος 200 × εικόνες του ίδιου (A) κανονικό ή (Β) παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) ιστοί εμφανίζονται στα 1000 × μεγέθυνση στην Εικόνα 1. Αντιπροσωπευτικές εικόνες σειριακό τμήμα του παγκρέατος εντερική νεοπλασία (PanIN) βλάβη στο (C) 200 × ή (Δ) 1000 × μεγέθυνση. Διαδοχικές τομές ιστού ανοσοχρώστηκαν με αντισώματα προς CK19, CXCL12, CXCR4 και CXCR7, ή τους ελέγχους ισοτύπου. n = 25 διαφορετικούς φυσιολογικούς ιστούς από 21 μεμονωμένους ασθενείς, 82 διαφορετικούς ιστούς από 29 διαφορετικές PDAC ασθενείς, ή 19 παθολογικά επιβεβαίωσε PanIN βλάβες.

Η

Ανάλυση του ιστού του όγκου PDAC revealeda περαιτέρω, και πιο έντονη, εξαφάνιση της CXCL12 στην CK-19 + καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 1Β, 2Β). Σε ετερογενή ιστό όγκου που περιέχει τόσο κακοήθεις και κανονικούς αδένες, χρώση CXCL12 ελαττώθηκε σε κακοήθη κύτταρα, butpreserved σε γειτονικό φυσιολογικό πόρου κυττάρων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ανάλυση των σειριακών ιστού sectionsrevealed ότι κακοήθη ιστό με χαμηλά επίπεδα CXCL12had μια αμοιβαία αύξηση του CXCR4, καθώς και CXCR7, χρώση (Εικ. 1Β, Εικ. 2Β). Ποσοτικοποίηση της ανοσοκηλιδώσεως ένταση CXCL12, CXCR4 και CXCR7 επιβεβαίωσε τη σημαντική μείωση της έκφρασης CXCL12 κατά τη διάρκεια progressionfrom φυσιολογικό να πρόδρομο PanIN σε κακοήθη παγκρεατικού ιστού (Εικ. 1Γ). Αντίθετα, η έκφραση CXCR4 ήταν αυξημένη στα PanINsand PDAC σε σύγκριση με φυσιολογικά αγωγούς (Σχ.1 Γ). Βαθμολόγησης της έκφρασης CXCR7 αποκάλυψε ένα διφασικό πρότυπο με χαμηλότερη έκφραση που συμβαίνουν στο στάδιο PanIN και υψηλότερη έκφραση επαναλαμβανόμενες σε PDAC (Σχ.1 Γ) .Όταν οι ασθενείς χωρίζονται σε ομάδες ανάλογα με το αν είχαν ή όχι λάβει νεο-επικουρική θεραπεία, οι ασθενείς που λαμβάνουν πρότυπο-of-care σχήματα γεμσιταβίνης ή θεραπείας FOLFIRINOX [52] – [54] είχε σημαντικά (

P

≤0.05) υψηλότερες βαθμολογίες για έκφραση CXCL12 (0,82 ± 0,18) σε σύγκριση με ασθενείς που δεν λάμβαναν εισαγωγική θεραπεία (0,43 ± 0,09)

έκφραση CXCL12 και επιγενετική ρύθμιση σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παγκρέατος

για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό των χημειοκινών -. έκφραση του υποδοχέα και να προσδιορίσει ένα κατάλληλο μοντέλο για τη μελέτη της λειτουργίας των CXCL12 στην PDAC, πρωτοβάθμια τον ασθενή προέρχονται και καθιερωμένες κυτταρικές σειρές καρκίνου του παγκρέατος αναλύθηκαν μέσω RT-PCR με τη χρήση προηγουμένως βελτιστοποιημένη σύνολα εκκινητών μας για CXCL12, CXCR4 και CXCR7 [24], [43]. RT-PCR έδειξε συνεπής έλλειψη CXCL12 μεταγραφή σε ασθενή που προέρχονται από πρωτογενή όσο και PANC1, MIAPaCa2, Capan2 και HPAFII κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3Α-Β). Σε συμφωνία με την ανοσοϊστοχημική ανάλυση, CXCR4 mRNA διατηρήθηκε σε 7of τις 8 κυτταρικές σειρές PDAC, ενώ η έκφραση CXCR7 ήταν πιο μεταβλητή (Σχήμα 3Α-Β). Η κυτταρομετρία ροής επιβεβαίωσε την κυτταρική επιφάνεια εντοπισμό των CXCR4 και CXCR7 στις αντιπροσωπευτικές κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 3C). Για να διαπιστωθεί αν η έλλειψη έκφρασης CXCL12 αντανακλάται επιγενετική αποσιώπηση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τιτλοδοτήθηκαν δόσεις του αναστολέα μεθυλοτρανσφεράσης DNA 5-αζα. Ο αναστολέας έσωσαν έκφραση CXCL12mRNA σε αντιπροσωπευτικές κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3D). Η θεραπεία με τον αναστολέα αποακετυλάσης ιστόνης τριχοστατίνη-Aalso αποκατασταθεί έκφραση του CXCL12 σε κύτταρα Capan2 (Σχ. 3Ε). Με βάση προκαταρκτικές έρευνες μας εξέταση των ειδικών μηχανισμών της υπερμεθυλίωσης CXCL12 υποκινητή του παχέος εντέρου και του μαστού [24], [25], τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι η έκφραση CXCL12 ρυθμίζεται μέσω επιγενετικών μηχανισμών στον καρκίνο του παγκρέατος, όπως well.Cumulatively, thesedata δείχνουν CXCL12 γονίδιο καταστολής στην ανθρώπινη tissueand μια μπαταρία των νέων και καθιερωμένων κυτταρική σειρά PDAC κυττάρων lines.The MIAPaCa2 ταυτοποιήθηκε ως ιδανικό μοντέλο, όπως CXCL12-CXCR4-CXCR7 μιμείται πρότυπο έκφρασης της που παρατηρείται σε κακοήθη ανθρώπινο ιστό PDAC.

RT- PCR ανάλυση απεκάλυψε ότι (Α) που λαμβάνονται από ασθενή με καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές (# 1, # 2, # 3, # 4) ή (Β) καθιερωμένες κυτταρικές σειρές δεν είχαν έκφραση του CXCL12 και διατηρείται έκφραση του CXCR4. CXCR7 mRNA ήταν παρόν σε 3 από 8 PDAC lines.Flow ανίχνευση με κυτταρομετρία (C) της επιφάνειας του CXCR4 ή έκφραση πρωτεΐνης CXCR7. Οι κυτταρικές σειρές treatedseven ημέρα με μια καμπύλη συγκέντρωσης (D) 5-αζα-2-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα) αποκατέστησε την έκφραση του CXCL12.Linestreated 4 ημέρες με μια καμπύλη συγκέντρωση του (Ε) Τριχοστατίνη Α (TSA) αποκατέστησε την έκφραση mRNA CXCL12 σε κύτταρα Capan2.

Η

CXCL12 επανέκφραση σε ανθρώπινα κύτταρα PDAC disruptedchemotaxis, αυξημένη συγκολλητική δυναμικό, και μειωμένη ηπατική μετάσταση

Η συμβατική παράδειγμα για τη μεσολάβηση χημειοκίνη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων είναι η έκφραση του CXCR4 είναι προ-μεταστατικό. Αυτό το μοντέλο απορρέει από την ικανότητα του εξωγενούς CXCL12 να διεγείρουν μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων

σε

vitro [13], [45], [55]. Όπως ήταν αναμενόμενο, η μέτρηση της φυσικής μετανάστευσης δυναμικό αρκετών CXCL12 με ανεπάρκεια του παγκρέατος κυτταρικές σειρές αποκάλυψαν ότι CXCR4-κύτταρα που εκφράζουν PDAC μεταναστεύουν προς την οξεία διέγερση CXCL12 (Σχ. 4Α). Είναι σημαντικό, PANC1 και MIAPaCa2 κύτταρα μετανάστευσαν προς CXCL12 στην εξαρτώμενη από διφασικό συγκέντρωση τρόπο που να συνάδει με την τρέχουσα κατανόηση των μεταναστευτικών χημειοτακτικών [55], [56]. Η HPAFII κυτταρική γραμμή η οποία έλειπε έκφραση επιφανείας είτε το CXCR4 ή CXCR7 δεν ήταν σε θέση να μεταναστεύσουν σε απόκριση σε θεραπεία CXCL12 (Σχ. 4Α). PANC1 cellsalso εισβάλει μια εξωκυτταρική μήτρα σε απόκριση σε οξεία εξωγενή διέγερση CXCL12 (Εικ. 4Β).

κύτταρα (Α) PANC1 και MIAPaCa2 μετανάστευσαν προς εξωγενή κλίσεις του CXCL12 σε ένα εύρος από 1 ηΜ έως 1000 ηΜ υπό ελεύθερο ορού δωρεάν συνθήκες (*), (**) και (***) σημαίνουν

P

≤0.05,

P

≤0.01, και

P

≤0.001, αντίστοιχα , σε σύγκριση με μη διεγερμένα κύτταρα (NS). Υποδοχέα-null κύτταρα HPAFII δεν μεταναστεύουν σε απάντηση CXCL12. (Β) CXCL12 κατευθύνει χημειοεισβολή κύτταρο PANC1 σε ένα τρισδιάστατο βύσμα Matrigel. Ο θετικός έλεγχος (+) ήταν 10% μέσο που περιέχει ορό. (*), (**) Και (***) σημαίνουν

P

≤0.05,

P

≤0.01, και

P

≤0.001, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (NS).

η

πιστεύουμε ότι η προ-μεταστατική απόκριση των κυττάρων PDAC οφείλεται στην αποσιώπηση της έκφρασης του CXCL12. Για να ελεγχθεί αυτό είχαν εισαχθεί έκφραση της χημειοκίνης, χρησιμοποιώντας το πλασμίδιο ενσωμάτωσης doublestable, σε κύτταρα MIAPaCa2. Τα κύτταρα πρώτα σταθερά διαμολυσμένα με πυγολαμπίδας-λουσιφεράσης και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με επιπλέον γονίδια χρησιμοποιώντας ένα δεύτερο επιλογή reagent.Several CXCL12-κλώνους έκφρασης παράχθηκαν μαζί με ένα κλώνο ελέγχου επιμολυσμένα με eGFP, το καθένα εμφανίζει επίπεδα ισοδύναμα δραστικότητας λουσιφεράσης (Σχ.5-Β ). Σημαντικά, έλλειψη παραγωγής χημειοκίνης ήταν επιβεβαιώνεται από ELISA σε PANC1, MIAPaCa2, Capan2, και HPAFII κυτταρικές σειρές (Σχ. 5C). Λειτουργική παραγωγή χημειοκίνης σε κλώνους CXCL12-εκφράζουν σε σύγκριση με κλώνους που εκφράζουν GFP-να κύτταρα MIAPaCa2 ελέγχθηκε με ELISA andtranswell μετανάστευση των κυττάρων U937 (Σχήμα 5C-D) κύτταρα που εκκρίνουν .MiaPaCa2 CXCL12demonstrated μια σημαντική μείωση της μεταναστευτικής απόκρισης προς ΤΟΡ-βor CXCL12 , και τα δύο γνωστά οδηγούς

in vitro

PDAC μετανάστευση κυττάρων (Fig.6A-D). Δεδομένης της σημασίας της κόλλας δυναμικού στις μεταστατικό ικανότητες των καρκινικών κυττάρων, προσκόλληση κυττάρων δίπλα μετρηθεί. CXCL12 θετικών κυττάρων ήταν σημαντικά πιο προσκολλημένη στην καλλιέργεια ιστού plasticcompared να χημειοκινικούς null κύτταρα (Σχ. 6Ε). Αυτά

in vitro

δεδομένα δείχνουν ότι η συνολική κακοήθους δυναμικού των παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, τόσο στην ικανότητα αυτών των κυττάρων να μεταναστεύουν και να αποφύγει την προσκόλληση υπόστρωμα, μειώνεται ακόλουθη επαναφορά της μεταγραφής CXCL12 εντός PDAC κύτταρα.

επίπεδα λουσιφεράσης σε GFP ελέγχου ή τρία διαφορετικά (31, # 2, # 3) CXCL12-εκφράζουν MIAPaCa2 κλώνους όπως μετράται με φασματοφωτόμετρο (Α) ή IVIS-100 βιοφωτονικές απεικονιστή (Β). Επίπεδα CXCL12 μετρήθηκαν με ELISA (Γ) σε καθιερωμένες κυτταρικές σειρές PDAC καθώς GFP- και CXCL12-κλώνους έκφρασης MIAPaCa2-λουσιφεράσης. (D) CXCL12-εκκρίνεται από επιμολυσμένων κλώνων MIAPaCa2-λουσιφεράσης # 1 και # 2 που διεγείρεται U937 χημειοταξία. Τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με αντίσωμα εξουδετέρωσης σε CXCL12 (αL12) επιβεβαίωσε την ειδικότητα του U937 χημειοταξία. Οι τιμές σε Α, C, και D είναι μέσες ± SEM, η = 2-3.

Η

(Α) δοκιμασίες μετανάστευσης Transwell αποκάλυψε σημαντικά μειωμένη χημειοταξία των κλώνων CXCL12-εκφράζουν (# 1 και # 2) σε σύγκριση με κύτταρα null συνδέτη (GFP). Προσελκυστικά ήταν μέσα άνευ ορού (-), 10% ορό (+), ή 10 ηΜ CXCL12 (L12) σε μέσα ελεύθερα ορού. υποδηλώνουν

P

≤0.01 και

P

≤0.001, αντίστοιχα, σε σύγκριση με 10 nM κύτταρα GFP CXCL12-διεγείρονται, n = 5. (Β) CXCL12 επανέκφραση μειώθηκε TGF-β (5 ng /mL) επαγόμενη χημειοταξία σε σχέση με τα CXCL12-null κύτταρα. (##) Δηλώνει

P

≤0.01 σύγκριση με τα κύτταρα GFP ΤΟΡ-β που διεγείρεται, η = 4. (C) & amp? (D) Αντιπροσωπευτικές εικόνες των πειραμάτων στο (Α) και (Β) αντίστοιχα. (Ε) κύτταρα CXCL12 εκφράζουν ήταν σημαντικά πιο προσκολλημένη στο πλαστικό καλλιέργειας ιστού σε σύγκριση με CXCL12-null κύτταρα. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα = (-), το αντίσωμα εξουδετέρωσης για δραστικότητα CXCL12 = (αL12), και ένα θετικό έλεγχο = 1 ng /mL EGF (+). (##) Δηλώνει

P

≤0.01 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου διεγείρεται από τον ορό 10%. (*), (**) Και (***) σημαίνουν

P

≤0.05,

P

≤0.01 και

P

≤0.001, αντίστοιχα, σε σύγκριση με μη διεγερμένα κύτταρα GFP, n = 7.

η

Είμαστε δίπλα φρόντισε να διαπιστώσει αν η ταυτόχρονη αύξηση της κόλλας και μειώθηκε migratoryphenotypes στα κύτταρα PDAC θα suppressmetastatic εξαπλωθεί

in vivo

usinga μοντέλο ποντικού ετεροτοπική ξένου μοσχεύματος. CXCL12 που εκφράζουν και CXCL12-ηυΙΙ κύτταρα εγχύθηκαν εντός του σπλήνα των ποντικών SCID. Πάνω από 28 ημέρες,

in vivo

εντοπισμό των κυττάρων έδειξε ότι, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, υπήρξε μια σημαντική μεταβολή στην ικανότητα των CXCL12-κυττάρων που εκφράζουν MIAPaCa2 για τη διάδοση μακριά από την αρχική θέση του εμβολιασμού (Σχήμα 7Α -ΣΙ).

Ex vivo

η ανάλυση έδειξε ότι η φωταύγεια στη θέση της σπληνικής εμβολιασμού ήταν αμετάβλητη, ενώ τα ποντίκια που ενέθηκαν με PDAC που παράγουν CXCL12had σημαντικά χαμηλότερο φορτίο ηπατικού όγκου από ποντικούς που έλαβαν ένεση με κύτταρα GFP-ελέγχου (Fig.7C-Ε). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι CXCL12 αλλοιώνει συγκεκριμένα την ικανότητα των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος στο σπίτι στο ήπαρ, ένα όργανο με υψηλή έκφραση του CXCL12 και κοινή μεταστατική προορισμό PDAC ασθενών.

(Α) Εκπρόσωπος εικόνες βιοφωτισμός των ποντικών ξενομοσχευθέντος με GFP- ή CXCL12-εκφράζοντα κύτταρα σε εμφύτευση (Ημέρα 0) ή τελικό σημείο της μελέτης (Ημέρα 28). (Β) σε ολόκληρο το σώμα

in vivo

λάμψη πάροδο του χρόνου της GFP- και CXCL12-ποντίκια. (C)

Ex vivo

λάμψη του αποκόπηκε σπλήνα (C), αντανακλώντας καρκινικά κύτταρα στο σημείο της ένεσης, ή του μεταστατικού προορισμού (D), αντανακλώντας μειωμένη ηπατική μετάσταση των κυττάρων CXCL12 που εκφράζουν GFP σε σχέση με τα κύτταρα . (**) Δηλώνει

P

≤0.01, n = 4-5. (Ε) Εκπρόσωπος H & amp?. Ε εικόνες που δείχνουν έντονη μάζας του όγκου στο ήπαρ του ελέγχου (GFP), σε σχέση με το πειραματικό (CXCL12) ξενομοσχεύτηκε ποντίκια

Η

Η ταυτόχρονη CXCL12, έκφραση CXCR4 και CXCR7 μειωμένο όγκο του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και η μετάσταση και παρατεταμένη επιβίωση σε προκλινικό PDAC μοντέλο

Προηγουμένως, είχαμε παρατηρήσει ότι εκ νέου έκφραση του CXCL12 σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα να οδηγήσει σε αυξημένη anoikis, αποκόλληση βάση απόπτωση [24], [43]. Δοκιμάσαμε το αν εκ νέου εισαγωγή του CXCL12 σε PDAC κύτταρα θα αλλάξουν αποπτωτικών ή πολλαπλασιαστικών δυνατότητες. Σε συνθήκες άνευ ορού, μια αύξηση στην απόπτωση ανιχνεύθηκε σε προσκολλημένα CXCL12-εκφράζοντα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος σε σύγκριση με τους μάρτυρες που εκφράζουν GFP, αν και αυτή η απόκριση ήταν εξασθενημένος με την προσθήκη ορού (Εικ. 8Α-Β). Χρησιμοποιώντας ένα καθιερωμένο μοντέλο για τη μελέτη αποκόλληση επαγόμενη απόπτωση, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με πολυ-ΗΕΜΑ [43]. Όπως και με προσκολλημένα κύτταρα, η απόπτωση αυξήθηκε σε μη-προσκολλημένα κύτταρα PDAC CXCL12-θετικά σύγκριση με τους ελέγχους, αλλά και πάλι η προσθήκη του ορού προκάλεσε καμία μεταβολή στην απόπτωση (Fig.8C-D). Ο αριθμός των κυττάρων παρέμεινε αμετάβλητη μεταξύ μη προσκολλημένα CXCL12-θετικών και αρνητικών κυτταρικών πληθυσμών (Σχ. 8C-D).

αξιολογήθηκαν Απόπτωση του GFP και CXCL12-κυττάρων που εκφράζουν MIAPaCa2 χρησιμοποιώντας κασπάσης 3/7 Glo assay.Cells στερήθηκαν για 24 ώρες και καλλιεργήθηκαν σε 0% ορό (A, C) ή 1% ορό (Β, D) μέσο που περιέχει. (Α-Β) Απόπτωση σε προσκολλητικά κύτταρα που εκφράζουν CXCL12-ανυψώθηκε σε σύγκριση με είτε GFP-κλώνους έκφρασης σε συνθήκες χωρίς ορό, χωρίς αλλαγή φαίνεται στο 1% ορό. GFP-κύτταρα werestimulated με 100 μΜ gemcitabine ως έλεγχος. (C-D) Για τη μέτρηση του αριθμού των κυττάρων και αποκόλληση με βάση την απόπτωση των κυττάρων σε εναιώρημα, MIAPaCa2-λουσιφεράσης κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί πολυ-ΗΕΜΑ. Χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Viacount και ρέουν καταμέτρηση κυτταρομετρίας κύτταρο, δεν υπήρχε διαφορά στον αριθμό των κυττάρων ζωντανών παρατηρούνται σε μη-προσκολλημένα CXCL12-null (GFP) ή κυττάρων που εκφράζουν όταν καλλιεργούνται είτε σε 0% (C) ή 1% ορό (D). Η απόπτωση των καλλιεργημένων κυττάρων πολυ-HEMA αποκάλυψε μια σε αύξηση των δραστική κασπάση-3/7 περιορίζεται σε κύτταρα καλλιεργημένα σε συνθήκες άνευ ορού μόνο (C) χωρίς να παρατηρηθεί σε 1% ορό (D) αλλαγή. Γεμσιταβίνη (GEM) χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας για την μείωση του αριθμού των κυττάρων και αυξημένη απόπτωση. (*), (**) Και (***) σημαίνουν

P

≤0.05,

P

≤0.01, και

P

≤0.001 αντίστοιχα σε σύγκριση με κύτταρα μάρτυρες (GFP). Οι τιμές είναι μέση τιμή ± SEM, n = 4-5.

Η

Με δεδομένη την ελάχιστη αλλαγή στην anoikis ευαισθησία σε CXCL12-κύτταρα που εκφράζουν PDAC σε συνθήκες ορό που περιέχει, μπορούμε επόμενο δοκιμαστεί τις δυνατότητες ανάπτυξής τους. Σε έντονη αντίθεση με τα δεδομένα μας σε ανθρώπινο ορθοκολικό ή του μαστού [24] – [26], [43], η αύξηση του πληθυσμού του CXCL12 που εκφράζουν PDAC ήταν σημαντικά μειωμένη σε σχέση με κύτταρα με ανεπαρκές χημειοκίνη (Εικ.9). Βραδύτερη ανάπτυξη των κυττάρων που εκφράζουν CXCL12-παρατηρήθηκε τόσο σε συνθήκες που περιέχουν ορό χωρίς ορό και (9Α-Β).