Αφηρημένο

Αυτή η μελέτη έγινε για να αποκρυπτογραφήσει τα αλληλοεξαρτώμενα ρόλους (i) μεθυλίωση εντός θέση πρόσδεσης Ε2 Ι και ΙΙ (E2BS-I /II) και αντιγραφής (nt 7862) σε μακροπρόθεσμη περιοχή ελέγχου (LCR), (ii) την έκφραση του ιικού ογκογονιδίου

Ε7

, (iii) την έκφραση του προϊόντος μετεγγραφής (

Ε7-E1∧E4)

που κωδικοποιεί πρωτεΐνη καταστολέα Ε2 και (iv) το ιικό φορτίο , στο ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων 16 (HPV16) που σχετίζονται με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας (CaCx) παθογένεια. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν υπερ-εκπροσώπηση (p . (D) ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης των προϊόντων PCR του

ΤΡ53

cDNA (εκκινητές εκτείνονται ιντρόνια). Λωρίδα 1-6, 8, 9: cDNA δείγμα δεν δείχνει συγκεκριμένο μέγεθος μπάντα των 448 bp? Οι διαδρομές 1, 2, 4, 6 και 9 δείχνουν καθαρά ολοκληρωμένη δείγματα T326, T327, T345, T344 και T328, αντίστοιχα, ενώ, λωρίδες 3, 5 και 8 δείχνουν επισωμικά (καθαρό ή ταυτόχρονη) δείγματα T329, T323 και T339, αντίστοιχα? Λωρίδα 10: CaSki κυτταρική σειρά DNA (θετικός έλεγχος)? Λωρίδα 11: DNA δείγματος (θετικός έλεγχος)? Λωρίδα 12: νερό (αρνητικός έλεγχος)? Διαδρομή 7:;.

Hae

III πέψη X174 δείκτη DNA (Promega)

Η

Σύμφωνα με APOT συζευγμένου-ποσοτική-RT-PCR δοκιμασία, η γονιδιωματική κατάσταση του HPV 16 θα μπορούσε επίσης να να ερμηνευθεί με βάση την αναλογία,

Ε7

C

Τ /

Ε4

C

T. Τα δείγματα CaCx (19/41) δείχνει

Ε7

και

ACTB

έκφραση, αλλά όχι

Ε4

έκφρασης (

Ε7

C

Τ /

Ε4

C

T = απροσδιόριστο), χαρακτηρίστηκαν ως υποθέσεις με ενσωματωμένο ιικών γονιδιωμάτων. δείγματα CaCx (18/41) παρουσίαση περισσότερων έκφραση

Ε7

από

Ε4

(

Ε7

C

Τ /

Ε4

C

T≤1) μαζί με το

ACTB

έκφρασης, θεωρήθηκαν ως περιπτώσεις που απεικονίζει την παρουσία της τόσο επισωματικά και ολοκληρωμένα γονιδιώματα ιών (ταυτόχρονη). Υπήρχαν τέσσερις περιπτώσεις CaCx δείχνει παρόμοια επίπεδα έκφρασης των δύο

Ε7

και

Ε4

(

Ε7

C

Τ /

Ε4

C

T = 1) μαζί με το

ACTB

έκφρασης, και αυτά θεωρούνται ως δείγματα υπόθαλψη ιικών γονιδιωμάτων επισωματική. Δεν υπήρχε σημαντική (ρ = 0,186? t-test) διαφορά σε

ACTB

έκφραση mRNA μεταξύ των περιπτώσεων CaCx φιλοξενούν ιικά γονιδιώματα επισωματικό (καθαρό και ταυτόχρονη) με μέση τιμή ± SD = 32,98 ± 3,99 και καθαρά ολοκληρωμένη ιικών γονιδιωμάτων με μέση τιμή ± SD = 34.99 ± 3.26. Έτσι, 53.66% (22/41) των περιπτώσεων CaCx harbored ανέπαφη ιικά γονιδιώματα των οποίων, 18,18% (4/22) είχαν καθαρή γονιδιώματα επισωμικό και 81,82% (18/22) είχαν ταυτόχρονη γονιδιώματα (Πίνακας 1).

Reanalysis των δεδομένων μας για E2BSI μεθυλίωση στο nt 58 στην LCR σε αυτό το υποσύνολο των δειγμάτων, αποκάλυψε επίσης ότι η εν λόγω μεθυλίωση ήταν σημαντικά (p

τάση = 0,001) υψηλότερη μεταξύ των περιπτώσεων που απεικονίζουν επισωμικό (καθαρό και ταυτόχρονη) ιικά γονιδιώματα (17/22? 77,27%) σε σύγκριση με εκείνους με καθαρά ολοκληρωμένη ιικών γονιδιωμάτων (5/19? 26,32%).

Ανάλυση της έκφρασης του

Ε7

και

Ε2

γονιδίων σε περιπτώσεις CaCx υπόθαλψη επισωμικό (καθαρό και ταυτόχρονη) ή αμιγώς ολοκληρωμένη γονιδιώματα HPV 16 και συσχέτιση με ιικό φορτίο

επόμενος στόχος μας ήταν να διερευνηθεί εάν τα δύο είδη καρκίνων, (i) εκείνες που φιλοξενούν επισωματικό ( καθαρό και ταυτόχρονη) και (ii) την ολοκληρωμένη ιογενή μορφές, διέφεραν στην ιική ογκογόνο έκφραση, αναλύοντας

Ε7

mRNAs. Ποσοτικοποιήσαμε

Ε7

έκφρασης (κανονικοποιούνται

ACTB

) με TaqMan με βάση qRT-PCR των προϊόντων cDNA που δημιουργήθηκε απευθείας από το mRNA, σε ένα υποσύνολο 17 επισωματική (καθαρώς επισωμικό και ταυτόχρονη) και 13 καθαρά ολοκληρωμένη περιπτώσεις.

Ε7

έκφραση του mRNA (

Ε7

C

Τ /

ACTB

C

T) βρέθηκε να να διανέμονται κανονικά τόσο επισωμικό (Kolmogorov-Smirnov τιμή Ζ = 0,418, p = 0,995) και να ενσωματωθεί (Kolmogorov-Smirnov τιμή Ζ = 1,06, p = 0,211) περιπτώσεις. Ο λόγος,

Ε7

C

Τ /

ACTB

C

T, ήταν σημαντικά χαμηλότερη (p & lt? 0,001? T-test) μεταξύ επισωματικό (μέση τιμή ± SD = 0,84 ± 0,15) σε σχέση με την ολοκληρωμένη (μέση τιμή ± SD = 1,12 ± 0,18) περιπτώσεις δείχνουν υψηλότερες

Ε7

έκφρασης στην πρώην.

Σχετική ποσοτικοποίηση με βάση το συγκριτικό C

μέθοδο Τ αποκάλυψε επίσης τη σημαντική διαφορά (p & lt? 0,001? Mann-Whitney U test) μεταξύ ΔΟ

Τ (

Ε7

C

T –

ACTB

C

T) τιμές των περιπτώσεων με ενσωματωμένο ιικό γονιδιώματα (διάμεση τιμή ΔΟ

T = 1,26) και με γονιδιώματα επισωματική (διάμεση τιμή ΔΟ

T = -4,97). Η ανάλυση πολλαπλής μεταβολής (χρησιμοποιώντας 2

-ΔΔCT, όπου ΔΔC

= διάμεσος

Τ επισωμικού ΔΟ Τ – μεσαίο ΔΟ

T ολοκληρωμένων), που απεικονίζεται που

Ε7

έκφρασης σε περιπτώσεις με επισωμικό (καθαρό και ταυτόχρονη) ιικών γονιδιωμάτων ήταν 75.087 πτυχώσεις υψηλότερη από τις περιπτώσεις με καθαρά ολοκληρωμένη ιικών γονιδιωμάτων

Viral αριθμό αντιγράφων (φυσικό log μεταμορφωθεί) ανά 100 ng γονιδιακού DNA ήταν επίσης σημαντικά υψηλότερη (p & lt?. 0.001 ? Mann-Whitney U test) μεταξύ των 17 περιπτώσεων επισωματικό (διάμεση ln (ιικό φορτίο) = 18,02 ανά 100 ng DNA) σε σύγκριση με τα 13 καθαρά ενσωματωθεί περιπτώσεις (διάμεσος ln (ιικό φορτίο) = 9,28 ανά 100 ng DNA). Ο λόγος,

Ε7

C

Τ /

ACTB

C

T, βρέθηκε να συσχετίζεται σημαντικά με το ιικό φορτίο (p = 0,007? R

2 = 0,398) εντός των δειγμάτων επισωματικό (καθαρό και ταυτόχρονη) (Σχήμα 3Α), αλλά όχι μέσα στα καθαρά ολοκληρωμένων δείγματα (ρ = 0,51?. R

2 = 0.038) (Σχήμα 3Β)

(Α) συσχέτιση του

Ε7

C

Τ /

ACTB

C

T με ιικό φορτίο (τιμές φυσικού log) σε περιπτώσεις CaCx με επισωματική (καθαρά επισωμικά και ταυτόχρονη) ιικών γονιδιωμάτων? (Β) Συσχέτιση του

Ε7

C

Τ /

ACTB

C

T με ιικό φορτίο (τιμές φυσικού log) σε περιπτώσεις CaCx με ενσωματωμένη ιικών γονιδιωμάτων? (Γ) τη σχέση του

Ε2

C

Τ /

ACTB

C

T με ιικό φορτίο (τιμές φυσικού log) σε σχέση με το

Ε2

γονιδίου σε περιπτώσεις CaCx με επισωματική (καθαρά επισωμικά και ταυτόχρονη) ιικών γονιδιωμάτων.

Η

Η επισωμικό (καθαρό και ταυτόχρονη) περιπτώσεις έδειξαν ταυτόχρονη έκφραση

Ε2

mRNA (μέση τιμή (

Ε2

C

Τ /

ACTB

C

T) ± sd = 0,92 ± 0,18), ενώ τα καθαρά ολοκληρωμένη περιπτώσεις παρέλειψε να το πράξει. Ο λόγος,

Ε2

C

Τ /

ACTB

C

T, βρέθηκε να συσχετίζεται σημαντικά (p & lt? 0.001? R

2 = 0,621) (Εικόνα 3C) με

Ε2

αριθμούς αντιγράφου γονιδίου (διάμεση ln (

Ε2

φορτίο) = 15.41 ανά 100 ng DNA) μεταξύ τέτοιες περιπτώσεις υπόθαλψη επισωμικό (καθαρό και ταυτόχρονη) ιικών γονιδιωμάτων.

κοινή ανάλυση των

Ε7

C

τιμές Τ από APOT συζευγμένου-ποσοτική-RT-PCR δοκιμασία και το ιικό φορτίο μεταξύ των δειγμάτων CaCx απεικονίζει καθαρά την ολοκληρωμένη γονιδιώματα HPV16 απασχολούν

k

-means ομαδοποίηση

Η έλλειψη συσχετισμού των

Ε7

έκφρασης με το ιικό φορτίο, μεταξύ των περιπτώσεων CaCx με ενσωματωμένο ιικών γονιδιωμάτων, επισήμανε προς τη δυνατότητα της ύπαρξης της ετερογένειας μεταξύ τέτοιες περιπτώσεις CaCx σε σχέση με το

Ε7

έκφρασης. Έτσι αναλυθούν περαιτέρω τα δεδομένα μας, εκτελώντας μια ανάλυση διασποράς (

k

-means clustering) με βάση ιικό φορτίο και

Ε7

C

T (APOT-σε συνδυασμό-ποσοτική-RT-PCR ). Μια τέτοια ανάλυση θα μπορούσε βέλτιστα ταξινομήσει τις περιπτώσεις με διαταραχές ιικών γονιδιωμάτων (46.34%? 19/41) σε τέσσερις συστάδες (Σχήμα 4) όπως απεικονίζεται στον Πίνακα 2. Οι αντίστοιχες συμπλέγματος κέντρα έχουν παρουσιάζονται στον Πίνακα 3. Το

ACTB

έκφραση mRNA από αυτές τις περιπτώσεις δεν συσχετίζεται με είτε του ιικού φορτίου τους (ρ = 0.588? γραμμική παλινδρόμηση), ή

Ε7

C

τιμές Τ (APOT-συζευγμένο-ποσοτικής-RT-PCR) (p = 0,753? γραμμική παλινδρόμηση)

Cluster 1:. χαμηλό ιικό φορτίο και χαμηλή

Ε7

έκφραση? Cluster 2: υψηλό ιικό φορτίο και χαμηλή

Ε7

έκφραση? Cluster 3: μέτρια ιικό φορτίο και μέτρια

Ε7

έκφραση? Cluster 4:. Χαμηλή έως μέτρια ιικό φορτίο και υψηλή

Ε7

έκφραση

Η

Η

Από αυτές τις τέσσερις ομάδες, Ομάδα 1 (μέση ιικό φορτίο ± sd = 6,87 ± 1.074? μέσος

Ε7

C

T ± sd = 37.91 ± 1.416) συμπεριλαμβάνονται 6 δείγματα (31,60% των αμιγώς ολοκληρωμένη δείγματα). Συνολικά, αυτά είχαν χαμηλό ιικό φορτίο και χαμηλή

Ε7

έκφρασης. Cluster 2 (μέση ιικό φορτίο ± sd = 17.01 ± 1.447? Μέσος

Ε7

C

T ± sd = 36.38 ± 1.948) περιλαμβάνονται επίσης 6 δείγματα (31,60% των αμιγώς ολοκληρωμένη δείγματα), η οποία είχε υψηλό ιικό φορτίο και χαμηλή

Ε7

έκφρασης. Μεταξύ αυτών των δειγμάτων,

ACTB

μεταγραφής (με την ίδια ποσότητα του cDNA που χρησιμοποιήθηκε στο APOT-συζευγμένη-ποσοτικής-RT-PCR ανάλυση για

Ε7

και

Ε4

) δεν συσχετίζονται με ιικό φορτίο (p = 0.942? γραμμική παλινδρόμηση). Cluster 3 (μέση ιικό φορτίο ± sd = 14.72 ± 3.359? Μέσος

Ε7

C

T ± sd = 12,47 ± 2.128) περιλαμβάνονται 5 δείγματα (26,32% των αμιγώς ολοκληρωμένη δείγματα) και αυτά απεικονίζονται μέτρια ιικό φορτίο και μέτρια

Ε7

έκφρασης. Cluster 4 (μέση ιικό φορτίο ± sd = 9.36 ± 2.694? Μέσος

Ε7

C

T ± sd = 2.41 ± 0.467) περιλαμβάνονται 2 δείγματα (10,56% των αμιγώς ολοκληρωμένη δείγματα), η οποία αποκάλυψε χαμηλή έως μέτρια ιικό φορτίο και πολύ υψηλό

Ε7

έκφρασης. Οι αποστάσεις των δειγμάτων από τα κέντρα των αντίστοιχων σχηματισμών τους παρέχονται στον Πίνακα 2. Έτσι από τις τέσσερις ομάδες, δύο βρέθηκαν να χαρακτηρίζεται από μέτρια έως υψηλή

Ε7

έκφραση και τα υπόλοιπα δύο απεικονίζεται χαμηλή