Αφηρημένο

ακτινοβολίας βαρέων ιόντων προκαλεί μια υψηλότερη συχνότητα θραύσεων διπλής έλικας DNA (DSBs), το οποίο πρέπει να επισκευαστεί σωστά. Κρίσιμη βράχυνση των τελομερών μπορεί να προκαλέσει αντιδράσεις βλάβες στο DNA, όπως DSBs. Τα τελομερή είναι πολύ ευαίσθητα σε οξειδωτικό στρες, όπως η ιοντίζουσα ακτινοβολία. Η καταλυτική υπομονάδα DNA εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση (DNA-PKcs) είναι το κεντρικό συστατικό στην μη-ομόλογη άκρο σύνδεσης (NHEJ) επισκευή συγκρότημα και συμμετέχει στη συντήρηση των τελομερών. Ως εκ τούτου, αναμένεται να ενισχύσει την επίδραση θανάτωσης κυττάρων της ακτινοβολίας βαρέων ιόντων μέσω αναστολής DNA-PKcs. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, κυτταρική ραδιοευαισθησία μετρήθηκε με την κλωνική γενετική δοκιμασία. DNA αποκατάστασης των ζημιών ήταν σχετικά ποσοτικά με μακρά PCR. Η απόπτωση προσδιορίστηκε ποσοτικά με ανάλυση κυτταρομετρικής ροής της αννεξίνης V /διπλή χρώση ΡΙ, και γήρανση αναλύθηκε με δραστικότητα γαλακτοσιδάσης. το μήκος των τελομερών ήταν ημι-ποσοτικά με PCR πραγματικού χρόνου. Ρ53 και ρ21 έκφραση προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι MCF-7 και HeLa κυττάρων με αναστολή DNA-PKcs ήταν πιο ευαίσθητα σε ακτινοβολία άνθρακα ιόντων από εκείνους χωρίς αναστολή DNA-PKcs. Ακόμα κι αν NHEJ ανεστάλη από τον συγκεκριμένο αναστολέα DNA-PKcs, NU7026, οι περισσότερες βλάβες στο DNA που προκαλείται από την ακτινοβολία του άνθρακα-ion επισκευάστηκε μέσα σε 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση και στις δύο κυτταρικές σειρές. Ωστόσο, οι δυνατότητες επισκευής θανατηφόρα βλάβη (PLDR) δεν θα μπορούσε να αποκαταστήσει την κυτταρική αδρανοποίηση στο DNA-PKcs ανέστειλε κύτταρα. MCF-7 κύτταρα έδειξαν εκτεταμένη γήρανση και επιταχυνόμενη μείωση του μήκους των τελομερών, ενώ τα κύτταρα HeLa υπέστησαν σημαντική απόπτωση μετά από ακτινοβόληση με NU7026 επώασης. Επιπλέον, και οι δύο κυτταρικές γραμμές με μικρότερους των τελομερών ήταν πιο ευαίσθητα στην ακτινοβολία άνθρακα-ιόντων. τρέχοντα δεδομένα μας πρότειναν ότι η αναστολή DNA-PKcs θα μπορούσαν να ενισχύσουν την κυτταρική ευαισθησία στην ακτινοβολία άνθρακα ιόντων μέσω διατάραξη λειτουργικό ρόλο της στον άκρο τελομερούς προστασίας. Ο συνδυασμός της αναστολής DNA-PKcs και ακτινοβολία άνθρακα-ιόντων μπορεί να είναι μια αποτελεσματική μέθοδος θεραπείας βαρέων ιόντων

Παράθεση:. Zhou Χ, Ζανγκ Χ, Xie Υ, Tanaka Κ, Wang Β, Zhang Η (2013 ) DNA-PKcs Αναστολή ευαισθητοποιεί καρκινικά κύτταρα σε Carbon-Ion ακτινοβολία μέσω τελομερούς Καθορισμός ανώτατου ορίου Η διακοπή. PLoS ONE 8 (8): e72641. doi: 10.1371 /journal.pone.0072641

Επιμέλεια: Xin Yuan-Γκουάν, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 14 Απρίλη, 2013? Αποδεκτές: 11 Ιουλ του 2013? Δημοσιεύθηκε: 27 Αυγούστου 2013

Copyright: © 2013 Zhou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Πρόγραμμα βασικής Έρευνας της Κίνας (2010CB834202), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (10835011), και οι επιστημονικές Τεχνολογίας Ερευνητικά Έργα της επαρχίας Gansu (0702NKDA045, 0806RJYA020) και HIMAC 11J364 σχέδιο το οποίο υποστηρίζεται από την Εθνική Ινστιτούτο ραδιολογικής Επιστημών. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα τελομερή είναι εξειδικευμένες δομές DNA-πρωτεΐνης που καπάκι τα άκρα των χρωμοσωμάτων. Περίπου το 90% των καρκινικών κυττάρων περιέχουν σύντομες τελομερή, αλλά επιδεικνύουν υψηλή δραστικότητα τελομεράσης. Καθώς τα καρκινικά κύτταρα διαιρούνται πιο συχνά, διαθέτουν, κατά μέσο όρο, μικρότερο τελομερή από τα φυσιολογικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, χωρίς την κατάλληλη λειτουργία της τελομεράσης για να διατηρήσει το μήκος των τελομερών, τελομερή στα κύτταρα του καρκίνου μπορεί να μειώσει με ταχύτερο ρυθμό από ό, τι τα φυσιολογικά κύτταρα. Κρίσιμα σύντομη τελομερή μπορεί να οδηγήσει σε χρωμόσωμα εκτροπές [1] και επάγουν την απόκριση βλάβη του DNA (DDR) [2]. Έτσι, το μήκος των τελομερών μπορεί να είναι ένας σημαντικός παράγοντας για τον καρκίνο των κυττάρων αδρανοποίηση.

Τα τελομερή παίζουν σημαντικό ρόλο στη κυτταρικές αποκρίσεις σε παράγοντες που βλάπτουν το DNA, όπως ιονίζουσα ακτινοβολία (IR) [3]. Πολλές γραμμές αποδείξεως έχουν προτείνει ότι η συντήρηση των τελομερών σχετίζεται με ραδιοευαισθησία. Για παράδειγμα, τόσο η ακτινοευαίσθητα ΑΤ κύτταρα και κύτταρα ABS έδειξαν αριθμός των ελαττωμάτων των τελομερών που σχετίζονται και ραδιοευαισθησία πρωτεΐνη που σχετίζεται με τους είναι παρούσα σε τελομερή [4] – [7]. Διπλό διαλείμματα σκέλος για τα τελομερή πρέπει να είναι κατάλληλα επεξεργασία από τελομεράσης με τη βοήθεια των πρωτεϊνών δέσμευσης των τελομερών. Αν όχι, τα διαλείμματα για τελομερή θα μπορούσε να ξεκινήσει η αποδόμηση ή /και χρωμοσωμικές αναδιατάξεις, DDR και τελικά να οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο [8].

Υψηλή LET ακτινοβολία μπορεί να προκαλέσει μεγαλύτερη και πιο σύνθετη βλάβη του DNA από χαμηλή ακτινοβολία LET. Χαμηλή LET ακτινοβολία παράγει κυρίως μονής αλυσίδας (SSB,), ενώ ακτινοβολία υψηλής LET παράγει κατά κύριο λόγο ϋδΒδ και συγκεντρωμένα ζημιές, οι οποίες αντιπροσωπεύουν μια επικίνδυνη μορφή της βλάβης. Εάν δεν είναι σωστά επιδιορθωθεί, DSBs προκαλέσει γενετικές αλλαγές και /ή κυτταρικό θάνατο. Οι διαφορική αποκρίσεις των κυττάρων μετά από έκθεση σε ακτινοβολία σε διαφορετικές τιμές LET μπορεί να αντιστοιχεί με το γεγονός ότι η φύση της βλάβης του DNA είναι διαφορετική. Υπάρχουν αναφορές που δείχνουν ότι η δομή των τελομερών είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα σε οξειδωτικό στρες [9]. Ως εκ τούτου, η ακτινοβολία υψηλής LET μπορεί να προκαλέσει πιο σοβαρή βλάβη στα τελομερή από χαμηλή ακτινοβολία LET. Δεδομένου ότι τα περισσότερα καρκινικά κύτταρα φιλοξενούν μικρότερη τελομερή από τα φυσιολογικά κύτταρα, τα τελομερή στα καρκινικά κύτταρα μπορεί να είναι πιο πιθανό να μειωθεί σε ένα κρίσιμο μήκος με την αναστολή της τελομεράσης. Ως εκ τούτου, η υπόθεση ότι η κυτταρική θανάτωση επίδραση της ακτινοβολίας βαρέων ιόντων θα μπορούσε να ενισχυθεί με την παρεμβολή που οφείλεται στην επιμήκυνση των τελομερών σε καρκινικά κύτταρα.

Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι η ραδιοευαισθησία των MCF-7 και κύτταρα HeLa ήταν ενισχυθεί σε μεγάλο βαθμό με NU7026, ένας ειδικός αναστολέας DNA-PKcs, μετά την ακτινοβολία του άνθρακα-ιόντων. Περαιτέρω έρευνες έδειξαν ότι με μία περιορισμένη επίδραση στην ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA, MCF-7 κύτταρα σε επεξεργασία με NU7026 έδειξαν επιταχυνόμενη απώλεια των τελομερών μετά την ακτινοβόληση άνθρακα-ιόντων. Όπως DNA-PKcs δεν είναι μόνο το βασικό στοιχείο στο συγκρότημα επισκευής ΝΗΕΙ, αλλά δραστηριοποιείται επίσης στην λειτουργία των τελομερών, που υποτίθεται ότι NU7026 θα μπορούσε να ενισχύσει ακτινοευαισθησία παρεμβαίνοντας με την πρόσβαση της τελομεράσης στην τελομερών μετά την ακτινοβόληση του άνθρακα-ιόντων.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια και ακτινοβολίας θεραπεία

το ανθρώπινο καρκινικό κύτταρο μαστού lineMCF-7 και του τραχήλου καρκινικής κυτταρικής σειράς HeLa αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (Gibco, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 5% CO

2 σε υγροποιημένο αέρα στους 37 ° C.

ακτίνων Χ παρήχθησαν με μια μηχανή ακτίνων Χ (Pantak-320S, Shimadzu, Ιαπωνία) που λειτουργεί στα 200 kVp και 20 mA χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο χαλκού αλουμινίου + 0,5 mm 0,5-mm. Ένας μετρητής έκθεσης επιτοκίου (AE-1321 M, Εφαρμοσμένη Μηχανική Inc, Japan) χρησιμοποιήθηκε για τη δοσιμετρία. Τα ποσοστά δόση ήταν 1,1 Gy /min. Κύτταρα σε εκθετική ανάπτυξη ακτινοβολήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου, με μη-ακτινοβολημένα κύτταρα καλλιέργειας (έλεγχος), οι οποίες αντιμετωπίζονται παράλληλα με τα ακτινοβολημένα δείγματα.

προσπίπτουσα ακτινοβολία Carbon-ion πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου κατά τη Βαρέων Ιόντων Medical Accelerator Center (HIMAC) του Εθνικού Ινστιτούτου Ραδιολογικών Επιστημών (Chiba, Ιαπωνία), με 290 MeV /n άνθρακα-ion? η αξία LET για τον άνθρακα-ιόντων ήταν 40 KeV /μm. Οι δόσεις ήταν 1 Gy /min. Κάποια διαδικασία ακτινοβόλησης πραγματοποιήθηκε επίσης στη Έρευνας Βαρέων Ιόντων Διευκόλυνση σε Lanzhou HIRFL, Ινστιτούτο Σύγχρονης Φυσικής, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών, Lanzhou, Κίνα με 300 MeV /n άνθρακα-ιόντων και μια αξίας LET των 49 KeV /μm.

κλωνογονική δοκιμασία

κύτταρα σε εκθετική ανάπτυξη σπάρθηκαν σε τρυβλία Petri για το σχηματισμό αποικιών. 1000-10000 κύτταρα σπάρθηκαν μέσα σε μία ώρα μετά την ακτινοβολία με βάση την δοσολογία ακτινοβολίας που έλαβε. Για την εξέταση του δυνητικά θανατηφόρα ανάκτησης βλάβη (PLDR), τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στο μέσο για μια περίοδο ανάνηψης από 24 ώρες μετά την ακτινοβολία και στη συνέχεια σπάρθηκε. Τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω έως ότου οι αποικίες που σχηματίστηκαν ήταν αρκετά μεγάλο για να καταμετρηθεί, ενώ εξακολουθεί να είναι διαχωρίσιμα. Οι αποικίες στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και βάφτηκαν με 0,6% διάλυμα Giemsa. Οι αποικίες μετρήθηκαν με το χέρι. Μόνον αποικίες που περιέχουν περισσότερο από περίπου 50 κύτταρα βαθμολογήθηκαν.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Ποσοτικοποίηση των αποπτωτικών κυττάρων λήφθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης Annexin V-FITC (beyotime, CN) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα δεδομένα αξιολογήθηκαν με FlowJo 7.2.1 λογισμικό. Μετά τους ελέγχους χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργηθεί αποζημίωση και τεταρτημόρια:. Βάφτηκε κύτταρα και κύτταρα βάφονται με ΡΙΤΟαννεξίνης V ή μόνο με PI

Γήρανση Δοκιμασία

κύτταρα MCF-7 πλύθηκαν δύο φορές με PBS και σταθεροποιήθηκαν με 2% φορμαλδεΰδη, 0,2% γλουταραλδεΰδη για 5 λεπτά. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν και πάλι με PBS και χρωματίστηκαν με ένα διάλυμα 1 mg /ml 5-βρωμο-4-χλωρο-3-inolyl-SS-γαλακτοσιδάσης σε διμεθυλοφορμαμίδιο (20 mg /ml απόθεμα), 5 mM σιδηροκυανιούχο κάλιο, 150 mM NaCl, 40 mM κιτρικό οξύ /φωσφορικό νάτριο, ρΗ 6,0, και 2 mM MgCl

2. Μετά από ολονύκτια επώαση στους 37 ° C, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και έπειτα φωτογραφήθηκαν.

QPCR για τελομερούς

μέτρησης του μήκους

Το σύστημα FTC-3000 qPCR (FUNGLYN, CA) χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση. Ολικό γενωμικό DNA από 50 ng χρησιμοποιήθηκαν για δοκιμασία μήκος των τελομερών, σε μια αντίδραση 20 μΙ που περιέχει 1Χ SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Ιαπωνία) και 200 ​​nmol /l κάθε εκκινητή. Οι πληροφορίες σχετικά με τα αλληλουχία εκκινητών παρατίθενται στον Πίνακα 1. αντιδράσεις εις τριπλούν πραγματοποιήθηκαν για κάθε δείκτη χρησιμοποιώντας το ακόλουθο προφίλ θερμικού κύκλου προσαρμοσμένο από Cawthon [10]: 15 λεπτά στους 95 ° C σε stage1? 2 κύκλοι 15 s στους 94 ° C, 15 s στους 49 ° C στο στάδιο 2? και 32 κύκλους 15 s στους 94 ° C, 15 s στους 58 ° C, 15 s στους 72 ° C με την απόκτηση σήματος στο στάδιο 3. Το 72 ° C διαβάζει παρέχονται οι τιμές Ct για την ενίσχυση του τελομερούς και c-myc πρότυπο. Σχετική ποσοτικοποίηση προσέγγιση (△△ Ct) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Κάθε δοκιμή πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν.

Η

DNA επισκευής ζημιών Δοκιμασία

Long PCR για mtDNA αξιολόγηση ζημιά έγινε χρησιμοποιώντας το κιτ GeneAmp XL PCR (Perkin-Elmer, Boston, MA) . Ποσοτική μακρά PCR εκτελέστηκαν σε ένα σύστημα Eppendorf Mastercycler PCR (Eppendorf, Hamburg, Germany). Η δοκιμή κύκλου PCR διεξήχθη πριν για να εξασφαλιστεί η PCR στην εκθετική φάση. Οι πληροφορίες αλληλουχία των εκκινητών έγινε παρατίθενται στον Πίνακα 1. Η PCR άρχισε με 75 ° C προσθήκη θερμής εκκίνησης της πολυμεράσης και αφήνεται να υποστεί το ακόλουθο προφίλ: αρχική μετουσίωση για 1 λεπτό στους 94 ° C που ακολουθείται από 25 κύκλους για μεγάλα θραύσματα ή 20 κύκλους για μικρά θραύσματα των 94 ° C μετουσίωση επί 15 sec και επέκταση στους 68 ° C για 15 λεπτά. Μια τελική επέκταση στους 72 ° C διεξήχθη για 10 λεπτά κατά την ολοκλήρωση του προφίλ. Ένα κλάσμα του κάθε προϊόντος PCR αναλύθηκε σε ένα κάθετο πήκτωμα αγαρόζης 1% και ηλεκτροφορήθηκε σε ΤΒΕ για 4 ώρες. Τα πήγματα στη συνέχεια ψηφιακά φωτογραφήθηκαν και ποσοτικά με FluorChem FC2 (η Alpha Innotech Corporation). Η βλάβη του DNA προσδιορίστηκε ποσοτικά με σύγκριση της σχετικής επίπεδο ενίσχυσης των μεγάλων θραυσμάτων του DNA (γονίδιο HPRT 10.4-kb) ομαλοποίηση αυτό στην ενίσχυση των μικρότερων (54-bp c-myc) θραύσματα.

Καθιέρωση κύτταρα με Shorter τελομερούς

τα κύτταρα επωάστηκαν με 2 μΜ MST312 (Sigma, USA) για 50-70 ημέρες σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (Gibco, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 5% CO

2 σε υγροποιημένο αέρα στους 37 ° C. Το μέσο με 2 μΜ MST312 αντικαταστάθηκε κάθε 3 έως 4 ημέρες. το μήκος των τελομερών προσδιορίστηκε με QPCR όπως περιγράφηκε παραπάνω. MST312 αφαιρέθηκε από τις μεσαίες 24 ώρες πριν από τη διαδικασία της ακτινοβολίας.

Η κυτταροτοξικότητα Δοκιμασία

Η κυτταροτοξικότητα της MST312 προσδιορίστηκε με παρακολούθηση σε πραγματικό χρόνο των προσκολλημένων κυττάρων από το Σύστημα RT-CES (ACEA Biosciences, Η.Π.Α. ). 10.000 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε 360 μλ καλά με 200 μL μέσου πριν από τη μέτρηση. Το μέσο αντικαταστάθηκε κάθε 3 ημέρες. Πολλαπλασιασμό των MCF-7 και HeLa κύτταρα καταγράφηκε κάθε 2 ώρες για τις 144 ώρες.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε για τα μέσα των δεδομένων που λαμβάνονται από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD. πρόγραμμα έλεγχος τ στο Microsoft Excel χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση στατιστική σημαντικότητα.

σ

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

NU7026 Θεραπεία Ενισχυμένη Κυτταρική αδρανοποίηση μέσω απόπτωσης ή /και γήρανση των καρκινικών κυττάρων μετά από Carbon-ion ακτινοβολία

Η ραδιοευαισθησία των κυττάρων εξετάσθηκε με κλωνογόνο προσδιορισμό. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 1, η ραδιοευαισθησία του NU7026-κατεργασμένων κυττάρων ήταν μεγαλύτερη από τον έλεγχο σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Η κυτταρική δράση αδρανοποίηση της ακτινοβολίας άνθρακα ιόντων ήταν μεγαλύτερη από εκείνη των ακτίνων Χ. Για να διερευνηθεί περαιτέρω κυτταρική μοίρα μετά την ακτινοβόληση και /ή θεραπεία NU7026, κυτταρική απόπτωση και γήρανση προσδιορίστηκαν με ανεξίνη /ΡΙ διπλή χρώση και ιστοχημική χρώση β-γαλακτοσιδάσης, αντίστοιχα. Απόπτωση σε MCF-7 και κύτταρα HeLa δεν είναι σημαντικά αυξημένα όταν θεραπεύτηκαν με ακτινοβολία άνθρακα-ιόντων ή NU7026 μόνο, αλλά ήταν σημαντικά αυξημένη από τον συνδυασμό ακτινοβολίας άνθρακα-ιόντων και θεραπεία NU7026 (Πίνακας 2). MCF-7 κύτταρα σε επεξεργασία με NU7026 μετά την ακτινοβόληση άνθρακα-ion έδειξαν εκτεταμένη κυτταρική γήρανση 30 ημέρες μετά την ακτινοβολία? ακτινοβόληση του άνθρακα-ion μόνος επάγεται επίσης γήρανση, αλλά σε πολύ μικρότερο βαθμό (Σχήμα 2). κύτταρα HeLa υπέστησαν σημαντική μείωση του πληθυσμού μέσω απόπτωσης 48 ώρες μετά την ακτινοβόληση και δεν μπορούν να συντηρήσουν τον πολλαπλασιασμό των υστέρων.

Τα κύτταρα επωάστηκαν με 10 μΜ NU7026 για 3 ώρες πριν από την ακτινοβόληση.

Η

Η

Ενισχυμένη ακτινοευαισθησία ήταν ανεξάρτητη της επισκευής Χωρητικότητα Βλάβη DNA

DNA-PKcs απαιτείται για την οδό ΝΗΕΙ της επιδιόρθωσης του DNA, που επανασυνδέει ϋδΒδ. Από ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA συνδέεται στενά με ακτινοευαισθησία, NU7026, ένας ειδικός αναστολέας DNA-PKcs, θα μπορούσε ενδεχομένως να ενισχύσει ραδιοευαισθησία παρεμβαίνοντας με την επισκευή των DSBs που διαμεσολαβείται από NHEJ. Ωστόσο, καμία σημαντική απώλεια της ικανότητας επιδιόρθωσης του DNA ανιχνεύθηκε σε αμφότερα τα κύτταρα επεξεργασμένα με 10 μΜ NU7026 μετά από 1 Gy ακτινοβόληση άνθρακα-ιόντων. Επιπλέον, PLDR δεν αποκατέστησε την κυτταρική αδρανοποίηση της DNA-PKcs-ανέστειλε κύτταρα όπως μετράται από το κλάσμα επιβίωσης, υποδεικνύοντας ότι το DNA-PKcs θα μπορούσε να επηρεάσει ραδιοευαισθησία μέσω εναλλακτικής οδού ανεξάρτητης του ρόλου της στην επιδιόρθωση της βλάβης του DNA (Σχήμα 3).

Α. Το κλάσμα επιβίωσης των ακτινοβολημένων κυττάρων μετά την ανάκτηση 24 ώρες? B. Η κινητική της επιδιόρθωσης βλαβών του DNA μετά από 1 Gy ακτινοβόληση άνθρακα ιόντων με /χωρίς θεραπεία NU7026, όπως μετράται με σχετική μακρά PCR ενίσχυση.

Η

DNA-PKcs Αναστολή Είχε ως αποτέλεσμα την ταχεία τελομερούς Μήκος Μείωση μετά Carbon -ιόν ακτινοβολία

το μήκος των τελομερών αποτελεί κρίσιμο παράγοντα για την εμφάνιση της κυτταρικής γήρανσης. Για να διερευνηθεί αν γηρασμό που προκαλείται από την ακτινοβολία οφείλεται στη μείωση του μήκους των τελομερών, σε πραγματικό χρόνο PCR χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η σχετική ποσοτικοποίηση των μήκους των τελομερών. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, MCF-7 κύτταρα καλλιεργήθηκαν με NU7026 επέδειξαν καμία σημαντική απώλεια των τελομερών? Ωστόσο, το μήκος των τελομερών σε ακτινοβολημένα κύτταρα άνθρακα ιόντων μειώθηκε σταδιακά εντός 30 ημερών. Ειδικότερα, το μήκος των τελομερών σε κύτταρα κατεργασμένα με τον συνδυασμό NU7026 και την ακτινοβόληση του άνθρακα ιόντων μειώθηκε περισσότερο σοβαρά. Αυτή η επιταχυνόμενη απώλεια των τελομερών θα μπορούσε να εξηγήσει την αυξημένη γήρανση παρατηρείται στα κύτταρα 30 ημέρες μετά την ακτινοβολία.

MCF-7 κύτταρα επωάστηκαν με 10 μΜ NU7026. *: P & lt? 0,01 έναντι του ελέγχου?

#: ρ. & Lt? 0,01 έναντι 1 Gy ακτινοβολίας άνθρακα-ion

Η

Σύντομη τελομερή προκαλείται Celluar αδρανοποίηση μετά από Carbon-ion Ακτινοβολία

Για να προσδιορίσετε αν βράχυνσης των τελομερών ήταν η αιτία της κυτταρική αδρανοποίηση μετά την ακτινοβόληση άνθρακα-ιόντων, τα κύτταρα MCF-7 και HeLa με μικρότερη τελομερή καθορίστηκαν μέσω συνεχούς επώαση με το MST312 αναστολέα τελομεράσης. Μια ανάλυση κυτταροτοξικότητας έδειξαν ότι 2μΜ MST312 δεν οδήγησε σε σημαντική αναστολή της ανάπτυξης σε σύγκριση με το μάρτυρα (Σχήμα 5Α-Β). Σημαντικές βράχυνση του μήκους των τελομερών ανιχνεύθηκε σε κύτταρα MCF-7 μετά 50 ημέρες και σε κύτταρα HeLa μετά από 30 ημέρες συνεχούς επώαση με MST312 (Σχήμα 5C). (Σχήμα 5Β). β-Γαλακτοσιδάση ιστοχημική χρώση αποκάλυψε ότι ενώ ανήλικος γήρανση ανιχνεύθηκε σε κύτταρα MCF-7 μετά από 50 ημέρες συν-επώαση με MST312 (Σχήμα 5C), 1 Gy ακτινοβολία άνθρακα ιόντων που προκαλείται εκτεταμένη γήρανση σε αυτά τα κύτταρα (Εικόνα 5D). ακτινοβολία Carbon-ion επαγόμενη υψηλό επίπεδο απόπτωσης σε κύτταρα HeLa με μικρότερη τελομερούς (Πίνακας 2).

σε πραγματικό χρόνο παρακολούθηση της ανάπτυξης και του πολλαπλασιασμού των MCF-7 και κύτταρα HeLa παρουσία MST312 χρησιμοποιώντας το RT -CES πλατφόρμα. B. Σχετική μήκος των τελομερών σε MCF-7 και HeLa κύτταρα μετά από παρατεταμένη επώαση MST312. Γ γήρανση των κυττάρων MCF-7 50 ημέρες μετά την επώαση MST312? Δ Η γήρανση των κυττάρων MCF-7 με μικρότερη τελομερή 5 ημέρες μετά από 1 Gy ακτινοβολίας άνθρακα-ιόντων.

Η

Συζήτηση

Μία από τις σημαντικές διαφορές μεταξύ υψηλών-ας και χαμηλής LET ακτινοβολίας είναι ότι η ακτινοβολία υψηλής LET παράγει πιο πυκνά κατανεμημένα και τα σμήνη των ϋδΒδ από χαμηλής LET ακτινοβολία. Έχει προταθεί ότι θα ήταν πιο δύσκολο για το κυψελοειδές σύστημα επιδιόρθωσης του DNA για την επιδιόρθωση της βλάβης του DNA συμπλέγματος [12], [13]. Υπάρχουν δύο βασικοί μηχανισμοί επιδιόρθωσης DSB σε κύτταρα θηλαστικών: ΝΗΕΙ και ο ομόλογος ανασυνδυασμός (HR). Πιστεύεται ότι NHEJ είναι η κυρίαρχη DSB επισκευή οδού σε κύτταρα θηλαστικών [14] – [17]. Ωστόσο, βραχέα θραύσματα DNA που προκαλείται από την ακτινοβολία των βαρέων ιόντων αναφέρθηκαν να αναστέλλουν την διαδικασία NHEJ [18]. Επιπλέον, βαρέων ιόντων που προκαλείται από την ακτινοβολία συγκρότημα ϋδΒδ τα οποία πιστεύεται ότι πρέπει να επισκευαστεί από HR [19]. Έτσι, το πρόσθετο ανασταλτικό αποτέλεσμα της ΝΗΕΙ θα μπορούσε να επιβάλει μια περιορισμένη επίδραση στην επισκευή του άνθρακα-ιόντων ακτινοβολίας που προκαλείται από βλάβες του DNA στο πείραμά μας. Η αναστολή της DNA-PKcs επιβράδυνε την κινητική της επιδιόρθωσης του DNA στη μελέτη μας και μπορεί να οφείλεται στη βραδύτερη κινητική επιδιόρθωσης του DNA του ανθρώπινου δυναμικού, σε σύγκριση με τη διαδικασία NHEJ. Όπως βλάβη στο DNA τελικά επισκευαστεί μέσα σε 24 ώρες μετά την ακτινοβολία, η ενισχυμένη ραδιοευαισθησία θα μπορούσε να έχει προκληθεί από άλλους παράγοντες, όπως η κρίσιμη βράχυνσης των τελομερών. Drissi et.at. ανέφερε ότι βραχυπρόθεσμα τελομερή προκαλέσουν δομής της χρωματίνης αλλαγές που περιορίζουν την πρόσβαση των ενεργοποιημένων ΑΤΜ στους μεταγενέστερους στόχους του σχετικά με την χρωματίνη, η οποία μπορεί να ευθύνεται για την αυξημένη ευαισθησία ακτινοβολίας που παρατηρείται με βράχυνσης των τελομερών [20]. Η ασχετοσύνη της επισκευής ΝΗΕΙ να ακτινοευαισθησία ήταν επίσης εμφανής στα δεδομένα PLDR μας, η οποία κατέδειξε ότι ακόμα και αν το μεγαλύτερο μέρος της βλάβης του DNA επισκευάστηκε μετά από 24 ώρες επώασης, η αναστολή του DNA-PKcs θα μπορούσε να οδηγήσει σε μείωση της κυτταρικής επιβίωσης.

Sabatino et.al πρότεινε ότι τελομερών συντομεύσει μετά την ακτινοβόληση μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα σημαντικό μεσολαβητή μεταξύ έκθεσης σε ακτινοβολία, το σχηματισμό ROS και την αγγειακή βλάβη [21]. Η αισθητή αύξηση ραδιοευαισθησία μετά την αναστολή DNA-PKcs μπορεί να έχει προκληθεί από το άλλο ρόλο των DNA-PKcs, το οποίο δρα ως πρωτεΐνη δεσμεύσεως των τελομερών [22]. DNA-PKcs κατάργηση μπορεί να οδηγήσει σε ταχύτερο ρυθμό αποικοδόμησης των τελομερών, λόγω της αλληλεπίδρασής της με τελομεράσης σε συντήρηση του τελομερούς [23]. Μελέτες έχουν δείξει ότι το DNA-PKcs συμμετείχε επίσης σε άκρο τελομερούς προστασίας. Τα χαρακτηριστικά της δυσλειτουργίας των τελομερών με αναστολή DNA-PKcs έχει μελετηθεί εκτενώς από Bailey SM et.al. [24], [25]. Αυτοί οι συγγραφείς απέδειξαν ότι χωρίς περικοπές τελομερή με το DNA-PKcs είναι ακατάλληλα ανιχνεύονται και να επεξεργάζονται όπως ϋδΒδ, συμμετέχοντας έτσι σε ιονίζουσα ακτινοβολία που προκαλείται από γεγονότα σύντηξης των τελομερών-DSB.

Ως ένα κρίσιμο συστατικό σε τελομερών τερματικές [26], αναστολή της DNA-PKcs μπορεί να διαταράξει τη σωστή πρόσβαση των τελομεράσης σε τελομερή, οδηγώντας τελικά σε βράχυνσης των τελομερών. Δεδομένου ότι τα περισσότερα καρκινικά κύτταρα φιλοξενούν μικρότερη τελομερή από τα φυσιολογικά κύτταρα, τα τελομερή τους είναι πιο πιθανό να μειωθεί σε ένα κρίσιμο μήκος αν τελομεράσης είναι δυσλειτουργικό. Στην παρούσα μελέτη, η επιτάχυνση της βράχυνσης των τελομερών ανιχνεύθηκε σε DNA-PKcs-ανέστειλε κύτταρα μετά από ακτινοβόληση άνθρακα ιόντων σε κύτταρα MCF-7, που συνοδεύεται από εκτεταμένη κυτταρική γήρανση. Δεν μπορεί να ανιχνεύσει βράχυνσης των τελομερών στα κύτταρα HeLa μετά από άνθρακα-ιόντων με την αναστολή του DNA-PKcs, λόγω της ανικανότητας τους για συνεχή πολλαπλασιασμό. Η σημαντική απόπτωση σε κύτταρα HeLa μπορεί να διαμεσολαβείται από απόκριση βλάβης DNA. Ωστόσο, δοκιμασία damge DNA αποκάλυψε ότι η βλάβη του DNA αποτελεσματικά επισκευαστεί μέσα σε 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση. Από το DNA-PKcs όχι μόνο συμμετείχε στο DNA διπλής επισκευή περίπτερο, αλλά και να λειτουργήσει ως ένα κρίσιμο στοιχείο για το τέλος των τελομερών καθορισμό ανώτατου ορίου, είναι συνεπώς πιθανό ότι απάντηση βλάβη στο DNA που προκαλείται από δυσλειτουργική τελομερών. Με την ίδρυση των HeLa και MCF-7 κύτταρα έτρεφε μικρότερη των τελομερών, επιβεβαιώσαμε ότι η δυσλειτουργία των τελομερών μπορεί να συμβάλει στην κυτταρική αδρανοποίηση των καρκινικών κυττάρων μετά την ακτινοβολία του άνθρακα-ιόντων. Τα αποτελέσματα αυτά παρέχουν ενδείξεις ότι η αναστολή DNA-PKcs μπορεί να οδηγήσει σε ραδιοευαισθητοποίηση λόγω κρίσιμο ρόλο της στην τέλος τελομερών κάλυψης.

Συμπερασματικά, βρήκαμε ότι NU7026 ευαισθητοποιημένα σημαντικά MCF-7 και HeLa κύτταρα σε ακτινοβολία άνθρακα-ιόντων. Αυτή η αυξημένη ακτινοευαισθησία ήταν απίθανο προκλήθηκε από ατελή επιδιόρθωση της βλάβης του DNA, αλλά από δυσλειτουργία των τελομερών. Τα ευρήματά μας παρέχουν στοιχεία που να δείχνουν ότι η στόχευση της τελομερών τερματικές πρωτεΐνη θα μπορούσε να είναι ένας αποτελεσματικός τρόπος για την αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελαν να ευχαριστήσω Πρόγραμμα Εξωτερικής Συνεργασίας της Κινεζικής Ακαδημίας επιστήμες, την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης και της Εθνικής για την Συνεταιριστική Ερευνητικό Πρόγραμμα. Οι συγγραφείς επίσης να ευχαριστήσω την κα H. Arai και την κα Μ Nakajima για την τεχνική βοήθεια τους σε όλη τη μελέτη.