Αφηρημένο

Ιστορικό

παχέος καρκίνο (CRC) η έρευνα έχει ωφεληθεί σε μεγάλο βαθμό από τη διαθεσιμότητα των μικρών μοντέλα όγκων σε ζώα. Αυθόρμητη και χημικά που προκαλείται από τα μοντέλα CRC χρησιμοποιούνται ευρέως ακόμη περιορισμένη ομοιότητα τους με την ανθρώπινη ασθένεια και συχνά παρατεταμένες, δεν με ακρίβεια επαναλαμβανόμενες, και συνδέονται με φλεγμονώδεις παρενέργειες. In-situ ποντικού ή ανθρώπου εμφύτευση του όγκου στη γαστρεντερική οδό των ποντικών είναι εξαιρετικά δύσκολο, και περιορίζεται από τη μεταβλητότητα μεταξύ των ζώων και των επιπλοκών διαδικασία και θνησιμότητα. Ως αποτέλεσμα, σε συχνές μελέτες CRC εμφυτεύεται στο άπω θέσεις, συνήθως την υποδόρια περιοχή, μια προσέγγιση που είναι σε μεγάλο βαθμό περιορισμένη από την έλλειψη κανονικής γαστρεντερικής milieu όγκων και έχει σημαντικές επιπτώσεις στην ανάπτυξη του όγκου.

Στόχοι

σε αυτή τη μελέτη με στόχο την ανάπτυξη μιας καλά ανεκτή επαναλαμβανόμενες εργαλείο για τη μελέτη CRC σε μικρά ζώα προσαρμόζοντας το κολονοσκόπηση σύστημα ποντικού για να χρησιμεύσει ως μια πλατφόρμα για κολονική υπο-βλεννογόνου ορθοτοπική εμφύτευση του ανθρώπου και ποντικού κύτταρα όγκου CRC.

Αποτελέσματα

Έχουμε αναφέρει τη δημιουργία ενός νέου μοντέλου CRC μικρών ζώων που είναι ελάχιστα επεμβατική, γρήγορη, καλά ανεκτή, πολύ επαναλήψιμη, και παρέχει ακριβή έλεγχο του αριθμού των όγκων, τη θέση και την ανάπτυξη τιμή. Επιπλέον, δείχνουμε ότι το μοντέλο αυτό επιτρέπει μοναδικά την επαγωγή side-by-side των διακριτών γενετικώς τροποποιημένα όγκων, επιτρέποντας την μηχανιστική μελέτη της αλληλεπίδρασης του όγκου και cross-talk εντός της φυσικής εντερικής μικροπεριβάλλον.

Συμπεράσματα

Απασχόληση αυτής της νέας προσέγγισης μπορεί να αντιπροσωπεύει μια σημαντική τεχνική εκ των προτέρων για το

in-vivo

μελέτη της CRC

Παράθεση:. Zigmond Ε, Halpern Ζ, Elinav Ε, Brazowski Ε, Jung S , Varol C (2011) Αξιοποίηση του ποντικού κολονοσκόπηση για ορθοτοπική εμφύτευση του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 6 (12): e28858. doi: 10.1371 /journal.pone.0028858

Επιμέλεια: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Ιούλ του 2011? Αποδεκτές: 16 Νοεμβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 12 Δεκ 2011

Copyright: © 2011. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το του Crohn & amp? Κολίτιδα Ίδρυμα της Αμερικής (CCFA) (στο S.J., τον αριθμό – 7.108.160.101? Ιστοσελίδα: www.ccfa.org). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παχέος καρκίνο (CRC) είναι η δεύτερη κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο σε πολλές βιομηχανικές [1] χώρες. μοντέλα CRC σε μικρά ζώα έχουν προσφέρει σημαντικά εργαλεία για τη διερεύνηση των υποκείμενων αιτιολογικός και παθοφυσιολογικών μηχανισμών της ανάπτυξης CRC και για την προκλινική αξιολόγηση των νέων θεραπευτικών μεθόδων. Πολυάριθμες μοντέλα CRC ποντικού έχουν αναπτυχθεί και περιγραφεί στην βιβλιογραφία [2], [3]. Οι κύριες προσεγγίσεις περιλαμβάνουν μεταλλαγμένα ποντίκια που αναπτύσσουν αυθόρμητη όγκους, η θεραπεία με ένα ευρύ φάσμα των καρκινογόνων παραγόντων, με ή χωρίς επαγωγή της χρόνιας φλεγμονής, και έκτοπη ή ορθοτοπική εμφύτευση των κυττάρων του όγκου.

Αυθόρμητη CRC στελέχη διαγονιδιακό ποντίκι μιμηθούν στενά ανθρώπινη σύνδρομα καρκίνου, όπως η κληρονομική μη-πολυποειδούς ορθοκολικού καρκίνου (HNPCC) [4] και οικογενή αδενομάτωση πολυποδίαση (FAP) [5]. Αυτά τα μοντέλα έχουν αποδειχθεί πολύτιμη για τη μελέτη των επιδράσεων των γνωστών γενετικών αλλαγών στην πορεία της νόσου. Ωστόσο, πολλά από αυτά τα μοντέλα ποντικών σχηματίζουν αδενώματα κυρίως στο λεπτό έντερο, και συνήθως συνδέεται με αργό ρυθμό ανάπτυξης και σημαντική μεταβλητότητα μεταξύ των ζώων [3] Το APC

στέλεχος Min /+ ποντίκι ιδρύθηκε με βάση τα αποτελέσματα που προέρχονται από μια μελέτη μεταλλαξιογονίας βλαστικής γραμμής με Ν-αιθυλ-Ν-νιτροζουρία συνδυασμό με φαινοτυπική διαλογή [5]. Αν και αυτό το μοντέλο συνδέεται με την εμφάνιση ενός μεγάλου αριθμού των καλοηθών αδενώματα στο λεπτό έντερο, CRC όγκοι αναπτύσσονται σε λιγότερο από το ήμισυ των ζώων. Παρ ‘όλα αυτά, θεραπεία αυτών των ποντικών με την αζοξυμεθάνιο καρκινογόνο παράγοντα (ΑΟΜ) αυξάνει σημαντικά την εμφάνιση όγκου στα παχύ έντερο των ποντικών αυτών, και αυτό το μοντέλο έχει αποδειχθεί ότι είναι χρήσιμη για την μελέτη της επίδρασης των ενώσεων χημειοπροληπτική [6], [7].

οι επαγώγιμοι μοντέλα ποντικών CRC, από την άλλη πλευρά, βασίζονται συνήθως στη χρήση των διαφόρων καρκινογόνων ενώσεων, όπως αζοξυμεθάνιο (ΑΟΜ), 1,2-διμεθυλυδραζίνη (DMH) και άλλοι [2]. Τα χημικά επαγόμενη εγκατεστημένων όγκων μοιράζονται πολλά από τα ιστοπαθολογικών χαρακτηριστικών των μη κληρονομικές ανθρώπινο CRC [2], [8]. ανάπτυξη όγκων σε αυτά τα μοντέλα έχει αναφερθεί ότι είναι της τάξεως των 30 εβδομάδων. Αξίζει να σημειωθεί ότι, ο συνδυασμός της καρκινογόνου ένωσης με χρόνια φλεγμονή, όπως στην περίπτωση του θειικού νατρίου ΑΟΜ /δεξτράνης (DSS) μοντέλο, έχει αποδειχθεί να μειωθεί ο λανθάνων χρόνος που παρατηρείται στην κλασική μοντέλο για περίπου 10 εβδομάδες και να στοχεύουν επαγωγή όγκων κυρίως στο άπω κόλον [8], [9]. Αυτά τα πλεονεκτήματα, καθώς και υψηλή ισχύ του, απλή τρόπο εφαρμογής, ευρύ φάσμα ευαισθησίες, και σχετική αποδοτικότητα κόστους, έχουν κάνει αυτό το μοντέλο είναι πολύ συχνή σε έρευνα CRC, και ένα εξαιρετικό εργαλείο έρευνας για τη μελέτη νωρίς καρκινογόνες εκδηλώσεις και την αξιολόγηση των δυνητικών θεραπευτικών προσεγγίσεις [2], [8]. Ωστόσο, σε αυτό το μοντέλο οι όγκοι αναπτύσσονται κάτω από τις επιδράσεις του περιβάλλοντος της χρόνιας φλεγμονής, μια κατάσταση που μιμείται φλεγμονώδη νόσο του εντέρου (IBD) -associated CRC αλλά όχι ο πιο κοινός σποραδικές ανθρώπινη CRC. Είναι σημαντικό, όλοι CRC

IN-vivo

μοντέλα που αναφέρθηκαν παραπάνω πάσχουν από μια εγγενή αδυναμία να ελέγξει τους αριθμούς του όγκου και κινητική ανάπτυξη.

Πολλά ορθοτοπική μοντέλα CRC ποντικού έχουν περιγραφεί, οι περισσότερες εκ των οποίων απαιτούν μια λειτουργική προσέγγιση για την έγχυση ή εμφύτευση των καρκινικών κυττάρων στο κόλον ή του τυφλού εντέρου στρωμάτων [10], [11]. Η πολυπλοκότητα της χειρουργικής διαδικασίας, με αποτέλεσμα τραύματος, φλεγμονή διαδικασία και θνησιμότητα, περιορίζουν σοβαρά την αξία αυτών των συστημάτων για τη μελέτη της έμφυτης και προσαρμοστικής αντικαρκινικές ανοσοαπαντήσεις.

Στους ανθρώπους, ενδοσκοπική εξέταση του του παχέος εντέρου είναι η πιο σημαντική μέθοδος για την ανακάλυψη και την παρακολούθηση φροντίδα του CRC. Πρόσφατα,

in vivo

ενδοσκόπηση ποντικού έχει αναπτυχθεί επιτρέποντας υψηλής ανάλυσης απεικόνιση του παχέος εντέρου σε ζωντανά ποντίκια, και επιτρέποντας στους ερευνητές να απεικονίσει άμεσα και να σκοράρει παθολογικές αλλαγές ιστό του παχέος εντέρου [12], [13] και στις ενδοκοινοτικές συναλλαγές -abdominal όργανα [14]. Επιπλέον παρεμβάσεις, όπως η επαναλαμβανόμενη βιοψίες των αλλοιώσεων του παχέος εντέρου σε ζωντανά ποντίκια κατά τη διάρκεια της περιόδου παρακολούθησης ενός πειράματος και η επακόλουθη πρωτεομική ανάλυση τους, έχουν εισαχθεί νέα ισχυρά εργαλεία για την έρευνα CRC [15].

Σας παρουσιάζουμε για πρώτη φορά μια προσαρμογή της κολονοσκόπησης σύστημα ποντικού και της απασχόλησης του για τη δημιουργία ενός νέου ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού της CRC. Αυτή η προσέγγιση παρέχει μια εύκολη και απλή λύση για τους τεχνικούς περιορισμούς που σχετίζονται με τα υπάρχοντα μοντέλα CRC.

Αποτελέσματα

Ίδρυση ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού CRC χρησιμοποιώντας την κολονοσκόπηση σύστημα ποντικού

Μικρές ενδοσκόπηση ζώο θεωρείται σήμερα ως ο χρυσός κανόνας εργαλείο για την επιτήρηση της παχέος φλεγμονωδών διαταραχών και CRC. Προκειμένου να προσαρμοστεί το σύστημα αυτό για το σκοπό της ορθοτοπική εμφύτευση των κυττάρων του όγκου CRC εντός του κόλου υπο-βλεννογόνο έχουμε ειδικά σχεδιασμένα μία υποδερμική βελόνα που μπορεί να περάσει μέσα από το ενδοσκοπικό θήκη κανάλι εργασίας του συστήματος miniendoscopic Karl Storz Coloview. Οι υποδόριες βελόνες custom made σύμφωνα με τις προδιαγραφές μας, Cadence Inc. ΗΠΑ, και είναι κατασκευασμένα από μακρύ εύκαμπτο ανοξείδωτο χάλυβα ευέλικτη 8 ιντσών, με 30 gauge εξωτερική διάμετρο, και ένα μικρό φάλτσο σε άγγελο 45 μοιρών (Σχήμα S1). Αυτή η υποδερμική βελόνα παρέχει πολλά πλεονεκτήματα του σχεδιασμού? το εύκαμπτο χάλυβα μαζί με διαστάσεις βελόνας ανακουφίσει την ελιγμών ένεση και να επιτρέψει την ομαλή πέρασμα μέσω του καναλιού εργασίας και της κλειδαριάς Luer, το οποίο βιδώνεται σε αυτό για να αποφευχθεί η διαρροή αέρα. Επιπλέον, η αμβλεία λοξοτομή επιτρέπει ένεση στον υπο-βλεννογόνο με μειωμένο κίνδυνο για διάτρηση ή χύσιμο του εγχεόμενου υλικού στον αυλό. Εξετάσαμε πρώτα την κατανομή ιστού των εγχυθεί αντιδραστηρίων και αξιολόγησε τον κατάλληλο όγκο ένεσης με έγχυση Ινδία μελάνι χρωστικής σήμανσης στην κολονική στρώμα υπο-βλεννογόνου. Ένας όγκος έγχυσης των 50 μΐ έδωσαν τον καλύτερο συνδυασμό ελάχιστη διαρροή και εστιακή σκέδαση της μελάνης κάτω από το επιθηλιακό στρώμα (Σχήμα 1Α). Flushing του κολικού αυλού εφαρμόζοντας αλατούχο μέσα από την εξέταση θήκη του ενδοσκοπίου επιβεβαίωσε τον εντοπισμό του εγχεόμενου μελάνης κάτω από το επιθηλιακό στρώμα (Ταινία S1). Η ιστολογική ανάλυση επιβεβαίωσε ότι η σινική μελάνη συγκρατείται μέσα στο κολονικό υμένα ακόμη και 5 ημέρες μετά την ορθοτοπική ένεση (Εικόνα S2A). Σημαντικά, η ιστολογική ανάλυση των ποντικών που ενέθηκαν με αποστειρωμένο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα Dulbecco Αλατόνερο χωρίς ασβέστιο και χωρίς μαγνήσιο (PBS

– /-) αποκάλυψε ένα κανονικό υγιές κολονικής αρχιτεκτονικής στην περιοχή της ένεσης που επιβεβαιώνει ότι αυτή η μέθοδος είναι ελάχιστα επεμβατική (Σχήμα S2B)

(Α) κολονοσκόπηση εικόνα που παρουσιάζει παχέος υπο-βλεννογόνου ένεση χρωστικής Ινδίας-μελάνι σε C57BL /6 ποντίκι για την αξιολόγηση του κατάλληλου όγκου έγχυσης και η κατανομή του στο παχέος lamina propria. (Β) Εκπρόσωπος κολονοσκόπηση εικόνες δείχνει την προοδευτική ανάπτυξη της CRC όγκου εντός της ίδιας C57BL /6 ποντίκι μετά από ορθοτοπική εμφύτευση του 1 × 10

5 MC38 CRC κύτταρα από την 5η ημέρα, έως την ημέρα 12 έως την ημέρα 19. (C-D) Αντιπροσωπευτικά εικόνα δείγματος ιστολογίας τομές χρωματίστηκαν με Αιματοξυλίνη και εωσίνη (Η &? Ε) και απομονώθηκε από κολονικό σημείο της ένεσης την 14η ημέρα μετά την ένεση του 1 × 10

5 κύτταρα MC38 CRC. Μεγεθύνσεις: C- [x40], D – [x100]. Σημειώστε το σύνορο περιοχή μεταξύ του όγκου και του παρακείμενου φυσιολογικού βλεννογόνου και της προβολής του όγκου μέσω της επιθηλιακής στιβάδας μέσα στον αυλό. (Ε) Αντιπροσωπευτική εικόνα που δείχνει H & amp? Ε χρώση του δείγματος ιστολογίας του ποντικού-CRC όγκου που δημιουργείται 5 ημέρες μετά την εμφύτευση ορθοτοπική των καρκινικών κυττάρων MC38 CRC σε C57BL /6 ποντίκια (Μεγέθυνση x40). (F) φθορισμού μικροσκοπική επισημανθεί GFP καρκινικά κύτταρα εικόνα που δείχνει και τη διάδοσή τους μέσω του επιθηλιακού στρώματος προς τον αυλό (μεγέθυνση χ 100). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Το MC-38 όγκου κόλου ποντικού είναι ένα αδενοκαρκίνωμα βαθμού III, η οποία επάγεται χημικά σε ένα θηλυκό C57BL /6 ποντίκι και χρησιμοποιούνται έκτοτε ως μεταφυτεύσιμων όγκου ποντικού μοντέλο [16]. Να ελεγχθεί η σκοπιμότητα της μεθόδου ορθοτοπική εμφύτευση όγκου, εμείς ένεση 1 × 10

5 καρκινικά κύτταρα MC38 CRC στην παχέος υπο-βλεννογόνο των συγγενικών C57BL /6 ποντίκια. Επαναληπτική κολονοσκόπηση του παραλήπτη ποντικών αποκάλυψε την προοδευτική ταχεία ανάπτυξη του όγκου ο οποίος μέσα στον αυλό του εντέρου ειδικά στο σημείο της ένεσης. Ενδοσκοπική ταξινόμησης σύμφωνα με το μέγεθος του όγκου σε σχέση με την περιφέρεια του παχέος εντέρου, όπως ορίζεται από τους Becker et al [12], αποκάλυψε προοδευτική ανάπτυξη του όγκου από το βαθμό 1 την ημέρα 5 σε βαθμό 4 από την ημέρα 12 και την επίτευξη βαθμού 5, καταλαμβάνοντας σχεδόν το σύνολο του κόλου περιφέρειας, μόνο κατά την ημέρα 19 (Σχήμα 1Β, και Movie S2). Αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) χρώση τομών ιστολογία αποκάλυψε μια χαρακτηριστική CRC αρχιτεκτονική των όγκων με φυσιολογικό γειτονικό βλεννογόνο και την προβολή του όγκου μέσω της επιθηλιακής στιβάδας μέσα στον αυλό (Σχήμα 1 C, D). Η ιστολογική ανάλυση του κολικού ιστού απομονώθηκαν από ποντίκια υποβλήθηκαν σε ορθοτοπική εμφύτευση του 1 × 10

5 MC38 κύτταρα CRC εκφράζουν GFP επιβεβαίωσε τη δημιουργία ενός μικρού όγκου μέσα στο ίδιο υμένα και τη διείσδυση των όγκων που προέρχονται GFP

+ κύτταρα μέσω της επιθηλιακό στρώμα ήδη κατά την ημέρα 5 (σχήμα 1 Ε, F). Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, ήμασταν επίσης σε θέση να επάγει αποτελεσματικά το σχηματισμό των ανθρώπινων όγκων CRC με εμφύτευση των ανθρωπίνων CRC κυτταρικές σειρές SW620, SW480, LS174T και ΗΤ-29 σε ανοσολογική ανεπάρκεια με γυμνό ή NOD /SCID ποντικών δεκτών (Σχήμα S3A). Παθολογική εκτίμηση των ορθοτοπικώς ιδρύθηκε ανθρώπινων όγκων CRC χρησιμοποιώντας αυτό το μοντέλο έχουν επιβεβαιώσει υψηλή ομοιότητα με CRC όγκοι απομονώθηκαν από ασθενείς ανθρώπους (Σχήμα S3b). Συγκεκριμένα, οι ανθρώπινοι όγκοι CRC που σχηματίζεται από την ορθοτοπική εμφύτευση LS174T και ΗΤ29 κύτταρα έδειξαν ιστολογικά χαρακτηριστικά χαρακτηριστικό του κόλου διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα όπως αδενικές δομές επενδεδυμένα με νεοπλασματική επιθήλιο περιέχουν κύτταρα goblet και αυλού νεκρωτικό υλικό, ενώ ο SW620 ανθρώπινα κύτταρα CRC σχηματίστηκε ένα μορφολογία του όγκου τυπικό των κακώς να αδιαφοροποίητο καρκίνωμα με ένθετα και διαχέεται πρότυπα και η έλλειψη σωληνοειδή σχηματισμό (Σχήμα S3b). Είναι ενδιαφέρον, ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC τόσο ΗΤ29 και LS174T σχηματίστηκαν από ένα πρωτογενές αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου, ενώ η SW620 ιδρύθηκε από μια μετάσταση λεμφαδένα.

Για να αξιολογηθεί η κινητική ανάπτυξη των όγκων CRC χρησιμοποιώντας αυτό μέθοδος που εγχέεται C57BL /6 ποντίκια με διακριτές ποσότητες MC38 κυττάρων (10e3, 10Ε4 και 10Ε5 κύτταρα) και ακολούθησε το κολονικό περιφέρεια και αναπτυξιακή βαθμού των εγκατεστημένων όγκων συναρτήσει του χρόνου με κολονοσκόπηση (Σχήμα 2Α). Τα αποτελέσματα γραφικά συνοψίζονται στην Εικόνα 2Β δείχνουν ότι η κινητική ανάπτυξη του όγκου ήταν σε άμεση συσχέτιση με το ποσό της ενέθηκαν κύτταρα φθάνοντας περιφέρεια του παχέος εντέρου του 21% (+/- 4.22), 54,1% (+/- 7.0), και 80% (+ /-7.2) 3 εβδομάδες μετά την έγχυση 10

3, 10

4, και 10

κύτταρα 5 MC38, αντίστοιχα. Στατιστική ανάλυση συγκρίνοντας κάθε χρονικό σημείο (1,2 και 3 εβδομάδες) για τις διαφορετικές ομάδες (10e3, 10Ε4 και κυττάρων 10Ε5) επιβεβαίωσε σημαντικές διαφορές (τουλάχιστον ρ & lt? 0,05) σε όλα τα χρονικά σημεία για το ποσοστό του κόλου περιφέρειας, καθώς και για βαθμός του όγκου. Εξαιρετικές ήταν η σύγκριση της ποιότητας των όγκων μεταξύ του 10Ε4 & amp?. 10Ε5 ομάδες κατά την εβδομάδα 3, όπως οι περισσότεροι από τους όγκους σε αυτές τις ομάδες ήταν ήδη τον 5ο βαθμό που να περιλαμβάνει όλους τους όγκους άνω του 50% του παχέος περιφέρειας

(Α) Εκπρόσωπος κολονοσκόπηση εικόνες επιδεικνύει τον συσχετισμό μεταξύ της ποσότητας του εγχέονται κύτταρα όγκου MC38 και το μέγεθος των καθιερωμένων CRC όγκου 3 εβδομάδες μετά την εμφύτευση ορθοτοπική κυττάρου όγκου. (Β) Γραφήματα συνοψίζει τις κινητικές ανάπτυξης, ποσοστό περιφέρεια και αναπτυξιακές βαθμού κολονικού όγκου σε συσχετισμό με την ποσότητα του εγχυόμενου κυττάρων MC38 CRC. Σημειώστε την ταχεία δημιουργία βαθμού 5 όγκων ήδη δύο εβδομάδες μετά την εμφύτευση του μόνο 1 × 10

5 κύτταρα MC38-CRC. Κάθε ομάδα αποτελείτο από 5 ποντικούς.

Η

Συλλογικά, δημιουργήσαμε εδώ μια νέα μέθοδο για την αποτελεσματική ορθοτοπική εμφύτευση όγκων CRC χρησιμοποιώντας ποντικού ενδοσκόπηση με ταχύ και ελάχιστα επεμβατικό τρόπο, με μια περιορισμένη ποσότητα κυττάρων που απαιτούνται για ένεση, και με απόλυτο έλεγχο σχετικά με την επίπτωση, την τοποθεσία και την ανάπτυξη της κινητικής του όγκου του.

ορθοτοπική εμφύτευση γενετικά τροποποιημένων κυττάρων CRC-όγκου

ένα από τα οφέλη της εμφύτευσης του καρκίνου πάνω από την αυθόρμητη ανάπτυξη μοντέλων όγκων είναι η ικανότητα να τροποποιούν τη γενετική καθιερωμένο όγκο. Ως απόδειξη της αρχής, θα εγχέονται ποντικοί BALB /c με 1 × 10

5 CT26 κύτταρα ποντικού CRC, η οποία είχε προηγουμένως γενετικώς για να εκφράσουν λουσιφεράσης. Ολόκληρο το σώμα βιοφωταύγειας οπτικής απεικόνισης (Biospace Photon εικονοληψίας) αποκάλυψε την ύπαρξη ενός όγκου CRC ειδικά γύρω από το σημείο της ένεσης που θα μπορούσε να είναι περαιτέρω ημι-ποσοτικά σύμφωνα με εκπεμπόμενο φωτοβολία του (Σχήμα 3Α). Αξίζει να σημειωθεί ότι, αυτή η προσέγγιση μπορεί να είναι χρήσιμη για την αξιολόγηση του φόρτου όγκου χωρίς την ανάγκη να θυσιάσει τις ποντικούς. Ένα πρόσθετο πλεονέκτημα γνήσια της ενδοσκοπικής μοντέλο εμφύτευσης είναι η ικανότητα να εμφυτεύσει αρκετές παρακείμενες ακόμη διακριτούς όγκους στον ίδιο ποντικό, τα οποία γενετικώς τροποποιημένα ώστε να υπερεκφράζουν ή σιωπή γονίδια που ενδιαφέρουν, που επιτρέπουν την άμεση σύγκριση τους με τον ίδιο περιβάλλον ξενιστή. Χρησιμοποιώντας ένα σύστημα φακοϊικών ρεπόρτερ, εμείς μετάγονται δύο διακριτά φθορίζοντα γονίδια αναφοράς εντός του MC38 κυτταρική γραμμή για να καθοριστεί η MC38-GFP και γραμμές MC38-RFP (Σχήμα 3Β άνω αριστερό πλαίσιο). Ένεση των κυττάρων MC38-GFP και δίπλα σε αυτά τα κύτταρα MC38-RFP είχε ως αποτέλεσμα την συν-σχηματισμό δύο γενετικά πανομοιότυπα όγκους που ποικίλλουν μόνο με την τοποθεσία και την έκφρασή τους των εισηγμένων γονιδίων αναφοράς (Σχήμα 3Β κάτω αριστερό πίνακα και δεξιά πάνελ) .

(Α) χρωματιστές αντιπροσωπευτική εικόνα του ολόκληρο το σώμα βιοφωταύγεια οπτική απεικόνιση των ποντικών BALB /c 2 εβδομάδες μετά υπο-βλεννογόνου ένεση PBS

– /- (αριστερά ποντίκι) ή 1 × 10

5 καρκινικά κύτταρα CT26 CRC που εκφράζουν λουσιφεράση και 10 λεπτά μετά την ένεση ip του D-λουσιφερίνης. Σημειώστε την εκπομπή φωταύγειας ειδικά από την περιοχή του με ένεση κυττάρων όγκου CRC (δεξιά ποντικού). (Β) Επάνω αριστερά πάνελ – φθορισμού stereo-μικροσκοπική εικόνα επικαλύπτονται σε μια φωτογραφία γραφική εικόνα του παραλήπτη C57BL /6 του παχέος εντέρου ποντίκι 3 εβδομάδες μετά από ορθοτοπική ένεση με κύτταρα MC38 CRC που είχαν γενετικά τροποποιημένους από λεντοϊού σύστημα δημοσιογράφο να εκφράσουν RFP, μεγέθυνση x10. Κάτω αριστερά πάνελ – κολονοσκόπηση εικόνα C57BL παχέος εντέρου /6 ποντικού μετά από ορθοτοπική εμφύτευση 2 συνεχόμενα καρκινικών κυττάρων MC38 CRC? MC38-RFP (κόκκινο βέλος) και MC38-GFP (πράσινο βέλος). Δικαίωμα πάνελ – φθορισμού stereo-μικροσκοπική εικόνα επικαλύπτονται σε ένα image photo γραφικών του παραλήπτη C57BL /6 ποντίκι άνοιξε παχέος εντέρου 2 εβδομάδες μετά side-by-side ορθοτοπική ένεση MC38-RFP (άπω) και MC38-GFP (εγγύς) καρκινικά κύτταρα CRC, μεγέθυνση x10. Σημειώστε την επαγωγή 2 συνεχόμενα όγκων CRC που διαφέρουν μόνο από την έκφραση του γονιδίου αναφοράς σε μεταγωγή. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Συζήτηση

περιγράφουμε εδώ, ένα μυθιστόρημα ορθοτοπικό μοντέλο ποντικού CRC με βάση την προσαρμογή του εμπορικά διαθέσιμου miniendoscopy σύστημα που παρέχει πολλά πλεονεκτήματα σε σύγκριση με τις γνωστές μοντέλα ποντικών CRC. Είναι ένα εύκολο να απασχολούν, ελάχιστα επεμβατική, και άκρως αναπαραγώγιμη διαδικασία που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε ποντίκια από κάθε γενετικό υπόβαθρο. Σε αυτό το μοντέλο μπορεί να επαχθεί αμφότερα ποντικού και ανθρώπου CRC-όγκους. Το μοντέλο επιτρέπει επίσης τον ακριβή έλεγχο του εμφάνιση όγκου και τη θέση εντός του παχέος εντέρου. Επιπλέον, αυτή η μέθοδος επιτρέπει τον απόλυτο έλεγχο στην κινητική ανάπτυξη του όγκου? μπορεί να είναι πολύ γρήγορη φθάνω βαθμού 5 σε 2 εβδομάδες μετά την εμφύτευση του μόνο 1 × 10

5 κυττάρων όγκου, ή μπορεί κανείς να το επιβραδύνει με την έγχυση χαμηλός αριθμός κυττάρων. Σημαντικά, αυτή η προσέγγιση αποφεύγει παράπλευρες ζημίες και φλεγμονή δει σε πολλές από τις άλλες που χρησιμοποιούνται σήμερα μοντέλα. Επιπλέον, μοναδικά επιτρέπει την επαγωγή γενετικώς τροποποιημένα CRC-όγκων και τη σύγκριση των διαφόρων ξεχωριστών όγκων καθορίζονται side-by-side με τον ίδιο ποντίκι αποφεύγοντας την μεταξύ των ζώων διακύμανση.

έκτοπη υποδόρια εμφύτευση καρκινικών κυτταρικών σειρών χρησιμοποιείται ευρέως ως ερευνητικό εργαλείο, ειδικά για την αξιολόγηση των θεραπευτικών παρεμβάσεων κυτταροστατική [17]. Ωστόσο, έκτοπη εμφύτευση αγνοεί την πολυπλοκότητα της μοναδικό χαρακτηριστικό μακιγιάζ του φυσικού μικροπεριβάλλοντος. Πράγματι, έχει επίσης αποδειχθεί ότι η incongruent στρώμα υποδοχής μπορεί να επηρεάσει ογκογενετικότητας και τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου σε σύγκριση με την εμφύτευση στη μητρική κρεβάτι ιστού [18], [19]. Το πλεονέκτημα της επιλογής ενός ορθοτοπική προσέγγιση είναι ιδιαίτερα σημαντική για το εντερικό περιβάλλον, το οποίο είναι το σπίτι του μοναδικού ανοσολογικού κυτταρικών και μοριακών οντοτήτων που βρίσκεται σε συνεχή αλληλεπίδραση με τη μικροχλωρίδα και συστατική έκθεση σε διαιτητικά αντιγόνα.

Επιδόσεις πάνω από 200 ορθοτοπική εμφυτεύσεις CRC χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο έχει εξασφαλίσει ότι το μοντέλο αυτό είναι καλά ανεκτό και υψηλή επαναληψιμότητα. Ωστόσο, μια πιθανή επιπλοκή της διαδικασίας είναι διάτρηση του παχέος εντέρου και ενδεχομένως διαρροή αέρα και κυττάρων στην περιτοναϊκή κοιλότητα. Επί του παρόντος, στα χέρια μας, αυτή η επιπλοκή είναι σπάνια, συνιστούν λιγότερο από το 5 τοις εκατό όλων των διαδικασιών. Η θνησιμότητα κατά τη διάρκεια της διαδικασίας είναι εξαιρετικά σπάνιο και μπορεί να συμβεί λόγω της αναισθησίας ή διάτρηση. Tumor επίπτωση στην επιβίωση ποντικών (95%) είναι 100%, πάντα με αποκορύφωμα μια σόλα ανάπτυξη όγκων ειδικά στο σημείο της ένεσης. Αξίζει να σημειωθεί ότι η χρήση ενός άκαμπτου πεδίου επιτρέπει την πρόσβαση μόνο στο απομακρυσμένο ήμισυ του παχέος εντέρου και ως εκ τούτου, περιορίζει την ορθοτοπική εμφύτευση με αυτή την προσέγγιση σε αυτόν τον τομέα.

CRC εξακολουθεί να είναι η δεύτερη κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο στις πολλές βιομηχανικές χώρες. Πειράματα γίνονται σε μικρά ζώα έχουν αποδειχθεί ότι είναι απαραίτητη για την κατανόηση της παθοφυσιολογίας της νόσου, καθώς και για την προκλινική αξιολόγηση των νέων θεραπευτικών μεθόδων. Παρ ‘όλα αυτά, τα μοντέλα ποντικού CRC περιορισμένη ομοιότητα τους με την ανθρώπινη ασθένεια. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα όσον αφορά το σχηματισμό μεταστάσεων όγκου CRC. Ένα αξιοσημείωτο μειονέκτημα της CRC μοντέλα ποντικών είναι η γενική έλλειψη επεμβατική και μεταστατικό φαινότυπο [2]. Στο μοντέλο /DSS ΑΟΜ περιγράφηκαν διηθητικής κορδόνια των επιθηλιακών κυττάρων να παραβιάσει το μυϊκό βλεννογόνο και να φτάσει, επίσης, την υπο-βλεννογόνου του λεμφικού συστήματος, αν και πολύ σπάνια [20]. Ομοίως, σπάνια μάρτυρες τοπική διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων που προέρχονται από, αλλά ποτέ δεν ανιχνεύουν άπω μεταστάσεων χρησιμοποιώντας προσέγγιση μας. Τα σχετικά ταχεία κινητική ανάπτυξης που σχετίζονται με το μοντέλο μας, η οποία εξαναγκάζει την πρώιμη θυσία των εμφυτευμένων ποντικών φροντίδα ενός βαθμού 5 CRC του όγκου, είναι πιθανόν να γίνει ένα μειονέκτημα για την επαγωγή ενός μεταστατικού όγκου. Πράγματι, ακόμη και ορθοτοπική εμφύτευση ανθρώπινων κυττάρων CRC, είναι γνωστό ότι είναι επιθετικά μεταστατικά, απέτυχε να προκαλέσει μια μεταστατικού όγκου. Η κοινή εμπόδιο συμμερίζονται μοντέλα CRC ποντικού για τη δημιουργία ενός μεταστατικού όγκου μπορεί να συνεπάγεται ότι το εντερικό περιβάλλον ποντικού δεν είναι υποστηρικτική του σχηματισμού μεταστάσεων. Παρ ‘όλα αυτά, αυτό μπορεί να είναι να μετατραπεί σε ένα επιθυμητό πρότυπο σύστημα για εκείνους που επιθυμούν να διερευνήσουν τον πιθανό ρόλο των κακοηθών γονιδίων. Προς υποστήριξη αυτού, το σύστημά μας μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προκαλέσει το σχηματισμό των γενετικά τροποποιημένων όγκων στην οποία υπερεκφράζουν ή τη σιωπή γονίδια ενδιαφέροντος.

Πιστεύουμε ότι αυτό το νέο πρότυπο ορθοτοπικής CRC αποτελεί μια σημαντική τεχνική πρόοδο για οι

in-vivo

μελέτη της CRC, και μπορεί να χρησιμοποιηθεί κυρίως για τη διερεύνηση νέων θεραπευτικών μεθόδων, η γενετική των όγκων και των μηχανισμών της ανάπτυξης, και τις αλληλεπιδράσεις της στο πλαίσιο της φυσικής εντερικής μικροπεριβάλλον.

Μέθοδοι

ηθική Δήλωση

Όλες οι μελέτες σε ζώα έχουν εγκριθεί από το Sourasky Ιατρικό κέντρο επιτροπή δεοντολογίας Τελ Αβίβ για μελέτες σε ζώα και σύμφωνη με τα υψηλότερα διεθνή πρότυπα μη βάναυσης φροντίδα των ζώων στη βιοϊατρική έρευνα. αριθμό έγκρισης της επιτροπής -. 037_b3428_8

Ζώα

8-10 εβδομάδων αρσενικά C57BL /6, Balb C και αθυμικά γυμνά ποντίκια ελήφθησαν από Harlan βιοτεχνολογίας (Rehovot, Ισραήλ). 8-10 εβδομάδων αρσενικά ποντίκια NOD SCID ευγενικά παρέχεται από prof. Tsvee Lapidot (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Ισραήλ).

αθυμικά γυμνά ποντίκια υπο-lethaly ακτινοβολούνται (450 rad) πριν από την ορθοτοπική εμφύτευση ανθρώπινων κυτταρικών σειρών CRC για την εξάλειψη των ανοσο-απόρριψης. Τα ζώα είχαν απεριόριστη πρόσβαση σε τροφή και νερό, στεγάστηκαν σε θερμοκρασία και δωμάτια με ελεγχόμενη υγρασία, και κρατήθηκαν σε ένα κύκλο φωτός /σκότους 12 ωρών φωτός.

Colo-ορθού καρκινικά κύτταρα

Ποντικού C57BL /6 καρκινικά κύτταρα CRC (MC38) παρασχέθηκαν ευγενώς από τον Dr. Avi Eisenthal (Τελ Αβίβ Sourasky Medical Center). Λουσιφεράσης stably- επιμολυσμένα καρκινικά κύτταρα ποντικού CRC (CT26) παρασχέθηκαν ευγενώς από τον καθηγητή Lea Eisenbach (Weizmann Institute of Science Rehovot, Ισραήλ). Οι ανθρώπινες CRC όγκου κυτταρικές γραμμές SW620, SW480 και LS174T ευγενικά παρέχεται από prof. Zelig Eshhar (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Ισραήλ). Το ανθρώπινο CRC κυτταρική σειρά ΗΤ-29 ήταν η γενναιόδωρη προσφορά του Δρ Ιζαμπέλ Zvibel (Τελ-Αβίβ Sourasky Ιατρικό Κέντρο, Τελ-Αβίβ, Ισραήλ). Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C σε υψηλής γλυκόζης ϋΜΕΜ μέσο συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 1% πενικιλλίνη στρεπτομυκίνη αντιβιοτικό διάλυμα, 1% διάλυμα L-γλουταμίνη, και 1% νάτριο λύση πυροσταφυλικό.

Δημιουργία καρκινικών κυττάρων MC38 CRC που εκφράζουν GFP ή RFP

καρκινικά κύτταρα MC38-GFP και MC38-RFP CRC παρήχθησαν από μεταγωγή με pCSC-SP-PW-IRES-GFP /RFP φακοϊούς σχεδιαστεί για να εκφράσουν GFP ή RFP με ΜΟΙ 50 (ευγενική προσφορά από το Δρ Alon Chen, Weizmann Institute of Science Rehovot, Ισραήλ). Στη συνέχεια, τα κύτταρα MC38 που εκφράζουν GFP ή RFP ταξινομήθηκαν σε υψηλής καθαρότητας χρησιμοποιώντας ένα υψηλής ταχύτητας FACSAria II διαλογέα (Beckton-Dickinson).

Ποντικού σύστημα ενδοσκοπική

Είμαστε χρησιμοποιηθεί ένα σύστημα ενδοσκοπική βίντεο ποντίκι υψηλής ανάλυσης ( » σύστημα Coloview ») που περιγράφηκε προηγουμένως για ενδοσκοπικές διαδικασίες ποντικού [12] – [14], το οποίο αποτελείται από ένα μικροσκοπικό ενδοσκόπιο (έκταση 1,9 χιλιοστά εξωτερική διάμετρος), μια πηγή φωτός ξένον, μια τριπλή μηχανή τσιπ, και μία αντλία αέρα για να επιτευχθεί οργανωμένη πληθωρισμού του εντέρου ποντικιού (Karl Storz, Tuttlingen, Γερμανία). Η ενδοσκοπική διαδικασία προβάλλονται σε μια έγχρωμη οθόνη και ψηφιακά καταγραφεί σε κασέτα.

ορθοτοπική παχέος υπο-βλεννογόνου εμφύτευση των κυττάρων CRC

Ποντίκια αναισθητοποιούνται χρησιμοποιώντας κεταμίνη /ξυλαζίνη. Υπο-βλεννογόνου ενέσεις επιτυγχάνεται χρησιμοποιώντας ανοξείδωτο εύκαμπτο ανοξείδωτο ατσάλι? μήκους 8 ιντσών, 30 gauge και 45 μοιρών με κωνικούς υποδόριες βελόνες custom made σύμφωνα με τις προδιαγραφές μας (Cadence Inc. U.S.A). Η βελόνα εισάγεται μέσω κλειδαριά Luer (Sollner, GmbH) βιδώνεται στο κανάλι εργασίας του πεδίου εφαρμογής για να αποφευχθεί η διαρροή αέρα. Στη συνέχεια, το πεδίο εισήχθη εντός του κόλον ποντικού και μετά το φούσκωμα του η βελόνη φέρθηκε διαμέσου του καναλιού εργασίας προς τα εμπρός το πεδίο εφαρμογής της. Η διαδικασία εμφύτευσης κυττάρων CRC έγινε με δύο συντονισμένο άτομα? ένα άτομο είχε την πλοήγηση στο κολονοσκόπηση, ενώ το άλλο πρόσωπο λειτουργούσε τον ελιγμό της ένεσης. Η ένεση πραγματοποιήθηκε υπό παρατήρηση με ένα πολύ απαλό υπο-βλεννογόνου διείσδυση με την ανοικτή πλευρά της επικεφαλίδας επάνω σε μια επίπεδη γωνία λοξοτομής. Ένας όγκος 50 μικρολίτρων CRC όγκους κύτταρα στη συνέχεια εγχέεται εντός του κολονικού υπο-βλεννογόνου.

In-vivo

απεικόνισης

Για να ακολουθήσει λουσιφεράσης που εκφράζουν CT26 CRC εμφύτευση του όγκου και ανάπτυξη σε ποντικούς BALB /c, 50 μλ D-λουσιφερίνης (30 μg /ml) ήταν ip εγχύθηκε 10 λεπτά πριν και στη συνέχεια εισήχθησαν εντός του κλειστού σκοτεινού θαλάμου ολόκληρου του σώματος ποντικούς ψύχεται κάμερα CCD σύστημα Photon Imager (Biospace Lab, Γαλλία) . Για

in-vivo

οπτικοποίηση της GFP και RFP θετικούς όγκους Leica MZ16F σύστημα στερεοσκοπικής φθορισμού χρησιμοποιήθηκε (Leica Microsystems, Γερμανία).

Ιστολογίας

Οι ιστοί μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη όλη τη νύκτα στους 4 ° C, ενσωματωμένο σε παραφίνη, τεμαχίστηκαν σειριακά (15 μm), και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Sigma).

τα πλακίδια παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας το μικροσκόπιο της Olympus BX51, και την απόκτηση της εικόνας πραγματοποιήθηκε με την Η olympus DP70 κάμερα και λογισμικό DP-Manager.

CRC κινητική ανάπτυξη του όγκου

C57BL /6 ποντίκια ορθοτοπικώς υπο-βλεννογόνου ένεση με 10

3, 10

4, ή 10 κύτταρα

5 MC38. κολονικής περιφέρεια του όγκου και το στάδιο της εξέλιξής παρακολουθήθηκαν συναρτήσει του χρόνου με κολονοσκόπηση κάθε εβδομάδα για 3 εβδομάδες μετά την εμφύτευση των κυττάρων. Ενδοσκοπική ταξινόμηση έγινε σύμφωνα με το μέγεθος του όγκου σε σχέση με την περιφέρεια του παχέος εντέρου, όπως ορίζεται από τους Becker et al. [12] Εν ολίγοις, το μέγεθος του όγκου βαθμολογήθηκε ως εξής: Βαθμός 1 (μόλις ανιχνεύσιμο όγκο), Grade 2 (όγκος που καλύπτει μέχρι και 1/8 του κολονικού περιφέρεια), βαθμού 3 (όγκος που καλύπτει μέχρι και 1/4 του κολικού περιφέρεια), Grade 4 (όγκου που καλύπτουν μέχρι και το 1/2 του παχέος περιφέρεια) και βαθμού 5 (όγκων που καλύπτουν περισσότερο από το 1/2 του παχέος περιφέρεια).

Στατιστική Ανάλυση

Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA και μετά την ανάλυση με πολλαπλές δοκιμές σύγκριση Bonferroni του.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Ειδικά προσαρμοσμένη υποδερμικές βελόνες που χρησιμοποιούνται για την ένεση ορθοτοπικά τα κύτταρα όγκου εντός του κολονικού υπο-βλεννογόνου. Οι υποδόριες βελόνες κατασκευασμένα από 8 ίντσες μακρύ εύκαμπτο ανοξείδωτο ατσάλι, με 30 gauge εξωτερική διάμετρο, και ένα μικρό φάλτσο σε άγγελο 45 βαθμού. Σημειώστε ότι η βελόνα εισάγεται μέσω του κλειδώματος Luer που στη συνέχεια βιδώνεται στο κανάλι εργασίας του ενδοσκοπίου για να αποφευχθεί η διαρροή αέρα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0028858.s001

(TIF)

Εικόνα S2.

Υπο-βλεννογόνου ενέσεις PBS

– /- και σινική μελάνη. Αντιπροσωπευτικές εικόνες των δειγμάτων ιστολογίας τομές χρωματίστηκαν με Αιματοξυλίνη και εωσίνη (Η &? Ε) και απομονώθηκε από κολονικό σημείο της ένεσης την ημέρα 5 μετά την ένεση 50 μΙ (Α) σινική μελάνη (Μεγέθυνση x40), (Β) Ινδία μελάνης (μεγέθυνση χ 100), (C) PBS

– /-, σημειώστε την κανονική υγιή αρχιτεκτονική του παχέος εντέρου. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0028858.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

ορθοτοπική επαγωγή ανθρώπινων όγκων CRC σε ανοσο-ανεπαρκή ποντίκια. (Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες των δειγμάτων ιστολογίας τομές χρωματίστηκαν με Αιματοξυλίνη και εωσίνη (Η &? Ε) και απομονώθηκε κατά την ημέρα 35 παρακάτω ορθοτοπική ένεση (2 × 10

5 κύτταρα το καθένα) των ανθρώπινων κυτταρικών σειρών CRC: SW620, SW480, LS174T και ΗΤ29 σε NOD /SCID ή υπο-θανατηφόρα ακτινοβοληθέντων γυμνούς ποντικούς. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) Histo-παθολογική σύγκριση μεταξύ ανθρώπινων όγκων CRC ιδρύθηκε από την ορθοτοπική εμφύτευση SW620, ΗΤ29 και LS174T σε ανοσο-ανεπαρκή ποντίκια και ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος ανθρώπινου

doi:. 10.1371 /journal.pone.0028858.s003

(ΔΕΘ)

Movie S1.

Ενδοσκοπική ζωντανή απεικόνιση της υπο-βλεννογόνου ένεση χρωστική ουσία μελάνι Ινδία. Αντιπροσωπευτικά ενδοσκοπική απεικόνιση βίντεο που αποδεικνύουν την διαδικασία της Ινδίας-μελάνι ένεση χρωστικής εντός του κόλου υπο-βλεννογόνο του ποντικούς C57BL /6 με τη χρήση του κολονοσκόπηση σύστημα ποντικού. Σημειώστε το εστιακό υπο-επιθηλιακών διανομή ένεση χρωστικής και το υπόλοιπο της μετά την παχέος έξαψη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0028858.s004

(WMV)

Movie S2.

Ενδοσκοπική ζωντανή απεικόνιση της προοδευτικής εντοπισμένη ανάπτυξη ενός CRC-όγκου μετά ορθοτοπική εμφύτευση του. Ενδοσκοπική βίντεο απεικόνισης δείχνει την ορθοτοπική εμφύτευση κυττάρων CRC-όγκου και την προοδευτική ανάπτυξη του όγκου είχε ως αποτέλεσμα, ειδικά στο σημείο της ένεσης και σε διαφορετικά χρονικά σημεία μέσα στον ίδιο αποδέκτη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0028858.s005

(WMV)

Ευχαριστίες

θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε βαθιά Έλινορ Elmaliah για βοήθεια καλλιέργεια ιστών, Michael Kaplan για την κτηνοτροφία, Ηλίας Shezen για ιστολογική εργασία, και Ido Kilemnik (CEO Medi -Tate, Ισραήλ) για τη γενναιόδωρη συνεισφορά του στο σχεδιασμό των βελονών. Θα θέλαμε επίσης να ευχαριστήσουμε τον καθηγητή Lea Eisenbach και Prof Zelig Eshhar (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Ισραήλ) για την CT26-λουσιφεράσης ποντικού κυτταρική γραμμή CRC και SW480, SW620 & amp? LS174T ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC, αντίστοιχα.