Αφηρημένο

Ιστορικό

Η μείωση των παραγόντων αντιγραφής συχνά προκαλεί κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα. Εξάντληση των Cdc7, μιας κινάσης απαραίτητη για την έναρξη της αντιγραφής του DNA, προκαλεί θάνατο των καρκινικών κυττάρων ανεξάρτητα από το καθεστώς p53, αλλά οι ακριβείς μονοπάτια της επαγωγής κυτταρικού θανάτου δεν έχουν χαρακτηριστεί.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Έχουμε χρησιμοποιήσει το πρόσφατα ανεπτυγμένο δείκτη κυτταρικού κύκλου, Fucci, για να χαρακτηρίσει επακριβώς τη διαδικασία κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από την εξάντληση Cdc7. Έχουμε επίσης παράγονται και χρησιμοποιούνται παρόμοιες φθορίζοντες δείκτες του κυτταρικού κύκλου με τη χρήση σύντηξης με άλλες ρυθμιστικές του κυτταρικού κύκλου για να αναλύσει τους τρόπους κυτταρικού θανάτου σε ζωντανά κύτταρα σε αμφότερες ρ53-θετικών και -αρνητική υπόβαθρα. Δείχνουμε ότι οι διακριτές αποκρίσεις του κυτταρικού κύκλου που επάγεται σε ρ53-θετικών και -αρνητικοί κύτταρα με εξάντληση Cdc7. p53-αρνητικά κύτταρα κυρίως συλλάβουν προσωρινά σε G2-φάση, συσσωρεύοντας CyclinB1 και άλλα μιτωτική ρυθμιστικές αρχές. Η παρατεταμένη σύλληψη σε G2-φάση και απότομη έναρξη παρεκκλίνουσα Μ-φάσης με την παρουσία των συσσωρευμένων CyclinB1 ακολουθούνται από κυτταρικό θάνατο κατά τη μετα-μιτωτική κατάσταση. Κατάργηση της συσσώρευσης κυτταροπλασματικής CyclinB1 μειώνει εν μέρει τον κυτταρικό θάνατο. Το μονοπάτι ATR-MK2 είναι υπεύθυνη για την παγίδευση των CyclinB1 με 14-3-3σ πρωτεΐνη. Σε αντίθεση, p53-θετικά καρκινικά κύτταρα δεν συσσωρεύονται CyclinB1, αλλά φαίνεται να πεθάνουν ως επί το πλείστον μέσω της έναρξης παρεκκλίνουσα S φάση μετά την εξάντληση Cdc7. Ο συνδυασμός της αναστολής Cdc7 με γνωστούς αντικαρκινικούς παράγοντες διεγείρει σημαντικά αποτελέσματα κυτταρικού θανάτου σε καρκινικά κύτταρα σε ένα γονότυπο-εξαρτώμενο τρόπο, παρέχοντας μια στρατηγική βάση για μελλοντικές θεραπείες συνδυασμού.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η χρήση του Fucci, και παρόμοιους δείκτες κυτταρικού κύκλου φθορισμού, προσφέρει ένα βολικό σύστημα δοκιμασίας με το οποίο να προσδιορίσει γεγονότα του κυτταρικού κύκλου σχετίζεται με τον καρκίνο θάνατο των κυττάρων. Επίσης, αναφέρουν γονότυπο-ειδικούς τρόπους κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από ανεπάρκεια έναρξη της αντιγραφής του DNA στα καρκινικά κύτταρα και τις δυνατότητες αξιοποίησής του για την ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπειών του καρκίνου

Παράθεση:. Ito S, Ishii Α, Kakusho Ν, Taniyama C, Yamazaki S, Fukatsu R, et al. (2012) Μηχανισμός Cancer Cell Death Induced από εξάντληση ενός Essential Ρυθμιστής αναπαραγωγής. PLoS ONE 7 (5): e36372. doi: 10.1371 /journal.pone.0036372

Επεξεργαστής: Ο Carl G. Μάκη, του Πανεπιστημίου Rush Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19 Ιανουαρίου, 2012? Αποδεκτές: 30 Μαρ 2012? Δημοσιεύθηκε: 4η Μαΐου 2012

Copyright: © 2012 Ito et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις-in-ενισχύσεις για την βασική επιστημονική έρευνα (Α) και Grant-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα στην Περιοχή προτεραιότητας «Κύκλος χρωμόσωμα» από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας (για HM). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Cdc7 είναι μια συντηρημένη κινάση σερίνης-θρεονίνης η οποία παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην πυροδότηση της αντιγραφής [1] – [3]. Ένα βασικό υπόστρωμα είναι MCM, ένα συστατικό του prereplicative συμπλόκου (pre-RC), και φωσφορυλίωση του MCM2, 4 και 6 υπομονάδες του συμπλόκου MCM από Cdc7 ενεργοποιεί τη σύνδεση της Cdc45 με προ-RC, ένα κρίσιμο στάδιο για την παραγωγή του ένα ενεργό διχάλα αντιγραφής [4] – [6]. Cdc7 σχηματίζει ένα σύμπλοκο με Dbf4, μία υπομονάδα ενεργοποίησης, για να παράγει ένα ενεργό σύμπλεγμα κινάση [2]. Στους ανθρώπους, δύο υπομονάδες ενεργοποίησης, ASK και Drf1 /ASKL1, είναι γνωστό ότι υπάρχουν [2], [7] – [9].

Knockout του Cdc7 σε ποντικούς προκαλεί πρώιμη εμβρυϊκή θνησιμότητα. Η αδρανοποίηση των γονιδίων Cdc7 σε κύτταρα ES ποντικού είναι επίσης θανατηφόρο [10]? κύτταρα παύουν σύνθεση του DNA, συσσωρεύονται βλάβες DNA, και τελικά υποβάλλονται σε κυτταρικό θάνατο σε ένα ρ53-εξαρτώμενο τρόπο. Νοκ ντάουν πειράματα σε κύτταρα θηλαστικών αναφέρει ότι ASK είναι απαραίτητη, ενώ Drf1 /ASKL1 μπορεί να είναι απαραίτητη για την βιωσιμότητα [9], [11]. Πράγματι, η αδρανοποίηση των ASK γονιδίων σε κύτταρα ES ποντικού επίσης οδηγεί σε θνησιμότητα [12]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι Cdc7-ASK είναι ουσιώδης για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων των θηλαστικών. Από την άλλη πλευρά, Drf1 /ASKL1 μπορεί να παίζουν ένα κυρίαρχο ρόλο ως ενεργοποιητής της Cdc7 στην πρώιμη ανάπτυξη των αμφιβίων [13], [14]. Ένα ορθόλογο του Drf1 /ASKL1 δεν έχει ταυτοποιηθεί σε ποντίκια.

Σε κυτταρικό επίπεδο, knockdown του Cdc7 δείχθηκε να προκαλούν κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα, αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα, στα οποία ρ53-εξαρτώμενη οδών σύλληψη ο κυτταρικός κύκλος πιθανώς σε φάση G1 [15], [16]. Αναφέρθηκε επίσης ότι Cdc7 knockdown επάγεται ρ38-εξαρτώμενη κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα HeLa [17]. Ωστόσο, η εξάντληση Cdc7 προκαλεί κυτταρικό θάνατο επίσης σε ρ53-θετικά κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι η ρ53 μόνη της δεν μπορεί να αποτρέψει τον θάνατο των κυττάρων που προκαλείται από την εξάντληση Cdc7 σε καρκινικά κύτταρα. Προς το παρόν, οι ακριβείς μηχανισμοί της ρ53-ανεξάρτητου θανάτου κυττάρου σε Cdc7-εξαντλημένο καρκινικά κύτταρα δεν είναι γνωστή. Σε αυτή τη μελέτη, αναλύσαμε την επίδραση της εξάντλησης Cdc7 στα καρκινικά κύτταρα με τη χρήση του πρόσφατα αναπτύχθηκε δείκτης κυτταρικού κύκλου Fucci [18], καθώς και παρόμοιους δείκτες κυτταρικού κύκλου φθορισμού. σημείο αποτελέσματά μας σε διαφορικές επιδράσεις του ρ53 με τον τρόπο κυτταρικού θανάτου σε Cdc7-εξαντλημένο καρκινικών κυττάρων.

Αποτελέσματα

Η εξάντληση των Cdc7 κινάσης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα προκαλεί κυτταρικό θάνατο

Μείωση της Cdc7 σε HeLa, U2OS ή άλλων καρκινικών κυττάρων με siRNA είχε σαν αποτέλεσμα την αναστολή της σύνθεσης του DNA, η συσσώρευση των ζημιών χρωμοσώματος [αντιπροσωπεύεται από γ-H2AX εστίες) και ενδεχόμενη απώλεια βιωσιμότητας βιωσιμότητα [15], [19], [20] . Ο κυτταρικός θάνατος προκλήθηκε σε δύο ρ53-θετικά ή p53-αρνητικά καρκινικά κύτταρα, σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [15], [19]. FACS αναλύσεις του περιεχομένου DNA έδειξε ότι η εξάντληση Cdc7 οδηγεί αρχικά σε μειωμένη πληθυσμός G1, που ακολουθείται από αύξηση του πληθυσμού υπο-G1, ενδεικτική κυτταρικού θανάτου (Εικ. S1 Α και η Εικ. S2B).

Προκειμένου να διερευνηθεί η λειτουργία του κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από την εξάντληση Cdc7, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα HeLa που εκφράζουν το δείκτη κυτταρικού κύκλου, Fucci (φθορίζοντα δείκτη κυτταρικού κύκλου ουμπικουϊτίνης-based? [18]), το οποίο επιτρέπει την απεικόνιση της κατάστασης του κυτταρικού κύκλου (κόκκινο για G1 και πράσινο για S /G2 /M). HeLa-Fucci επιμολύνθηκε με Cdc7 siRNA και τα κύτταρα παρακολουθούνται για να προσδιοριστεί το στάδιο του κυτταρικού κύκλου στο οποίο υποβάλλονται σε κυτταρικό θάνατο. Ο κυτταρικός θάνατος επέρχεται τόσο σε μετα-μιτωτικά G1 και κατά τη διάρκεια S /G2 φάση /Μ σε HeLa-Fucci (Εικ. 1Α και C, ταινίες S1 και S2). Δημιουργήσαμε επίσης U2OS-Fucci και εξέτασε τη λειτουργία του κυτταρικού θανάτου σε U2OS μετά την εξάντληση Cdc7. Σε U2OS, περισσότερο από το 70% των κυττάρων πέθαναν κατά τη διάρκεια S /G2 /M φάση (πράσινο? Εικ. 1Β και C). Σε αντίθεση, η εξάντληση Cdc7 δεν προκάλεσε κυτταρικό θάνατο σε NHDF (φυσιολογικό ανθρώπινο δερματικό ινοβλάστη) κύτταρα και οδήγησε κυρίως στην G1 σύλληψη όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Εικ. S1 και δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα? [15]).

(Α κύτταρα και Β) HeLa (Α) ή U2OS (Β) που εκφράζουν Fucci υποβλήθηκαν σε θεραπεία με έλεγχο ή Cdc7-D siRNA, και time lapse εικόνα καταγράφηκε με την Olympus LCV100 (ταινίες S1 και S2). Οι εικόνες που λαμβάνονται από τα δεδομένα πάροδο του χρόνου στους χρόνους που υποδεικνύονται παρουσιάζονται. Τα ανώτατα πάνελ (έλεγχος siRNA) υποδεικνύουν κύτταρα που υφίστανται φυσιολογική κυτταρική διαίρεση. Οι αριθμοί σε κάθε χρόνο πίνακα δείχνουν (ώρες) μετά από siRNA επιμόλυνση. Κάτω δύο πίνακες (Α και Β) δείχνουν Cdc7 siRNA επεξεργασμένα κύτταρα. Μερικά κύτταρα πέθαναν σε κόκκινο χρώμα (φάση G1, α), και άλλα κύτταρα πέθαναν σε πράσινο (S /G2 /M φάση, β). Τα μήκη των σταδίων του κυτταρικού κύκλου που αναφέρεται στο πάνελ (G1, βέλη διακεκομμένες γραμμές? S /G2 /M, βέλη συμπαγείς γραμμές). Bar, 20 μm. (Γ) Τα νεκρά κύτταρα σε Cdc7 siRNA επεξεργασμένο HeLa-Fucci (αριστερά, 324 κύτταρα) ή U2OS-Fucci (δεξιά, 180 κύτταρα) μετρήθηκαν από τα δεδομένα παρέλευση χρόνου για τον προσδιορισμό των κλασμάτων των νεκρών κυττάρων σε κόκκινο και πράσινο. Ο κυτταρικός θάνατος επέρχεται τόσο σε G1 και S /G2 /M φάσεις αγωγή καρκινικά κύτταρα Cdc7 siRNA. (D, Ε και F) HeLa κύτταρα επιμολύνθηκαν με έλεγχο ή Cdc7-D siRNA και συλλέχθηκαν στις 48 ώρες (D) ή κατά τους χρόνους που υποδεικνύονται (Ε και F). Τα ολόκληρα κυτταρικά εκχυλίσματα (D) ή CSK-διαλυτά εκχυλίσματα (Ε) αναλύθηκαν με western αποτύπωση χρησιμοποιώντας τα αντισώματα υποδεικνύονται. δραστικότητα κινάσης (F) Cdc2-CyclinB1 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τις CSK-διαλυτά εκχυλίσματα. Τα ανοσοϊζήματα (IP) που χρησιμοποιείται για τις δοκιμασίες και τα εκχυλίσματα εισόδου αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Η έκταση της καταστροφής Cdc7 ήταν παρόμοια μεταξύ των HeLa και U2OS. Cdc7 δεν ήταν ανιχνεύσιμο από δυτικές μετά τη θεραπεία siRNA στα δύο κύτταρα. κύτταρα (G) HeLa υποβλήθηκαν σε αγωγή με έλεγχο ή Cdc7-D siRNA για δεικνυόμενους χρόνους, συλλέχθηκε, πλύθηκε με PBS, διογκώθηκε σε 75 mM KCl για 20 λεπτά στους 37 ° C, και σταθεροποιήθηκαν με κρυσταλλικό οξικό οξύ /μεθανόλη (1:03) διάλυμα τρεις φορές. Σταθερή χρωμοσώματα έπεσαν σε ένα γυάλινο πλακίδιο, ξηραίνεται και χρωματίστηκαν με διάλυμα 5% Giemsa σε 1/15 Μ PBS αέρα. χρωμοσώματα εξάπλωση παρατηρήθηκαν κάτω All-in-One μικροσκοπία (Keyence). Τα μιτωτικά κύτταρα με παρεκκλίνοντα τρόπο συμπυκνωμένο χρωμοσώματα μετρήθηκαν και τα κλάσματα που παρουσιάζονται. Τα ένθετα δείχνουν αντιπροσωπευτικές εικόνες των παρεκκλίνοντα συμπυκνώνεται χρωμοσωμάτων που παρατηρήθηκαν σε μια Cdc7 siRNA θεραπεία HeLa κυττάρων (αριστερά) και κατάλληλα συμπυκνώνεται χρωμοσώματα που παρατηρείται σε ένα κύτταρο ελέγχου (δεξιά). Μπαρ, 50 μm. κύτταρα (H) HeLa υποβλήθηκαν σε αγωγή με έλεγχο ή Cdc7-D siRNA για 48 ώρες, πλύθηκαν με PBS, μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με Hoechst 33342. Τα κύτταρα εξετάστηκαν υπό μικροσκόπιο LSM 510 συνεστιακή (1427 κύτταρα τα κύτταρα στα στάδια φάση Μ βαθμολογήθηκαν [Cdc7] και 1023 κύτταρα [έλεγχος]), και. Τα κλάσματα των κυττάρων σε κάθε στάδιο μιτωτική που παρουσιάζονται. (Ι) Spread και σταθεροποιήθηκαν χρωμοσώματα παρασκευάζονται σε U2OS όπως περιγράφεται παραπάνω παρατηρήθηκαν με FSX100 την Olympus μικροσκοπία. Καμία σημαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε σε μιτωτικά κύτταρα μετά την εξάντληση Cdc7. Ωστόσο, οι αριθμοί των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε σε Cdc7-εξαντλημένο κύτταρα U2OS. Μπαρ, 32 μm. Στην C, G και Η, το «η» αντιπροσωπεύει τον αριθμό των ανεξάρτητων πειραμάτων που διεξάγονται.

Η

κυτταροπλασματική συσσώρευση της πρωτεΐνης σε CyclinB1 Cdc7-εξαντλημένο κύτταρα HeLa

Η ανάλυση FACS των Cdc7- κύτταρα HeLa απεμπλουτισμένου δεν έδειξε συσσώρευση του G2 /M του πληθυσμού (Εικ. S1 Α και η Εικ. S2B). Ωστόσο, αναλύσεις Western διαφόρων πρωτεϊνών μετά την εξάντληση Cdc7 σε κύτταρα HeLa έδειξε ότι τα επίπεδα του CyclinB1, πρωτεΐνες AuroraA και PLK1 αυξημένη (Εικ. 1 D, Ε και F). Τα επίπεδα τόσο της Cdc25C, Cdc25CS216 (Εικ. 1 Ε) και η τυροσίνη 15 φωσφορυλίωση της Cdc2 αυξήθηκε επίσης (Εικ. 1 F), γεγονός που υποδηλώνει ότι G2 /M σημείο ελέγχου μπορεί να προκληθεί σε Cdc7-εξαντλημένο κύτταρα HeLa. Αν και το επίπεδο της πρωτεΐνης CyclinB1 αυξηθεί, η CyclinB1 εξαρτώμενη δραστικότητα της κινάσης Cdc2 ήταν σχεδόν η ίδια με εκείνη του ελέγχου (Εικ. 1 F). Αυτό μπορεί να οφείλεται στην ένωση με 14-3-3 πρωτεΐνες, οι οποίες μπορούν να αναστέλλουν τη δραστικότητα κινάσης (βλέπε παρακάτω), καθώς επίσης και στο σημείο ελέγχου που προκαλείται από την ανασταλτική της τυροσίνης 15 φωσφορυλίωση. Από την άλλη πλευρά, σε ρ53-θετικούς U2OS, εξάντληση των Cdc7 δεν προκαλούν συσσώρευση CyclinB1, και δεν επηρέασε CyclinB1-εξαρτώμενη δραστικότητα της κινάσης Cdc2 ή τυροσίνη 15 φωσφορυλίωση της Cdc2 (Εικ. 1 F).

Η χρώση και την παρατήρηση της Μ χρωμοσωμάτων φάσης έδειξε μια αύξηση της έκτροπα των συνοπτικών χρωμοσωμάτων σε Cdc7 siRNA-κατεργασμένα κύτταρα (Εικ. 1G). Περίπου το 50% των μιτωτικών κυττάρων εμφάνιζε τις παρεκκλίνοντα συμπυκνώνεται χρωμοσώματα σε Cdc7-εξαντλημένο κύτταρα HeLa. Επίσης, μεταφασικά να τελόφαση πληθυσμούς κυττάρων μειώθηκε σε Cdc7 siRNA επεξεργασμένα κύτταρα HeLa (Σχ. 1). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ένα μεγάλο μέρος του πληθυσμού των κυττάρων σύλληψη ή να επιβραδυνθεί σε G2 μετά την εξάντληση των Cdc7 κινάσης σε κύτταρα HeLa με παρεκκλίνοντα συμπυκνωμένο χρωμοσώματα, και ένα τμήμα των κυττάρων πεθαίνουν κατά G2 /M φάση, ενδεχομένως με μετάφαση. Ωστόσο, η ακριβής χρονική στιγμή του θανάτου των κυττάρων κατά τη διάρκεια της φάσης Μ δεν έχει προσδιοριστεί. Σε U2OS, δεν υπάρχει σημαντική διαφορά για Μ χρωμοσώματα φάσης μεταξύ Cdc7 εξαντλημένο και κύτταρα ελέγχου. Ωστόσο, οι αριθμοί των αποπτωτικών πυρήνων αυξήθηκε μετά την εξάντληση των Cdc7 σε U2OS (Εικ. 1θ). Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν επίσης ότι η χρονική στιγμή του κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από την εξάντληση Cdc7 μπορεί να διαφέρουν σε κύτταρα HeLa και U2OS.

Στη συνέχεια αναλύσαμε την κυτταρική εντόπιση της πρωτεΐνης CyclinB1 με ανοσοχρώση. Σημειώσαμε την αύξηση του CyclinB1-θετικών κυττάρων σε Cdc7 siRNA-επεξεργασμένα κύτταρα, όπως αναμένεται από την αύξηση του συνολικού επιπέδου της πρωτεΐνης CyclinB1. Μπορούμε επίσης να σημειωθεί ότι ένα σημαντικό πληθυσμό της Cdc7-εξαντλημένα κύτταρα HeLa περιέχουν CyclinB1 πρωτεΐνη στο κυτταρόπλασμα (Εικ. 2Α και Β). Για να επιβεβαιώσετε αυτό το αποτέλεσμα, εξετάσαμε την επίδραση της εξάντλησης Cdc7 χρησιμοποιώντας κύτταρα HeLa που εκφράζουν σταθερά mKO2-συγχωνευμένων πρωτεϊνών CyclinB1. Σε αυτή την κυτταρική γραμμή, τα κόκκινα σήματα φθορισμού εμφανίστηκε για πρώτη φορά στο κυτταρόπλασμα σε περίπου 10-14 ώρες μετά την κυτταρική διαίρεση. Τα σήματα ήταν ανιχνεύσιμα για περίπου 5-6 ώρες. Από τα πειράματα υποδηλώνουν ότι ο συγχρονισμός G2 /M φάσεις σε κύτταρα HeLa διαρκούν για περίπου 3-5 ώρες, CyclinB1 είναι πιθανόν να εκφράζονται από όψιμη φάση S μέσω μετάφασης. Αυτά τα σήματα μετατοπίζονται σε πυρήνες και εξαφανίζονται μετά μετάφαση (Σχήμα 2C, άνω πάνελ? Ταινία S3.), Συνεπή με την αναμενόμενη συμπεριφορά της ενδογενούς πρωτεΐνης CyclinB1, όπως φαίνεται προηγουμένως [21] – [23]. Όταν κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNA Cdc7, ο πληθυσμός των κυττάρων με ισχυρά κυτταροπλασματική κόκκινα σήματα αυξημένη, και τα σήματα αυτά έμειναν στο κυτταρόπλασμα για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα (Εικ. 2C, κάτω πάνελ και ταινία S4). Ο χρόνος που απαιτείται για τη μετάθεση των ερυθρών σημάτων σε πυρήνες μετά την εμφάνισή του στο κυτταρόπλασμα ήταν μερικά ώρες στα κύτταρα ελέγχου, ενώ αυξήθηκε το Cdc7-εξαντλημένο κύτταρα (Σχ. 2C και D, ταινίες S3 και S4). Αυτό παρατηρήθηκε επίσης και με διαφορετικές Cdc7 siRNAs (Εικ. S2 και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν με την ιδέα ότι CyclinB1 συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα σε κύτταρα HeLa σε επεξεργασία με Cdc7 siRNA. Δημιουργήσαμε επίσης κύτταρα HeLa που εκφράζουν mKO2-AuroraA. Έκφραση και τη δραστηριότητα των AuroraA, ένα από τα μιτωτικής κινασών, είναι γνωστό ότι κορυφής στη G2 /M φάση [24]. Σταθερά, τα σήματα AuroraA εμφανίστηκε φάση G2, και εξαφανίστηκαν στο τέλος της φάσης Μ σε κύτταρα ελέγχου, ενώ η διάρκεια των σημάτων AuroraA έγινε πολύ περισσότερο μετά την εξάντληση Cdc7 (Εικ. S3, ταινίες S5 και S6). Αυτό το αποτέλεσμα ήταν και πάλι παρατηρήθηκε με άλλους Cdc7 siRNAs (Εικ. S3C και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η εξάντληση Cdc7 προκαλεί το G2 καθυστέρηση του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα HeLa ταυτόχρονη με αυξημένη CyclinB1 και τα επίπεδα πρωτεΐνης AuroraA.

(Α) κύτταρα HeLa καλλιεργήθηκαν στο κάλυμμα γυαλιά, επιμολυσμένα με έλεγχο ή Cdc7-D siRNA για 48 ώρες, σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με αντίσωμα αντι-CyclinB1 που ακολουθείται από FITC-συζευγμένο αντι-ποντικού IgG και Hoechst33342. Αριστερά, Cdc7 siRNA? δεξιά, τον έλεγχο siRNA. Πράσινο, CyclinB1? μπλε, DNA. Φωτογραφίες τραβήχτηκαν από FSX100 Ολύμπου μικροσκόπιο. Μπαρ, 16 μm. (Β) Περισσότερα από 3000 κύτταρα εξετάσθηκαν και τα κύτταρα με σήματα πυρηνικού CyclinB1 βαθμολογήθηκαν και τα κλάσματα που παρουσιάζονται. «Η» αντιπροσωπεύει τον αριθμό των ανεξάρτητων πειραμάτων που διεξάγονται. κύτταρα (C) HeLa που εκφράζουν mKO2-CyclinB1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με Cdc7-D siRNA ή ελέγχουν siRNA. εικόνες πάροδο του χρόνου καταγράφηκαν από την Olympus LCV100 (ταινίες S3 και S4). Οι εικόνες που λαμβάνονται από τα δεδομένα πάροδο του χρόνου στους χρόνους που υποδεικνύονται παρουσιάζονται. Άνω, τον έλεγχο siRNA? κάτω, Cdc7 siRNA. Κόκκινο σήματα δείχνουν mKO2-CyclinB1. Τα κύτταρα siRNA που έλαβαν τον έλεγχο δείχνουν εκείνους που υποβάλλονται σε περιοδική κυτταροπλασματική εμφάνιση, πυρηνική μεταφορά, και την υποβάθμιση (άνω πάνελ), ενώ οι Cdc7 siRNA-επεξεργασμένα κύτταρα δείχνουν συνεχή ισχυρή cytoplamic σήματα για μεγάλο χρονικό διάστημα (κάτω πίνακας). Οι αριθμοί σε κάθε χρόνο πίνακα δείχνουν (ώρες) μετά τη θεραπεία siRNA. Bar: 20 μm. (Δ) Ο χρόνος (ώρες) μεταξύ της πρώτης εμφάνισης του κυτταροπλάσματος σήματος mKO2-CyclinB1 και μετατόπιση της εντός του πυρήνα μετρήθηκε στις εικόνες παρέλευση χρόνου ελέγχου ή Cdc7-D siRNA επεξεργασμένα κύτταρα HeLa. Το P-τιμή του δίπλευρη unpaired t-test υπολογίζεται από το λογισμικό Prism.

Η

Πολλοί Cdc7-εξαντλημένα κύτταρα με υψηλή κυτταροπλασματική CyclinB1 απότομα εισάγετε μίτωση μετά από μακρές G2 σύλληψη, και πολύ συχνά υποβάλλονται σε εμφανή κυτταρικού θανάτου στις ακόλουθες ώρες. Αυτό είναι παρόμοιο με την μιτωτική καταστροφή αναφερθεί στο παρελθόν [25], αλλά τα κύτταρα συγκρατούνται από προβεί σε φάση Μ με αναστολή της πυρηνικής μετατόπισης του CyclinB1, όχι στο στάδιο της ατράκτου οδοφράγματος, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως σε ένα διαφορετικό σύστημα [26]. Πράγματι, κατάργηση του σημείου ελέγχου της ατράκτου με siRNA στοχεύουν ΜΑϋ2 δεν επηρέασε την κατακράτηση CyclinB1 σε κυτόπλασμα που λαμβάνει χώρα σε απόκριση προς εξάντληση Cdc7 σε κύτταρα HeLa (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

14-3-3σ απομονώνει CyclinB1 σε το κυτταρόπλασμα μετά Cdc7 εξάντληση

το επόμενο ερώτημα είναι πώς CyclinB1 συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα. 14-3-3σ είναι συντηρημένη, καλά χαρακτηρισμένους παράγοντες, που είναι γνωστό ότι δεσμεύονται σε διάφορες ρυθμιστικές του κυτταρικού κύκλου και να διατηρούν ζωντανά στο κυτταρόπλασμα σε ορισμένες περιπτώσεις [25]. Κάθε ένα από τα επτά 14-3-3 ισομορφές εκφράστηκε, και εξετάστηκε η αλληλεπίδρασή της με Cdc2-CyclinB1. 14-3-3σ ήταν μεταξύ των ισχυρότερων συνδετικά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Εξετάσαμε αν η συσσωρευμένη CyclinB1 δεσμεύεται να 14-3-3σ σε Cdc7 εξαντλημένο κύτταρα HeLa και διαπίστωσε ότι CyclinB1-δεσμεύεται 14-3-3σ σημαντικά αυξημένη σε Cdc7 εξαντλημένο κύτταρα (Εικ. 3Α, λωρίδα 2). Επίσης, ανοσοκαθίζηση εκφράζεται παροδικά 14-3-3σ μετά την εξάντληση Cdc7 έδειξε ότι CyclinB1 και Cdc2 συνδέονται με 14-3-3σ (Σχ. 3Β). Ωστόσο, απέτυχε να ανιχνεύσει τη σύνδεση των 14-3-3σ και Cdc25C, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25], [27]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι 14-3-3σ απομονώνει το σύμπλοκο Cdc2-CyclinB1 στο κυτταρόπλασμα μετά την εξάντληση Cdc7 σε κύτταρα HeLa.

(Α) κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε αγωγή με έλεγχο ή Cdc7-D siRNA για 24 ώρες. Εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και τα προϊόντα ανοσοκαταβύθισης με αντι-CyclinB1 αντίσωμα (λωρίδες 1 και 2) και τα εκχυλίσματα εισόδου (διαδρομές 3 και 4? 20% του εκχυλίσματος που χρησιμοποιείται για ανοσοκαταβύθιση) αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. κύτταρα (Β) HeLa υποβλήθηκαν σε αγωγή με έλεγχο ή Cdc7-D siRNA, που ακολουθείται από επιμόλυνση ενός Flag-tagged 14-3-3σ εκφράζει πλασμίδιο. Εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν σε 48 ώρες μετά την siRNA διαμόλυνση και τα ανοσοϊζήματα με αντι-Flag αντισώματος (λωρίδες 1 και 2) ή κανονικό (έλεγχος) IgG (λωρίδες 3 και 4) και τα εκχυλίσματα εισόδου (διαδρομές 5 και 6? 17% του εκχυλίσματος που χρησιμοποιείται για ανοσοκαταβύθιση) αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Η σύνδεση της Cdc2 /CyclinB1 με 14-3-3σ αυξήσεις μετά την επεξεργασία Cdc7 siRNA, υποδηλώνοντας ότι 14-3-3σ διατηρεί CyclinB1 στο κυτταρόπλασμα μετά την εξάντληση Cdc7 σε κύτταρα HeLa. (Γ και Δ) HeLa κύτταρα κατεργάστηκαν με Cdc7-D siRNA, 14-3-3σ και Cdc7-D siRNAs, 14-3-3σ siRNA και τον έλεγχο siRNA για 48 ώρες. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western των ολόκληρων κυτταρικών εκχυλισμάτων. περιεχόμενα (D) DNA των κυττάρων σε C αναλύθηκαν με FACS (10,000 κύτταρα για κάθε ένα) και το κλάσμα των κυττάρων σε κάθε στάδιο του κυτταρικού κύκλου παρουσιάζεται. κύτταρα (Ε) HeLa που εκφράζουν mKO2-CyclinB1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με Cdc7-D ή /και 14-3-3σ siRNA όπως υποδεικνύεται. Ο χρόνος (ώρες) μεταξύ της πρώτης εμφάνισης του κυτοσολίου σημάτων mKO2-CyclinB1 και μετατόπιση του εντός του πυρήνα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τις εικόνες παρέλευσης του χρόνου, η οποία άρχισε στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA. Η τιμή Ρ του δίπλευρη unpaired t-test υπολογίστηκε από το λογισμικό Prism. Συν-εξάντληση των 14-3-3σ οδήγησε σε μείωση του συνολικού επιπέδου της πρωτεΐνης CyclinB1 (C), μειωμένη κυτταρικό θάνατο (D), και μείωσε τη διάρκεια της κυτταροπλασματικής κατακράτησης του (Ε).

Η

μείωση των κυτταροπλασματική συσσώρευση της CyclinB1 μειώνει μερικώς κυτταρικό θάνατο

Δεδομένου ότι τα κύτταρα συσσωρεύονται CyclinB1 στο κυτταρόπλασμα είναι επιρρεπείς σε κυτταρικό θάνατο, εξετάσαμε αν η μείωση των κυτταροπλασματικών CyclinB1 ανταγωνίζεται την επίδραση θάνατο κυττάρου εξάντληση Cdc7. Συν-εξάντληση των δύο Cdc7 και 14-3-3σ σε κύτταρα HeLa μείωσε την CyclinB1, AuroraA, PLK1 και τα επίπεδα πρωτεΐνης Cdc25C (Σχ. 3C). Ο χρόνος που απαιτείται για την πυρηνική μετατόπιση του CyclinB1 συντομευθεί και του πληθυσμού υπο-G1 κυττάρων μειώθηκε (Σχ. 3D και Ε). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η απουσία 14-3-3σ διευκολύνει τη μετάβαση G2-M και εξέλιξης στο επόμενο στάδιο του κυτταρικού κύκλου, εν μέρει διάσωση των κυττάρων από τον κυτταρικό θάνατο.

επόμενο εκφράζεται mKO2-NLS-CyclinB1, η οποία ουσιαστικώς εντοπίζεται σε πυρήνες στα κύτταρα HeLa στα τέλη του S μέσω μετάφαση. Σε αυτά τα κύτταρα, ο χρόνος που απαιτείται για τη μετάβαση από τα τέλη του S να G2 /M κόντυναν σε σύγκριση με mKO2-CyclinB1 κύτταρα που εκφράζουν και τον κυτταρικό θάνατο μερικώς παρακαμφθεί στις 48 ώρες μετά την εξάντληση Cdc7 (Σχ. 4Α και Β). Αυτό είναι σύμφωνο με μια προηγούμενη αναφορά ότι η έκτοπη έκφραση της NLS-CyclinB1 σε κύτταρα HeLa μείωσε την G2-καθυστέρηση που συμβαίνουν σε απόκριση προς ακτινοβολία ακτίνων-Χ [28]. Ωστόσο, τα κύτταρα που εκφράζουν mKO2-NLS-CyclinB1 ακόμη υπέστησαν απόπτωση σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία μετά την εξάντληση Cdc7. Αυτό μπορεί να αναμένεται εφόσον η έκφραση του πυρηνικού CyclinB1 είναι γνωστό ότι επάγουν απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα [29]. Συν-εξάντληση των CyclinB1 μειωμένη G2-επιμήκυνσης και μερικώς διασωθεί το θάνατο των κυττάρων που προκαλείται από την εξάντληση Cdc7 (Σχ. 4C, D). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την ιδέα ότι κυτταροπλασματική συσσώρευση CyclinB1 και απότομη μετατόπιση της σε πυρήνες είναι τουλάχιστον εν μέρει υπεύθυνη για την παρατηρούμενη κυτταρικό θάνατο σε κύτταρα HeLa που επάγεται από εξάντληση Cdc7 και ότι το κυτταρικό θάνατο μπορεί να προληφθεί εν μέρει τουλάχιστον με τη διευκόλυνση της μίτωσης.

κύτταρα (Α) HeLa που εκφράζουν mKO2-NLS-CyclinB1 (αριστερά) ή mKO2-CyclinB1 (δεξιά) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με έλεγχο ή Cdc7-D siRNA και παρακολουθήθηκαν από την Olympus LCV100. Τα νεκρά κύτταρα μετρήθηκαν στο χρόνο παρέλευσης εικόνες στους χρόνους που υποδεικνύονται. Ο κυτταρικός θάνατος καταστάλθηκε σε mKO2-NLS-CyclinB1 εκφράζουν κύτταρα HeLa έως 72 ώρες (στην οποία το ήμισυ των Cdc7 φτωχού κύτταρα HeLa είναι συνήθως νεκρά). mKO2-NLS-CyclinB1 πλασμίδιο κατασκευάστηκε με εισαγωγή της αλληλουχίας NLS (PPKKKRKVEDP) από το SV40 μεγάλο Τ αντιγόνο εντός του πλασμιδίου mKO2-CyclinB1 μεταξύ mKO2 και CyclinB1. Περίπου 200 ή 60 κύτταρα που εκφράζουν mKO2-NLS-CyclinB1 ή mKO2-CyclinB1, αντίστοιχα, μετρήθηκαν. «Η» αντιπροσωπεύει τον αριθμό των ανεξάρτητων πειραμάτων που διεξάγονται. κύτταρα (Β) HeLa που εκφράζουν mKO2-CyclinB1 (WT) ή mKO2-NLS-CyclinB1 (NLS) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον έλεγχο ή Cdc7-D siRNA και τη διάρκεια της έκφρασης CyclinB1 πριν μετρήθηκε έναρξη Μ φάση στις εικόνες παρέλευσης του χρόνου. Μετά εξάντληση Cdc7, κύτταρα NLS δεν συσσωρεύουν την ετικέτα CyclinB1 σε κυτταρόπλασμα, και συνεχίστηκε μέσω του κυτταρικού κύκλου περισσότερο ή λιγότερο κανονικά. κύτταρα (C) HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνύεται siRNAs για 48 ώρες. περιεχόμενα DNA αναλύθηκαν με FACS (10,000 κύτταρα για κάθε ένα) και τα κλάσματα του πληθυσμού υπο-G1 υπολογίστηκαν και παρουσιάζονται. Συν-εξάντληση των CyclinB1 μείωσε το κυτταρικό θάνατο που επάγεται από Cdc7-D siRNA σε κύτταρα HeLa. (D) κύτταρα HeLa που εκφράζουν mKO2-CyclinB1 (WT) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Cdc7-D ή Cdc7-D + CyclinB1 siRNA και ο χρόνος (ώρες) μεταξύ της πρώτης εμφάνισης του κυτοσολίου σήματος mKO2-CyclinB1 και μετατόπιση του εντός του πυρήνα μετρήθηκε σε οι εικόνες χρονικού διαστήματος κάθε κυτταρικού πληθυσμού. Κάτω ρύθμιση της έκφρασης CyclinB1 συντομευθεί τη σύλληψη G2 που προκαλείται από την εξάντληση Cdc7. Στο (Β) και (Δ), οι Ρ-τιμές των δύο ουρά unpaired t-test υπολογίστηκαν από το λογισμικό Prism.

Η

επιμήκυνση G2 προκαλείται από εξάντληση του Cdc7 σε ρ53-αρνητικά κύτταρα μέσω MK2

ενεργοποίησης

προηγουμένως αναφέρθηκε ότι το μονοπάτι ρ38-MK2 ενεργοποιείται σε κύτταρα HeLa με εξάντληση της Cdc7 [17]. Επομένως, εξετάσαμε αν αυτό το μονοπάτι εμπλέκεται στην κυτταροπλασματική συσσώρευση CyclinB1 σε Cdc7-εξαντλημένο κύτταρα HeLa. Πρώτον, επιβεβαίωσε ότι MK2 είναι υπερφωσφορυλιωμένη από εξάντληση Cdc7 σε κύτταρα HeLa, αλλά όχι σε U2OS ή NHDF κύτταρα (Σχ. 5Α). Αυτή η ενεργοποίηση του MK2 σε Cdc7-εξαντλημένο κύτταρα HeLa μπορεί να οφείλεται σε απευθείας ενεργοποίηση των MK2 με Cdc7 προκαλούμενη στρες αντιγραφής. Εναλλακτικά, αύξηση των κυττάρων φάσης G2 με εξάντληση Cdc7 μπορεί να συνεισφέρει στην ενεργοποίηση των MK2, αφού MK2 είναι γνωστό ότι είναι πιο ενεργά στην G2 και Μ φάσεις. Co-εξάντληση των Cdc7 και MK2 μείωσε τα Β1 και AuroraA επίπεδα πρωτεϊνών κυκλίνης και φωσφορυλίωση Cdc25C Ser216, γεγονός που υποδηλώνει ότι μίτωση είναι μερικώς αποκατασταθεί (Εικ. 5Β). Μείωσε, επίσης, τη δέσμευση της 14-3-3σ και CyclinB1 /Οάο2 (Εικ. 5C). Ωστόσο, συν-εξάντληση των Cdc7 και MK2 δεν εμπόδισε το θάνατο των κυττάρων HeLa, προφανώς επειδή εξάντληση MK2 μόνος επάγεται σημαντική κυτταρικό θάνατο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) HeLa (διαδρομές 1, 2, 7 και 8 ), U2OS (λωρίδες 3 και 4) και NHDF (διαδρομές 5 και 6) κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον έλεγχο ή Cdc7 siRNA και το σύνολο κυτταρικά εκχυλίσματα έτρεξαν σε phosgel και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. Οι λωρίδες 7 και 8, εκχυλίσματα από Cdc7 siRNA-επεξεργασμένα κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν μη-επεξεργασμένα (-) ή επεξεργασμένα με λ-φωσφατάση (+). Βέλη δείχνουν την φωσφορυλιωμένη μπάντα MK2. κύτταρα (Β) HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNA μάρτυρα (διαδρομές 1 και 5), Cdc7 siRNA (λωρίδες 2 και 6), Cdc7 και MK2 siRNAs (λωρίδες 3 και 7) και MK2 siRNA (λωρίδες 4 και 8) για 48 ώρες, και CSK-διαλυτό (λωρίδες 1-4? Sup) και αδιάλυτων (λωρίδες 5-8? Ppt) πρωτεΐνες αναλύθηκαν με western αποτύπωση. Τουμπουλίνης και LaminB δείχνονται σαν μάρτυρες φόρτωσης. σφαιρίδια (C) γλουταθειόνης Sepharose 4Β μεταφέρουν GST-14-3-3σ πρωτεΐνη επωάστηκε για 1 ώρα στους 4 ° C με CSK-διαλυτά εκχυλίσματα κυττάρων HeLa σε επεξεργασία με siRNA, όπως φαίνεται. Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες εξετάστηκαν με κηλίδωση Western. «Input» αντιπροσωπεύει μόνο τα αποσπάσματα χωρίς προσθήκη GST-14-3-3σ πρωτεΐνη. Cdc7 και MK2 συν-εξάντληση μειώνεται η πρόσδεση μεταξύ 14-3-3σ και Cdc2 /CyclinB1. κύτταρα (D) HeLa που εκφράζουν mKO2-CyclinB1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με υποδεικνυόμενη siRNAs. Ο χρόνος (ώρες) μεταξύ της πρώτης εμφάνισης του κυτοσολίου σήματος mKO2-CyclinB1 και μετατόπιση του εντός του πυρήνα μετρήθηκε στις εικόνες παρέλευσης του χρόνου. Συν-εξάντληση του MK2, ρ38 (ανάντη κινάση του MK2) ή ATR μειωμένη κυτταροπλασματική κατακράτηση CyclinB1 (επιμήκυνση G2) παρατηρήθηκε σε Cdc7-εξαντλημένο κύτταρα HeLa. Οι Ρ-τιμές των δύο ουρών μη ζευγαρωμένο t-test υπολογίστηκαν από το λογισμικό Prism. Cdc7-D siRNA χρησιμοποιήθηκε σε όλα τα πειράματα.

Η

Ο χρόνος που απαιτείται για την πυρηνική μετατόπιση μετά την ταυτόχρονη εξάντληση των Cdc7 και MK2 κόντυναν κοντά στο επίπεδο του ελέγχου. Επιπλέον, η επιμήκυνση G2 που παρατηρείται μετά την εξάντληση Cdc7 ακυρώθηκε επίσης με συν-εξάντληση του ATR ή ρ38 με Cdc7 (Σχ. 5D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι αυτό το G2 σημείο ελέγχου εξαρτάται από την ATR-ρυθμιζόμενη ενεργοποίηση MK2.

Η κυτταροπλασματική συσσώρευση CyclinB1 δεν συμβαίνουν σε p53-θετικά U2OS ή HCT116 μετά Cdc7 εξάντληση

Αν και η εξάντληση Cdc7 στα κύτταρα U2OS (ανθρώπινου οστεοσαρκώματος), που προκαλείται από έντονη κυτταρικό θάνατο, τα επίπεδα των μιτωτικών κινασών δεν αυξάνουν (Εικ. 1). Ως εκ τούτου, ιδρύθηκε U2OS που εκφράζουν σταθερά mKO2-CyclinB1, και εξέτασε την επίδραση της Cdc7 siRNA στη δυναμική CyclinB1. Σε αυτή την κυτταρική γραμμή, δεν παρατηρήσαμε καμία συσσώρευση CyclinB1 στο κυτταρόπλασμα μετά την εξάντληση Cdc7. Ο χρόνος που απαιτείται για την πυρηνική μετατόπιση σε Cdc7-εξαντλημένο κύτταρα U2OS ήταν παρόμοια με εκείνη των κυττάρων ελέγχου (Σχ. 6Α). Ωστόσο, κατέστη πλέον όταν ρ53 συν-εξαντλημένο (Σχ. 6Α). Το επίπεδο της πρωτεΐνης CyclinB1 ελαφρώς αυξημένη μετά από συν-εξάντληση των Cdc7 και ρ53 σε U2OS (Εικ. 6Β). Στη συνέχεια εξετάσαμε μια κυτταρική γραμμή καρκίνου του παχέος εντέρου, HCT116. Σε p53-θετικό καρκίνο HCT116 κύτταρα, τα επίπεδα των μιτωτικών πρωτεϊνών όπως CyclinB1 και PLK1 μειώθηκαν μετά την εξάντληση Cdc7 προφανώς λόγω G1 σύλληψη (Εικ. 7Α). Ταυτοχρόνως, η δραστηριότητα /CyclinB1 Cdc2 ήταν επίσης μειωμένη σε Cdc7-εξαντλημένο ρ53-θετικά κύτταρα HCT116 (Εικ. 7Β). Ο χρόνος που απαιτείται για την πυρηνική μετατόπιση σε Cdc7-εξαντλημένο ρ53-θετικών κυττάρων HCT116 ήταν παρόμοια με εκείνη των κυττάρων ελέγχου (Σχ. 7C, αριστερό πάνελ). Σε αντίθεση, Cdc2 δραστηριότητα /CyclinB1 σε ρ53-αρνητική HCT116 μετά την εξάντληση Cdc7 ήταν σχεδόν η ίδια με εκείνη του ελέγχου (Εικ. 7Β). Επιπλέον, όπως φαίνεται σε κύτταρα HeLa, ο χρόνος που απαιτείται για την πυρηνική μετατόπιση σε Cdc7-εξαντλημένο p53-αρνητικά κύτταρα HCT116 ήταν μεγαλύτερη από εκείνη του μάρτυρα (Σχ. 7C, δεξιό πλαίσιο). Αυτή η επιμήκυνση G2 ακυρώθηκε από την συν-εξάντληση των Cdc7 και MK2 σε p53-αρνητικά HCT116 κύτταρα (Σχ. 7C, δεξί πάνελ). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η επιμήκυνση φάση G2 μετά την εξάντληση Cdc7 εξαρτάται από την απουσία της πρωτεΐνης ρ53 [15], [30] – [32]

(Α) κύτταρα που εκφράζουν U2OS mKO2-CycinB1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNAs και το χρόνο. παρέλευση εικόνες καταγράφηκαν από LCV100. Ο χρόνος (ώρες) μεταξύ της πρώτης εμφάνισης του κυτοσολίου σήματος mKO2-CyclinB1 και μετατόπιση του εντός του πυρήνα μετρήθηκε στις εικόνες χρονικού διαστήματος του κάθε κυτταρικού πληθυσμού. Σε Cdc7 εξαντλημένο U2OS, CyclinB1 δεν συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα. Ωστόσο, συν-εξάντληση των Cdc7 και p53 προκάλεσε συσσώρευση CyclinB1 σε κυτόπλασμα για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. Οι Ρ-τιμές των δύο ουρών μη ζευγαρωμένο t-test υπολογίστηκαν από το λογισμικό Prism. (Β) Ανάλυση Western των ολόκληρων κυττάρων εκχυλίσματα κυττάρων U2OS σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενη siRNAs για 48 ώρες. Ένα phosgel χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του MK2. Άλλες πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν σε πήκτωμα διαβάθμισης 4-12%.

Η

(Α) ρ53-θετικά ή -αρνητική HCT116 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον έλεγχο ή Cdc7-D siRNA επί 48 ώρες, και τα εκχυλίσματα ολικού κυττάρου αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. (Β) CSK-διαλυτά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν από τα ίδια κύτταρα όπως στο (Α) και ανοσοκαθίζηση διεξήχθη με αντίσωμα αντι-CylinB1. δραστικότητα κινάσης Cdc2-CyclinB1 μετρήθηκε με ιστόνη Η1 ως υπόστρωμα (άνω πάνελ), όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι». Το παρακάτω γράφημα δείχνει την ποσοτικοποίηση του επιπέδου φωσφορυλίωσης. Κάτω πάνελ, κηλίδωση Western αναλύσεις πρωτεϊνών CyclinB1 στα ανοσοκαθιζήματα που χρησιμοποιούνται για τις δοκιμασίες κινάσης. (C) ρ53-θετικών (αριστερά) ή -αρνητική (δεξιά) κύτταρα HCT116 που εκφράζουν mKO2-CyclinB1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με καταγράφηκαν υποδεικνύεται εικόνες παρέλευση siRNA και χρόνο. Ο χρόνος (ώρες) μεταξύ της πρώτης εμφάνισης του κυτοσολίου σήματος mKO2-CyclinB1 και μετατόπιση του εντός του πυρήνα μετρήθηκε στις εικόνες παρέλευσης του χρόνου. Οι Ρ-τιμές των δύο ουρών μη συζευγμένη δοκιμασία t υπολογίστηκε με το λογισμικό Prism.

Η

Πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι ο παράγοντας μεταγραφής FoxO3 εμπλέκεται στην G1 σύλληψη, που προκαλείται από την εξάντληση της Cdc7 σε φυσιολογικά κύτταρα [16]. FOXM1, ένα άλλο μέλος της οικογένειας Fox, είναι γνωστό ότι ρυθμίζει την έκφραση των μιτωτικών ρυθμιστές όπως Plk, CyclinB1 και κυκλίνη μετά από βλάβη του DNA [33] – [36]. Η έκφραση του FOXM1 ρυθμίζεται αρνητικά από p53 [37], [38]. Σε HeLa, δείχνουμε ότι τα επίπεδα του mRNA της FOXM1 αυξήθηκε μετά την εξάντληση Cdc7 (Εικ. 8Α), η οποία μπορεί επίσης να είναι εν μέρει υπεύθυνη για την αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης FOXM1 υπό τις ίδιες συνθήκες. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι αυτοί οι παράγοντες Fox οικογένεια μεταγραφής μπορεί να εμπλέκεται στην διακοπή του κυτταρικού κύκλου και η επαγωγή του κυτταρικού θανάτου από εξάντληση Cdc7 σε ρ53-αρνητικά κύτταρα. Διπλή knockdown του Cdc7 και FOXM1 σε κύτταρα HeLa μειώνεται δραματικά το επίπεδο CyclinB1 mRNA σε σύγκριση με εξάντληση Cdc7 μόνο. Το επίπεδο της πρωτεΐνης CyclinB1 μειώθηκε επίσης από συν-εξάντληση των Cdc7 και FOXM1, αλλά όχι στην έκταση του επιπέδου mRNA (σχ. 8Β). εξάντληση FOXM1, ωστόσο, δεν καταργεί τη σύλληψη G2 ή να μειώσει τον κυτταρικό θάνατο (Σχ. 8D, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).