Αφηρημένο

Εμείς περιγράφεται πρόσφατα το μιτοχονδριακό εντοπισμό και την εισαγωγή του υποδοχέα της βιταμίνης D (VDR) στα ενεργά πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα HaCaT, για πρώτη φορά, αλλά ο ρόλος του στο οργανίδιο παραμένει άγνωστη. Πολλοί μεταβολικά ενδιάμεσα που υποστηρίζουν την ανάπτυξη των κυττάρων παρέχονται από τα μιτοχόνδρια? Κατά συνέπεια, η ταυτοποίηση των πρωτεϊνών που ρυθμίζουν μιτοχονδριακή μεταβολικών οδών έχει μεγάλο ενδιαφέρον, και επιδιώξαμε να καταλάβουμε αν VDR μπορούν να ρυθμίσουν αυτές τις οδούς. Εμείς γενετικά σιγήσει VDR στα κύτταρα HaCaT και μελέτησε τις επιπτώσεις στην ανάπτυξη των κυττάρων, μιτοχονδριακό μεταβολισμό και βιοσυνθετικών οδών. VDR knockdown οδήγησε σε ισχυρή αναστολή της ανάπτυξης, με συσσώρευση στην G0G1 φάση του κυτταρικού κύκλου και μειώθηκε συσσώρευση στη φάση Μ. Οι επιδράσεις του VDR αποσιώπησης στον πολλαπλασιασμό επιβεβαιώθηκαν σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές γραμμές του ανθρώπου. Μειωμένη έκφραση VDR παρατηρήθηκε σταθερά σε δύο διαφορετικά μοντέλα κυτταρικής διαφοροποίησης. Η απομείωση της σιγήσει ανάπτυξη των κυττάρων HaCaT συνοδευόταν από απότομη αύξηση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης, η οποία ευαισθητοποιηθεί τα κύτταρα σε οξειδωτικό στρες. Βρήκαμε ότι η μεταγραφή του υπομονάδες II και IV της οξειδάσης του κυτοχρώματος c αυξήθηκε σημαντικά κατά VDR αποσιώπηση. Κατά συνέπεια, η θεραπεία των κυττάρων HaCaT με βιταμίνη D ρυθμίζεται προς τα κάτω και τις δύο υπομονάδες, γεγονός που υποδηλώνει ότι VDR μπορεί να αναστέλλει την αναπνευστική αλυσίδα και ανακατευθύνουν ενδιάμεσα TCA προς βιοσύνθεση, συμβάλλοντας έτσι στην μεταβολική διακόπτη που είναι χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων. Προκειμένου να διερευνήσουν την υπόθεση αυτή, εξετάσαμε διάφορα ακετυλο-ΟοΑ-εξαρτώμενη βιοσυνθετικές οδούς, όπως mevalonate οδό (μετρούμενη ως βιοσύνθεση χοληστερόλης και πρενυλίωση των μικρών GTPases), και τα επίπεδα ακετυλίωσης ιστόνης? Όλες αυτές οι οδοί ανεστάλησαν από VDR σίγηση. Αυτά τα δεδομένα παρέχουν στοιχεία για το ρόλο του VDR ως φύλακα της μιτοχονδριακής δραστηριότητας αναπνευστικής αλυσίδας και διευκόλυνσης της εκτροπής του ακετυλο-CoA από τον κύκλο TCA παραγωγής ενέργειας προς βιοσυνθετικών οδών που είναι απαραίτητες για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό.

Παράθεση: Consiglio Μ, DESTEFANIS Μ, Morena D, Foglizzo V, Forneris Μ, Pescarmona G, et al. (2014) Το Δ υποδοχέα της βιταμίνης Αναστέλλει την αναπνευστική αλυσίδα, Συμβολή στην Μεταβολικό διακόπτη που είναι απαραίτητη για τον Καρκίνο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. PLoS ONE 9 (12): e115816. doi: 10.1371 /journal.pone.0115816

Επιμέλεια: Makoto Makishima, Nihon University School of Medicine, Ιαπωνία

Ελήφθη: 9, Αυγούστου 2014? Αποδεκτές: 27 Νοεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 29 Δεκεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Consiglio et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Ministero dell’Istruzione Università e Ricerca. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο υποδοχέας της βιταμίνης D (VDR), μαζί με τα άλλα μέλη της οικογένειας υποδοχέων στεροειδούς ορμόνης, έχει γενικά περιγραφεί ως ένα κλασσικό παράγοντα μεταγραφής συνδετήρα-διαμορφωμένο. Τα διαφοροποίηση των αποτελεσμάτων της VDR ενεργοποιείται από επάγεται με συνδέτη πυρηνική μετατόπιση και πρόσδεση σε βιταμίνη D στοιχείο απόκρισης (VDRE) θέσεις σε ρυθμιζόμενες γονίδια, σε συνεργασία με τους εταίρους ετεροδιμερισμό, συνενεργοποιητές και συγκαταστολείς. Οι διαφορές σε δέσμευση συνκαταστολέα και μεθυλίωσης του DNA απεικονίζουν τις βαθιές μεταβλητότητα του VDR αντιπολλαπλασιαστικής αποκρίσεις σε διαφορετικά μοντέλα κυττάρου [1]. Αντοχή στις πυρηνικές επιδράσεις της βιταμίνης D έχει αναφερθεί σε διάφορα μοντέλα καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του προστάτη, του μαστού και της ουροδόχου κύστης, με την οποία αυξημένη συγκαταστολέας έκφραση και εντοπισμός έχει κριθεί ότι είναι υπεύθυνη για την έλλειψη ευαισθησίας προς την ορμόνη [2] – [4 ].

οι υποδοχείς στεροειδών έχουν επίσης ένα μη γονιδιωματικών τροπικότητα της δράσης, ιδίως σε μεμβράνη πλάσματος ή μιτοχονδριακό χώρους, και το VDR δεν αποτελεί εξαίρεση. Στην πραγματικότητα, η ταχεία, μη γονιδιωματικών επιδράσεων της βιταμίνης D φαίνεται να διαμεσολαβείται από την VDR [5] – [7]. Πολλοί υποδοχείς στεροειδών και πυρηνικούς παράγοντες μεταγραφής εισέλθουν στην μιτοχονδριακή διαμέρισμα, όπου είτε ασκούν μεταγραφική ρύθμιση του μιτοχονδριακού DNA ή ελέγχουν μιτοχονδριακό βιογένεση και τον μεταβολισμό [8] – [11]. Έχουμε περιέγραψε πρόσφατα την μιτοχονδριακή εντοπισμό του VDR σε ένα κερατινοκυττάρων ανθρώπινη κυτταρική σειρά πολλαπλασιαζόμενο (HaCaT) για πρώτη φορά και έδειξαν ότι μιτοχονδριακή εισαγωγή του υποδοχέα διαμεσολαβείται από το σύμπλοκο πόρου μετάπτωσης διαπερατότητας [12]. Ωστόσο, η λειτουργία του VDR σε αυτήν οργανίδιο παραμένει να διευκρινιστεί. Τα μιτοχόνδρια είναι οργανίδια πολυλειτουργικό και μιτοχονδριακή δραστηριότητα είναι σημαντική για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη φυσιολογία. Για παράδειγμα, τα μιτοχόνδρια παίζουν βασικούς ρόλους στην κυτταρική ενέργεια (ATP) παραγωγή μέσω του κύκλου τρικαρβοξυλικού οξέος (TCA) συζευγμένο με οξειδωτική φωσφορυλίωση (OXPHOS), καθώς επίσης και κατά την διάρκεια της απόπτωσης μέσω αντιδραστικά είδη οξυγόνου απελευθέρωσης C (ROS) και κυτόχρωμα. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι μιτοχονδριακή δυσλειτουργία συμβάλλει στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των διαφόρων ανθρώπινων ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [13]. Ένα χαρακτηριστικό των κυττάρων του όγκου μεταβάλλεται ο μεταβολισμός υποστήριξης της ταχείας κυτταρικό πολλαπλασιασμό [14]. Πολλές μεταβολικά ενδιάμεσα που υποστηρίζουν την ανάπτυξη των κυττάρων που παρέχονται από τα μιτοχόνδρια [15]? Κατά συνέπεια, η ταυτοποίηση των πρωτεϊνών που ρυθμίζουν μιτοχονδριακή μεταβολικών οδών έχει μεγάλο ενδιαφέρον, και επιδιώξαμε να καταλάβουμε αν το VDR μπορεί να διαμορφώσει αυτά τα μονοπάτια.

Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιώντας περιγράφηκε προηγουμένως το μοντέλο μας (η πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων HaCaT line), έχουμε γενετικά σιγήσει τον υποδοχέα και εξετάστηκαν οι επιπτώσεις στην ανάπτυξη των κυττάρων, μιτοχονδριακό μεταβολισμό και βιοσυνθετικών οδών. Τα δεδομένα που συλλέχθηκαν παρέχουν ενδείξεις ενός νέου ρόλου του VDR ως αρνητικός ρυθμιστής της δραστηριότητας της αναπνευστικής αλυσίδας, και έχουμε τονίσει τις επιπτώσεις για την κυτταρική αναβολισμός και την ανάπτυξη που παράγεται από το VDR για μιτοχονδριακή αναπνοή. Με βάση τις παρατηρήσεις μας, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι το VDR, με τον περιορισμό της μιτοχονδριακής αναπνευστικής δραστηριότητας, επιτρέπει στο κύτταρο να διαθέσετε μεταβολικές ενδιάμεσα, το οποίο μπορεί να εκτραπεί από το οξειδωτικό μεταβολισμό προς ένα μοίρα βιοσύνθεσης, υποστηρίζοντας την ανάπτυξη των κυττάρων. Εμείς επικυρωθεί το γενικό ρόλο του VDR ως ενισχυτής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού που εκτείνονται τις παρατηρήσεις μας σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές σειρές άνθρωπο.

Αποτελέσματα

VDR σίγηση σε κύτταρα HaCaT παρεμποδίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό

Επειδή στο παρελθόν χαρακτηρίζεται VDR μιτοχονδριακή εισαγωγή στα κύτταρα HaCaT, χρησιμοποιήσαμε αυτό το μοντέλο για τη διερεύνηση της λειτουργίας VDR χρήση γενετικών αποσιώπηση. Η μείωση των επιπέδων VDR κατά την παράδοση λεντοϊού της shRNA που είχε εγείρει κατά του ανθρώπινου VDR ήταν αξιοσημείωτη, όπως αποδεικνύεται από mRNA και πρωτεΐνης αναλύσεις στο σχ. 1Α και 1Β, και προκάλεσε ισχυρή αναστολή της ανάπτυξης σε κύτταρα HaCaT, όπως αξιολογείται χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία πολλαπλασιασμού, η οποία υπογράμμισε προφανή μείωση του ρυθμού αύξησης των VDR-σιγήσει κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (εικ. 1 C). διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων που χαρακτηρίζεται από την συσσώρευση του γκρεμίζω κυτταρικό πληθυσμό VDR στη φάση G0 /G1 του κυτταρικού κύκλου και μία μείωση στον πληθυσμό των κυττάρων Μ φάσης (εικ. 1D). Κανένα σημάδι των αποπτωτικών ή πάσχουν κύτταρα ήταν εμφανής στα σιωπή κύτταρα, όπως αποδεικνύεται από την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, η οποία δεν αποκάλυψε μια κορυφή sub-G0, και την δοκιμασία τοξικότητας ΜΤΤ, η οποία αποκάλυψε ταυτόσημες βιωσιμότητα στον έλεγχο και σιγήσει κύτταρα (εικ. 1Ε).

κύτταρα Υποσυρρέουσες HaCaT μολύνθηκαν με λεντοϊού VDR shRNA 3 και shRNA σωματίδια ελέγχου. Επτά ημέρες μετά την μόλυνση και την επιλογή πουρομυκίνης, η έκφραση VDR αξιολογήθηκε σε κυτταρικά εκχυλίσματα. τα επίπεδα έκφρασης του mRNA (Α) ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση σε πραγματικό χρόνο των VDR μεταγραφές, και οι τιμές εκφράζονται ως φορές αλλαγές στα σιγήσει κυττάρων σε σύγκριση με τους ελέγχους. (Β) έκφραση VDR στα μιτοχονδριακά κλάσματα (αριστερά πάνελ) και η συνολική λύματα (δεξιά πάνελ) από shRNA επιμολυσμένα ελέγχου και shRNA επιμολυσμένα κύτταρα VDR αναλύθηκε χρησιμοποιώντας westem αποτύπωση. Τουμπουλίνης ανιχνεύονται σε ολικά εκχυλίσματα και τα επίπεδα VDAC σε μιτοχονδριακή κλάσματα χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι για την πρωτεΐνη φόρτωσης. Οι επιδράσεις του VDR αποσιώπησης στον πολλαπλασιασμό αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία ιώδες κρύσταλλο σε κύτταρα που είχαν χρωματίστηκαν σε διάφορες χρονικές στιγμές μετά την σπορά (C), καθώς επίσης και τη χρησιμοποίηση ανάλυσης κυτταρικού κύκλου (D) σε κύτταρα που συλλέχθηκαν κατά την ημέρα 7 μετά την μόλυνση . (Ε) Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ την ημέρα 7 μετά την μόλυνση και οι τιμές εκφράζονται ως το ποσοστό απορρόφησης του ελέγχου shRNA. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * P & lt?. 0.05 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Το διαφοροποίησης και αντι-πολλαπλασιαστική δράση της βιταμίνης D in vitro έχει περιγραφεί προηγουμένως στη βιβλιογραφία. Τέτοια αποτελέσματα που προκαλούνται από τον μεταγραφικό έλεγχο, ο οποίος προηγείται πυρηνική μετατόπιση και δεν παρουσιάζεται σε D-διεγερμένα κύτταρα HaCaT βιταμίνη [12]. κύτταρα HaCaT φαίνεται να είναι ανθεκτικός στις πυρηνικές αντιπολλαπλασιαστικά αποτελέσματα της βιταμίνης D, και κατά συνέπεια, βρήκαμε ότι η θεραπεία βιταμίνης D δεν μετέβαλε το ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων HaCaT (όπως φαίνεται στο S1. εικόνα). Έτσι, τα κύτταρα HaCaT αντιπροσωπεύουν ένα μοντέλο αντίστασης στις διαφοροποίηση ιδιότητες της βιταμίνης D, και δεν υπάρχει καμία δυσαρμονία μεταξύ του πυρηνικού αντιπολλαπλασιαστική ρόλος της βιταμίνης D που περιγράφονται στη βιβλιογραφία και τα πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα που ασκούνται από VDR στο μοντέλο των κυττάρων μας. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων μας σιγαστήρα δείχνουν ότι VDR σε κύτταρα HaCaT αυξάνει την ανάπτυξη των κυττάρων.

Μιτοχονδριακή εντοπισμός του VDR είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό των ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών, και σίγηση υποδοχέα αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό

προκειμένου να εκτιμηθεί κατά πόσον τα μιτοχόνδρια μπορούν να θεωρηθούν ότι είναι ένα κανονικό στόχο του VDR, αξιολογήσαμε την έκφρασή του σε ένα πάνελ ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών και των προαναφερθέντων HaCaT κύτταρα (εικ. 2Α). Σε κάθε κυτταρική σειρά που βρέθηκαν θετικά για έκφραση VDR, η μιτοχονδριακή εκχυλίσματα αναλύθηκαν μέσω στύπωση western και αποκάλυψε την παρουσία του υποδοχέα. Υποθέσαμε ότι εάν το VDR ήταν το σήμα κατατεθέν της πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα και είχαν τη δυνατότητα να διευκολύνουν την ανάπτυξη των κυττάρων, όπως προτείνεται από τον φαινότυπο που παρατηρείται σε σιγήσει κύτταρα HaCaT, τότε θα μπορούσε εύκολα να γλιτώσει, ή ακόμη και να εξαλειφθούν, σε μια διαφοροποιημένη κατάσταση. Έτσι, αξιολογήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης VDR σε δύο μοντέλα, επιτρέποντας την εξέταση των ανθρώπινων κυττάρων πολλαπλασιαζόμενα και διαφοροποιημένα ομολόγων τους: Συγκρίναμε HaCaT πολλαπλασιαζόμενα κερατινοκύτταρα σε πλήρως διαφοροποιημένα πρωτογενή κερατινοκύτταρα και τα κύτταρα ραβδομυοσαρκώματος RD18 που είχαν προκληθεί για διαφοροποίηση από την υπό όρους έκφραση του miR-206 [16]. Μιτοχονδριακή εκχυλίσματα και των δύο διαφοροποιημένων κυτταρικών πληθυσμών αποκάλυψε μειωμένη έκφραση του υποδοχέα σε σύγκριση με τα επίπεδα που παρατηρούνται σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα (εικ. 2Β).

(Α) έκφραση VDR αναλύθηκε σε ένα πάνελ πολλές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας westem αποτύπωση συνολικά λύματα (TOT VDR) και μιτοχονδριακή εκχυλίσματα (mitoc VDR). Για τα κύτταρα RD και MCF7, ανίχνευση VDR απαιτείται μεγαλύτερη διάρκεια της έκθεσης σε ECL. (Β) Δύο μοντέλα κυτταρικής διαφοροποίησης χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση των επιπέδων VDR στο συνολικό λύματα και μιτοχονδριακή κλάσματα: Ανθρώπινα κύτταρα πολλαπλασιαζόμενα HaCaT εναντίον ανθρώπινων πρωτογενών διαφοροποιημένων κερατινοκυττάρων και την διαφοροποίηση κυττάρων που επάγονται RD18 μεταφέρουν ένα δοξυκυκλίνη επαγόμενο miR-206 που εκφράζουν φορέα λεντοϊού υπό την απουσία (δεν είχαν επαχθεί: NI) ή παρουσία δοξυκυκλίνης για τέσσερις (προκαλούμενη: IND4) και έξι ημέρες (που προκαλείται από: IND6). Τουμπουλίνης ανιχνεύονται σε ολικά εκχυλίσματα και τα επίπεδα VDAC σε μιτοχονδριακή κλάσματα χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι για την πρωτεΐνη φόρτωσης. Οι κηλίδες είναι αντιπροσωπευτικά μιας σειράς τριών ανεξάρτητων πειραμάτων

Η

Αφού εντόπισε την ευρέως διαδεδομένη μιτοχονδριακή έκφρασης του VDR, επιδιώξαμε να επιβεβαιώσει ότι VDR κατάλυση θέτει σε κίνδυνο τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό.? Έτσι, καταργείται η έκφραση VDR σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας γενετική σίγηση. έκφραση VDR σίγησε σε όλες τις κυτταρικές σειρές VDR-θετικό, καθώς και τα κύτταρα HaCaT, και η έκφραση του υποδοχέα και πάλι έντονα μειωμένη, όπως αξιολογείται τόσο στα ολικά εκχυλίσματα και τα κλάσματα των μιτοχονδρίων (εικ. 3Α). Οι παρατηρήσεις που έγιναν σε κύτταρα HaCaT έντονα υποστηρίζεται από τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων knockdown επειδή ο πολλαπλασιασμός όλων των κυττάρων ανεστάλη έντονα από VDR σίγηση. Στην πραγματικότητα, ήμασταν σε θέση να αποδείξουν μια γενική μείωση του ρυθμού πολλαπλασιασμού του συνόλου των σιγήσει κυττάρων, η οποία ήταν παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε στα κύτταρα HaCaT, όταν η ανάπτυξή τους εκτιμήθηκε μεταξύ 72 ώρες και 5 ημέρες σε σύγκριση με εκείνη του άγριου τύπου κύτταρα (εικ. 3Β). Η σιγήσει φαινότυπος επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας μια διαφορετική shRNA για την VDR (shRNA 4, όπως περιγράφεται στο τμήμα των Μεθόδων), το οποίο ήταν τόσο αποτελεσματική σε επιβάλλει σιωπή στο VDR ως shRNA 3 και μειώθηκε επίσης την ανάπτυξη των κυττάρων (S2 εικ.). Επιπλέον, όταν διατύπωσε shRNA που ήταν αναποτελεσματική όσον αφορά την VDR σίγηση (shRNA 2, όπως περιγράφεται στην ενότητα Μέθοδοι) ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων HaCaT δεν περιορίζεται (S2 εικ.).

(Α) τα κύτταρα μολύνθηκαν με λεντοϊού VDR shRNA 3 ή shRNA ελέγχου και την αποτελεσματικότητα σίγηση εξετάστηκε τόσο στο σύνολο και μιτοχονδριακή εκχυλίσματα χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. Τουμπουλίνης ανιχνεύονται σε ολικά εκχυλίσματα και τα επίπεδα VDAC σε μιτοχονδριακή κλάσματα χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι για την πρωτεΐνη φόρτωσης. (Β) Τόσο τα σιγήσει και κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε δοκιμασίες πολλαπλασιασμού επτά ημέρες μετά την μόλυνση και επιλογής. Τα κύτταρα βάφτηκαν σε 72 ώρες ή πέντε ημέρες μετά τη σπορά, και οι τιμές για τα σιγήσει κυττάρων εκφράζεται ως το ποσοστό των αντίστοιχων ελέγχων τους. Τα δεδομένα εκφράζονται ως το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * Ρ & lt?. 0.05 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

VDR σίγηση ενισχύει μιτοχονδριακή αναπνοή

άλλους υποδοχείς στεροειδών έχουν προηγουμένως υποδεικνύεται για τη ρύθμιση μιτοχονδριακή μεταγραφή και δραστηριότητα [17] – [19], προτρέποντας μας να ερευνήσει εάν το VDR, το οποίο εντοπίζεται στο μιτοχονδριακό διαμέρισμα (παρόμοια με την οικογένειά ανάλογά της), ελέγχει το μιτοχονδριακό μεταβολισμό. Πρώτον, αξιολογήσαμε την μιτοχονδριακή αναπνευστική δραστηριότητα των κυττάρων HaCaT με τη μέτρηση των μεταβολών στο δυναμικό της μεμβράνης μέσω JC-1 ανάλυση χρησιμοποιώντας κυτοφθορομετρία. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, VDR σίγασης που αυξήθηκε σημαντικά το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης, και όταν υποβάλλονται αυτά τα κύτταρα σε οξειδωτικό στρες (H

2O

2), το δυναμικό τους ήταν μειωμένη σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι εκείνη των κυττάρων άγριου τύπου υποβλήθηκαν στην ίδια αγωγή (εικ. 4Α). Ωστόσο, όταν τα κύτταρα εκτέθηκαν σε ένα διαφορετικό, μη-οξειδωτικό στρες (π.χ., σορβιτόλη που προκαλείται οσμωτική πίεση), το μιτοχονδριακό δυναμικό των δύο άγριου τύπου και γκρεμίζω κύτταρα μειώθηκαν στον ίδιο βαθμό (εικ. 4Β). Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι ο VDR ανέστειλε το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης και πιθανόν συγκρατημένη παραγωγή ROS, προστατεύοντας τα κύτταρα από επιπλέον οξειδωτικό στρες. Αντιθέτως, η απώλεια VDR αύξησε την αναπνευστική δυναμικό, αλλά καθίστανται κύτταρα περισσότερο επιρρεπή σε ένα οξειδωτικό δυναμικό με γνώμονα κατάρρευσης. Η δυνατότητα αυτή υποστηρίζεται από την κατανάλωση σημαντικά χαμηλότερη γλουταθειόνη (GSH) στα κύτταρα άγριου τύπου, όπως αποκαλύπτεται από τα υψηλότερα επίπεδα του αντιοξειδωτικού μορίου που μετρήθηκαν σε άγριου τύπου κύτταρα σε σύγκριση με σιγήσει κύτταρα (S3 εικ.).

κύτταρα HaCaT μολύνθηκαν με έλεγχο shRNA ή VDR shRNA 3 και το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης εξετάστηκε χρησιμοποιώντας JC-1 κυτταροφθορισμομετρική αξιολόγησης, υπό την παρουσία ή απουσία δύο διαφορετικών στρεσογόνους παράγοντες: (Α) έλεγχος και σιγήσει κύτταρα επεξεργάστηκαν είτε με 10 mM H

2O

2 ή (Β) 0,5 Μ σορβιτόλη. Και στα δύο σχήματα, μια αντιπροσωπευτική εικόνα από το κυτταροφθορισμομετρική ανάλυση φαίνεται στο πινάκιο κορυφής, ενώ τα αποτελέσματα από τρία ξεχωριστά πειράματα χαράσσεται στο γράφημα στο κάτω πάνελ. Η αναλογία FL-2 /FL-1 υπολογίστηκε και οι τιμές εκφράζονται ως ποσοστό του μη επεξεργασμένου ελέγχου shRNA. * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο μάρτυρα shRNA,

$ P & lt? 0,05 σε σύγκριση με την αγωγή ελέγχου shRNA. (Γ) σε πραγματικό χρόνο ανάλυση της COX II (COX II) και IV (COX IV) έκφραση μεταγράφου υπομονάδα ελέγχου και σιγήσει κύτταρα. Οι πολλαπλές μεταβολές απεικονίζονται στα διαγράμματα ως μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. * Ρ & lt? 0.05 και ** Ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο shRNA. κύτταρα (D) HaCaT καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία 10 ηΜ βιταμίνης D και COX II και COX IV μεταγραφής έκφρασης αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση πραγματικού χρόνου μετά από 24 και 48 ώρες θεραπείας. Οι τιμές απεικονίζονται στα γραφήματα αντιπροσωπεύουν το πλάσια αλλαγή στην έκφραση μεταγράφου σε κατεργασμένα έναντι μη κατεργασμένα κύτταρα και εμφανίζονται ως το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων.

§ P & lt? 0,05 και

§§ P & lt?. 0.01 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα

Η

Το μιτοχονδριακό δυναμικό που υπέστη από την κλίση πρωτονίων που δημιουργείται από την δραστηριότητα αναπνευστικής αλυσίδας? Ως εκ τούτου, αποφασίσαμε να εξετάσει την έκφραση των δύο υπομονάδων των πολύπλοκων IV: κυτοχρώματος c οξειδάσης (COX) υπομονάδες II και IV, των οποίων οι μεταγραφές είναι του μιτοχονδριακού (πρώην) και πυρηνικών (το τελευταίο) προέλευσης. Και οι δύο πυρηνικά και μιτοχονδριακώς κωδικοποιούνται πρωτεΐνες που απαιτούνται για τον σχηματισμό δραστικών αναπνευστικής συμπλοκών. Οι μιτοχονδριακές RNAs μεταγράφονται, εφόσον, πολυκιστρονικών πρόδρομος μεταγραφές που αργότερα επεξεργασία για να απελευθερώσει ατομική rRNAs και mRNA. Ως εκ τούτου, θεωρήσαμε COX II να είναι ένας δείκτης της μιτοχονδριακής δραστικότητας μεταγραφής και COX IV να είναι ένας δείκτης της πυρηνικής συμβολή στην διαμόρφωση της αναπνευστικής αλυσίδας.

Αυξημένη έκφραση και των δύο υπομονάδων σε σιγήσει κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου (Εικ. 4C). Για να επιβεβαιωθεί ότι ο VDR επηρεαστεί αρνητικά COX μεταγραφή, εμείς κατεργασμένα κύτταρα HaCaT άγριου τύπου με βιταμίνη D και παρατήρησε ότι τα επίπεδα όλων των μεταγραφών μειώθηκαν (εικ. 4D). Λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός ότι η μεταγραφή των υπομονάδας IV είναι η πυρηνική, ενώ εκείνη της υπομονάδας II κωδικοποιείται από το μιτοχονδριακό DNA (mtDNA), καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η βιταμίνη D μεταγραφικό έλεγχο ασκείται στα δύο επίπεδα, πράγμα που δεν αποτελεί έκπληξη δεδομένου του γεγονότος ότι τα πυρηνικά και μιτοχονδριακή μεταγραφή των πρωτεϊνών αναπνευστικής αλυσίδας είναι λεπτή συντονισμένοι [20].

Επειδή η διαμόρφωση του μιτοχονδριακού μεταγραφή από το VDR δεν έχει περιγραφεί προηγουμένως, θεωρήσαμε η δυνατότητα άμεσης σύνδεσης του υποδοχέα σε mtDNA.

Στο silico

ανάλυση έγινε με σκοπό την εξέταση mtDNA για τον εντοπισμό στοιχείο απόκρισης περιοχές της βιταμίνης D (VDRE). Χρησιμοποιήσαμε μία αλληλουχία VDRE που αντιπροσωπεύεται από μια συλλογή θέσης μητρών βάρους (όπως περιγράφεται στο τμήμα των Μεθόδων και εμφανίζονται στον πίνακα S1B) για να υπολογίσουμε την συγγένεια του VDR για την αλληλουχία του mtDNA. Μόνο δύο VDRE θέσεις βρέθηκαν να έχουν αποκοπές υψηλής συγγένειας (89% και 82% της μέγιστης βαθμολογίας) και αμφότερα βρίσκονταν στο βρόχο εκτόπισης (D-loop), μια μη-κωδικοποίησης και ρυθμιστική περιοχή. Εντοπίσαμε επίσης συνολικά 40 VDRE περιοχές με χαμηλές βαθμολογίες συγγένεια (& gt? 60% του μέγιστου) συγκεντρωμένα σε λίγες περιοχές (βλέπε πίνακα 1 για την περιγραφή των υψηλότερων sites VDRE συγγένεια και πίνακα S1 Α για την πλήρη λίστα). Σε ορισμένες περιπτώσεις, αυτές οι θέσεις VDRE σχηματίζεται από πολλαπλές επαναλήψεις, υποδεικνύοντας μια σημαντική παρουσία των χώρων σε αυτές τις περιοχές σύνδεσης. Αξίζει να σημειωθεί ότι η συντριπτική πλειοψηφία των sites VDRE βρέθηκαν στο σκέλος αντίστροφο, το οποίο είναι πιθανό να οφείλεται στην ασυμμετρία του mtDNA διανομή νουκλεοτιδίων. Επιπλέον, οι θέσεις χαμηλής συγγένειας εμπλουτίστηκαν σε υπερμεταβλητή τμήμα 1 (p = 0,01425). Η υψηλή συγγένεια των εντοπίζονται περιοχές VDRE επιτρέπει τη δυνατότητα VDR-μεσολάβηση άμεσο έλεγχο μεταγραφής του mtDNA. Περαιτέρω μελέτες για τη διερεύνηση των χαρακτηριστικών αυτής της δέσμευσης.

Η

Η αυξημένη δυναμικό μεμβράνης που παρατηρήθηκε στα κύτταρα σιγήσει, σε συνδυασμό με την επαγόμενη έκφραση του COX μεταγραφές, απέδειξαν ότι η αναπνευστική αλυσίδα ενισχύεται σε σιγήσει κύτταρα HaCaT.

στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η VDR παίζει ένα ρόλο στην αρνητική ρύθμιση της έκφρασης της αναπνευστικής αλυσίδας και της αναπνευστικής δραστηριότητας, η οποία το δυναμικό της μεμβράνης και οι δύο μετριοπαθείς και είναι προστατευτική ενάντια στο οξειδωτικό στρες.

VDR αποσιώπηση ελαχιστοποιεί τη χρήση ακετυλο-CoA σε βιοσυνθετικών οδών

σε μια προσπάθεια να συνδεθεί η μειωμένη κυτταρική ανάπτυξη και το αυξημένο μιτοχονδριακό δυναμικό που παρατηρήθηκε στο VDR γκρεμίζω κύτταρα, υποθέσαμε ότι η έντονη δραστηριότητα της αναπνευστικής αλυσίδας διεγείρει τον κύκλο TCA σε σιγήσει κύτταρα. Σε αδρανή κύτταρα, η θεμελιώδης λειτουργία των μιτοχονδρίων είναι η παραγωγή ΑΤΡ μέσω ενός TCA κύκλο-σίτιση αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων και την οξειδωτική φωσφορυλίωση, προκειμένου για την παροχή ενέργειας για μια ποικιλία κυτταρικών λειτουργιών? Αντίθετα, τα καρκινικά κύτταρα δεν εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από OXPHOS για ενεργειακές απαιτήσεις τους και τα ενδιάμεσα του κύκλου TCA εκ νέου απευθείας για τη διατήρηση βιοσυνθετικών λειτουργία τους. Έτσι, σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα, οι μιτοχονδριακές οδοί rewired να υποστηρίξει τον πολλαπλασιασμό.

Τα στοιχεία μας πρότεινε ότι η VDR, μειώνοντας τα μεταβολικές απαιτήσεις της αναπνευστικής αλυσίδας, μπορεί να επαναπρογραμματίσει τον κύκλο TCA και τα ενδιάμεσα του μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε βιοσυνθετικές διαδικασίες . Προκειμένου να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, αναλύσαμε τα βιοσυνθετικών οδών που εξαρτώνται από την ακετυλο-CoA εκτρέπονται από μιτοχονδριακή καταβολισμό. Πρώτον, θεωρήσαμε τα προϊόντα της μεβαλονικού καταρράκτη, δηλαδή η χοληστερόλη, η ουβικινόνη και isoprenic μονάδες απαραίτητη για μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των πρωτεϊνών. Χοληστερόλη και ουβικινόνη

de novo σύνθεση

μετρήθηκε σε κύτταρα HaCaT. γκρεμίζω κύτταρα ελέγχου και VDR σημάνθηκαν με [

3Η] οξικό και το λιπιδικό περιεχόμενο των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας TLC. VDR σίγηση μείωσε την

de novo

σύνθεση της χοληστερόλης (εικ. 5Α), ενώ ο ρυθμός βιοσύνθεσης ουβικινόνη δεν επηρεάστηκε από φίμωση (εικ. 5Β). Η σύνθεση του isoprenic μονάδων μετρήθηκε ως η κατάσταση πρενυλίωσης δύο μικρών GTPases: RhoA και Ras. VDR σίγηση οδήγησε σε μειωμένη πρενυλίωση των δύο πρωτεϊνών, ενώ συνολικά η έκφρασή τους παρέμεινε αμετάβλητη (εικ. 5C).

κύτταρα HaCaT μολύνθηκαν με έλεγχο shRNA ή VDR shRNA 3 και βιοσυνθετικών οδών εξετάστηκαν επτά ημέρες μετά τη μόλυνση. Η οδός μεβαλονικό αξιολογήθηκε ως η

de novo

σύνθεση της χοληστερόλης (Α) και ουβικινόνη (Β). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. (Γ) isoprenoid μονάδες που παράγονται από την ίδια οδό αναλύθηκαν ως ενσωμάτωση ήμισυ πρενυλ στο μικρό GTPases RhoA και Ras. Έλεγχος και σιγήσει κύτταρα συλλέχθηκαν και τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε TX-114 φάση εκχύλισης, ώστε να διαχωριστούν οι πρενυλιωμένων μορφές. Συνολική και πρενυλιωμένων πρωτεΐνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. VDAC και έκφραση ακτίνης αποδεικνύεται ισοδύναμη πρωτεΐνη φόρτωση των υδρόφοβων φάσεων και ολικά εκχυλίσματα, αντίστοιχα. (D) Τα επίπεδα ακετυλίωσης ιστόνης αξιολογήθηκαν με κηλίδωση Western ανάλυση χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αντι-ακετυλο H4 και τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. Οι κηλίδες είναι αντιπροσωπευτικά ενός συνόλου τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Τέλος, η διαθεσιμότητα των μονάδων ακετυλίου για βιοσυνθετική σκοπούς αξιολογήθηκε ως ακετυλίωση των ιστονών και VDR σίγηση μειώθηκε επίσης αυτή τη διαδικασία, η οποία μετρήθηκε ως ιστόνης Η4 ακετυλίωση (εικ. 5D).

Συλλογικά, αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι κατά VDR αποσιώπηση, η αυξημένη δραστηριότητα αναπνευστικής αλυσίδας οξειδώνει ενδιάμεσα μεταβολικά, αποτρέποντας τη χρησιμοποίησή τους σε βιοσυνθετικές οδούς. Έχουμε αποδείξει την υποδειγματική εκτροπή του ακετυλο-CoA, η ενσωμάτωση των οποίων μειώνεται κατά τη διάρκεια της βιοσύνθεσης της χοληστερόλης, εκδηλώσεις πρενυλοποίηση και ιστόνης αναδιαμόρφωση.

Συζήτηση

προηγούμενες εργασίες μας σε κύτταρα HaCaT αποδειχθεί VDR μιτοχονδριακό εντοπισμό και ο μηχανισμός εισαγωγής. Στην παρούσα μελέτη, αναγνωρίσαμε μια εντυπωσιακά σημαντικό νέο ρόλο για τον υποδοχέα στη λειτουργία του οργανίδιο και κυτταρικό μεταβολισμό επειδή αποδείξαμε ότι ο πολλαπλασιασμός δραστικότητα VDR βαθιά επιπτώσεις.

Μιτοχονδριακή λειτουργίες έχουν περιγραφεί προηγουμένως για άλλους υποδοχείς στεροειδών, αρκετές από που διεγείρουν μιτοχονδριακή αναπνοή και ως εκ τούτου θεωρείται ότι είναι είτε διαφοροποίηση υποδοχείς ορμονών (π.χ., ο υποδοχέας θυρεοειδούς, βήτα υποδοχέα οιστρογόνου και ο υποδοχέας των ανδρογόνων) ή ενισχυτές δαπάνη ενέργειας και τους παρόχους (δηλαδή, ο υποδοχέας γλυκοκορτικοειδών) [17], [21], [22]. Ορμονικές ερέθισμα επηρεάζει την μεταγραφή της μιτοχονδριακά κωδικοποιείται OXPHOS τόσο έμμεσα, με διέγερση της πυρηνικής σήματα (όπως μιτοχονδριακή παράγοντες μεταγραφής, οι οποίοι ρυθμίζουν θετικά την μεταγραφή του μιτοχονδριακού γονιδιώματος), και άμεσα, με την εντόπιση στο οργανίδιο και να αλληλεπιδρά με στοιχεία απόκρισης σε μιτοχονδριακό DNA [ ,,,0],23]. Μέχρι σήμερα, VDR λειτουργία στα μιτοχόνδρια παραμένει μη χαρακτηρισμένο.

Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι ο VDR προάγει τον πολλαπλασιασμό, όπως της φίμωση έντονα επηρεάζει το ρυθμό ανάπτυξης των HaCaT και άλλων καρκινικών κυτταρικών σειρών που εκφράζουν ένα μιτοχονδριακό VDR. Ξεκινώντας με τα προηγούμενα χαρακτηρίζεται κύτταρα HaCaT και επεκτείνοντας την ανάλυσή μας σε άλλα κυτταρικά μοντέλα, βρήκαμε ότι το μιτοχονδριακό εντοπισμό του υποδοχέα είναι ένα ευρέως διαδεδομένο χαρακτηριστικό των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων, και η σύνδεση του VDR με πολλαπλασιασμό ενισχύθηκε από τα αποτελέσματα της ανάλυσής μας διαφοροποιημένων κύτταρα. Παρατηρήσαμε μειωμένα μιτοχονδριακό επίπεδα VDR σε δύο διαφορετικά μοντέλα διαφοροποιημένα κύτταρα (πρωτογενείς καλλιέργειες κερατινοκυττάρων αντιπροσωπεύουν φυσιολογική διαφοροποίηση, ενώ miR-206 που προκαλείται από κύτταρα RD18 αντιπροσωπεύουν miRNA με γνώμονα την διαφοροποιημένη κατάσταση). Κατά τη γνώμη μας, αυτή είναι μια ενδιαφέρουσα παρατήρηση που χρήζει περαιτέρω διερεύνησης του μεταβολικού αντίκτυπο και μοριακών μηχανισμών που διέπουν VDR ρύθμιση προς τα κάτω σε αδρανή κύτταρα.

Προηγούμενη λογοτεχνία περιέγραψε την διαφοροποίηση ιδιότητες της βιταμίνης D, παραδοσιακά διαμεσολαβείται από πυρηνικές επενέργειες του VDR για μεταγραφή. Ωστόσο καρκινικά κύτταρα είναι συχνά ανθεκτικά στους αντιπολλαπλασιαστικές και διαφοροποιώντας τις ιδιότητες της βιταμίνης D, ως αποτέλεσμα της αυξημένης σύνδεσης του VDR με συγκαταστολείς επί χρωματίνη [24]. Αυτό έχει αναφερθεί για τον καρκίνο του δέρματος, μεταξύ των άλλων [25]. Η ανθρώπινη πολλαπλασιαζόμενων κερατινοκυττάρων κυτταρική γραμμή HaCaT δεν ανταποκρίνεται στην αντι-πολλαπλασιαστική δράση της βιταμίνης D (S1 εικ.), Και εμείς προηγουμένως αποδειχθεί ότι πυρηνική μετατόπιση του VDR, η οποία αποτελεί προϋπόθεση για μεταγραφική δραστικότητα, δεν επάγεται κατά τη διέγερση προσδέματος [12 ], υποδεικνύοντας έτσι αναποτελεσματικά, ή αδύναμο, σηματοδότηση πυρηνική VDR σε αυτά τα κύτταρα. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα HaCaT αντιπροσωπεύουν ένα καλό μοντέλο που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να εξετάσει τα μιτοχονδριακή επιπτώσεις της δραστηριότητας των VDR σε ένα φόντο ήταν οι διαφοροποιώντας ιδιότητες της βιταμίνης D έχουν χαθεί.

Γενετική αποσιώπηση του VDR σε κύτταρα HaCaT παρήγαγε δύο επιδράσεις που συνδέθηκαν: μειωμένος πολλαπλασιασμός που αντιστοιχούσε σε αύξηση στην έκφραση της αναπνευστικής αλυσίδας και το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης. Είχαμε ενδείξεις ότι το VDR εξισορροπεί δραστηριότητα της αλυσίδας των ηλεκτρονίων, με αποτέλεσμα διπλή πλεονεκτήματα για το κύτταρο: προστασία από το οξειδωτικό στρες και την υποστήριξη της διάδοσης μέσω άμεσα διαθέσιμα βιοσυνθετικής ενδιάμεσα. Ο πρώην συμπέρασμα επιτεύχθηκε όταν παρατηρήσαμε την αυξημένη ευπάθεια των σιγήσει κυττάρων σε μια ισχυρή οξειδωτική προσβολή, συνοδεύεται από μειωμένη ενδοκυτταρική πισίνα GSH. Η τελευταία αυτή ερμηνεία, το άλλο σημαντικό εύρημα της εργασίας μας, προτάθηκε από τα πειράματα που αποσκοπούν στην αξιολόγηση της ικανότητας βιοσύνθεσης των σιωπή κύτταρα HaCaT. Αναλύσαμε διαφορετικές πορείες βιοσύνθεσης που βασίζονται σε ακετυλο-CoA της μιτοχονδριακής προέλευσης. Ακετυλο-CoA είναι ένα ζωτικής σημασίας στοιχείο για την ενδογενή βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων και της χοληστερόλης και εμπλέκεται στη ισοπρενοειδή που βασίζονται τροποποιήσεις πρωτεΐνη? ακετυλο-CoA απαιτείται επίσης για αντιδράσεις ακετυλίωση που τροποποιούν πρωτεΐνες, όπως ακετυλίωση ιστονών. Βρήκαμε ότι VDR γκρεμίσουμε κύτταρα εμφανίζεται ένα περικοπούν βιοσυνθετικής ποσοστό mevalonate οδό, μετρούμενη ως η μειωμένη παραγωγή της χοληστερόλης και πρενυλ μόρια για να χρησιμοποιηθούν σε τροποποίηση της πρωτεΐνης. Εμείς αποκλείεται το γεγονός ότι στα πειράματα μας είχαμε τη διαγραφή θετική διαμόρφωση του 3-υδροξυ-3-μεθυλγλουταρυλ συνενζύμου Α (HMG-CoA), ένα ένζυμο κλειδί στην μεβαλονικού καταρράκτη επειδή τα επίπεδα του ενός από τα προϊόντα της οδού, ουβικινόνη (CoQ), δεν επηρεάστηκαν από VDR αποσιώπηση. Αντ ‘αυτού, θα αποδοθεί το παρεμποδίζεται βιοσυνθετικής ποσοστό σε μειωμένη διαθεσιμότητα ακετυλο-CoA, και η δυνατότητα αυτή επικυρωθεί από την παρατήρηση ότι VDR αποσιώπηση υποχώρησαν επίσης ακετυλίωση των ιστονών. Η αναισθησία της σύνθεσης ουβικινόνης σε μείωση των επιπέδων ακετυλο-CoA, η οποία είναι κρίσιμη για άλλα λιπίδια, μπορεί να οφείλεται σε διαφορές στις τιμές Km των ενζύμων διακλάδωσης σημείων στην mevalonate οδό. Η αρχή της κλασικής υπόθεση εκτροπή της ροής δείχνει ότι μεταβολές στο μέγεθος της πρόδρομης πισίνας θα επηρεάσει κυρίως της σύνθεσης της χοληστερόλης, επειδή η Km της συνθάσης σκουαλενίου για το υπόστρωμα της είναι υψηλή, ενώ όλα τα άλλα ένζυμα διακλάδωσης σημείων εμφανίζουν χαμηλές τιμές Km και το περιοριστικό του ρυθμού ενζύμων του υποκαταστήματος βιοσυνθετικής CoQ μπορεί να έχει τις χαμηλότερες τιμές Km. Δυστυχώς, οι πλήρεις λεπτομέρειες της σύνθεσης CoQ σε ζωικούς ιστούς μένει να διευκρινιστεί.

Καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το VDR, με τον περιορισμό της μιτοχονδριακής αναπνευστικής δραστηριότητας, ανταλλακτικό μιτοχονδριακό μεταβολικές ενδιάμεσα, τα οποία μπορούν να εκτραπούν από το οξειδωτικό μεταβολισμό προς ένα μοίρα βιοσυνθετικής . Τα τελικά προϊόντα που βρέθηκαν να επηρεάζονται από αυτό το διακόπτη στην παρούσα μελέτη είναι απαραίτητη για τον πολλαπλασιασμό? ειδικότερα, η χοληστερόλη, η οποία συνεχώς ενσωματωθεί μεμβράνες, και αρκετές εκθέσεις δείχνουν ότι cholesterogenesis είναι απέραντα αυξημένη σε διάφορα καρκινικά κύτταρα [26] – [28]. Επιπλέον, πρενυλίωση είναι μία μετα-μεταφραστική τροποποίηση των πολλών μικρών GTPases και είναι απαραίτητη για τη βάση σύνδεσης και τη δραστηριότητα των ενζύμων αυτών? παρεμποδίζει δραστικότητα ΟΤΡάσης παρεμβαίνει με πολλαπλασιασμό, η οποία έχει αναφερθεί εκτεταμένα για τις δύο μικρές ΟΤΡάσες που αναλύθηκαν στην παρούσα μελέτη, RhoA και Ras, η πρενυλίωση των οποίων είναι απαραίτητη για την ικανότητά τους να επάγουν κακοήθη μετασχηματισμό, εισβολή και μετάσταση [29] . Τέλος, η κατάσταση ακετυλίωση ιστονών είναι μια σημαντική πτυχή του πολλαπλασιασμού επειδή αντιπροσωπεύει μια επιγενετική στρατηγική έλεγχο χρωματίνης αναδιαμόρφωση. follows:

5′-CCGGCCTCCAGTTCGTGTGAATGATCTCGAGATCATTCACACGAACTGGAGGTTTTT-3′,

5′-CCGGCTCCTGCCTACTCACGATAAACTCGAGTTTATCGTGAGTAGGCAGGAGTTTTTG-3′,