Αφηρημένο

νεφροκυτταρικό καρκίνωμα (RCC) είναι η έκτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στις ΗΠΑ. Ενώ RCC είναι ιδιαίτερα μεταστατικό, υπάρχουν λίγες θεραπευτικών επιλογές που είναι διαθέσιμες για τους ασθενείς με μεταστατικό RCC, και επιβίωση χωρίς εξέλιξη των ασθενών, ακόμη και με τα πιο πρόσφατα στοχευμένη θεραπευτική είναι μόνο μέχρι δύο έτη. Έτσι, τα νέα θεραπευτικοί στόχοι για την ασθένεια αυτή είναι απολύτως απαραίτητες. Με βάση τις προηγούμενες μελέτες μεταβολισμική μας δείχνει τις μεταβολές του υπεροξειδιοσώματος α υποδοχέα που ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή (ΡΡΑΚα) που σχετίζονται με τα γεγονότα τόσο RCC ασθενούς και του ξενομοσχεύματος υλικά ποντίκια, αυτή η οδός εξετάστηκε περαιτέρω στην παρούσα μελέτη στη ρύθμιση του RCC. ΡΡΑΚα είναι μια πυρηνική πρωτεΐνη υποδοχέα που λειτουργεί ως παράγοντας μεταγραφής γονιδίων συμπεριλαμβανομένων εκείνων που κωδικοποιούν ένζυμα που εμπλέκονται στο μεταβολισμό της ενέργειας? ενώ ΡΡΑΚα έχει αναφερθεί για τη ρύθμιση της ανάπτυξης του όγκου σε διάφορες μορφές καρκίνου, δεν έχει αξιολογηθεί σε RCC. Ένας ειδικός ανταγωνιστής PPARa, GW6471, που επάγεται τόσο απόπτωση και κύκλου κυττάρου σε G0 /G1 σε VHL (+) και VHL (-) RCC κυτταρικές γραμμές (786-O και Caki-1) που συνδέεται με εξασθένιση του κυτταρικού κύκλου ρυθμιστικών πρωτεϊνών c Myc έχει, κυκλίνη D1, και CDK4? Αυτά τα δεδομένα επιβεβαιώθηκε ως ειδικές για ΡΡΑΚα ανταγωνισμός με μεθόδους siRNA. Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν γλυκόλυση έχει αποκλειστεί από διάφορες μεθόδους, η κυτταροτοξικότητα της GW6471 ήταν συνεργικά αυξημένη, γεγονός που υποδηλώνει μια στροφή προς την οξείδωση των λιπαρών οξέων από τη γλυκόλυση και παρέχοντας μια εντελώς νέα θεραπευτική προσέγγιση για RCC

Παράθεση:. Abu Aboud O, Wettersten HI, Weiss RH (2013) Αναστολή της ΡΡΑΚα Προκαλεί κυτταρικού κύκλου σύλληψης και απόπτωση, και συνεργεί με γλυκόλυση αναστολή στον Καρκίνο νεφρικά κύτταρα. PLoS ONE 8 (8): e71115. doi: 10.1371 /journal.pone.0071115

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Απρ 2013? Αποδεκτές: 26, Ιουνίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 7, Αυγούστου 2013

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί 1R01CA135401-01A1 και 1R01DK082690-01A1 (σε RHW) και η Ιατρική Υπηρεσία των ΗΠΑ Τμήμα Υποθέσεων Βετεράνων (έως RHW). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Νεφρική καρκίνωμα (RCC) είναι παγκοσμίως η 13η πιο κοινή μορφή καρκίνου, και ένας από τους λίγους καρκίνους του οποίου η συχνότητα αυξάνεται για λόγους που δεν είναι απολύτως σαφείς, αλλά μπορεί να σχετίζεται με το κάπνισμα και την παχυσαρκία (αναθεωρηθούν [1 ] και [2]). Κατά τα τελευταία χρόνια, στοχευμένες θεραπείες έχουν γίνει όλο και περισσότερο διαθέσιμα και έχουν δείξει σημαντική υπόσχεση για τη θεραπεία του RCC και άλλες κακοήθειες? Ωστόσο, ακόμη και με αυτές τις θεραπείες προσδόκιμο ζωής γενικά επεκτείνεται μόνο από λιγότερο από ένα έτος, λόγω της ανάπτυξης αντοχής φαρμάκου [3]. Υπό το φως του αυξανόμενου αριθμού των ασθενών που εμφανίζουν καθυστερημένη στάδιο της νόσου και την επικράτηση της ανθεκτικότητας στα φάρμακα που διατίθενται σήμερα, νέων θεραπευτικών στόχων είναι απολύτως αναγκαία. Ταυτοποίηση των στόχων αυτών θα μπορούσε να οδηγήσει τόσο στο σχεδιασμό νέων φαρμάκων ή /και με την επαναξιολόγηση των υφισταμένων φαρμάκων για χρήση σε ασθενείς με RCC.

Ο ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή περοξυσώματος υποδοχέα α (ΡΡΑΚα) ανήκει στον υποδοχέα στεροειδούς ορμόνης υπεροικογένεια [4]. Μέχρι σήμερα, έχουν τρεις υποτύπους του PPAR (α, β, και γ) έχουν ταυτοποιηθεί σε πολλά είδη συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων [5]. Όπως συμβαίνει και με άλλους υποδοχείς στεροειδών ορμονών, μετά την ενεργοποίηση συνδέτη, οι PPARs ετεροδιμερίζονται με τον υποδοχέα ρετινοειδούς Χ (RXR), συνδέονται προς την ειδική αλληλουχία προαγωγέα (το στοιχείο περοξυσώματος απόκριση πολλαπλασιαστή ή PPRE), και ως αποτέλεσμα να προκαλέσει την έκφραση μιας ποικιλίας των γονιδίων στόχων [6], συμπεριλαμβανομένων εκείνων που εμπλέκονται στη γλυκόζη, λιπίδια, και το μεταβολισμό αμινοξέων [7].

Οι υποδοχείς ΡΡΑΚα έχουν μια σημαντική, αν και πιθανόν πλειοτροπική δοθεί πολλαπλές λειτουργίες τους, ρόλο στην κακοήθεια. Είτε λειτουργούν ως καταστολείς των όγκων ή επαγωγείς σε καρκίνους είναι ακόμη αβέβαιη? τέτοιες λειτουργίες μπορούν να αφορούν τον τύπο του καρκίνου και /ή ειδικές μικροπεριβάλλον του όγκου. Ενώ η καταστολή του όγκου με ΡΡΑΚα έχει αναφερθεί σε μερικούς καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του μελανώματος [8] και το γλοιοβλάστωμα [9], ΡΡΑΚα έχει επίσης βρεθεί να οδηγήσει στην εξέλιξη της ανάπτυξης του όγκου σε άλλους καρκίνους συμπεριλαμβανομένων ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [10] και του καρκίνου του μαστού [11]. Στη συνεχιζόμενη μελέτη μας καρκίνου του νεφρού χρησιμοποιώντας μεθόδους μεταβολισμική βρήκαμε μεταβολική υπογραφές του PPARa διαφοροποίησης σε ένα ανθρώπινο κύτταρο RCC (Caki-1) μοντέλο ξενομοσχεύματος σε όλες τις τρεις «μήτρες» (ιστός, ορός, ούρα) [12]. Είτε αυτό το εύρημα οφείλεται στην αιτιότητα της ενεργοποίησης ΡΡΑΚα στην ογκογένεση ή αν είναι απλά ένας καρκίνος «υπογραφή» δεν προσδιορίστηκε σε αυτή τη μελέτη. Παρ ‘όλα αυτά, αυτό το εύρημα μας οδήγησε να αξιολογήσει αγωνιστών και ανταγωνιστών ΡΡΑΚα, για πρώτη φορά, ως πιθανές θεραπείες RCC.

Δείχνουμε τώρα, χρησιμοποιώντας ένα ειδικό ανταγωνιστή ΡΡΑΚα, καθώς και μέθοδοι siRNA, ότι οι συγκεκριμένες ΡΡΑΚα ανταγωνισμός οδηγεί σε διακοπή κύκλου νωρίς κυττάρων καθώς επίσης και την απόπτωση σε κυτταρικές γραμμές RCC. Επιπλέον, θα παρέχει στοιχεία που αποδεικνύουν ότι όταν τα κύτταρα RCC στερούνται του υποστρώματος γλυκόλυση, γίνονται πιο ευαίσθητα σε ανταγωνιστές ΡΡΑΚα, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα κύτταρα RCC μεταβάλλουν μονοπάτια ενεργειακό μεταβολισμό τους υπό αυτές τις συνθήκες, και επισημαίνοντας τη σκοπιμότητα του συνδυασμού των ανταγωνιστών ΡΡΑΚα και αναστολέα γλυκόλυση θεραπεία για την ασθένεια αυτή.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικές γραμμές

κυτταρικές γραμμές RCC, Caki-1, και 786-Ο ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Rockville , MD, USA), και το «φυσιολογικό ανθρώπινο νεφρό» (NHK) κυτταρική γραμμή ελήφθη από την Lonza (Βασιλεία, Ελβετία). 786-O και τα κύτταρα Caki-1 διατηρήθηκαν σε κύτταρα RPMI και NHK διατηρήθηκαν σε DMEM, τόσο συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 μονάδες /mL στρεπτομυκίνη, και 100 mg /mL πενικιλλίνη. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε 5% CO

2 και στους 37 ° C

Υλικά |

διαφάνειες παραφίνη-ενσωματωμένες φορμόλη-σταθερό (αιματοξυλίνη ηωσίνη [H Μεθόδους. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τρεις επαναλήψεις. * Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με το DMSO. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση.

Η

Το ΡΡΑΚα Ανταγωνιστή οφείλεται τόσο διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης στις δύο γραμμές κυττάρων

Η μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων που παρατηρείται μετά την επώαση των δύο κυτταρικές σειρές RCC με το ΡΡΑΚα ανταγωνιστής GW6471 θα μπορούσε να συμβεί ως ένα αποτέλεσμα είτε μείωση του πολλαπλασιασμού, διέγερση απόπτωσης, ή και τα δύο. Για να αρχίσει να απαντήσουμε στο ερώτημα αυτό, θα αξιολογηθούν πρώτα τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής μεθόδους. Και οι δύο τύποι κυττάρων επωάστηκαν με GW6471 ή φορέα DMSO επί 24 ώρες μετά τις οποίες διεξήχθη η ανάλυση κυτταρικού κύκλου. GW6471 συνέλαβαν τον κυτταρικό κύκλο στη φάση G0 /G1 και στα δύο κύτταρα Caki-1 και 786-Ο (Εικ. 3), γεγονός που υποδηλώνει ότι η δοκιμασία ΜΤΤ είναι, τουλάχιστον εν μέρει, υποδεικνύοντας διακοπή του κυτταρικού κύκλου.

κύτταρα RCC (Caki-1 και 786-O) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO (Cont) ή GW6471 (GW) 25 μΜ για 24 ώρες και η ανάλυση κυτταρικού κύκλου διεξήχθη όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τρεις επαναλήψεις.

Η

Για να προσδιορίσετε αν PPARα ο ανταγωνισμός οδήγησε σε απόπτωση εκτός από την διακοπή του κυτταρικού κύκλου, αξιολογήσαμε την επόμενη χρώση αννεξίνης V κάτω από παρόμοιες συνθήκες όπως παραπάνω. Μετά την επεξεργασία των δύο κυτταρικές σειρές με GW6471 ή DMSO για 24 ώρες τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ροή ανάλυση cytometery μετά από χρώση αννεξίνης V, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Όπως εκτιμάται από ταξινόμηση κυττάρων, GW6471 αύξησε την ποσότητα της συνολικής αποπτωτικών κυττάρων σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές Caki-1 και 786-Ο (Σχ. 4Α). Για να επιβεβαιωθεί η απόπτωση υπό αυτές τις συνθήκες, η διάσπαση ΡΑΚΡ σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με GW6471 σύγκριση με DMSO εκτιμήθηκε επίσης (Σχ. 4Β). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η μειωμένη σήμα παρατηρείται στην δοκιμασία ΜΤΤ μετά από επώαση των κυττάρων με GW6471 οφείλεται τόσο διακοπή του κυτταρικού κύκλου και η επαγωγή απόπτωσης.

A. κύτταρα RCC (Caki-1 και 786-O) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή GW6471 (GW) στις ενδεικνυόμενες δόσεις για 24 ώρες και μια δοκιμασία απόπτωσης αννεξίνη V-based διεξήχθη όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. κύτταρα Β RCC (Caki-1 και 786-O) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή GW6471 (GW) στις ενδεικνυόμενες δόσεις για 24 ώρες και ανοσοαποτύπωση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. β-ακτίνη ανοσοαποτύπωμα ως έλεγχος φόρτωσης. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τρεις επαναλήψεις.

Η

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω το μηχανισμό της σύλληψης του κυτταρικού κύκλου και την επαγωγή απόπτωσης από GW6471, μετρήσαμε τα επίπεδα των σχετικών πρωτεϊνών σηματοδότησης που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης G0 /G1 σημείο ελέγχου. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 24 ώρες με GW6471, και στη συνέχεια το κυτταρόλυμα ανοσοστυπώθηκαν με CDK4, κυκλίνη D1, και c-Myc αντισώματα? όλες αυτές οι πρωτεΐνες σημαντικά μειώθηκαν από τον ανταγωνιστή ΡΡΑΚα, υποστηρίζοντας την παρατηρούμενη G0 /G1 σύλληψη και προτείνοντας ένα μηχανισμό για την ίδια (Εικ. 5).

κύτταρα RCC (Caki-1 και 786-Ο) κατεργάστηκαν με DMSO (Cont) ή GW6471 (GW) 25 μΜ για 24 ώρες και ανοσοαποτύπωση πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Οι φωτογραφίες που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τρεις ασθενείς για κάθε ομάδα.

Η

siRNA Οι επιμολύνσεις Επιβεβαιώστε Ιδιαιτερότητα της ΡΡΑΚα αναστολέα

Για να επιβεβαιωθεί ότι τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν με αναστολή GW6471 είναι ειδικά για ΡΡΑΚα αναστολή, χρησιμοποιήσαμε μια προσέγγιση siRNA. Caki-1 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με ένα ΡΡΑΚα siRNA ή ομελέτα αλληλουχία ελέγχου siRNA όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNA, ΡΡΑΚα siRNA εξασθενημένα επίπεδα πρωτεΐνης του ΡΡΑΚα (Εικ. 6Α) παρόμοιο με αυτό που παρατηρήθηκε με GW6471 σε αυτή την κυτταρική σειρά (σύγκρινε Σχ. 6Α έως Εικ. 5 αριστερό πλαίσιο), επιβεβαιώνοντας τόσο την αποτελεσματικότητα του siRNA και ιδιαιτερότητα του GW6471 προς ΡΡΑΚα. Έγιναν πολλές προσπάθειες για την επιμόλυνση 786-Ο κύτταρα με το πανομοιότυπο siRNA, αλλά αυτές δεν ήταν επιτυχείς.

κύτταρα Caki-1 επιμολύνθηκαν με siRNA ελέγχου ή ΡΡΑΚα siRNA στα 100 ηΜ για 72 ώρες και υποβάλλονται σε επεξεργασία για ανοσοκηλίδωση, κύτταρο ανάλυση του κύκλου, και δοκιμασία απόπτωσης, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. πρωτεϊνικό επίπεδο Α ΡΡΑΚα εξασθένισε στα κύτταρα επιμολυσμένα με ΡΡΑΚα siRNA. Β ΡΡΑΚα siRNA επιμόλυνση συνελήφθη κυτταρικού κύκλου σε G0 /G1 φάση. C. CDK4, κυκλίνη D1, και c-Myc επίπεδα πρωτεΐνης ήταν εξασθενημένα στα κύτταρα επιμολυσμένα με ΡΡΑΚα siRNA. Δ ΡΡΑΚα siRNA διαμόλυνση επαγόμενη απόπτωση. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται είναι κάθε εκπρόσωπος από τουλάχιστον τρεις επαναλήψεις.

Η

Για να επιβεβαιώσετε ότι το κυτταρικό κύκλο και αποπτωτικά γεγονότα που παρατηρήθηκαν με GW6471 επώασης ήταν στην πραγματικότητα οφείλεται στην αναστολή ΡΡΑΚα και όχι σε off-στόχο των αποτελεσμάτων της ανταγωνιστής, αξιολογήσαμε τα κύτταρα υπό συνθήκες siRNA διαμόλυνσης παράλληλα προς GW6471 επώασης. siRNA επιμόλυνση των κυττάρων Caki-1 συνέλαβαν τον κυτταρικό κύκλο σε G0 /G1 (Εικ. 6Β), εξασθενημένα επίπεδα πρωτεΐνης της CDK4, κυκλίνη D1, και c-Myc (Εικ. 6C), και επαγόμενη απόπτωση (Σχ. 6D) σε ένα πανομοιότυπο τρόπο με αυτό που παρατηρήθηκε με τη θεραπεία με GW6471, υποδεικνύοντας ότι η διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την εξασθένηση αυτών των πρωτεϊνών από GW6471 ήταν στην πραγματικότητα οφείλεται σε ΡΡΑΚα ανταγωνισμό. Έτσι, οι συνέπειες του GW6471 επί του κυτταρικού κύκλου, ρυθμιστικές πρωτεΐνες του, και την απόπτωση προέκυψαν από συγκεκριμένες ανταγωνισμός ΡΡΑΚα.

ΡΡΑΚα ανταγωνισμός και γλυκόλυση Αναστολή Συνεργιστικά εξασθενεί RCC την Κυτταρική Βιωσιμότητα

Από ΡΡΑΚα έχει γίνει γνωστό για να ενεργοποιήσετε την οξείδωση των λιπαρών οξέων (FAO) και να μειώσει τη χρησιμοποίηση γλυκόζης [17], υποθέσαμε ότι PPARα ο ανταγωνισμός μπορεί να κάνει τα κύτταρα να μειώσουν την εξάρτησή τους από τον FAO και κατά συνέπεια να εξαρτάται εξαίσια σε γλυκόλυση για την ενεργειακή πηγή τους? η διαπίστωση αυτή θα προτείνει μια νέα προσέγγιση για την κλινική χρησιμότητα των ανταγωνιστών ΡΡΑΚα, ιδίως όσον αφορά την θεραπεία RCC. Για να αξιολογηθεί αυτή η υπόθεση, έχουμε κατεργασμένα κύτταρα RCC με GW6471 ή /και την γλυκόλυση αναστολέα 2-DG και στη συνέχεια μετράται η βιωσιμότητα των κυττάρων. Υπό αυτές τις συνθήκες, υπήρξε μια συνεργική εξασθένιση της βιωσιμότητας των κυττάρων με GW6471 και 2-DG. Για να επιβεβαιώσετε ότι το 2-DG, η οποία ανταγωνίζεται με γλυκόζη και συνεπώς μειώνει την κυτταρική γλυκόλυση, έχει προκαλέσει τα κύτταρα για να μειώσετε τη χρήση της γλυκόζης, που αντιμετωπίζονται τα κύτταρα με GW6471 αναπτύχθηκαν σε μέσα γλυκόζης εξαντλημένο. Και οι δύο 2-DG θεραπεία και γλυκόζη εξάντληση ευαισθητοποιημένα κύτταρα RCC για ΡΡΑΚα ανταγωνισμό (Εικ. 7), υποδεικνύοντας βασική εξάρτηση των κυττάρων RCC για ΡΡΑΚα επαγόμενη FAO έτσι ώστε τα κύτταρα να στραφούν σε γλυκόζη εξάρτηση όταν FAO εξασθενεί με την αναστολή ΡΡΑΚα. Για να αξιολογηθούν οι πιθανές διαφορές στην RCC έναντι «κανονική» κυτταρικές σειρές RTE, εκτελέσαμε παράλληλα πειράματα σε ένα «κανονικό» κυτταρική σειρά νεφρού ανθρώπου (NHK) λαμβάνεται από το εμπόριο και βρήκε παρόμοιες αλλαγές (Εικόνα S1). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η διπλή αναστολή των ΡΡΑΚα και γλυκόλυσης είναι ένας πιθανός νέος και ισχυρός συνδυασμός θεραπευτική προσέγγιση για RCC.

A. κύτταρα RCC (Caki-1 και 786-O) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO (Cont), GW6471 (GW) 25 μΜ, και /ή 2-DG (5 mM) για 72 ώρες και η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και μεθόδους. κύτταρα Β RCC (Caki-1 και 786-O) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO (Cont), GW6471 (GW) 25 μΜ, χαμηλή γλυκόζη μέσο (Lo Glu), ή GW6471 σε χαμηλά επίπεδα γλυκόζης για 72 ώρες και η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε με μια δοκιμασία ΜΤΤ όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τρεις επαναλήψεις. ** Συνεργική δράση σε σύγκριση με κάθε αγωγή ξεχωριστά. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση

Η

Συζήτηση

RCC είναι η έκτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στις ΗΠΑ και είναι ένας από τους λίγους καρκίνους των οποίων η επίπτωση επί του παρόντος αυξάνεται.? η 5-y επιβίωσης για τους ασθενείς με μεταστατικό RCC είναι μια μελαγχολική 26% (ΤΝΜ στάδιο IV με βάση 2005 στατιστικά στοιχεία) [18]. Για το ένα τρίτο περίπου των ασθενών που παρουσιάζουν με μεταστατική νόσο, υπάρχουν αρκετές FDA εγκεκριμένο διαθέσιμων φαρμάκων, μεταξύ των οποίων και οι αναστολείς πολυ-κινάσης (π.χ. sorafenib και sunitinib) [19] και ο στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (αναστολείς mTOR) [ ,,,0],20]. Δεδομένου ότι η επιβίωση χωρίς εξέλιξη, ακόμη και με αυτά τα νέα φάρμακα είναι ένα ασήμαντο ένα έως δύο χρόνια, και επειδή σχεδόν όλοι οι ασθενείς αρχικά παρουσιάζει με μεταστατικό υποκύπτουν καρκίνο με τη νόσο τους [21], είναι απαραίτητο να εξερευνήσουν νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις για τους ασθενείς με μεταστατικό RCC.

ΡΡΑΚα είναι ένας παράγοντας μεταγραφής ενεργοποιούμενοι από συνδέτες που ανήκει στον υποδοχέα πυρηνικής ορμόνης υπεροικογένεια [22]. Αυτός ο υποδοχέας έχει δειχθεί ότι διεγείρει το μεταβολισμό των λιπαρών οξέων [17], να εξασθενεί γλυκόλυση [17], και για τη ρύθμιση της ογκογένεσης μέσω της προώθησης της μεταγραφής των γονιδίων στόχων του [23] – [28]. Παρά την εκτεταμένη γνώση των διαφόρων στόχων του PPARa, ο ακριβής ρόλος αυτού του υποδοχέα στη ρύθμιση του καρκίνου είναι ακόμα αβέβαιη.

ΡΡΑΚα αγωνιστές έχει αποδειχθεί ότι μειώνουν την ανάπτυξη του μελανώματος, γλοιοβλάστωμα, και ινοσάρκωμα, και αυτά τα αποτελέσματα έχουν συσχετισθεί με ΡΡΑΚα επαγόμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού των ενδοθηλιακών κυττάρων καθώς και ΡΡΑΚα εξαρτώμενη ρύθμιση προς τα κάτω του κυτοχρώματος Ρ450, με αποτέλεσμα την αναστολή της νεοαγγειογένεσης [29], [30]. Από την άλλη μεριά, η ενεργοποίηση του PPARa έχει δειχθεί ότι αυξάνουν πολλαπλασιασμό σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού [11]. Επιπλέον, η μακροχρόνια χορήγηση αγωνιστών ΡΡΑΚα προκάλεσε καρκίνο του ήπατος σε τρωκτικά [31], και

Pparα-

μηδενικούς ποντικούς ήταν ανθεκτικά σε ηπατοκαρκινογόνου επιδράσεις των αγωνιστών ΡΡΑΚα [31], [32]. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι ΡΡΑΚα παίζει πλειοτροπική ρόλο στον καρκίνο, αλλά αν λειτουργεί ως καταστολέας όγκου ή μια ογκοπρωτεΐνη φαίνεται να εξαρτάται από τον τύπο του καρκίνου ή ακόμη και κυτταρικό τύπο υψηλά.

Ως βάση για αυτή τη μελέτη, πρόσφατα ανακαλύφθηκε μια μεταβολική υπογραφή του RCC σε ποντικούς ξενο-μεταμόσχευσις ανθρώπινο RCC (Caki-1) κυττάρων [12]. Η μελέτη μας υποστηρίζεται από ένα άλλο σε ουροποιητικό καρκίνους συγκρίνοντας mRNA και miRNA χαρακτηριστικών, τα οποία έδειξαν αποδεικνύεται από ένα εμπλουτισμένο οδού ΡΡΑΚα σε RCC, αλλά όχι σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης [33]. Αν και αυτές οι μελέτες υποστηρίζουν την ογκογόνο δράση του PPARa σε RCC, οι μοριακοί μηχανισμοί της ογκογένεσης με ΡΡΑΚα και μια πιθανή θεραπευτική προσέγγιση της αναστολής ΡΡΑΚα δεν έχουν αξιολογηθεί σε RCC. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε για πρώτη φορά ότι ΡΡΑΚα ανταγωνισμός εξασθενεί την ανάπτυξη των κυττάρων RCC μέσω G0 /G1 φάση αναστολή του κυτταρικού κύκλου και την επαγωγή της απόπτωσης που συνδέονται με μειωμένη CDK4, κυκλίνη D1, και τα επίπεδα c-Myc.

Αν και έχουν υπάρξει μελέτες που δείχνουν προς τα πάνω ρύθμιση των συγγενικών ΡΡΑΚα μεταβολίτες [12] και τα γονίδια [33] στο RCC, καμία μελέτη δεν έχει δείξει αλλοίωση των πραγματικών επιπέδων της πρωτεΐνης ΡΡΑΚα που σχετίζονται με ογκογένεση. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε αυξημένα επίπεδα ΡΡΑΚα σε υψηλής ποιότητας RCC ιστούς έναντι χαμηλού βαθμού ιστούς, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης ΡΡΑΚα σχετίζεται με την επιθετικότητα του RCC. Επειδή ΡΡΑΚα ρυθμίζει οξείδωση των λιπαρών οξέων (FAO), μέσω του γονιδίου-στόχου μεταγραφής του [34], και λαμβανομένου υπόψη του γεγονότος ότι εξαρτώμενη βαθμού αλλοιώσεις των οδών ενέργειας (συμπεριλαμβανομένων FAO) πρωτεϊνών έχει αναφερθεί [35], είναι πιθανό ότι ΡΡΑΚα τουλάχιστον μερικώς παίζει ρόλο στην επιθετικότητα και το μεταβολισμό της ενέργειας διαφορές ως συνάρτηση του βαθμού RCC. Αυτή η δυνατότητα υποστηρίζεται από το εύρημα ότι τα κύτταρα χαμηλού βαθμού RCC έχουν πιο εκτεταμένη σαφείς κυτοσόλιο, το οποίο αποτελείται από λιπίδιο και γλυκογόνου, από κύτταρα ανώτερων βαθμό [14], [36].

Για να αξιολογηθεί κατά πόσον ΡΡΑΚα είναι ένα βιώσιμος πιθανό θεραπευτικό στόχο για προηγμένη RCC, αναλύσαμε την αποτελεσματικότητα του ΡΡΑΚα ανταγωνισμού χρησιμοποιώντας ένα ειδικό ανταγωνιστή ΡΡΑΚα, GW6471, σε κυτταρικές γραμμές RCC. Τα δεδομένα μας έδειξαν για πρώτη φορά ότι η εν λόγω χειρισμός προκάλεσε G0 /G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου καθώς και επαγωγή της απόπτωσης. Είναι πιθανό ότι αυτά τα γεγονότα που σχετίζονται με αλλαγές του μεταβολισμού της ενέργειας που έχουν καλά μελετηθεί σε φυσιολογικά κύτταρα και σε πολλές ασθένειες, συμπεριλαμβανομένων των καρδιαγγειακών παθήσεων και του καρκίνου, στο οποίο ΡΡΑΚα έχει προταθεί ως θεραπευτικός στόχος [10], [17], [ ,,,0],37], [38]. Για τις γνώσεις μας, η δική μας είναι η πρώτη μελέτη που δείχνει τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου με αναστολή ΡΡΑΚα σε RCC.

ΡΡΑΚα ανταγωνισμό τόσο από GW6471 και ενός ειδικού siRNA εμφάνισαν μειώσεις στο c-myc, κυκλίνη D1, και CDK4. Αυτά τα ευρήματα υποστηρίζονται από μια μελέτη η οποία έδειξε ΡΡΑΚα αυξήσεις που εξαρτώνται από c-myc, κυκλίνη D1, και πρωτεΐνη CDK4 [39] από τον αγωνιστή ΡΡΑΚα WY-14643 σε ηπατικά κύτταρα ποντικών άγριου τύπου αλλά όχι στην ουδέτερη κύτταρα ΡΡΑΚα. Το κυτταρικό πρωτο-ογκογονιδίου,

c-myc,

συνδέεται με μια ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων και είναι έντονα εμπλέκονται στον έλεγχο του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο, και διαφοροποίηση [40]. ΡΡΑΚα έχει δειχθεί να σταθεροποιήσει c-Myc πρωτείνης μέσω της καταστολής της let-7c miRNA [41]. Έτσι, είναι πιθανό ότι η εξασθένηση του c-myc πρωτεΐνης σε κύτταρα RCC με ΡΡΑΚα ανταγωνισμός ήταν μέσω αυξημένης ας-7c αποτέλεσμα μειωμένη σταθερότητα του c-myc. Το συγκρότημα κυκλίνης D1 /CDK4 προωθεί την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μέσω της φωσφορυλίωσης του υποστρώματος της, συμπεριλαμβανομένης της pRb (αναθεωρούνται στο [42]). Εξασθένηση της c-Myc καταστέλλει κυκλίνη D1 /CDK4 η έκφραση και δραστικότητα σε G1 /S μετάβαση [43], [44]. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η παρατήρηση μας ότι ΡΡΑΚα αποτελέσματα αναστολή σε μειωμένα επίπεδα c-Myc μπορεί να ευθύνεται για τη μείωση της κυκλίνης D1 /CDK4 και έτσι να προκαλέσει την παρατηρούμενη αναστολή του κυτταρικού κύκλου σε G0 /G1 σε κύτταρα RCC.

Ένα σημαντικό εύρεση από τη μελέτη μας ήταν ότι η αναστολή ΡΡΑΚα όχι μόνο συνέλαβε τον κυτταρικό κύκλο, αλλά και προκάλεσε απόπτωση στα κύτταρα RCC. Είναι ενδιαφέρον ότι, η αναστολή CDK4 έχει αναφερθεί ότι διεγείρει απόπτωση [45] προκαλώντας μετατόπιση του ΚεΙΑ, το κύριο συστατικό του ΝΡκΒ, από το κυτταρόπλασμα προς πυρηνόπλασμα και στη συνέχεια στο πυρηνίσκο με αποτέλεσμα καταστολή των αντι-αποπτωτική παραγωγή πρωτεΐνης συμπεριλαμβανομένων survivin. Επειδή παρατηρήθηκε έντονη αναστολή CDK4 μετά ΡΡΑΚα ανταγωνισμός, είναι πιθανό ότι η αναστολή ΡΡΑΚα-επαγόμενη απόπτωση ήταν αποτέλεσμα της CDK4 εξασθένηση τουλάχιστον σε κύτταρα RCC.

Για να επεκτείνει περαιτέρω το δυναμικό της αναστολής ΡΡΑΚα ως μία θεραπευτική προσέγγιση, επιδιώξαμε συνδυασμός θεραπείες που αυξάνουν την αποτελεσματικότητα του ανταγωνιστή ΡΡΑΚα. Δεδομένου ότι ένας από τους ρόλους του ΡΡΑΚα περιλαμβάνει την αύξηση του FAO [10] καθώς επίσης ελαττώνει τη γλυκόλυση σε μεταγραφικό και λειτουργικά επίπεδα που οδηγεί σε μείωση της πυροσταφυλικού και παραγωγή γαλακτικού [17], υποθέσαμε ότι ΡΡΑΚα ανταγωνισμός μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη εξάρτηση των κυττάρων για γλυκόλυση, λόγω της εξασθένησης του FAO. Η ανακάλυψή μας ότι η αποτελεσματικότητα του GW6471 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε μέσα γλυκόζης-εξαντλημένο από τα κανονικά μέσα επιβεβαίωσαν περαιτέρω αυτή υπόθεση και περαιτέρω πρότεινε ότι η συνεργιστική δράση του ανταγωνιστή ΡΡΑΚα και θεραπεία συνδυασμού 2-DG ήταν ειδικώς οφείλεται στην αναστολή της γλυκόλυσης και να μην επιδράσεις εκτός στόχου του 2-DG. Επιπλέον, το εύρημα αυτό υποστηρίζει τη μελλοντική αξιολόγηση της διπλής θεραπευτικών τα οποία θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ταυτόχρονα επιτίθενται έτσι RCC στην αχίλλειο πτέρνα του ενεργειακού μεταβολισμού.

Τα ευρήματά μας ότι τα κύτταρα NHK έδειξε παρόμοιες αλλαγές υπό αυτές τις συνθήκες θα πρέπει να μετριάζεται από διάφορα θέματα . Πρώτον, η συμπεριφορά όλων των κυτταρικών σειρών, ιδιαίτερα κύτταρα υποστήριξε ότι είναι «κανονική», πρέπει να αξιολογηθεί σε in vivo τους πλαίσιο πριν μπορούν να εξαχθούν σαφή συμπεράσματα σχετικά με τη συμπεριφορά τους, λόγω θέματα όπως η επιρροή των στρωματικών κυττάρων καθώς και κυτταροκινών απελευθερώσετε και άλλα αυτοκρινείς επιδράσεις. Δεύτερον, η χορήγηση του GW6471 σε ένα μοντέλο κουνελιού (4 mg /kg ως εφάπαξ ένεση IV) [46] δεν οδήγησε σε σοβαρές αλλαγές στο νεφρό ή μεταβολές στην παραγωγή ούρων σε σύγκριση με ζώα ελέγχου μετά από 5 ώρες (Christopher Lotz, προσωπική επικοινωνία ).

εν κατακλείδι, δείχνουμε εδώ για πρώτη φορά, ότι (1) ΡΡΑΚα υπερεκφράζεται σε ιστούς RCC υψηλής ποιότητας σε σύγκριση με χαμηλού βαθμού ιστούς, (2) αναστολή ΡΡΑΚα εξασθενεί η βιωσιμότητα των κυττάρων RCC μέσω c-myc, CDK4, κυκλίνη D1 και μείωση μεσολαβεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου και επαγωγή απόπτωσης, και (3) αναστολή γλυκόλυση συνεργεί με ΡΡΑΚα κατά τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν αναστολή ΡΡΑΚα ως νέα θεραπευτική προσέγγιση για την προηγμένη RCC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

γλυκόζης εξάντληση συνέργεια με τον ανταγωνιστή ΡΡΑΚα συμβαίνει σε πρωτογενή φυσιολογικά κύτταρα ανθρώπινου νεφρού επιθηλιακά (NHK). κύτταρα NHK υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2-DG και υποβλήθηκε σε καμία media γλυκόζη όπως περιγράφεται στο Σχ. 7. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τρεις επαναλήψεις. ** Συνεργική δράση σε σύγκριση με κάθε αγωγή ξεχωριστά. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση

doi:. 10.1371 /journal.pone.0071115.s001

(TIFF)