Αφηρημένο

Γονιδίωμα-ευρύ μελέτες συσχέτισης (GWAS) έχουν εντοπιστεί 19 παραλλαγές κινδύνου που συνδέεται με καρκίνο του παχέος εντέρου. Δεδομένου ότι οι περισσότερες από αυτές τις παραλλαγές κινδύνου διαμένουν εκτός των περιοχών κωδικοποίησης των γονιδίων, πραγματοποιήσαμε

cis

-έκφραση γονιδίων των ποσοτικών χαρακτήρων (

cis

-eQTL) αναλύσεις για να διερευνήσει πιθανές ρυθμιστικές λειτουργίες για την έκφραση των γειτονικών γονίδια. Σαράντα μικροδορυφορικού σταθερή και CpG νησί methylator φαινότυπο αρνητικά παχέος όγκους και σε συνδυασμό παρακείμενων φυσιολογικών ιστών του παχέος εντέρου χρησιμοποιήθηκαν για γονιδιώματος-ευρεία SNP και προφίλ γονιδιακής έκφρασης. Βρήκαμε ότι οι τρεις παραλλαγές κινδύνου (rs10795668, rs4444235 και rs9929218, χρησιμοποιώντας σχεδόν τέλεια πληρεξούσια rs706771, rs11623717 και rs2059252, αντίστοιχα) ήταν σημαντικά σχετίζεται (FDR

q

-τιμή ≤0.05) με τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων σε κοντινή απόσταση (& lt ? 2 Mb ανάντη ή κατάντη). Παρατηρήσαμε τη σύνδεση μεταξύ του αλληλόμορφου χαμηλό κίνδυνο ορθοκολικού καρκίνου (A) για rs10795668 σε 10p14 και αυξημένη έκφραση του

ATP5C1

(

q

= 0,024) και μεταξύ του αλληλόμορφου υψηλού κινδύνου καρκίνου του παχέος εντέρου (C ) για rs4444235 στο 14q22.2 και αυξημένη έκφραση του

DLGAP5

(

q

= 0.041), και τα δύο σε δείγματα όγκων. Το αλληλόμορφο καρκίνο του παχέος εντέρου χαμηλού κινδύνου (A) για rs9929218 στο 16q22.1 συσχετίστηκε με σημαντική μείωση στην έκφραση και των δύο

NOL3

(

q

= 0,017) και

DDX28

(

q

= 0,046) στις παρακείμενες δείγματα φυσιολογικού ιστού του παχέος εντέρου. Από τα τέσσερα γονίδια,

DLGAP5

και

NOL3

έχουν αναφερθεί στο παρελθόν για να παίξει ένα ρόλο στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου και

ATP5C1

και

DDX28

είναι μιτοχονδριακών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στον κυτταρικό μεταβολισμό και διαίρεση, αντίστοιχα. Ο συνδυασμός των ευρημάτων GWAS, πριν από λειτουργικές μελέτες, και το

cis

-eQTL αναλύσεις που περιγράφονται εδώ υποδηλώνουν υποτιθέμενο λειτουργικές δραστηριότητες επί τρία του καρκίνου του παχέος εντέρου GWAS προσδιορίζονται τόπους κινδύνου που ρυθμίζουν την έκφραση των γειτονικών γονιδίων.

Παράθεση: Loo LWM, Cheng Ι, Tiirikainen Μ, Lum-Jones Α, Seifried Α, Dunklee LM, et al. (2012)

cis

-έκφραση ΟΤΙ Η ανάλυση των Ιδρύθηκε τον καρκίνο του παχέος εντέρου Παραλλαγές του κινδύνου σε όγκους του παχέος εντέρου και παρακείμενο φυσιολογικό ιστό. PLoS ONE 7 (2): e30477. doi: 10.1371 /journal.pone.0030477

Συντάκτης: Amanda Ewart Toland, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 του Σεπτεμβρίου του 2011? Αποδεκτές: 16 Δεκέμβρη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 17, Φεβρουαρίου, 2012

Copyright: © 2012 Loo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, National Institutes of Health υπό RFA # CA-95-011? και μέσω συμφωνιών συνεργασίας με το Πανεπιστήμιο της Χαβάης καρκίνου του παχέος εντέρου Οικογένεια Μητρώου (U01 CA074806), Mayo Clinic Συνεταιρισμός Οικογένεια Μητρώο του καρκίνου παχέος εντέρου Σπουδών (U01 CA074800), Οντάριο Μητρώου Μελετών της οικογενής καρκίνου του παχέος εντέρου (U01 CA074783), το Πανεπιστήμιο της Νότιας Καλιφόρνιας η οικογενής παχέος νεοπλασία Collaborative Group (U01 CA074799), και τα μέλη του καρκίνου του παχέος εντέρου Οικογένεια Μητρώο και αναστολέων πρωτεάσης Επιπλέον, το έργο αυτό εν μέρει υποστηρίζεται από επιχορήγηση 5U24 CA074806 και Affymetrix Συνεργασίες στον Καρκίνο Ερευνητικό Πρόγραμμα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Γονιδίωμα-ευρύ μελέτες συσχέτισης (GWAS) του καρκίνου του παχέος εντέρου αποκάλυψαν 19 κοινές γενετικές παραλλαγές σε 14 τόπους που συμβάλλουν στον κίνδυνο του καρκίνου του παχέος εντέρου [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]. Όλα εκτός από ένα (rs10936599) αυτών των παραλλαγών κινδύνου διαμένουν σε εσωνίων, διαγονιδιακές ή γονιδίου-έρημο περιοχές (Πίνακας 1) και μπορούν να χρησιμεύσουν ως δείκτες για παραλλαγές συνάφεια που ρυθμίζουν τις γειτονικές ή μακρινές γονίδια. Έτσι, η σημερινή πρόκληση είναι να διασαφηνίσει το πώς αυτές οι παραλλαγές κινδύνου επηρεάζουν ειδικά την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. Μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση είναι να αξιολογήσει αυτές τις παραλλαγές για τις ενώσεις τους με διαφορική γονιδιακή έκφραση από την απομαγνητοφώνηση της αφθονίας μπορεί να λειτουργήσει ως ένα χρήσιμο ενδιάμεσο φαινότυπο στην αποκρυπτογράφηση τη σχέση μεταξύ ενός γενετικού τόπου και ένα κλινικό φαινότυπο [8].

Η

τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου είναι ιδιαίτερα κληρονομικές [9], [10], [11] και διαφορική γονιδιακή έκφραση μπορεί να χαρτογραφηθεί σε ένα συγκεκριμένο γενετικό τόπο ως τόπο έκφρασης ποσοτικών χαρακτήρων (eQTL) επηρεάζουν σε κοντινή απόσταση (

σις

) ή μακρινή (

συναλλαγών

) γονίδια [12], [13]. Πράγματι, οι τόποι κίνδυνο GWAS έχουν αναφερθεί να εμπλουτιστεί για eQTLs, παρέχοντας πληροφορίες για την πιθανή μηχανιστική αποτελέσματα καθώς και βοηθώντας στον εντοπισμό των πρόσθετων παραλλαγές που μπορεί να ευθύνονται για την κληρονομικότητα της νόσου [14]. Ενώ αρκετές προηγούμενες μελέτες eQTL έχουν διεξαχθεί σχεδόν αποκλειστικά σε λεμφοβλαστοειδείς κυτταρικές σειρές [12], [15], [16], μερικές πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ιστο-ειδικών ενώσεων μεταξύ των γενετικών παραλλαγών και έκφρασης γονιδίου [17], [18], [19]. Για θέσεις κινδύνου εμφάνισης καρκίνου, οι ενώσεις eQTL παρατηρείται στην καταγωγής ιστό προκαλώντας του όγκου αναμένεται να είναι πιο κατατοπιστική [20].

Για να αποκαλύψει αν ιδρύθηκε παραλλαγές του κινδύνου για καρκίνο του παχέος εντέρου επηρεάζουν την έκφραση των γειτονικών γονιδίων διαφορικά από γονότυπο, πραγματοποιήσαμε μια

cis

-eQTL ανάλυση της GWAS-προσδιορίζονται κίνδυνο ορθοκολικού των παραλλαγών χρησιμοποιώντας τα δείγματα δίπλα-φυσιολογικών και καρκινικών ιστών σε συνδυασμό παχέος εντέρου που συλλέχθηκαν από 40 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. Αυτή είναι η πρώτη μελέτη που διεξάγει

cis

-eQTL ανάλυση και στις δύο παρακείμενες φυσιολογικών και καρκινικών ιστών από μια ομοιογενή ομάδα μοριακά χαρακτηρίζεται παχέος όγκους (MSS και CIMP-αρνητικό).

Υλικά και μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

η έγκριση για τη μελέτη αυτή λήφθηκε σύμφωνα με τις τοπικές απαιτήσεις Institutional Review Board (IRB) σε όλα τα συμμετέχοντα κέντρα. Όλα τα θέματα που περιλαμβάνονται στην παρούσα μελέτη υπέγραψε ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση.

Θέματα Μελέτη και δείγματα ιστών

Φρέσκο-κατεψυγμένα, αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου και σε συνδυασμό γειτονικό φυσιολογικό δείγματα ιστών συλλέχθηκαν σε τρεις περιοχές (Mayo Clinic, Όρος Σινά, και Cleveland Clinic) από τους συμμετέχοντες στον καρκίνο του παχέος εντέρου Οικογένεια μητρώου (C-CFR) [21] και δοκιμάστηκε για μικροδορυφορικού αστάθεια (MSI) και CpG φαινότυπο νησί methylator (CIMP). Δείγματα από 40 μικροδορυφορικών σταθερές (MSS) /CIMP-αρνητικούς όγκους, η πιο κοινή μορφή καρκίνου του παχέος εντέρου, και αντιστοιχισμένο γειτονικό φυσιολογικό δείγματα ιστού τους (συνολικά 80 δείγματα) χρησιμοποιήθηκαν για αυτή τη μελέτη. Οι 40 ασθενείς είχαν ευρωπαϊκή καταγωγή, με μέση ηλικία διάγνωσης τα 57 ετών.

DNA και RNA Απομόνωση

Όλα τα δείγματα όγκων κόπηκαν και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη, στη συνέχεια, εξετάζονται από ένα παθολογοανατόμο για τον προσδιορισμό του περιεχομένου των καρκινικών κυττάρων. δείγματα όγκων που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη είχαν & gt? 70% περιεκτικότητα σε κύτταρο όγκου. Γονιδιωματικό DNA και ολικό RNA εκχυλίστηκαν από αυτά τα δείγματα ιστού χρησιμοποιώντας το QIAGEN AllPrep DNA /RNA Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA) ακολουθώντας τις συστάσεις του κατασκευαστή.

MSI και CIMP Testing

κατάσταση MSI ήταν προσδιορίστηκε από την αντίδραση 10 μικροδορυφορικούς τόπους (

BAT25

,

BAT26

,

BAT40

,

BAT24C4

,

D5S346

,

D17S250

,

ΚΑΣ

,

D18S55

,

D10S197

, και

MYCL

) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Όγκοι ταξινομούνται ως MSS αν υπάρχουν δείκτες παρουσίασαν αστάθεια. Για τη δοκιμή CIMP, DNA όγκου υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όξινο θειώδες νάτριο και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία MethyLight αυτοματοποιημένο πραγματικού χρόνου που βασίζεται στην PCR για τον εντοπισμό μεθυλιωμένες θέσεις CpG στις περιοχές υποκινητή ενός καθιερωμένου πάνελ πέντε γονίδιο για CIMP (

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

, και

SOCS1

) και στην περιοχή του υποκινητή του

MLH1

. κατάσταση CIMP αναφέρθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως στο [23]. Όγκοι ταξινομούνται ως CIMP αρνητική αν υπερμεθυλίωση προαγωγού βρέθηκε σε ≤2 γονίδια του πίνακα πέντε-γονίδιο και αν δεν υπήρχε

MLH1

DNA υποστηρικτής methyation.

μικροσυστοιχιών Ανάλυση

προφίλ γονιδιακής έκφρασης για όγκους του παχέος εντέρου και παρακείμενο φυσιολογικό ιστό εκτιμήθηκαν με την Affymetrix GeneChip Human εξόνιο 1,0 ST Array (Affymetrix, Santa Clara, CA)? GEO αριθμό προσχώρησης GSE31737. Ριβοσωματικό RNA (rRNA) απομακρύνθηκε από ολικό RNA χρησιμοποιώντας το RiboMinus ανθρώπου /ποντικού μεταγραφικό Απομόνωση Kit (Invitrogen Carlsbad, CA). Μετά τη μείωση του rRNA, η Affymetrix GeneChip Σύνολο Transcript (WT) Sense στόχος δοκιμής επισήμανσης είχε χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή ενισχύεται και βιοτινυλιωμένο αίσθηση σκέλος στόχους DNA για υβριδοποίηση στο GeneChip Ανθρωπίνων εξόνιο 1.0 ST Πίνακες, σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή.

Γονιδιωματική DNA εκχυλίστηκε από φυσιολογικό ιστό κόλου (n = 34) ή αίματος (η = 6) δείγματα και ο γονότυπος χρησιμοποιώντας το Affymetrix Genome-Wide Ανθρώπινα SNP 6.0 Array. Εν συντομία, τα δείγματα DNA υποβλήθηκαν σε επεξεργασία, επισημαίνονται και υβριδοποιήθηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Όλες οι συστοιχίες σαρώθηκαν στο σαρωτή GeneChip® 3000 7G χρησιμοποιώντας το λογισμικό Affymetrix GeneChip Command Console (AGCC) για τη μέτρηση των φθορισμού εντάσεις σήματος σε κάθε θέση αισθητήρα. Το μέσο ποσοστό κλήσεων για τα 80 δείγματα ήταν 99,6%.

Η επιλογή των παραλλαγών κινδύνου για CRC

Θεωρήσαμε όλων των 19 ιδρύθηκε παραλλαγές του κινδύνου για καρκίνο του παχέος εντέρου αναφερθεί από μελέτες συσχέτισης του γονιδιώματος σε επίπεδο μέχρι το Νοέμβριο, 2010 (Πίνακας 1) [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]. Τα δεδομένα γενότυπο για 12 από τα 19 παραλλαγές δεν ήταν διαθέσιμα από την Affymetrix 6,0 array (Πίνακας 1). Για καθένα από αυτά τα 12 δεν παραλλαγές στη συστοιχία, επιλέχθηκε μεσολάβησης μεταξύ των πληκτρολογήσει SNPs μέσα σε μια περιοχή 20 kb ανάντη ή κατάντη της αλληλόμορφο κινδύνου, η οποία ήταν στο υψηλότερο LD (r

2≥0.90) με τον κίνδυνο παραλλαγή μεταξύ HapMap CEU (https://gvs.gs.washington.edu/GVS/). Επειδή rs10411210 στο 19q13.1 δεν έχουν μια αποδεκτή μεσολάβησης (r

2 & lt? 0,90). Στο 6.0 σειρά Affymetrix, αποκλείστηκε, με αποτέλεσμα συνολικά 18 παραλλαγές του κινδύνου για την ανάλυση

Σε πραγματικό Time PCR επικύρωση

Τεχνική επικύρωση των προφίλ γονιδιακής έκφρασης έγινε σε 20 ζεύγη κανονικό όγκο γειτονικά περιλαμβάνονται στις δοκιμασίες μικροσυστοιχίας. Πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR (qPCR) διεξήχθη για τα γονίδια βρέθηκαν να εκφράζονται διαφορικά από geneotype σε αυτή τη μελέτη (

ATP5C1

,

DLGAP5

,

NOL3

,

DDX28

) και για τέσσερα γονίδια (

APC

,

MACC1

,

DCC

, και

DSC2

) έχουν αναγνωρισθεί προηγουμένως να εκφράζονται διαφορικά σε όγκους παχέος εντέρου. Εν συντομία, cDNA παρασκευάστηκε από έως 2 μg ακατέργαστων ολικό RNA χρησιμοποιώντας High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems Foster City, CA). Για το Real-Time qPCR, 21-25 ng του cDNA (με βάση τα στοιχεία του RNA) διεξήχθη σε 384-καλά πλάκες PCR εις τριπλούν χρησιμοποιώντας 1 × αναλύσεις της γονιδιακής έκφρασης TaqMan και TaqMan Οικουμενική PCR βασικού μείγματος με τις συνιστώμενες θερμικό προφίλ στο 7900HT Fast Ρεάλ -Ώρα PCR System (Applied Biosystems Foster City, CA).

Στατιστική ανάλυση

για καθεμία από τις περιπτώσεις 18 κινδύνου που εξετάστηκαν, ένα

cis

-eQTL ανάλυση έγινε για να διερευνήσει τη σχέση μεταξύ γονότυπων SNP και την έκφραση του γονιδίου της όλα τα κοντινά γονιδίων (εντός 2 Mb ανάντη και κατάντη της κάθε SNP). Κάθε SNP εξετάστηκε από συν-κυρίαρχο και κυρίαρχα μοντέλα, χρησιμοποιώντας το ανέφεραν σημαντική αλληλόμορφο μεταξύ των Ευρωπαίων ως το αλληλόμορφο αναφοράς. παραλλαγές του κινδύνου που έχει μια κατηγορία γονότυπο με λιγότερο από 2 δείγματα δεν παρουσιάζονται. τιμών γονιδιακής έκφρασης του γονιδιώματος σε επίπεδο ήταν log

2-μετασχηματισμένα και κανονικοποιούνται χρησιμοποιώντας Στιβαρή Multi-array Ανάλυση (RMA), χρησιμοποιώντας διάμεση βερνίκι περιληπτική [24]. Η τιμή έκφρασης μεταγράφου για κάθε γονίδιο θεωρείται βασίστηκε στην μέση τιμή της έντασης probeset για το εν λόγω γονίδιο. Για τον εντοπισμό

cis

-genes συνδέονται με διαφορική έκφραση από SNP γονότυπο, πολυπαραγοντική ανάλυση συνδιακύμανσης (ANCOVA) διεξήχθη, την προσαρμογή για το στάδιο του όγκου και της παρτίδας δοκιμασία. Η Benjamini και ψευδείς ρυθμό ανακάλυψης (FDR) διόρθωση Hochberg για εφαρμόστηκε για τη διόρθωση για τον αριθμό των γονιδίων που ελέγχονται εντός του διαστήματος 4 Mb ρωτήθηκαν για κάθε αλληλόμορφο κινδύνου [25]. Spearman rank δοκιμές συσχετισμού διεξήχθη για να επικυρώσει τη συσχέτιση μεταξύ των μικροσυστοιχιών και αναλύσεις qPCR. Η Partek Γονιδιωματική Σουίτα 6,5 Λογισμικό (St. Louis, ΜΟ) χρησιμοποιήθηκε για μικροσυστοιχιών και αναλύει στατιστικά στοιχεία.

Αποτελέσματα

Στο σύνολο του δείγματος μας για 40 ζεύγη MSS και CIMP αρνητικά παχέος όγκους και γειτονικών φυσιολογικών ιστών, εντοπίσαμε 50 γονίδια που εκφράστηκαν διαφορικά με γονότυπο για 11 από τις παραλλαγές κινδύνου 18 μελετήθηκαν (

p-τιμές

& lt? 0,05? Πίνακας S1). Μετά από διόρθωση για πολλαπλές δοκιμές, τέσσερα γονίδια (

ATP5C1

,

DLGAP5

,

NOL3

,

DDX28

) εντοπίστηκαν να καταδείξει μια στατιστικά σημαντική διαφορά στα επίπεδα έκφρασης στον όγκο ή γειτονικό φυσιολογικό ιστό του παχέος εντέρου σε μία ή περισσότερες από τις τρεις κατηγορίες γονότυπο για rs10795668 (10p14), rs4444235 (14q22.2), ή rs9929218 (16q22.1) (παγκόσμια δοκιμή: FDR

q

-τιμή & lt? 0,05? Πίνακας 2). Για rs10795668 στο 10p14, παρατηρήσαμε μια σημαντική διαφορά στα επίπεδα έκφρασης γονιδίου με γονότυπο σε όγκους για το γονίδιο που κωδικοποιεί για την γάμα υπομονάδα στο συγκρότημα F1 του μιτοχονδριακού ΑΤΡ συνθάσης (

ATP5C1

?

q

-τιμή = 0.024). Αντίθετα, δεν υπήρχε διαφορά στα επίπεδα έκφρασης γονιδίου με γονότυπο για

ATP5C1

ή άλλα γειτονικά γονίδια σε παρακείμενο φυσιολογικό ιστό κόλου για αυτή την παραλλαγή. Ομοίως, για rs4444235 στο 14q22.2, παρατηρήσαμε μια σημαντική διαφορά στα επίπεδα έκφρασης γονιδίου από το γονότυπο για το

Drosophila

ομόλογο των δίσκων, τα μεγάλα πρωτεΐνης που συνδέεται με 5 (

DLGAP5? Q

-τιμή = 0,041) κατά τη σύγκριση των επιπέδων έκφρασης γονιδίου σε ιστό όγκου, αλλά όχι σε γειτονικό φυσιολογικό ιστό. Για rs9929218 στο 16q22.1, δύο γονίδια που παρατηρήθηκαν να έχουν μια διαφορά στα επίπεδα έκφρασης από τον γονότυπο: πυρηνισκικός πρωτεΐνη 3 (

NOL3

?

q

-τιμή = 0,017) και DEAD κουτί πολυπεπτίδιο 28 (

DDX28

,

q

-τιμή = 0,046), σε γειτονικό φυσιολογικό, αλλά δεν ιστό του όγκου.

Η

Οι γονότυπο-ειδικό συγκρίσεις για τις τρεις παραλλαγές του κινδύνου με

cis

-eQTL οι ενώσεις φαίνονται στον πίνακα 2 και στο Σχήμα 1. Παρατηρήσαμε μια στατιστικά σημαντική αυξημένη έκφραση του

ATP5C1

στους όγκους των ασθενών ομόζυγα για το αλληλόμορφο Α (

q

-τιμή = 0.006) σε rs10795668 (10p14) σε σύγκριση με το γονότυπο αναφοράς (GG). Για rs4444235 (14q22.2), οι όγκοι των ασθενών οι οποίοι ήταν ομόζυγοι για το αλληλόμορφο C είχαν σημαντικά υψηλότερη έκφραση για το

DLGAP5

σε σύγκριση με τους όγκους των ατόμων με τον γονότυπο αναφοράς (ΤΤ) (

q

-τιμή = 0,014). Για rs9929218 (16q22.1), το γονότυπο συγκεκριμένη έκφραση για

NOL3

και

DDX28

στο παρακείμενο φυσιολογικό ιστό του παχέος εντέρου μειώθηκαν σημαντικά μεταξύ των ασθενών ετερόζυγο για το αλληλόμορφο σε σχέση με εκείνους με το γονότυπο αναφοράς (GG) (

q

-τιμή = 9,34 × 10

-5 και

q

-τιμή = 4,15 × 10

-4, αντίστοιχα).

Κουτί οικόπεδα των επιπέδων έκφρασης κανονικοποιούνται γονίδιο

ATP5C1

,

DLGAP5

,

NOL3

,

και DDX28

για ζεύγη παρακείμενο φυσιολογικό ιστό του παχέος εντέρου (n = 40) και του όγκου του κόλου ιστού (n = 40). Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει τα κανονικοποιημένα επίπεδα έκφρασης του RNA για ένα άτομο. Το μεσαίο επίπεδο γονιδιακής έκφρασης για κάθε συγκεκριμένη ομάδα γονότυπου υποδεικνύεται από μια γραμμή στο εσωτερικό κάθε κουτί μέσα στο γράφημα. Η

σ

-τιμή υποδεικνύει τη σημασία της παγκόσμιας δοκιμή συγκρίνοντας την έκφραση σε όλη γονότυπους. Εάν οι p-τιμές ήταν σημαντικά (

σ

-value≤0.05), το FDR

q

δόθηκαν-τιμές, υποδεικνύοντας τη σημασία μετά τη διόρθωση για πολλαπλές συγκρίσεις.

Η

Λόγω του μικρού αριθμού υποκειμένων που ήταν ομόζυγα για το καρκίνο του παχέος εντέρου ελάσσονα αλληλόμορφα, μπορούμε επίσης να θεωρηθούν τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης σε δείγματα που πραγματοποιούνται είτε ένα ή δύο αντίγραφα του ανηλίκου αλληλόμορφου, σε σύγκριση με τον γονότυπο αναφοράς (τελευταία στήλη του Πίνακας 2). δείγματα όγκων από ασθενείς με ένα ή δύο αντίγραφα της ελάχιστο αλληλόμορφο (-α) (οποιαδήποτε A) για rs10795668, σε σύγκριση με το γονότυπο GG, έδειξαν αυξημένη έκφραση του

ATP5C1

σε 10p14 (

q

-τιμή = 0,004). Παρομοίως, για τα δείγματα όγκων των ασθενών με μία ή δύο αντίγραφα της ελάχιστο αλληλόμορφο (-α) (οποιοδήποτε C) στο rs4444235 (14q22.2), η έκφραση του

DLGAP5

αυξήθηκε σε σύγκριση με όγκους με ΤΤ γονότυπο (

q

-τιμή = 0,032). Δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά στην έκφραση του

NOL3

και

DDX28

σε όγκο ή γειτονικό φυσιολογικό ιστό κατά τη σύγκριση των ασθενών με μία ή δύο αντίγραφα της ελάχιστο αλληλόμορφο (-α) (Α) έναντι εκείνοι με το γονότυπο GG για rs9929218 στο 16q22.1 (Πίνακας 2).

τα τέσσερα γονίδια που εντοπίσαμε να εκφράζεται διαφορικά σε σχέση με τις τρεις παραλλαγές κινδύνου έχουν αποδειχθεί ότι έχουν ένα ρόλο στον καρκίνο που σχετίζεται μηχανισμών, όπως τον κυτταρικό μεταβολισμό και τον πολλαπλασιασμό, και την απόπτωση [26], [27], [28], [29]. Ως εκ τούτου, σε σύγκριση με τα επίπεδα έκφρασης των τεσσάρων

cis

-regulated γονίδια (

ATP5C1

,

DLGAP5

,

DDX28

,

NOL3

) μεταξύ όγκων και γειτονικό φυσιολογικό ιστό κόλου. Και τα τέσσερα γονίδια διαφορικά εκφραζόμενα σε όγκους σε σύγκριση με τον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό κόλου δείγματα. Το επίπεδο έκφρασης του

ATP5C1

(

σ

-τιμή = 0.005) ήταν χαμηλότερη σε όγκους, ενώ τα επίπεδα έκφρασης του

DLGAP5

(

p

– value = 7,80 × 10

-7),

DDX28

(

σ

-τιμή = 0,016) και

NOL3

(

p-τιμή

0,044) ήταν υψηλότερη σε όγκους σε σύγκριση με το παρακείμενο φυσιολογικό ιστό του παχέος εντέρου (Σχήμα 2).

οικόπεδα ασφαλείας των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου για

ATP5C1

,

DLGAP5

,

NOL3

,

και DDX28

σε ζεύγη παρακείμενο φυσιολογικό ιστό ιστού του παχέος εντέρου και του όγκου του παχέος εντέρου (n = 40 ζεύγη). Η σημασία της διαφορικής έκφρασης υποδεικνύεται από το

σ

-τιμή.

Η

Για να επιβεβαιωθεί η αξιοπιστία των αποτελεσμάτων μικροσυστοιχιών, πραγματοποιήσαμε μια τεχνική επικύρωση χρησιμοποιώντας δοκιμές qPCR των επιπέδων γονιδιακής έκφρασης σε 20 περιπτώσεις με το υπόλοιπο RNA, από τους 40 πρωτότυπα περιπτώσεις, για τις δύο γειτονικών φυσιολογικών και καρκινικών δείγματα ιστών. συντελεστές συσχέτισης Rank Παραγγελία του Spearman για τα τέσσερα γονίδια που προσδιορίζονται στο

cis

-eQTL ανάλυση στον τύπο ιστού (όγκου ή κανονική) όπου παρατηρήθηκε γονότυπο-ειδικό διαφορική έκφραση ήταν,

ATP5C1 r

s

= 0,39?

DLGAP5 r

s

= 0,68?

NOL3 r

s

= 0,11?

DDX28 r

s

= 0.22. Ως πρόσθετο βήμα τεχνική επικύρωση, μπορούμε προσδιορίστηκαν τέσσερα γονίδια (

APC

,

MACC1

,

DCC

, και

DSC2

) που έχουν προηγουμένως καθοριστεί να εκφράζονται διαφορικά μεταξύ όγκου και παρακείμενο φυσιολογικό ιστό σε καρκίνο του παχέος εντέρου [30], [31], [32], [33]. Βρήκαμε καλή συσχέτιση (Κατάταξη Παραγγελία συσχέτισης Spearman, το

r

s

& gt? 0,5) στα προφίλ γονιδιακής έκφρασης για τα τέσσερα γονίδια μεταξύ των μικροσυστοιχιών μας και αναλύσεις qPCR. Συγκεκριμένα, χαμηλότερη έκφραση του

APC

,

DCC

, και

DSC2

και υψηλότερη έκφραση του

MACC1

παρατηρήθηκε στα δείγματα των όγκων σε σχέση με την αντιστοίχιση παρακείμενο φυσιολογικό ιστό τόσο στην μικροσυστοιχία και προσδιορισμούς qPCR. Αυτά τα τεχνικά δεδομένα επικύρωσης υποστηρίζουν την αξιοπιστία της τις παρατηρήσεις μας με βάση τα αποτελέσματα μικροσυστοιχιών γονιδιακής έκφρασης.

Συζήτηση

Η μελέτη μας εξέτασε 18 από τα 19 GWAS ταυτότητα του παχέος παραλλαγές κίνδυνο καρκίνου για σύνδεση με την έκφραση της γειτονικής γονιδίων (εντός 2 Mb ανάντη και κατάντη του SNP) σε 40 ασθενείς με MSS και CIMP-αρνητικό καρκίνο του παχέος εντέρου, με χρήση γειτονικών δειγμάτων Καταψυγμένα ζεύγη κανονικό και όγκου κόλον (Σχήμα S1). Εμείς εντοπίστηκαν τέσσερα γονίδια (

ATP5C1

,

DLGAP5

,

NOL3

, και

DDX28

) σε τρεις τόπους κίνδυνο με στατιστικά σημαντική διαφορά στην έκφραση γονιδίων επίπεδα με το γονότυπο.

ATP5C1

κωδικοποιεί την υπομονάδα γ του καταλυτικού πυρήνα (F1) του μιτοχονδριακού ΑΤΡ συνθάσης, το ένζυμο συγκρότημα υπεύθυνο για τη σύνθεση του ΑΤΡ, που είναι γνωστό ότι παίζουν κεντρικό ρόλο στην κυτταρική αναπνοή. Μια κοινή εκδήλωση στα κύτταρα του όγκου είναι το διακόπτη μεταβολική από αναπνοή (στα μιτοχόνδρια) προς γλυκόλυση (στο κυτταρόπλασμα), που συχνά αναφέρεται ως «το φαινόμενο Warburg» [34], [35]. Πολλαπλές μηχανισμοί μπορεί να κινεί αυτό το διακόπτη, ένα εκ των οποίων είναι η μείωση στην έκφραση της β υπομονάδας της συνθάσης ΑΤΡ (F1) (

ATP5B

), που οδηγεί στην διατάραξη της καταλυτική λειτουργία του συγκροτήματος συνθάσης ΑΤΡ, ένα γεγονός που έχει προηγουμένως παρατηρηθεί σε πολλαπλούς τύπους καρκίνου [26], [29]. Στα δείγματα όγκου που αναλύθηκαν στην παρούσα μελέτη, παρατηρήσαμε μια αύξηση στα επίπεδα έκφρασης του

ATP5C1

ότι συσχετίστηκε σημαντικά με το Α αλληλόμορφου σε rs10795668. Η Α αλληλόμορφο έχει σχετιστεί με μειωμένο κίνδυνο ορθοκολικού καρκίνου (OR = 0,89?

σ

= 2.5 × 10

-13) σε προηγούμενη GWAS [6]. Ετσι, η αυξημένη έκφραση του

ATP5C1

συνδέεται με το Α αλληλόμορφο θα ήταν συνεπής με τη διατήρηση των δραστηριοτήτων των συνθάσης ΑΤΡ και την κυτταρική αναπνοή και πιθανώς αναστέλλοντας την εξέλιξη του όγκου για τον ορθοκολικό καρκίνο.

DLGAP5

, επίσης γνωστή ως

hurp

(ηπάτωμα επάνω ρυθμισμένη πρωτεΐνη), κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη μικροσωληνίσκων πρόσδεσης εμπλέκεται στο σχηματισμό και τη λειτουργία των μιτωτικών ατράκτων [36], [37] και πιστεύεται ότι είναι ένα κύτταρο ρυθμιστής κύκλου και στόχος της Aurora A κινάσης [38], [39]. Υπερέκφραση του

DLGAP5

έχει συσχετιστεί με την απελευθέρωση του σχηματισμού ατράκτου ινών και λειτουργίας κατά τη διάρκεια της μίτωσης [38]. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι

DLGAP5

μπορεί να έχει ένα ρόλο στη διατήρηση των βλαστικών κυττάρων και την επιβίωση και έχει παρατηρηθεί ότι υπερ-εκφράζεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα [27], [28], [40]. Το αλληλόμορφο C για rs4444235 έχει προηγουμένως αναφερθεί σε GWAS να αυξήσει τον κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου (OR = 1,11?

σ

= 8.1 × 10

-10) [3]. Η ανακάλυψή μας ότι το αλληλόμορφο C σχετίζεται με αυξημένη

DLGAP5

έκφραση σε όγκους, υποδηλώνει μια πιθανή μηχανισμό με τον οποίο αυτό το αλληλόμορφο μπορεί να προάγει την εξέλιξη του όγκου για τον ορθοκολικό καρκίνο. Επιπλέον, σημειώνουμε ότι rs4444235 έχει αποδειχθεί ότι έχουν σημαντικά ισχυρότερη συσχέτιση με MSS-υποτύπων του καρκίνου του παχέος εντέρου [3], η οποία ήταν η μοριακή υποτύπου των δειγμάτων όγκων που περιλαμβάνονται στη μελέτη μας.

DDX28

κωδικοποιεί για μια πρωτεΐνη DEAD κουτί με δραστηριότητα ελικάσης RNA. Αν και

DDX28

δεν έχει ειδικώς αναφερθεί ότι έχει ένα ρόλο στην ορθοκολικό καρκίνο, άλλες ελικάσες RNA DEAD κουτί έχει αποδειχθεί ότι υπερεκφράζεται σε όγκους παχέος εντέρου, επιδεικνύοντας μια λειτουργία για την RNA ελικάσες στην ογκογένεση [41], [42 ], [43]. Η

NOL3

γονίδιο, επίσης γνωστή ως ARC (απόπτωση καταστολέα με τον τομέα επιστράτευσης κασπάσης) κωδικοποιεί για ένα αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη που ρυθμίζει ρ53 και κασπάσες 2 και 8 [44], [45]. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι

NOL3

ρυθμίζεται από ενεργοποιημένα Ν- και Η- Ras και υπερεκφράζεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου [41], [46], [47]. Παρατηρήσαμε επίσης

NOL3

να υπερεκφράζεται στον όγκο έναντι παρακείμενο φυσιολογικό ιστό. Επιπλέον, μας

cis

-eQTL ανάλυση έδειξε σύνδεσης για μειωμένη έκφραση και των δύο

DDX28

και

NOL3

σε παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς του παχέος εντέρου των ατόμων που φέρουν το αλληλόμορφο, ιδιαίτερα περιπτώσεις με το γονότυπο GA για rs9929218. Σε συνδυασμό με τη διαπίστωση ότι η Α αλληλόμορφο στο rs9929218 σχετίζεται με μειωμένο κίνδυνο ορθοκολικού καρκίνου (OR = 0,91?

σ

= 1.2 × 10

-8) [3], η παρατήρηση μας ένωσης μεταξύ αυτού του αλληλόμορφου και μειωμένη

DDX28

και

NOL3

έκφραση σε παρακείμενο φυσιολογικό ιστό προτείνει ότι αυτά τα γονίδια μπορεί να μειώσει τον κίνδυνο του παχέος εντέρου λειτουργώντας να αναστέλλουν πρώιμα γεγονότα του παχέος καρκινογένεσης. Τα ευρήματά μας μπορεί επίσης να υπογραμμιστεί η σημασία της μελέτης φυσιολογικού ιστού, εκτός από ιστό του όγκου, σε μελέτες eQTL του καρκίνου.

Είναι ενδιαφέρον, τα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια που εντοπίζονται στην παρούσα μελέτη δεν ήταν γονίδια που γειτνιάζουν άμεσα με τις παραλλαγές κινδύνου GWAS. Για παράδειγμα, για rs10795668,

GATA3

είναι το πιο κοντινό γειτονικών γονιδίων, αλλά δεν τήρησε καμία σημαντική συσχέτιση για διαφορική έκφραση του

GATA3

και γονότυπο αυτού του SNP του (

p

-τιμή & gt? 0,05). Ομοίως, για rs4444235 και

ΒΜΡ4

, οι οποίες διαχωρίζονται από λιγότερο από 10 kb, και για rs9929218 που βρίσκεται σε ένα ιντρόνιο του

Cdh1

, παρατηρήσαμε καμία συσχέτιση με γονότυπο και γονιδιακή έκφραση. Σε μια πρόσφατη μελέτη, Carvajal-Carmona et al. αναφερθεί σε μια λεπτή μελέτη χαρτογράφησης για την παχέος αλληλόμορφα τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου στο 8q23.3 και 16q22.1 [48]. Βρήκαν επίσης καμία συσχέτιση με έκφραση γονιδίων του πλησιέστερου γονιδίου, όπως

EIF3H

και

Cdh1

σε κυτταρικές σειρές μονοκυττάρων, αντίστοιχα, αλλά βρείτε μια σύνδεση με πιο μακρινές γονίδια όπως

UTP23

για rs16892766 σε 8q23.3 και

ZFP90

για rs2059254 στο 16q22.1 [48]. Στη μελέτη μας, των δειγμάτων ιστού του παχέος εντέρου, παρατηρήσαμε επίσης μια ένωση (

σ

= 0.03) για

ZFP90

επίπεδα έκφρασης και το αλληλόμορφο κινδύνου σε 16q22.1 (Πίνακας S1)? Ωστόσο, η συσχέτιση δεν ήταν πλέον σημαντική μετά τις προσαρμογές για πολλαπλές συγκρίσεις. Τα αποτελέσματα αυτά, καθώς και εκείνα άλλων μελετών [3], [12], [15], [49], δείχνουν ότι οι παραλλαγές του κινδύνου δεν μπορεί κατά προτίμηση ρυθμίζουν τα γονίδια που βρίσκονται πιο κοντά. Αντίθετα, η μεταγραφική ρυθμιστικοί μηχανισμοί που επηρεάζονται από την κατάσταση αλληλομόρφων μπορεί να συνεπάγεται περίπλοκες καταστάσεις επιβεβαίωση της χρωματίνης και τη λειτουργία μέσα σε ένα συγκεκριμένο ιστό πλαίσιο.

Λίγες άλλες μελέτες έχουν εξετάσει τη σχέση μεταξύ του παχέος παραλλαγές κίνδυνο καρκίνου και γονιδιακή έκφραση σε σχεδόν από τα γονίδια. Η πειστική μελέτη διερεύνησε έξι παραλλαγές του κινδύνου GWAS για την επίδρασή τους στην έκφραση ενός μικρού αριθμού των γειτονικών υποψήφιων γονιδίων σε 90 CEU HapMap, EBV μετασχηματισμένες λεμφοβλαστοειδείς κυτταρικές σειρές (rs9929218 για

Cdh1

και

CDH3

, rs4444235 για

BMP4

, rs10411210 για

RHPN2

, rs961253 για

ΒΜΡ2

, rs6983267 για

c-myc

, και rs3802842 για

LOC120376

) [3]. Δεν βρέθηκαν σημαντικές συσχετίσεις. Παρά το γεγονός ότι δεν ήμασταν σε θέση να αξιολογήσει rs10411210, βρήκαμε ομοίως δεν συσχετίσεις μεταξύ των υπόλοιπων τεσσάρων παραλλαγές και διαφορική έκφραση αυτών των γονιδίων πριν ή μετά από διόρθωση για πολλαπλές δοκιμές τόσο σε γειτονικό φυσιολογικό κόλον και του όγκου των ιστών (

p-τιμές

& gt ? 0,05). Επιπλέον, παρόμοια με τα ευρήματά μας, μια προηγούμενη μελέτη του rs6983267 δεν διαπίστωσε καμία συσχέτιση με

c-myc

έκφραση σε 117 δείγματα φυσιολογικού ιστού του παχέος εντέρου [50].

Αυτή είναι η πιο ολοκληρωμένη και ένα από τα μεγαλύτερα ιστο-ειδικών

cis

-eQTL μελέτες έχουν αναφερθεί μέχρι σήμερα για τον ορθοκολικό καρκίνο. Παρ ‘όλα αυτά, η ερμηνεία των αποτελεσμάτων μας περιορίζεται από την στατιστική δύναμη μας (& lt? 60% για την ανίχνευση μια διαφορά 15% στην έκφραση σε όλη γονότυπους) και την ανάγκη για μελέτες αναπαραγωγής με μεγαλύτερα μεγέθη δειγμάτων για να επιβεβαιώσει την επίδραση αυτών των παραλλαγών κινδύνου για τη ρύθμιση γονιδιακή έκφραση των γειτονικών γονιδίων. Οι πιο αξιοσημείωτες αντοχές της μελέτης αυτής ήταν η ένταξη των δύο παρακείμενων φυσιολογικών και κακοήθων ιστών και ο περιορισμός σε μια ομοιογενή ομάδα μοριακά χαρακτηρίζεται παχέος όγκους (MSS και CIMP-αρνητικό).

Εν περιλήψει, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η ανάλυση των αποτελεσμάτων της αλλήλια κινδύνου επί της έκφρασης γονιδίων σε καλά χαρακτηρισμένο όγκων και αντιστοιχισμένο παρακείμενο φυσιολογικό ιστό τους είναι πιθανό να είναι ιδιαίτερα κατατοπιστική. Περαιτέρω εξέταση των παραλλαγών κινδύνου και διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων θα πρέπει να διεξάγεται για να επιβεβαιώσει τα αποτελέσματά μας, καθώς και την επέκταση της ανάλυσης σε άλλες μοριακές υποτύπους του καρκίνου του παχέος εντέρου και την αντιμετώπιση μηχανιστική γεγονότα σε ένα συγκεκριμένο ιστό πλαίσιο.

Συμπληρωματικές πληροφορίες

Σχήμα S1. διάγραμμα

ροής του

cis

-eQTL ανάλυση του παχέος παραλλαγές κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου. Το διάγραμμα ροής περιγράφει τις διαδικασίες για την ανάλυση των αποτελεσμάτων της αλλήλια κινδύνου επί της γονιδιακής έκφρασης, των γονιδίων μέσα σε ένα εύρος 4 Mb του αλληλόμορφου κινδύνου, σε καλά χαρακτηρισμένο ορθοκολικούς όγκους και αντιστοιχισμένο παρακείμενο φυσιολογικό ιστό τους

doi:. 10.1371 /journal.pone.0030477.s001

(ΔΕΘ)

πίνακα S1.

διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια που συνδέονται με τις παραλλαγές του κινδύνου για καρκίνο του παχέος εντέρου. Μια λίστα με τις 50 γονίδια που εντοπίστηκαν να εκφράζονται διαφορικά με γονότυπο για 11 του κινδύνου 18 παραλλαγών που μελετήθηκαν (

p-τιμές

& lt? 0,05) στην ανάλυση των 40 ζεύγη MSS και CIMP αρνητικά ορθοκολικού όγκου και γειτονικών φυσιολογικών ιστών

doi:. 10.1371 /journal.pone.0030477.s002

(PDF)

Ευχαριστίες

Το περιεχόμενο αυτού του χειρογράφου δεν αντανακλά απαραίτητα τις απόψεις ή τις πολιτικές του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου ή κάποιο από τα συνεργαζόμενα κέντρα στα CFRs, ούτε αναφορά εμπορικών επωνυμιών, εμπορικών προϊόντων ή οργανισμών υποδηλώνει την έγκριση από την κυβέρνηση των ΗΠΑ ή το ΚΠΑ. Ευχαριστούμε επίσης τους συμμετέχοντες του παχέος εντέρου Οικογενειακό Μητρώο που έχουν συμβάλει στην καλύτερη κατανόηση των γενετικών συνεισφορών σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Θα θέλαμε επίσης να ευχαριστήσουμε Affymetrix Καρκίνου του Προγράμματος Έρευνας και Δρ. Gordon Okimoto και Hansong Wang για αναλυτικές οδηγίες.