Αφηρημένο

Ιστορικό

Πρόσφατα εχινοδερμάτων μικροσωληνίσκους που σχετίζονται πρωτεΐνες όπως 4- αναπλαστικού λεμφώματος κινάσης (

EML4-ALK

) γονίδιο σύντηξης έχει γίνει ένα σημαντικό βιοδείκτη για ALK αναστολέας της τυροσινικής κινάσης (crizotinib) θεραπεία σε NSCLC. Ωστόσο, η καλύτερη μέθοδος για την ανίχνευση και τη σημασία του

EML4-ALK

τύπους παραλλαγή παραμένουν αβέβαιες.

Μέθοδοι

αλυσιδωτή αντίδραση αντίστροφης μεταγραφάσης-πολυμεράσης (RT-PCR), φθορισμού in situ υβριδισμού (FISH) και ανοσοϊστοχημική (IHC) χρώση έγιναν σε ιστούς όγκων των 312 ασθενών με NSCLC για την ανίχνευση του

ALK

αναδιατάξεις. Μετάλλαξη αναλύσεις για

EGFR

και

KRAS

γονίδια πραγματοποιήθηκαν επίσης.

Αποτελέσματα

Δεκατρείς από τους 312 ασθενείς (4,17%) είχαν

ALK

αναδιατάξεις ανιχνεύεται με RT-PCR. Εάν τα δεδομένα RT-PCR χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο του χρυσού, τεστ FISH είχαν χαμηλή ευαισθησία (58,33%), αλλά πολύ καλή ειδικότητα (99,32%). IHC λεκέ είχε καλύτερη ευαισθησία (91,67%) από ό, τι FISH, αλλά χαμηλότερη ειδικότητα (79,52%), όταν η αποκοπή ήταν IHC2 +. Όλα από τους 8 ασθενείς με υψηλή αφθονία

EML4-ALK

θετικά κύτταρα σε ιστούς όγκων (αξιολογείται από τις εντάσεις του σήματος του RT-PCR προϊόντος), επίσης έχουν υψηλή έκφραση του ALK πρωτεΐνης (IHC3 +), και θετική για τα ψάρια, εκτός από ένα απέτυχε στα ψάρια. Παραλλαγές 3α + 3β (4/5, 80%) του

EML4-ALK

γονίδιο σύντηξης ήταν πιο κοινό να έχει υψηλή αφθονία

EML4-ALK

θετικά κύτταρα σε ιστούς όγκων από παραλλαγή 1 ( 1/3, 33,3%). Μετα-ανάλυση των δημοσιευμένων στοιχείων των 2273 ασθενών με NSCLC αποκάλυψε ότι παραλλαγή 3 (23/44, 52,3%) ήταν ο πιο κοινός τύπος στο κινεζικό πληθυσμό, ενώ η παραλλαγή 1 (28/37, 75,7%) ήταν πιο συχνή σε Καυκάσιους.

Συμπεράσματα

Μεταξύ των τριών μεθόδων ανίχνευσης, RT-PCR θα μπορούσε να ανιχνεύσει όχι μόνο την παρουσία του

EML4-ALK

γονίδιο σύντηξης και τύπους παραλλαγή τους, αλλά και την αφθονία των

EML4-ALK

θετικά κύτταρα σε ιστούς όγκων NSCLC. Οι δύο τελευταίοι παράγοντες μπορεί να επηρεάσει την ανταπόκριση στη θεραπεία με αναστολέα αντι-ALK. Συμπεριλαμβανομένης της RT-PCR ως διαγνωστικό τεστ για τη θεραπεία αναστολέα ALK στις προοπτικές κλινικές μελέτες συνιστάται

Παράθεση:. Wu Y-C, Chang I-C, Wang C-L, Chen T-D, Chen Υ-Τ, Liu H-P, et al. (2013) Σύγκριση των IHC, FISH και Μέθοδοι RT-PCR για την ανίχνευση του

ALK

Ανακατατάξεις στα 312 μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ασθενείς στην Ταϊβάν. PLoS ONE 8 (8): e70839. doi: 10.1371 /journal.pone.0070839

Επιμέλεια: Syed A. Αζίζ, Υγείας του Καναδά και το Πανεπιστήμιο της Οτάβα, Καναδάς

Ελήφθη: 15 του Απρίλη του 2013? Αποδεκτές: 24 του Ιούν, 2013? Δημοσιεύθηκε: 7, Αυγούστου 2013

Copyright: © 2013 Wu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από Εθνικό Σύστημα Υγείας Ερευνητικά Ινστιτούτα (NHRI-Α1-MG-100-PP-04, NHRI-Α1-MG-101-PP-04), και το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο (NSC97-2320-Β-400-006- my3) για το Δρ Shiu-Feng Huang. Ο φθορισμός σε in situ υβριδισμού μελέτη (FISH) υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από την Pfizer (WS2084622) για το Δρ Yi-Cheng Wu. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Έχουμε τα εξής ενδιαφέροντα: το φθορισμό in situ υβριδισμού (FISH) μελέτη υποστηρίχθηκε με επιχορήγηση από την Pfizer (WS2084622) για το Δρ Yi-Cheng Wu. Pfizer στην Ταϊβάν ήρθε να επισκεφτεί η ομάδα μας κατά το έτος 2011 για την υποστήριξη μιας μελέτης του ALK αναδιάταξη σε ασθενείς με NSCLC στην Ταϊβάν, η οποία ήταν σημαντικό για αυτούς, δεδομένου ότι τα στοιχεία αυτά ήταν ακόμα λείπει στην Ταϊβάν (τα δεδομένα της Κίνας και του Χονγκ Κονγκ έχει δημοσιευθεί στην έτους 2010 και 2009, αντίστοιχα). Επιθυμούσαν να υποστηρίξει μια μελέτη που θα μπορούσε να περιλαμβάνει περισσότερους από 300 ασθενείς με NSCLC (naive σε θεραπεία αναστολέα ALK) και περιλαμβάνει μέθοδο ανίχνευσης FISH. Αφορούν κυρίως ήθελαν να γνωρίζουν την επίπτωση της ALK ανακατατάξεις στους ασθενείς με NSCLC στην Ταϊβάν. Pfizer ανακοίνωσε ότι δεν θα παρεμβαίνει με το σχεδιασμό της μελέτης, τις μεθόδους, τα αποτελέσματα και τις μελλοντικές εκδόσεις. Μέχρι το τέλος του επιχορηγήσεων, χρειαζόμαστε μόνο να υποβάλουν συνοπτική έκθεση των αποτελεσμάτων της μελέτης, η οποία ήταν παρόμοια με άλλες πηγές χρηματοδότησης. Έτσι, αποφασίσαμε να δεχτούμε αυτή την επιχορήγηση από την Pfizer μετά από αυτή τη συμφωνία. Στα τέλη του 2012, έχουμε υποβάλει μια δισέλιδη σύντομη συνοπτική έκθεση στην Pfizer για το χρόνο (τέλος της υποστήριξης επιδότησης), η οποία περιελάμβανε μόνο τα ανεπεξέργαστα δεδομένα. Μετά από αυτό, δεν χρειάζεται να δώσει περισσότερες πληροφορίες για την Pfizer. Ο Δρ Shiu-Feng Huang έχει προσκληθεί ως μέλος της συμβουλευτικής επιτροπής της Pfizer στη μελέτη NSCLC στην Ταϊβάν. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει προσήλωση μας σε όλα τα PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

καρκίνους του πνεύμονα, κυρίως μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) υπήρξε η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στον κόσμο, και ο αριθμός των ασθενών εξακολουθεί να αυξάνεται [1,2]. Η μεγάλη επιτυχία της στοχευμένης θεραπείας με τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) αναστολέας της τυροσίνης κινάσης (ΤΚΙ): gefitinib και erlotinib, για τη θεραπεία του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα έχει καταστήσει στοχευμένη θεραπεία γίνει η πιο δημοφιλής μορφή για μεγάλα καρκίνους του ανθρώπου [3-7]. Ψάχνοντας για νέους και αποτελεσματικούς στόχους, εκτός από EGFR στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα δεν υπήρξε επιτυχής μέχρι το έτος 2007, όταν Soda, et al προσδιόρισε το microtubule- εχινοδερμάτων πρωτεΐνη που συνδέεται-like-4 και η αναπλαστικού λεμφώματος κινάσης (

EML4-ALK

) γονίδιο σύντηξης με ικανότητα μετασχηματισμού σε ασθενείς με ΜΜΚΠ [8]. ALK πρωτεΐνη είναι ένα 200kDa υποδοχέα κινάσης τυροσίνης. σηματοδοτικό μονοπάτι του εμπλέκει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη διαφοροποίηση, και αντι-απόπτωση [8,9]. Πριν από την ταυτοποίηση του

EML4-ALK

γονίδιο σύντηξης,

Nucleophosmin

–

ALK

(ΝΡΜ-ALK) γονίδιο σύντηξης εντοπίστηκε για πρώτη φορά στο αναπλαστικό λέμφωμα μεγάλων κυττάρων [10]. Διάφοροι συνδυασμοί ALK με άλλες πρωτεΐνες έχει ανακαλυφθεί σε διαφορετικές νεοπλάσματα, όπως η διάχυτη από μεγάλα Β κύτταρα λέμφωμα, φλεγμονώδεις μυοϊνοβλαστικά όγκου, νευροβλάστωμα, καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων του οισοφάγου, και καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων [11-13]. Αλλά η

EML4-ALK

γονίδιο σύντηξης είναι μοναδική για NSCLC [14]. ALK αναγνωρίζεται πλέον ως ένα σημαντικό ογκογόνο οδηγό σε NSCLC. Πολλαπλές

EML4-ALK

έχουν παραλλαγές στο NSCLCs έχουν εντοπιστεί, όλοι περιέχουν το ίδιο C-τελική περιοχή της κινάσης, και να αναθέσει το κέρδος-of-λειτουργία ιδιότητες [14]. Παρά το γεγονός ότι

EML4

γονίδιο είναι το κυρίαρχο εταίρο σύντηξης του

ALK

σε NSCLC, άλλα γονίδια συνεργάτη σύντηξης και έχουν εντοπιστεί, η οποία περιελάμβανε

KIF5B-ALK, KLC1-ALK και ΜΟΚ-ALK

γονίδια σύντηξης [15-18]. Πλειοψηφία των

ALK

ανακατατάξεις εντοπίστηκαν σε αδενοκαρκίνωμα και μη-καπνιστές [8,14,18-28]. Οι συχνότητες εμφάνισης

EML4-ALK

γονίδιο σύντηξης στο NSCLC ήταν περίπου 1,4 σε 11,6% χωρίς σημαντικές διαφορές μεταξύ των χωρών της Ασίας και της δυτικής [8,14,18-28]. Ενώ

EML4-ALK

σύντηξης που προσδιορίζονται στο NSCLC, ένας νέος αναστολέας της τυροσινικής κινάσης ALK (ALK-TKI): crizotinib αναπτύχθηκε σε παρόμοιο χρόνο. Αυτό το φάρμακο αρχικά σχεδιάστηκε ως αναστολέας τυροσινικής κινάσης ΜΕΤ για τη θεραπεία ασθενών με NSCLC, αλλά βρέθηκε να είναι ένας αναστολέας ALK, πάρα πολύ. Έτσι, προοπτικές κλινικές μελέτες σχεδιάστηκαν και ξεκίνησαν γρήγορα σε ασθενείς με NSCLC με

EML4-ALK

γονίδια σύντηξης. Η κλινική δοκιμή φάσης ΙΙ δημοσιεύθηκε το έτος 2010, η οποία κατέδειξε δραματική απόκριση και μεγαλύτερη επιβίωση χωρίς εξέλιξη σε crizotinib θεραπεία σε ασθενείς με

EML4-ALK

γονίδιο σύντηξης [29-31], παρόμοια με EGFR-ΤΚΙ σε NSCLC ασθενείς με

EGFR

μεταλλάξεις [3-7]. Crizotinib εγκρίθηκε από την Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) των Ηνωμένων Πολιτειών κατά το έτος 2011 για τη θεραπεία των ασθενών με NSCLC, και με ένα διαγνωστικό τεστ σύντροφος, η Vysis ALK Break Εκτός FISH Probe Kit, που θα μπορούσε να σας βοηθήσει να προσδιορίσετε αν ένας ασθενής έχει το ανώμαλη

ALK

γονίδιο [32].

EML4-ALK

γονιδίου σύντηξης γίνεται ένα νέο σημαντικό μοριακό δείκτη για τη θεραπεία crizotinib σε ασθενείς με NSCLC. Ωστόσο, η καλύτερη μέθοδος ανίχνευσης για

EML4-ALK

γονίδιο σύντηξης παραμένει αμφιλεγόμενη. Θεωρητικά, η αντίστροφη αλυσιδωτή αντίδραση τρανσκριπτάσης-πολυμεράσης (RT-PCR) και φθορισμό in situ υβριδισμού (FISH) είναι δύο τυποποιημένες μέθοδοι για την ανίχνευση των γονιδίων σύντηξης, αλλά και οι δύο έχουν σημαντικούς περιορισμούς στην κλινική πρακτική. RT-PCR απαιτεί δείγματα νωπού κατεψυγμένου ιστού για την εξαγωγή του RNA, και μια αξιόπιστη δοκιμασία FISH απαιτεί καλή πεδίο φθορισμού και τεχνική εμπειρογνωμοσύνη. Ανοσοϊστοχημική (IHC) χρώση για την ανίχνευση του ALK υπερ-έκφραση υπήρξε μια καθιερωμένη μέθοδος για την ανίχνευση του

ALK

αναδιατάξεις, όπως ΝΡΜ-ΑΙΚ, σε αιματολογικές κακοήθειες για χρόνια [33,34]. Δεδομένου ότι το κόστος της ανάλυσης κηλίδας IHC είναι πολύ μικρότερη από αυτή του προσδιορισμού FISH, IHC λεκέδες θα μπορούσε να είναι μια πολύ πιο βολικό και οικονομικά αποδοτική μέθοδο διαλογής για

ALK

ανακατατάξεις σε NSCLCs, σε σύγκριση με τα ψάρια ή RT-PCR . Ωστόσο, η ευαισθησία της IHC λεκέ παρέμεινε αμφιλεγόμενη. Πολλές ερευνητικές ομάδες ανέφεραν καλές συσχετίσεις μεταξύ IHC λεκέ και FISH για την ανίχνευση του

EML4-ALK

γονίδιο σύντηξης [16,35-38], αλλά κάποιοι ανέφεραν ότι IHC λεκέ ήταν μη ευαίσθητα στην ανίχνευση του

EML4 -ALK

γονίδιο σύντηξης [25,39-41]. Θα ήταν πιο ιδανικό για να εκτελέσει όλες τις τρεις μεθόδους (IHC, FISH και RT-PCR) σε μια μεγάλη σειρά NSCLC όγκων για άμεση σύγκριση των αποτελεσματικοτήτων τους.

Προηγουμένως, έχουμε ανέφεραν καλή συσχέτιση μεταξύ IHC λεκές για ALK και τη μελέτη RT-PCR για την αναγνώριση του

EML4-ALK

γονιδίων σύντηξης σε 64 ασθενείς με NSCLC [42]. Έχουμε επεκταθεί η μελέτη μας για 312 ασθενείς με NSCLC και εκτέλεσε τις τρεις μεθόδους (IHC, FISH, και RT-PCR) για την άμεση σύγκριση της ευαισθησίας και της ειδικότητας.

Αποτελέσματα

ALK

αναδιάταξη ανιχνεύεται με RT-PCR

τα κλινική-παθολογική χαρακτηριστικά των 312 ασθενών παρουσιάζονται στον πίνακα S1. Μεταξύ των 312 ασθενών που συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη RT-PCR, δεκατρείς ασθενείς (13/312, 4,17%), τρία αρσενικά (ο ένας ήταν ποτέ καπνιστής) και δέκα γυναίκες (επτά είχαν ποτέ καπνιστές), βρέθηκαν να έχουν

ALK

αναδιάταξη. Δώδεκα είχε

EML4-ALK

γονίδιο σύντηξης και ένας είχε

KIF5B-ALK

γονίδιο σύντηξης. Οι διαγνώσεις παθολογία ήταν αδενοκαρκινώματα (ADC) σε έντεκα ασθενείς, πλακώδες καρκίνωμα (SCC) σε ένα ασθενή, και αδενοχοληδωτό καρκίνωμα (ADSC) σε έναν ασθενή. Κανένας από τους 13 ασθενείς είχαν συνυπάρχουσες

EGFR

ή

KRAS

μεταλλάξεις. Η συχνότητα των

ALK

αναδιάταξη σε EGFR-άγριου τύπου, μη-SCC ασθενών ήταν 12% (12/100).

KLC1-ALK

, και

ΜΟΚ-ALK

γονίδια σύντηξης που δεν προσδιορίζονται. Μεταξύ των 12 ασθενών με

EML4-ALK

γονίδιο σύντηξης, τρεις ήταν παραλλαγή 1, ένα ήταν παραλλαγή 2, πέντε ήταν παραλλαγή 3a + 3b με 3b κυρίαρχη, δύο ήταν παραλλαγή 3α, και ένα ήταν παραλλαγή 3β.

ALK

αναδιάταξη ήταν μόνο σημαντική συσχέτιση με το γυναικείο φύλο (P = 0.0248) από την μονοπαραγοντική ανάλυση. Αν και πλειοψηφία (8/13, 61,5%) των ασθενών με

ALK

αναδιάταξη ήταν στο στάδιο Ι και καμία δεν ήταν σε στάδιο IV, η σύνδεση με το στάδιο του όγκου ήταν στατιστικά μη σημαντική (p = 0,5740). Η πολυπαραγοντική ανάλυση για την ένωση με πέντε κλινικο-παθολογικών χαρακτηριστικών, δηλαδή το φύλο, την ηλικία, το ιστορικό καπνίσματος, είδη ιστολογίας και το στάδιο του όγκου, εκτελέσθηκε από δυαδική δοκιμή λογιστικής παλινδρόμησης. Εκτός από το γυναικείο φύλο (p = 0,007), μη καπνιστής, επίσης, έγινε σημαντική συσχέτιση με το

ALK

αναδιατάξεις (p = 0.022), δεδομένου ότι υπάρχει μια μεγάλη διαφορά στο ποσοστό καπνίσματος μεταξύ ανδρών και γυναικών ασθενών (ποτέ καπνιστές είχαν 38% σε άνδρες έναντι 94,4% στις γυναίκες, p & lt? 0,0001). Το στάδιο του όγκου παρέμενε μη σημαντική. Οι τιμές P για κάθε στάδιο ήταν: Στάδιο Ι: Ρ = 0,6220, Στάδιο II: P = 0.4040, Φάση ΙΙΙ: P = 0.6190, και Στάδιο IV: P = 0.9990, αντίστοιχα

ALK

αναδιάταξη καθορίζεται από FISH

Μεταξύ των 312 ασθενών, οι μελέτες FISH δεν πραγματοποιήθηκαν σε δύο ασθενείς, δεδομένου ότι δεν υπολειπόμενο ιστό του όγκου θα μπορούσε να βρεθεί στα τμήματα παραφίνης. μελέτες FISH απέτυχε σε άλλα 5 ασθενείς. Ως αποτέλεσμα, τα δεδομένα ανάλυσης FISH ήταν διαθέσιμο σε συνολικά 305 ασθενείς. Εννέα ασθενείς (9/305, 2,95%) ήταν θετικά από διάλειμμα εκτός μελέτη FISH. Όλοι τους είχαν αδενοκαρκίνωμα. Ο ένας ήταν άνδρας ασθενής (καπνιστής), και οκτώ ήταν γυναίκες ασθενείς (δύο ήταν καπνιστές). Μόνο 7 από τους 9 ασθενείς ήταν επίσης RT-PCR (+).

έκφραση πρωτεΐνης ALK ανιχνεύεται με IHC λεκές

Ένα σύνολο 310 ασθενών είχαν επιτυχή λεκέ IHC για την ανίχνευση της έκφρασης πρωτεΐνης ALK, αφού αποκλείστηκαν 2 ασθενείς χωρίς μέρος του όγκου στα τμήματα ιστών. Όλοι οι 78 ασθενείς με αρνητικό λεκέ IHC ήταν RT-PCR (-) και FISH (-). Για τους 159 ασθενείς με IHC 1+, μόνο ένας ασθενής ήταν RT-PCR (+), αλλά FISH (-), ήταν η μόνη SCC θετικό για RT-PCR. Για τους 61 ασθενείς με IHC 2+, τρία ασθενής ήταν RT-PCR (+), αλλά FISH (-), και ένας ασθενείς ήταν RT-PCR (-) αλλά FISH (+). Για τους 12 ασθενείς με IHC 3+, εννέα ήταν RT-PCR (+). Επτά από αυτούς ήταν επίσης FISH (+), η οποία περιελάμβανε την μόνο ένας ασθενής με

KIF5B-ALK

γονίδιο σύντηξης (Σχήμα S1). Ένας άλλος ένας ήταν FISH (-) και το τελευταίο απέτυχε στα ψάρια. Για τις υπόλοιπες 3 ασθενείς με IHC3 + και RT-PCR (-), ένα ήταν FISH (+) (Σχήμα S2), ένα ήταν FISH (-), και ένα απέτυχε στα ψάρια. Τα τελευταία 2 ασθενείς είχαν επίσης μεταλλάξεις του EGFR.

μετάλλαξη του EGFR αναλύει

Ανάμεσα στους 312 ασθενείς με ΜΜΚΠ, η

ρυθμός EGFR

μετάλλαξης ήταν 43,91% (137/312). Όλα ήταν μη-SCC, η οποία περιελάμβανε 133 ADC και 4 ADSC. Η

EGFR

ρυθμό μετάλλαξης σε μη-SCC ασθενείς ήταν 57,81% (137/237). Για τους μη-SCC ασθενείς,

EGFR

μεταλλάξεις μόνο σημαντικά σχετίζονται με μη καπνιστές (p = 0,0002), αλλά όχι με την ηλικία ή το φύλο. Κανένας από τους ασθενείς είχαν συνυπάρχουσες

ALK

ή

KRAS

μεταλλάξεις.

KRAS μετάλλαξη αναλύει

Ανάμεσα στους 312 ασθενείς με ΜΜΚΠ, η

KRAS

ρυθμός μετάλλαξης ήταν 5,77% (18/312), η οποία περιελάμβανε 16 αδενοκαρκινώματα και δύο αδενοχοληδωτό καρκινώματα. Ο ρυθμός μετάλλαξης σε μη-SCC ήταν 7,59% (18/237). Δώδεκα ασθενείς ήταν άνδρες (10 ήταν καπνιστές) και 6 ήταν γυναίκες (κανένα δεν ήταν καπνιστές).

KRAS

μεταλλάξεις μόνο σημαντική συσχέτιση με την ιστολογική εξέταση τύπου (καρκίνωμα μη πλακώδους επιθηλίου) (p = 0,0091).

Σύγκριση των τριών μεθόδων ανίχνευσης

Ένα σύνολο 305 ασθενείς είχαν δεδομένα των τριών μεθόδων ανίχνευσης (RT-PCR, FISH και IHC) για την άμεση σύγκριση. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα S2. Τα αποτελέσματα της μελέτης όλων των 17 ασθενείς θετικοί για είτε RT-PCR, ή έκφραση FISH ή υψηλής ALK συνοψίστηκαν στον Πίνακα S3. Τα ιστολογικά χαρακτηριστικά όλων των 17 ασθενών που εξετάστηκαν. Όλα τα αδενοκαρκινώματα θετικό για ALK αποτελούνταν από μικτά ιστολογικές μορφές.

Η ειδικότητα και η ευαισθησία των ψαριών και IHC σύμφωνα με τα στοιχεία

RT-PCR

Αν τα αποτελέσματα RT-PCR χρησιμοποιήθηκαν ως κανόνα του χρυσού για ALK αναδιάταξη, και της αποκοπής για έκφραση ALK πρωτεΐνη ήταν IHC 2+, η ευαισθησία και η ειδικότητα της IHC ήταν 91,67% και 79,52%, αντίστοιχα. Η θετική προγνωστική αξία της IHC ήταν μόλις 15,49% και η αρνητική τιμή πρόβλεψης ήταν 99,57%. Αν το cut-off 3+ κατά IHC, η ευαισθησία και η ειδικότητα της IHC ήταν 66,67% και 99,32%, αντίστοιχα. Η θετική προγνωστική αξία της IHC ήταν 80.00% και η αρνητική τιμή πρόβλεψης ήταν 98,64%. Για τη δοκιμή FISH, αν η ευαισθησία της ήταν μόλις 58.33%, η ειδικότητα ήταν πολύ υψηλή (99,32%). Η θετική προγνωστική αξία της FISH ήταν 77.78% και η αρνητική τιμή πρόβλεψης ήταν 98,31%.

Η αξιολόγηση της αφθονίας των EML4-ALK θετικά κύτταρα σε ιστούς όγκων με RT-PCR

Η αφθονία των

EML4-ALK

θετικά κύτταρα σε ιστούς όγκων εκτιμήθηκε σύμφωνα με τις εντάσεις των RT-PCR προϊόντων σε ηλεκτροφόρηση πηκτής. Το αποτέλεσμα του κάθε όγκου σε σύγκριση με το ψάρι και τα δεδομένα IHC (Πίνακας S3). Οκτώ από τους όγκους 13 RT-PCR (+) είχε ισχυρή ένταση των προϊόντων RT-PCR, η οποία πρότεινε μεγάλη αφθονία

του EML4-ΑΙΚ

θετικών κυττάρων στους ιστούς του όγκου. Όλες αυτές οι 8 ασθενείς ήταν 3+ κατά IHC και FISH (+), εκτός από μία απέτυχαν στη μελέτη FISH. Για τους 5 ασθενείς με ασθενή ένταση των προϊόντων RT-PCR, η οποία πρότεινε χαμηλή αφθονία

EML4-ALK

θετικά κύτταρα σε ιστούς όγκων, όλοι τους ήταν FISH (-) και μόνο μία ήταν IHC 3+. Ο τελευταίος ήταν ένας όγκος ανήκε στην παραλλαγή 3α + 3β. Εκπρόσωπος περιπτώσεις φαίνεται στο Σχήμα S3. Όταν σε σύγκριση με τα δεδομένα τύπου παραλλαγή, μεγάλη αφθονία των

EML4-ALK

θετικά κύτταρα σε ιστούς όγκων ήταν πιο συχνές σε παραλλαγή 3α + 3β (4/5, 80%) από ό, τι Περίπτωση 1 (1/3, 33,3 %) (Πίνακας S3).

μετα-ανάλυση της εθνότητας και τους τύπους παραλλαγή που σχετίζονται με

EML4-ALK

γονίδιο σύντηξης

η μετα-ανάλυση των δεκαοκτώ μελέτες (συμπεριλαμβανομένων η παρούσα μελέτη) που είχε πραγματοποιηθεί μελέτη RT-PCR για την ανίχνευση του

EML4

–

ALK

γονίδιο σύντηξης πραγματοποιήθηκαν και παρουσιάζονται στον πίνακα S4 και S5 Πίνακας [8,15,16,18- 28,40,41,43]. Μεταξύ των 2273 ασθενών με NSCLC με διαθέσιμα εθνικότητα και τα δεδομένα τύπου παραλλαγή για

EML4

–

ALK

γονίδιο σύντηξης, παραλλαγή 3 (23/44, 52,3%) ήταν ο πιο κοινός τύπος στο κινεζικό πληθυσμό, ενώ Περίπτωση 1 (28/37, 75,7%) ήταν πιο συχνή σε Καυκάσιους. Η διαφορά ήταν στατιστικά σημαντική τόσο για την παραλλαγή 1 (p = 0,0000) και την παραλλαγή 3 (ρ = 0,0020). Όσον αφορά Ιάπωνες ασθενείς, Περίπτωση 1 (11/33, 33%) ήταν επίσης οι πιο κοινές παραλλαγές, αλλά δεν ήταν τόσο κυρίαρχη όσο στον Καυκάσου.

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, η συχνότητα εμφάνισης

ALK

αναδιατάξεις σε ασθενείς με NSCLC στην Ταϊβάν ήταν αρκετά χαμηλή (4.17%) σύμφωνα με τα αποτελέσματα RT-PCR. Για

EGFR

-wild τύπου, μη-SCC ασθενείς, ήταν 12% (12/100).

ALK

αναδιάταξη ήταν μόνο σημαντική συσχέτιση με το γυναικείο φύλο και μη-καπνιστές από αναλύσεις πολλαπλών μεταβλητών. Τα παραπάνω αποτελέσματα ήταν αρκετά παρόμοια με προηγουμένως δημοσιευμένες αναφορές από χώρες της Ασίας ή της Δυτικής Ευρώπης. Βρήκαμε ότι η κατανομή στάδιο σε ασθενείς με NSCLC με

ALK

ανακατατάξεις ήταν όλα πολύ παρόμοια, δηλαδή μεγαλύτερο αριθμό στο στάδιο Ι και κανένας ή πολύ λίγοι σε στάδιο IV, μεταξύ των σπουδών μας και 4 δημοσιευμένες εκθέσεις [21,24, 25,27], Ο λόγος για τον οποίο δεν συσχετίστηκε σημαντικά με το στάδιο του όγκου ήταν ότι οι ασθενείς χωρίς

ALK

ανακατατάξεις είχαν επίσης υψηλότερο αριθμό των ασθενών στη φάση Ι και το χαμηλότερο στην σταδίου IV σε όλες αυτές τις 5 μελέτες (μόνο 2-14 ασθενείς στο στάδιο IV). Αυτή η άνιση κατανομή φάση ήταν πιθανότατα λόγω της διαθεσιμότητας του φρέσκου κατεψυγμένου ιστών για RT-PCR, η οποία ήταν περισσότερο διαθέσιμο σε λειτουργική ασθενείς (στάδιο Ι έως III), και είναι δύσκολο για το στάδιο IV του ασθενούς. Είναι ενδιαφέρον ότι οι συχνότητες των

ALK

ανακατατάξεις στο στάδιο ΙΙΙ ασθενείς ήταν όλα υψηλότερα από ό, τι τα άλλα στάδια στη μελέτη μας και 3 από τα παραπάνω 4 εκθέσεις [21,24,27]. Θα απαιτούσε ένα μεγάλο αριθμό υπόθεσης για να διαπιστωθεί αν η συχνότητα του

ALK

αναδιατάξεις θα αυξηθεί με το στάδιο του όγκου, δεδομένου ότι η συχνότητα εμφάνισης

ALK

ανακατατάξεις ήταν αρκετά χαμηλή.

Ένας σημαντικός στόχος αυτής της μελέτης ήταν να συγκριθεί η ευαισθησία και την ειδικότητα μεταξύ των τριών μεθόδων ανίχνευσης (IHC, FISH, και RT-PCR). Αποκάλυψε ότι τα ψάρια είχαν χαμηλή ευαισθησία (58.33%), αλλά με πολύ καλή ειδικότητα (99,32%). Σε αντίθεση, IHC λεκέ φάνηκε να έχει καλύτερη ευαισθησία (91,67%) από ό, τι FISH, αλλά η ειδικότητα (79,52%) ήταν πολύ χαμηλότερη, όταν η αποκοπή ήταν IHC2 +. Για να καταλάβετε αν τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται θα επηρεάσει τα αποτελέσματα IHC ή όχι, έχουμε εκτελούνται λεκέδες IHC σε όλα τα RT-PCR (+) όγκους με επιπλέον αντισώματα ALK από διαφορετικές εταιρείες, οι οποίες περιλαμβάνονται 5A4 (Histofine, Nichirei), 5A4 (Abcam), 5A4 (Novocastra), και D5F3 (Cell Signaling), να συγκρίνουν την ευαισθησία και την ειδικότητα τους. Όλα τα παραπάνω αντισώματα ALK έχουν χρησιμοποιηθεί σε δημοσιευμένες αναφορές [15,25,35,36,38-40]. Φάνηκε ότι όταν οι όγκοι είχαν έκφραση υψηλού ALK (IHC 3+) από το αντίσωμα αντι-ALK χρησιμοποιήσαμε (ZAL4), αυτά θα ήταν επίσης θετικός με υψηλή ένταση από όλα τα άλλα αντισώματα αντι-ALK (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αντίθετα, εάν οι όγκοι είχαν μόνο μέτρια έκφραση αλκ (IHC 2+) με ZAL4, αυτοί οι όγκοι θα ήταν εντελώς αρνητικό για ALK από τα άλλα αντισώματα αντι-ΑΙΚ. Όπως φαίνεται στον Πίνακα S3, τέσσερα RT-PCR (+) ή FISH (+) όγκους σε αυτή τη μελέτη ήταν IHC 2+. Έτσι, ZAL4 φάνηκε να έχουν υψηλότερες ευαίσθητη για την ανίχνευση της έκφρασης ALK από ό, τι άλλα αντισώματα αντι-ALK, αλλά με χαμηλότερη ειδικότητα.

Έχουμε εξετάσει όλες τις εικόνες ηλεκτροφόρηση γέλης όγκων RT-PCR (+) για να ελέγξετε αν θα μπορούσε να συσχετιστεί με το επίπεδο έκφρασης πρωτεΐνης ALK σε IHC λεκέ. Προς έκπληξή μας, τα αποτελέσματα RT-PCR είχε καλή συσχέτιση, όχι μόνο με την έκφραση της πρωτεΐνης ALK, αλλά και τα δεδομένα FISH. Όλα τα 8 όγκων με ισχυρή ένταση των PCR προϊόντων (που υποδηλώνει μεγάλη αφθονία του

EML4-ALK

θετικά κύτταρα σε ιστούς όγκων) είχε επίσης υψηλή έκφραση ALK πρωτεΐνης με ανοσοϊστοχημεία λεκέδες και όλα τα θετικά για τις δοκιμές FISH, εκτός ένα απέτυχε στα ψάρια (Πίνακας S3). Αυτός ο συσχετισμός έχει ποτέ αναφερθεί προηγουμένως. Από τη στιγμή που αξιολογούνται μόνο 100 καρκινικά κύτταρα στο τεστ FISH για κάθε όγκο, ήταν λογικό ότι η υψηλή αφθονία

EML4-ALK

θετικά κύτταρα σε ιστούς όγκων θα έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα να είναι θετικό για FISH. Από FISH έχει εγκριθεί ως ένα αξιόπιστο διαγνωστικό τεστ για crizotinib (αναστολέας ALK) θεραπεία [32], τα ευρήματά μας θα μπορούσε να υποδηλώνει ότι η μεγάλη αφθονία των

EML4-ALK

θετικά κύτταρα σε ιστούς όγκων θα μπορούσε επίσης να σχετίζονται με τη θεραπεία ανταπόκριση σε αναστολείς ALK.

επίσης, ήταν ενδιαφέρον να μάθουμε ότι η υψηλή αφθονία

EML4-ALK

θετικά κύτταρα σε ιστούς όγκων ήταν πιο συχνές σε παραλλαγή 3α + 3β (4/5, 80% ) από ό, τι Περίπτωση 1 (1/3, 33,3%). Υψηλή έκφραση της πρωτεΐνης ALK (IHC3 +) ήταν επίσης πιο συχνή σε Παραλλαγή 3a + 3b (5/5, 100%) από ό, τι Περίπτωση 1 (1/3, 33,33%). Αυτό ήταν παρόμοια με την έκθεση του Wallander, et al. Βρήκαν ότι υπήρχε 100% αντιστοιχία για την ανίχνευση του

EML4-ALK

παραλλαγή 3α + 3β από τις 3 μεθόδους ανίχνευσης (RT-PCR, FISH και IHC), αλλά όχι για την παραλλαγή 1 σε μια μελέτη με 46 Καυκάσιοι ασθενείς [41]. Δεδομένου ότι η πιο κοινή παραλλαγή των ασθενών Καυκάσου NSCLC ήταν Παραλλαγή 1, θα μπορούσε να είναι ένας λόγος για τον οποίο οι μέθοδοι IHC βρέθηκαν να είναι μη ευαίσθητα στις εκθέσεις από ορισμένες από τις εκθέσεις δυτικών μελέτη [25,40,41], αλλά είχε καλή συσχέτιση με τα ψάρια στη μελέτη αναφέρει από τις ασιατικές χώρες [35,36,38]. Πρόσφατα

EML4-ALK

παραλλαγές βρέθηκαν επίσης να έχουν διαφορετική ευαισθησία σε αναστολέα ALK με in vitro μελέτη. Παραλλαγή 1 ήταν η πιο ευαίσθητη σε αναστολέα ALK, που ακολουθείται από την παραλλαγή 2 και παραλλαγή 3b (εξίσου ευαίσθητα), και η τελευταία ήταν παραλλαγή 3α [44]. Θα ήταν ενδιαφέρον να ελέγξει κατά πόσον οι τύποι παραλλαγή του

EML4-ALK

και την εθνικότητα των ασθενών θα μπορούσαν να επηρεάσουν τη θεραπευτική αντιμετώπιση αναστολέα ALK ή όχι.

Ένα άλλο εύρημα άξια συζήτησης ήταν οι δύο ασθενείς με μεταλλάξεις του EGFR και υψηλή έκφραση πρωτεΐνης ALK (IHC3 +), αλλά αρνητικές στη μελέτη RT-PCR. Ένας από αυτούς ήταν FISH (-) και ένα άλλο απέτυχε στα ψάρια. Από συνύπαρξη

ALK

και

EGFR

μεταλλάξεις ήταν πολύ σπάνια, μια άλλη πιθανή εξήγηση γι ‘αυτή την ένωση είναι ότι η υψηλή έκφραση του ALK θα μπορούσε να προκληθεί από

EGFR

μεταλλάξεις μέσω της αλληλεπίδρασης αυτών των δύο κινασών πρωτεϊνών. Ταυτόχρονη ενεργοποίηση των ALK και EGFR μονοπάτια σηματοδότησης έχει αναφερθεί στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, και αυτές οι κυτταρικές σειρές θα μπορούσαν να κατασταλεί μόνο με διπλή αναστολή τόσο της ALK και EGFR [21,45].

Εν περιλήψει, μεταξύ οι μέθοδοι ανίχνευσης για τρία αναδιατάξεων ALK, RT-PCR θα μπορούσε να ανιχνεύσει όχι μόνο την παρουσία του

EML4-ALK

γονιδίου σύντηξης και τους τύπους παραλλαγή, αλλά και την αφθονία του

EML4-ALK

θετικά κύτταρα σε ιστούς όγκων NSCLC. Οι δύο τελευταίοι παράγοντες μπορεί να επηρεάσει την ανταπόκριση στη θεραπεία με αναστολέα αντι-ALK. Συμπεριλαμβανομένης της RT-PCR ως διαγνωστικό τεστ για τη θεραπεία αναστολέα ALK στις προοπτικές κλινικές μελέτες συνιστάται.

Υλικό και Μέθοδοι

Ασθενείς και ιστοί

Φρέσκα κατεψυγμένα δείγματα όγκου 328 NSCLC ασθενείς (274 ασθενείς από Μάιος 2002 – Απρίλιος 2006 και 54 ασθενείς από Οκτώβριος 2009 – Μάιος 2012) που έλαβαν χειρουργική εκτομή σε Chang Gung Memorial Hospital και υπέγραψε συγκατάθεση ελήφθησαν από την τράπεζα ιστών του Memorial Hospital Chang Gung για εξαγωγή RNA και μοριακή μελέτες βιοδεικτών. Κανένας από τους ασθενείς έχουν λάβει θεραπεία με αναστολείς ALK πριν. Κατεψυγμένες τομές πραγματοποιήθηκαν σε κάθε φρέσκο ​​κατεψυγμένο ιστούς καρκίνου του πνεύμονα για τον προσδιορισμό του όγκου% από έναν παθολόγο (SFH) πριν από την μελέτη. Μόνο οι ασθενείς με όγκο% υψηλότερη από 70% συμπεριλήφθηκαν για αυτή τη μελέτη. Μερικοί ιστοί όγκου με χαμηλή% του όγκου και άφθονο ινώδη στρώμα ήταν μικροτομή το χέρι κάτω από το μικροσκόπιο για την επίτευξη υψηλότερων% του όγκου. Όλοι οι ασθενείς που περιλαμβάνονται, επίσης, πρέπει να έχουν στη διάθεσή τους τα τμήματα παραφίνης του όγκου πνεύμονα για ALK IHC λεκέ και τη μελέτη FISH. Τέλος, συνολικά 312 ασθενείς είχαν επαρκή δείγματα για να μπει σε αυτή τη μελέτη. Η ιστορία κλινικά δεδομένα και το κάπνισμα ελήφθησαν από τα ιατρικά αρχεία. Κανένας από τους ασθενείς έχουν λάβει θεραπεία crizotinib πριν. Αυτό το πρωτόκολλο της μελέτης είχαν ελεγχθεί και εγκριθεί από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Chang Gung Memorial Hospital και το Εθνικό υγείας Ερευνητικά Ινστιτούτα. Μεταξύ των 312 ασθενών, τα αποτελέσματα της μελέτης ALK αναδιάταξη και IHC 64 ασθενών έχουν δημοσιευθεί προηγουμένως [42].

εκχύλιση RNA και συμπληρωματικό σύνθεση DNA

Φρέσκα κατεψυγμένα ιστούς όγκων χρησιμοποιήθηκαν ως πρώτες ύλες για το σύνολο εκχύλιση του RNA με τη μέθοδο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, Καλιφόρνια.). Η ποιότητα του RNA επαληθεύεται δι ‘ηλεκτροφορήσεως γέλης. Δύο μ§ ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε ως υλικό ξεκίνησε για συμπληρωματικό DNA σύνθεσης (cDNA) με απασχολούνται με SuperScript III ανάστροφης μεταγραφάσης (200U /μl, Invitrogen, Carlsbad, Calif.). Μετά αντίστροφη αντίδραση μεταγραφής τελείωσε, ελήφθη ένα συνολικό όγκο 40 μΐ cDNA. Ένα μΐ προκύπτον cDNA χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω αντιδράσεις PCR.

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR) για την ανίχνευση των διαφορετικών ALK αναδιάταξη με διάφορους εταίρους

EML4-ALK

σύντηξης γονίδιο.

RT-PCR σε συνδυασμό με διεξήχθησαν Sanger προσδιορισμό αλληλουχίας των προϊόντων της PCR. Δύο σύνολα εκκινητών (φαίνονται στον Πίνακα S6) έχουν σχεδιαστεί σύμφωνα με τις δημοσιευμένες εκθέσεις για τον εντοπισμό

EML4-ALK

Παραλλαγή 1 και Παραλλαγή Μη-1, αντίστοιχα [8,26,46]. Το τελευταίο θα μπορούσε να ανιχνεύσει

EML4-ALK

Παραλλαγή 2 έως 7. Οι συνθήκες θερμικού κύκλου ήταν διαφορετικές για την παραλλαγή 1 και Παραλλαγή Μη-1. Για

EML4-ALK

Παραλλαγή 1, οι συνθήκες θερμικού κύκλου ήταν προεπώαση για 4 λεπτά στους 95 ° C για την αρχική ενεργοποίηση, ακολουθούμενη από 35 κύκλους αποδιάταξης για 30 δευτερόλεπτα στους 95 ° C, συγκόλληση του αρχικού τεμαχίου για 30 δευτερόλεπτα στους 55 ° C, και επιμήκυνση για 2 λεπτά 30 δευτερόλεπτα στους 72 ° C. για

EML4-ALK

παραλλαγή μη-1, το θερμικό κύκλο ήταν: 15 λεπτά στους 95 ° C, ακολουθούμενη από 35 κύκλους αποδιάταξης για 30 δευτερόλεπτα στους 95 ° C, συγκόλληση του αρχικού τεμαχίου για 30 δευτερόλεπτα στους 66 ° C, και επιμήκυνση για 1 λεπτό στους 72 ° C. Εκτιμώμενο μέγεθος προϊόντος PCR (ζευγών βάσεων) της κάθε παραλλαγής που απαριθμούνται ως εξής: Περίπτωση 1 (247 bp) , παραλλαγή 2 (2303 bp), παραλλαγή 3α (728 bp), παραλλαγή 3b (761 bp), παραλλαγή 4 (1664 bp), παραλλαγή 5α (269 bp), παραλλαγή 5β (386 bp), παραλλαγή 6 (1619 bp) και παραλλαγή 7 (1688 bp).

KIF5B-ALK

,

KLC1-ALK

και

ΜΟΚ-ALK

γονίδια σύντηξης.

Η πιθανή ύπαρξη

KIF5B-ALK

,

KLC1-ALK

και

ΜΟΚ-ALK

, εξετάστηκαν επίσης σε όγκους όλων των ασθενών που ήταν αρνητικοί για

EML4-ALK

γονίδιο σύντηξης. Οι ομάδες εναρκτήρα (που φαίνονται στον Πίνακα S6) και την κατάσταση PCR σχεδιάστηκαν σύμφωνα με τις προηγουμένως δημοσιευμένες αναφορές [15-18]. Οι συνθήκες θερμικού κύκλου για

KIF5B-ALK

ήταν 95 ° C για 4 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 30 δευτερολέπτων στους 95 ° C, 30 δευτερόλεπτα στους 50 ° C, και 2 λεπτά 30 δευτερόλεπτα στους 72 ° C για 40 κύκλους. Για

KLC1-ALK

, ήταν 95 ° C για 4 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 30 δευτερολέπτων στους 95 ° C, 30 δευτερόλεπτα στους 55 ° C και 3 λεπτά στους 72 ° C. Για

ΜΟΚ-ALK

, ήταν 4 λεπτά στους 94 ° C, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 45 δευτερολέπτων στους 94 ° C, 45 δευτερόλεπτα στους 65 ° C, και 1 λεπτό 30 δευτερόλεπτα σε 72 ° C.

Αφού η αντίδραση PCR τελείωσε, ολικού προϊόντος PCR (20 μΙ) του κάθε περίπτωση χρησιμοποιήθηκε για ηλεκτροφόρηση πηκτής DNA. Αν λήφθηκε οποιοδήποτε προϊόν PCR με αναμενόμενο μέγεθος, αλληλουχίας νουκλεοτιδίων (Applied Biosystems PRISMR 3730 DNA Analyzer Sequencer) εκτελέστηκε. Οι αλληλουχίες νουκλεοτιδίων που ελήφθησαν επαληθεύεται από το πρόγραμμα BLAST στο NCBI. Όλα τα θετικά αποτελέσματα επαναλήφθηκαν από ένα δεύτερο τεχνικό για επιβεβαίωση.

ALK

αναδιάταξη καθορίζεται από διάλειμμα εκτός μελέτη FISH

Η ανίχνευση FISH έγινε σε μη χρωματισμένα 5-μm πάχους τομές ιστών σταθεροποιημένα με φορμαλίνη εγκλεισμένα σε παραφίνη. Σύμφωνα με την χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης του ίδιου μπλοκ ιστού, επιλέχθηκε το τμήμα του όγκου σε κάθε διαφάνεια και κυκλικά από ένα παθολόγο (SFH) πριν από τη μελέτη FISH. Η

ALK

ανιχνευτής που χρησιμοποιήθηκε ήταν η Vysis ALK Break Εκτός FISH Probe (Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL, USA). Οι αποπαραφινωθείσες τομές ιστών πρώτα σε προεπεξεργασία με 100 mM Tris, 50 mM EDTA, ρΗ 7.0 διαλύματος σε 92 ° C για 15 λεπτά, ακολουθούμενο από αλατούχο διάλυμα (PBS) πλύση ρυθμισμένο με φωσφορικό, στη συνέχεια υπέστη πέψη με 300 μΙ Digest-all (Zymed, Inc., South San Francisco, CA) στους 37 ° C για 90 έως 120 λεπτά, ανάλογα με το μέγεθος των τμημάτων του ιστού. Η πέψη διεκόπη με 10% ουδέτερη φορμαλίνη σε θερμοκρασία δωματίου για 1 λεπτό και πλύθηκαν με PBS και πάλι. Δέκα μΐ

ALK

ανιχνευτής εφαρμόστηκε σε κάθε αφυδατωμένο και ξηραίνεται στον αέρα διαφάνεια, και μετουσιώνεται στους 94 ° C για 4 λεπτά, στη συνέχεια υβριδοποιήθηκαν όλη τη νύχτα στους 37 ° C σε Vysis HYBrite (Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL, USA). πλύση μετα-υβριδισμού διεξήχθη με 2χ πρότυπο κιτρικό αλατόνερο στους 72 ° C για 5 λεπτά και κατόπιν ξεπλύθηκαν σε PBS με 0.25% Tween 20 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, ΜΟ). Οι πλάκες στη συνέχεια τοποθετείται με 10 μΐ μέσου στερέωσης Vectashield (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) με 0.1 μg /ml 4 ‘, 6-διαμιδινο-2- φαινυλινδόλη. Τα αποτελέσματα της μελέτης FISH αξιολογήθηκαν με το πεδίο εφαρμογής της Leica DMR φθορισμού μικρο (Leica Microsystems Nussloch GmbH, Nussloch, Γερμανία). Τα σήματα FISH αξιολογήθηκαν για πρώτη φορά από δύο έμπειρους τεχνικούς ανεξάρτητα (THW, YTC) και επανελέγχονται από έναν παθολόγο (SFH) για τις εν λόγω FISH θετικό όγκους. Τουλάχιστον 100 μη αλληλεπικαλυπτόμενες και ακέραια πυρήνες των όγκων αξιολογήθηκαν. Τα καρκινικά κύτταρα θεωρήθηκαν θετικά για τη μελέτη FISH σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, δηλαδή όταν τα κόκκινα και πράσινα σήματα ήταν διάπλατα ανοιχτά για περισσότερο από 2 πυρήνες ή είχαν απώλεια του σε συνδυασμό πράσινου σήματος (ατομικές κόκκινο σήμα, IRS). Μόνο όγκων με περισσότερο από το 15% των κυττάρων του όγκου που έχει θετικά σήματα FISH διάλειμμα-εκτός θεωρήθηκαν για να έχουν

ALK

αναδιατάξεις.