Αφηρημένο

Πολλοί καρκίνοι του προστάτη υποτροπής λόγω της παραγωγής του χημειοαντίσταση καθιστώντας φάρμακα πρώτης γραμμής θεραπεία, όπως πακλιταξέλη (ΡΤΧ) αναποτελεσματική. Η παρούσα μελέτη έχει ως στόχο να προσδιορίσει το ρόλο των miRNAs και Hedgehog (Hh) μονοπάτι σε χημειοθεραπεία του καρκίνου του προστάτη και να αξιολογηθεί η θεραπεία συνδυασμού χρησιμοποιώντας Hh κυκλοπαμΐνης αναστολέα (ΟΥΑ). Διεξήχθησαν μελέτες σε κυτταρικές σειρές και την κλινική τους ιστούς του προστάτη ΡΤΧ ανθεκτικά DU145-TXR και PC3-TXR. ευαισθησία των ναρκωτικών και οι δοκιμασίες απόπτωσης έδειξαν σημαντικά βελτιωμένη κυτταροτοξικότητα με συνδυασμό των ΡΤΧ και CYA. Για να γίνει διάκριση της παρουσίας καρκίνου βλαστικών κυττάρων σαν πλευρά πληθυσμούς (SP), χρησιμοποιήθηκε Hoechst 33342 κυτταρομετρία ροής μεθόδου. ανθεκτικά ΡΤΧ DU145 και τα κύτταρα PC3, καθώς και των ιστών ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη έχουν μια διακριτή κλάσμα SP. Σχεδόν το 75% των κυττάρων SP είναι στην φάση G0 /G1 σε σύγκριση με 62% για τα κύτταρα μη-SP και έχουν υψηλότερη έκφραση δεικτών βλαστοκυττάρων, καθώς και. κλάσμα SP κυττάρων αυξήθηκε ακόλουθη μονοθεραπεία και θεραπεία PTX με ΟΥΑ ή ΟΥΑ συν PTX μειωθεί αποτελεσματικά ο αριθμός τους που υποδηλώνει την αποτελεσματικότητα της θεραπείας συνδυασμού. κύτταρα κλάσμα SP αφέθηκαν να διαφοροποιηθούν και να αναλύονται με χρώση Hoechst και ανάλυση γονιδιακής έκφρασης. Αξιολογήστε διαφοροποίηση, τα κύτταρα SP αποτελούν το 15,8% του συνόλου των βιώσιμων κυττάρων η οποία μειώνεται σε 0,6% για τη θεραπεία με ΟΥΑ. Τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης εκροής P-gp μειώθηκαν επίσης σημαντικά κατά την επεξεργασία με ΡΤΧ και CYA συνδυασμό. MicroRNA προφίλ των DU145-TXR και PC3-TXR κυττάρων και των ιστών του καρκίνου του προστάτη από τους ασθενείς παρουσίασαν μειωμένη έκφραση των ογκοκατασταλτικών miRNAs όπως miR34a και miR200c. Η θεραπεία με ΡΤΧ και CYA συνδυασμός αποκατέστησε την έκφραση του miR200c και 34α, επιβεβαιώνοντας το ρόλο τους στη διαμόρφωση χημειοαντίσταση. Έχουμε δείξει ότι η συμπλήρωση μιτωτική φάρμακα σταθεροποιητή όπως ΡΤΧ με HH-αναστολέα της ΟΥΑ μπορεί να αντιστρέψει ΡΤΧ χημειοαντίσταση και την εξάλειψη κλάσμα SP σε ανδρογόνα ανεξάρτητο, κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη μεταστατικό

Παράθεση:. Singh S, D Chitkara, Mehrazin R , Behrman ΝΔ, αφύπνισης RW, Mahato RI (2012) χημειοαντίσταση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη ρυθμίζεται από miRNAs και Hedgehog Pathway. PLoS ONE 7 (6): e40021. doi: 10.1371 /journal.pone.0040021

Επιμέλεια: Wing-Kin Syn, Ινστιτούτο ηπατολογίας Λονδίνο, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 26 Γενάρη 2012? Αποδεκτές: 30η Μαΐου 2012? Δημοσιεύθηκε: 29 του Ιούν 2012

Copyright: © 2012 Singh et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από ένα βραβείο ‘Ιδέα (W81XWH-10-1-0969) από το Υπουργείο άμυνας του καρκίνου του προστάτη Ερευνητικό Πρόγραμμα. Οικονομική στήριξη από Kosten Ίδρυμα (www.kostenfoundation.com) είναι επίσης αναγνωρίζεται με ευγνωμοσύνη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου που σχετίζονται με τον καρκίνο στους άνδρες στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Ενώ αντι-ανδρογόνο θεραπεία είναι σήμερα η πρώτη γραμμή θεραπείας για ασθενείς με διάγνωση καρκίνων του προστάτη, οι περισσότεροι ασθενείς θα αναπτύξουν τελικά το ανδρογόνο ανεξάρτητη μορφή καρκίνων του προστάτη η οποία είναι πολύ μεταστατικός και έχει φτωχή πρόγνωση [2]. σταθεροποιητές μικροσωληνίσκων όπως ΡΤΧ είναι αποτελεσματικές στη θεραπεία ασθενών που έχουν διαγνωστεί με ανεξάρτητο από ανδρογόνο καρκίνο του προστάτη [3]. Ενώ κλινικές μελέτες έχουν αποδείξει την αρχική αποτελεσματικότητα των ταξανών στην αύξηση της επιβίωσης σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη [4], σήμερα υπάρχουν λίγες αποτελεσματικές προσεγγίσεις για τη θεραπεία χημειοθεραπεία καρκίνων του προστάτη.

Οι περισσότεροι όγκοι είναι ετερογενή και αποτελούνται από χύμα και όγκου κύτταρα έναρξης (TICs) με την τελευταία σχηματίζουν ένα διακριτό υποπληθυσμού σε πολλούς καρκίνους. Οι TICs αναφέρονται συχνά ως καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) και είναι υπεύθυνοι για την έναρξη του όγκου, αυτο-ανανέωση, και χημειοαντίσταση [5], [6]. Πολλοί καρκίνοι του προστάτη υποτροπιάζουν λόγω της παρουσίας υψηλής χημειοθεραπεία όγκων κίνησης /καρκινικά βλαστικά κύτταρα [7], [8]. Χημειοαντίσταση σε αντικαρκινικά φάρμακα συμπεριλαμβανομένης της ΡΤΧ, από αυτά τα κύτταρα μπορεί να εισφέρει αντλίες φάρμακο εκροής που μπορεί να απομακρύνει αποτελεσματικά λιπόφιλων μορίων, συμπεριλαμβανομένων των υδρόφοβων αντικαρκινικά φάρμακα. Αυτή η εγγενής ιδιότητα του στη χημειοθεραπεία κυττάρων χρησιμοποιείται για την ταυτοποίηση και την απομόνωση ενός πληθυσμού πλευρά (SP), τα οποία είναι ένας τύπος καρκίνου βλαστικών κυττάρων. Το κλάσμα SP, εντοπίστηκαν αρχικά από Goodell, είναι ένα μικρό υποπληθυσμό κυττάρων με δραστικότητα εμπλουτισμένο βλαστοκυττάρων και είναι γνωστό ότι επιδεικνύουν χαρακτηριστική χαμηλά επίπεδα Hoechst 33342 χρώσης χρωστικής [9]. τα κύτταρα κλάσμα SP έχει δειχθεί ότι είναι ευαίσθητη σε διάφορες χημειοθεραπευτικά φάρμακα [10], λόγω της ικανότητάς τους σε effluxing φάρμακα χημειοθεραπείας (και λιπόφιλες βαφές όπως Hoechst 33342) λόγω της υψηλής έκφρασης του ΑΤΡ-δέσμευσης οικογένεια κασέτα, όπως MDR1 (Ρ γλυκοπρωτείνη) και ABCG2 [11]. Χημειοθεραπεία κύτταρα SP θα επιβιώσουν και να διατηρήσουν κλωνογενοποιήσεως τους κατά την αρχική έκθεση σε κυτταροστατικά φάρμακα, επιτρέποντας έτσι την επανεμφάνιση της νόσου, όταν η θεραπεία έχει αποσυρθεί. Αυτά τα υποσύνολα των ΚΕΠ συνεπώς θεωρούνται ένα βιώσιμο στόχο για βελτιωμένη θεραπευτική παρέμβαση και την πρόληψη χημειοαντίσταση και υποτροπής του καρκίνου.

Η ανάπτυξη χημειοαντίσταση μέσω της αύξησης του αριθμού των βλαστικών καρκίνου, όπως κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων κλάσματα SP έχει αποδοθεί σε μεταβολές στο επίπεδο των microRNAs (miRNAs) σε διάφορους τύπους καρκίνου. Αυτά τα μη-κωδικοποίησης μόρια RNA μπορούν να λειτουργήσουν ως ογκογονίδια, καθώς και ογκοκατασταλτικά [12], [13], [14]. Δυσλειτουργία του miRNAs έχει ενοχοποιηθεί στην ογκογένεση και αντοχής φαρμάκου, καθώς και. Πρόσφατες εργασίες από Cochrane et al. εντόπισε miRNAs που εμπλέκονται στην ρύθμιση χημειοαντίσταση σε αρκετούς καρκίνους [15].

παρούσα μελέτη μας, υποθέσαμε ότι χημειοαντίσταση να ΡΤΧ στα μεταστατικά καρκινικά κύτταρα προστάτη θα μπορούσε να οφείλεται στην αλλαγμένη έκφραση miRNA σε αυτά τα κύτταρα και ότι η συνδυασμός αντιμιτωτική φαρμάκου με ένα άλλο μικρό μόριο που αναστέλλει ΚΕΠ είναι πιθανό να είναι αποτελεσματική όχι μόνο επανέρχεται χημειοαντίσταση καταστέλλοντας ΚΕΠ αλλά επίσης να στοχεύουν miRNAs που εμπλέκονται στην χημειοαντίσταση. Έτσι, ενώ αποτυχία των παραδοσιακών χημειοθεραπείας οφείλεται σε αποτυχία να καταστρέψει κλάσματα /SP ΚΕΠ, μια συνδυαστική προσέγγιση είναι πιθανό να αποδώσει καλύτερα αποτελέσματα δεδομένου ότι η CSC-αναστολέα θα σκοτώσει πολυδύναμα καρκινικά κύτταρα και θα επιτρέψει την αντιμιτωτικά φάρμακο (σε αυτήν την περίπτωση ΡΤΧ) να επιτεθεί χύμα κύτταρα όγκου. Προς το σκοπό αυτό, έχουμε σε συνδυασμό με ΡΤΧ κυκλοπαμίνη (ΟΥΑ), ένα φυσικό στεροειδές αλκαλοειδές που αναστέλλει την οδό Hedgehog (Hh) καταλήγοντας σε μειωμένο πολλαπλασιασμό και αυξημένη απόπτωση [16]. Τα τελευταία χρόνια, η οδός σηματοδότησης Hh έχει ενοχοποιηθεί για την ανάπτυξη και την εξάπλωση του καρκίνου του προστάτη [17], [18]. Αποδεικτικά στοιχεία έχει δείξει επίσης ότι σηματοδότηση Hh υποστηρίζει σηματοδότηση ανδρογόνων και ανεξάρτητου από ανδρογόνο ανάπτυξη σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη σε ένα χαμηλό ανδρογόνων περιβάλλον [19]. Αναστολή της ΗΗ-μονοπάτι οδηγεί σε μειορύθμιση των γονιδίων που εμπλέκονται στην βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση, καθώς και υποχώρηση του όγκου του προστάτη χωρίς υποτροπή [20]. Συνδυασμός της docetaxel με τον υποδοχέα ΟΥΑ και του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) αναστολέας επαγόμενης gefitinib μεγαλύτερη αντιπολλαπλασιαστική και αποπτωτικά αποτελέσματα επί κλάσματα SP κυττάρων που απομονώθηκαν από μεταστατικά κύτταρα καρκίνου του προστάτη από ό, τι μεμονωμένα φάρμακα [21]. Έχουμε πρόσφατα απέδειξαν ότι η προσθήκη του EGFR αναστολέας lapatinib μπορεί να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα του ΡΤΧ στην επαγωγή της απόπτωσης σε ένα paclitaxel-ανθεκτικό, ανδρογόνο-ανεξάρτητες μεταστατικά κύτταρα καρκίνου προστάτη γραμμή DU145-TXR, τόσο

in vitro

καθώς και σε ξενομόσχευμα όγκων [22].

Για να κατανοήσουμε το φαινόμενο της χημειοαντίσταση, στην παρούσα μελέτη έχουμε χρησιμοποιήσει ανδρογόνων ανεξάρτητο (AI) μεταστατικό καρκίνο του προστάτη κυτταρικές σειρές DU145 και PC3 και ΡΤΧ ανθεκτικά εκδόσεις τους, DU145-TXR και PC3-TXR, αντίστοιχα. Δείξαμε ότι PTX αντίσταση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη μπορεί να διαμορφώνεται στο επίπεδο του miRNAs. Έχουμε αποδείξει περαιτέρω ότι η συνδυαστική θεραπεία με ΟΥΑ και ΡΤΧ μπορεί να μειώσει αποτελεσματικά την βιωσιμότητα των κυττάρων, να μειώσει κλάσμα SP-κυττάρων σε δόσεις πολύ χαμηλότερες από αυτές που χρησιμοποιήθηκαν για ΟΥΑ μονοθεραπεία και των επιπτώσεων miRNAs εμπλέκονται πιθανώς στην ρύθμιση χημειοαντίσταση. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η συνδυαστική θεραπεία που περιλαμβάνει συμπλήρωση του ΡΤΧ με ΗΗ-αναστολείς μπορούν να στοχεύσουν συγκεκριμένους miRNAs και του καρκίνου βλαστικών κυττάρων σαν κυτταρικούς πληθυσμούς SP σε δόσεις οι οποίες είναι αποτελεσματικές σε συνδυασμό, αλλά όχι σε μονοθεραπεία. Αυτή η προσέγγιση μπορεί να αντιπροσωπεύει μια καλύτερη προσέγγιση για την πρόληψη μετάστασης και υποτροπή σε ανθεκτικό καρκίνο προστάτη, δεδομένου ότι είναι λιγότερο πιθανό να είναι τοξικά και θα παρουσιάσει με πολύ λιγότερες παρενέργειες για τον ασθενή, εξασφαλίζοντας καλύτερη συμμόρφωση και μειώνοντας τις πιθανότητες μιας επανάληψης.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

ΡΤΧ και CYA αγοράστηκαν από LC Labs (Woburn, ΜΑ). SYBR Green real-time PCR κύριο μείγμα και να αντιστρέψει τα αντιδραστήρια μεταγραφή αγοράστηκαν από την Applied Biosystems (πόλη Foster, CA). Goat P-gp αντίσωμα και το αντίστοιχο δευτερεύον αντίσωμα αντι-κουνελιού αγοράστηκε από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Όλα τα άλλα χημικά ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ) και χρησιμοποιήθηκαν όπως ελήφθησαν, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Οι κυτταρικές σειρές

Το ανθρώπινο μεταστατικό καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές DU145 και PC3 και PTX ανθεκτικά εκδόσεις τους DU145-TXR και PC3-TXR ήταν ένα είδος δώρο του καθηγητή Evan Τ Keller (University of Michigan). Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε RPMI μέσο καλλιέργειας συμπληρωμένο με 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Gibco) σε υγροποιημένο επωαστή που περιέχει 5% CO

2 στους 37 ° C όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22] .

Ανθρώπινο προστάτη ιστών

Ανθρώπινο προστατικό ιστό (καρκινικά και καλοήθεις) ελήφθησαν από τις Υποθέσεων Βετεράνων (VA) Νοσοκομείο, Memphis, TN ακολουθώντας καθιερωμένα πρωτόκολλα, και σύμφωνα με την ενημέρωση παραίτηση συγκατάθεση παρέχεται από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review (IRB) σε UTHSC και στο Νοσοκομείο VA. Προστάτη ιστός ελήφθη χρησιμοποιώντας ένα 18-gauge βελόνα πυρήνα πιστολέτο βιοψίας και ένα τμήμα αυτού του ιστού ξεπλύθηκε και είτε φλας καταψύχθηκε σε υγρό άζωτο και στη συνέχεια αποθηκεύεται στους -80 ° C ή να τοποθετηθεί σε κρύο RPMI μέσο χωρίς ορό που περιέχει αντιβιοτικά για την παρασκευή ενιαία αιωρήματα κυττάρων. Ιστοί χαρακτηρίζονται ως κακοήθεις ή καλοήθεις βασίζεται στη διάγνωση γίνεται από έναν παθολόγο.

ευαισθησία των ναρκωτικών και την απόπτωση δοκιμασίες σε DU145-TXRCells

Για να προσδιοριστεί η έκταση της κυτταρικής απόπτωσης μετά από φαρμακευτικές αγωγές, DU145- κύτταρα TXR απλώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων (7.5 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο). Μετά από 24 ώρες, το μέσο απομακρύνθηκε και προστέθηκαν ΟΥΑ ή συνδυασμούς τους φρέσκο ​​μέσο που περιέχει διάφορες συγκεντρώσεις του ΡΤΧ. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με Annexin-V και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) χρησιμοποιώντας το Vybrant Προσδιορισμός απόπτωσης Kit σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Molecular Probes). Εν συντομία, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS και κατακρημνίστηκαν με φυγοκέντρηση σε 800 rpm για 5 λεπτά. Τα σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε 100 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης αννεξίνης 1Χ και 5 μΐ ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) -Annexin-V. Ιωδιούχο προπίδιο (100 μg /ml) προστέθηκε σε κάθε 100 μΐ κυτταρικού αιωρήματος. Τα βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν αμέσως με κυτταρομετρία ροής.

Κύτταρα

DU145-TXR χρησιμοποιήθηκαν επίσης για να προσδιοριστεί η ικανότητα αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης του ΡΤΧ και ΟΥΑ. Κύτταρα (5 × 10

3 /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας 96 φρεατίων και επωάστηκαν για 24 ώρες για να επιτραπεί η προσκόλληση των κυττάρων. Το μέσο στη συνέχεια αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει ΡΤΧ (0,5 /1 μΜ) ή ΟΥΑ (10/25 μΜ) ή συνδυασμός (ΡΤΧ 0,5 μΜ και 10 μΜ CYA) και επωάστηκαν περαιτέρω για 48 ώρες στους 37 ° C /5% CO

2. Η κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογείται στη συνέχεια με δοκιμασία ΜΤΤ. Για το σκοπό αυτό, τα μέσα απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και 200 ​​μΙ φρέσκου μέσου που περιέχει 3- (4,5-διμεθυλο-θειαζολ-2-υλ) -2, 5-διφαινυλ τετραζόλιο (ΜΤΤ) (0,5 mg /ml ) προστέθηκε ακολουθούμενο από επώαση στους 37 ° C /5% CO

2 για 4 ώρες. Μετά από 4 ώρες, τα μέσα απομακρύνθηκαν και σχημάτισαν κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν σε 200 μΙ DMSO και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 560 nm. Η βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο:

DMSO χρησιμοποιήθηκε για την διαλυτοποίηση ΡΤΧ και CYA και τους ελέγχους DMSO συμπεριλήφθηκαν σε όλα τα πειράματα

ανάλυση Side Πληθυσμός και διαλογή κυττάρων με FACS

ανάλυση Side πληθυσμού στην DU14-TXR και κυτταρικές σειρές PC3-TXR έγινε χρησιμοποιώντας Hoechst 33342 κυτταρομετρία ροής μεθόδου. Εν συντομία, προσκολλημένα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και πλύθηκαν με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). Κύτταρα (1 χ 10

6 κυττάρων /ml) στη συνέχεια εναιωρήθηκαν σε RPMI μέσα συμπληρωμένα με 2% FBS και 1 mM HEPES ρυθμιστικό με ή χωρίς διαλύματα φαρμάκου (Verapamil, ΡΤΧ ή ΡΤΧ + ΟΥΑ). Hoechst 33342 (5 μl? 1 mg /ml) χρωστικής προστέθηκε κατόπιν ακολουθούμενο από επώαση για 90 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα ανακτήθηκαν με φυγοκέντρηση και πλύθηκαν αρκετές φορές με PBS για να απομακρυνθεί η μη δεσμευμένη χρωστική και τελικά εναιωρήθηκαν σε παγωμένο PBS που περιείχε 2% FBS. κλάσμα SP σε κλινικά δείγματα αναλύθηκαν όπως περιγράφηκε παραπάνω με επιπλέον βήματα. Εν συντομία, προσφάτως εκτομή ιστό προστάτη ξεπλύθηκε, μηχανικά κιμά και πέψη για 4 ώρες στους 37 ° C με 100 U /ml κολλαγενάση IV (Worthington Biologicals) σε ελεύθερη RPMI ορού. Ο ιστός συχνά πιπέτα με ένα 5-ml ορολογική πιπέτα και στο τέλος της επώασης το προϊόν πέψης διήλθε μέσω μιας βελόνας 18.5- gauge, φυγοκεντρείται σύντομα και το υπερκείμενο κοσκινίζεται μέσα από ένα σουρωτήρι κύτταρο 100 μm για να ληφθεί εναιώρημα απλού κυττάρου. Μειωμένα απλού κυττάρου εναιωρήματα στη συνέχεια πέρασαν μία φορά μέσω του φίλτρου πλέγματος 40 μm, η βιωσιμότητά τους αξιολογήθηκε με βαφή κυανούν τρυπανίου και διατηρούνται σε πάγο μέχρι να αναλυθούν.

Τα κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων υποβλήθηκαν σε αγωγή με Α) 0.3% DMSO, Β) 0,5 μΜ PTX C) ΟΥΑ 10 μΜ, Δ) 25 μΜ ΟΥΑ, Ε) 0,5 μΜ ΡΤΧ 10 μΜ ΟΥΑ για 48h και F) σε κύτταρα DU145-TXR μετά από διαφορετικές φαρμακευτικές αγωγές. Ακολούθως, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν με PBS και χρωματίστηκαν με Αννεξίνη V-FITC και ΡΙ πριν αποπτωτική ανάλυση με κυτταρομετρία ροής. Α-Ε είναι αντιπροσωπευτικά οικόπεδα από τρία ξεχωριστά πειράματα. Τα δεδομένα στον πίνακα F είναι η ποσοτικοποίηση του% κυτταρικό θάνατο και αντιπροσωπεύει μέση ± SD (η = 3). *

σ

& lt? 0,05 ενάντια στον έλεγχο. Για δοκιμασία ΜΤΤ (Εικ. 1 G), τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων υπέστησαν κατεργασία με ενδεικνυόμενη συγκέντρωση των φαρμάκων επί 48 ώρες. Στη συνέχεια, το αντιδραστήριο ΜΤΤ σε PBS προστέθηκε και η επώαση διεξήχθη για άλλες 4 ώρες. Το προκύπτον προϊόν φορμαζάνη διαλύθηκε σε DMSO και η ένταση του χρώματος προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα αναγνώστη πλάκας. Μία στατιστικά σημαντική διαφορά (*

σ

αξία & lt? 0,05) παρατηρήθηκε όταν συνδυασμός 0.5 μΜ ΡΤΧ και 10 μΜ CYA χρησιμοποιήθηκε. Κυτταρικής βιωσιμότητας = Α

δοκιμών /A

controlX100. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SD (η = 4). PTX, πακλιταξέλη? ΟΥΑ, κυκλοπαμίνη.

Η

Κύκλου Κυττάρου ανάλυση

Η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί το ποσοστό των κυττάρων σε διαφορετικούς κύκλους ανάπτυξης. Κύτταρα (5 × 10

5) που λαμβάνεται μετά τη διαλογή πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν με αιθανόλη (70%) στους 4 ° C όλη τη νύκτα ακολουθούμενο από επεξεργασία με RNAse (1 mg /ml) και χρωματίστηκαν με ΡΙ (10 μg /ml ). Ποσοστό κυττάρων σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε στη συνέχεια.

Α) κύτταρα DU145, Β) κύτταρα DU145-TXR, κύτταρα C) DU145-TXR κατεργασία με βεραπαμίλη (10 μΜ, 90 λεπτά), D) DU145 -TXR κύτταρα κατεργασμένα με ΡΤΧ (1 μΜ, 12 ώρες), Ε) κύτταρα DU145-TXR αγωγή με ΟΥΑ (20 μΜ, 12 ώρες), τα κύτταρα F) DU145-TXR κατεργάζεται με ΟΥΑ και ΡΤΧ (20 μΜ και 0,5 μΜ, αντίστοιχα , 12 h). Verapamil χρησιμοποιήθηκε για να πύλη του κλάσματος SP σε όλους τους πίνακες και παρουσιάζονται ως το ποσοστό του συνόλου του πληθυσμού βιώσιμων κυττάρων. Οι αριθμητικές τιμές που αναφέρονται είναι ο μέσος όρος ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. *

σ

& lt? 0,05 vs κύτταρα DU145 ελέγχου (Α). PTX, πακλιταξέλη? ΟΥΑ, κυκλοπαμίνη.

Η

Α) κύτταρα PC3-TXR, Β) κύτταρα κατεργασμένα με βεραπαμίλη (10 μΜ, 90 λεπτά), τα κύτταρα C) PC3-TXR αγωγή με ΟΥΑ (20 μΜ, 12 ώρες) ή, D) ΟΥΑ και ΡΤΧ (20 μΜ και 0,5 μΜ, αντίστοιχα, 12 h). Το κλάσμα SP, το οποίο απομακρύνθηκε με κατεργασία με βεραπαμίλη, ήταν περιφραγμένη (P8) σε όλους τους πίνακες και παρουσιάζονται ως το ποσοστό του συνόλου του πληθυσμού βιώσιμων κυττάρων. Οι αριθμητικές τιμές που αναφέρονται είναι ο μέσος όρος ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. *

σ

& lt? 0,05 vs έλεγχο DU 145 κύτταρα (Α). PTX, πακλιταξέλη? CYA, κυκλοπαμίνη.

Η

Μετά την διαλογή ροής, καθαρό κύτταρα SP απλώθηκαν και αφέθηκαν να διαφοροποιηθούν για 2 εβδομάδες. Αντιπροσωπευτικά μικροφωτογραφίες του SP (Α) και τα κύτταρα NSP (Β) που φαίνονται με περισσότερα κύτταρα SP διαθέτει μια ινοβλαστική, επίμηκες φαινότυπο σε σύγκριση με NSP. Πραγματικού χρόνου RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει υψηλότερη έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων OCT 4 και Nanog και καρκινικοί δείκτες αρχέγονων κυττάρων CD133 και ΑΙ_ϋΗ1 (C). Παρόμοια μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για να δείξει υψηλότερη έκφραση της pluripotency και ABCG2 δείκτη εκροής και χαμηλότερη έκφραση του MCM7 μεταγραφές στην αρχική κύτταρα SP (SP), σε σύγκριση με μικτό πληθυσμό μετα-διαφοροποίησης (ΔΠ), όπου μειώθηκε ABCG2 και παρατηρήθηκαν αυξημένα επίπεδα MCM7 (D) . Μία ομάδα κυττάρων επίσης σε επεξεργασία με 25 μΜ ΟΥΑ για 48 ώρες. Ακολούθως, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και την εκ νέου χρώση με Hoechst χρωστική ουσία και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Μετά την διαφοροποίηση, κύτταρα που προέρχονται από ροή διαλογή κυττάρων SP είχαν υψηλότερο ποσοστό των κλασμάτων SP κυττάρων από εκείνα που λαμβάνονται προηγουμένως από κύτταρα μη-ταξινομημένο DU145-TXR. θεραπεία ΟΥΑ μείωσε σημαντικά (

ρ

& lt? 0,001 vs. μάρτυρα) το ποσοστό των κυττάρων κλάσματος SP από 15,8 (± 2,1)% (Πίνακας Ε) προς 0,6 ± (0,09)% (Πίνακας F). Αντιπροσωπευτικά διαγράμματα σημείων από τρία ξεχωριστά πειράματα που παρέχονται. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση ± SD (η = 3).

Η

In vitro διαφοροποίηση μελέτη

Δυνατότητα SP κυττάρων να διαφοροποιούνται προσδιορίστηκε με καλλιέργεια των καθαρών κλασμάτων κυττάρου σε ένα 6 φρεατίων για 14 ημέρες μετά τη διαλογή. SP-κλάσμα κυττάρων από DU145-TXR και PC-TXR (1 × 10

5 /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε 6 πλάκα καλά και αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε μέσο RPMI καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% FBS. Μετά από 14 ημέρες, η Hoechst χρώση και SP ανάλυση έγινε σε επεξεργασμένο ή κυτταρικών πληθυσμών όπως περιγράφεται παραπάνω. Ανάλυση έκφρασης γονιδίων πραγματοποιήθηκε επίσης σε SP και μη SP κύτταρα τόσο πριν όσο και μετά-διαφοροποίηση.

Μετά την αγωγή, με διάφορα φάρμακα, όπως περιγράφεται, συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται και διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE πριν από ανίχνευση με P -gp αντισώματος. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Ένας συνδυασμός 0.5 μΜ ΡΤΧ και 10 μΜ CYA ήταν πιο αποτελεσματική στην προς τα κάτω ρύθμιση της P-gp έκφραση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη ανθεκτικά σε φάρμακο από τη μονοθεραπεία είτε με ΟΥΑ ή ΡΤΧ σε συγκέντρωση 10 και 0,5 μΜ. P-gp προς τα κάτω ρύθμιση με 25 μΜ ΟΥΑ ήταν σχεδόν παρόμοια με εκείνη που λαμβάνεται με θεραπεία συνδυασμού. (Β) Έκφραση του Hh οδού και βλαστικών γονιδίων δεικτών κυττάρων σε κύτταρα DU145-TXR. Ολικό RNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα και σε αντίστροφη μεταγραφή σε cDNA. Πραγματικού χρόνου RT-PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας SYBR Green χημεία και Ct τιμές που λαμβάνονται έτσι χρησιμοποιούνται για να υπολογιστεί η μεταβολή φορές. ανθεκτικά Drug κύτταρα DU145-TXR έχουν υψηλότερη έκφραση και των τριών γονιδίων που δοκιμάστηκαν. ΡΤΧ ευαίσθητα κύτταρα DU145 χρησιμοποιήθηκαν ως τιμές ελέγχου έκφρασης και το γονίδιο για τα κύτταρα DU145-TXR κανονικοποιήθηκαν σε σχέση με τις τιμές ελέγχου. *

σ

& lt?. 0.05 ενάντια στον έλεγχο

Η

ανάλυση Western blot

Μετά τη θεραπεία, τα κύτταρα DU145 TXR λύθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA και η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Bio-Rad RC DC κιτ προσδιορισμού πρωτεϊνών (Hercules, CA). SDS-PAGE στη συνέχεια διεξήχθη για την επίλυση των πρωτεϊνών οι οποίες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε Immobilon φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) χρησιμοποιώντας iBlot σύστημα ξηράς κηλίδωσης (Invitrogen, Carlsbad, CA). Blocking έγινε χρησιμοποιώντας 5% άπαχο ξηρό γάλα σε 1Χ PBST (PBS που περιέχει 0.05% Tween-20) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα επί 16 ώρες στους 4 ° C. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως πρωτεΐνη ελέγχου φόρτωσης και στόχος ανιχνεύθηκε με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL) κιτ ανίχνευσης (GE Healthcare Life Sciences, ΡΑ).

Ολικό RNA συμπεριλαμβανομένων miRNAs απομονώθηκε από DU145-TXR και τα κύτταρα DU145 (Α ) ή PC3 και τα κύτταρα PC3-TXR (Β) χρησιμοποιώντας miRNEasy RNA κιτ απομόνωσης. SYBR Green βάση οδού εστιασμένη miScript miRNA PCR Array (Qiagen, MD) χρησιμοποιήθηκε για miRNA προφίλ μελέτες. Οι πλάκες τρέχουν σε όργανο ενός Roche Light Cycler 480® και η έκφραση των μεμονωμένων miRNAs αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τους λαμβανόμενους C

τιμές ρ και τη μέθοδο ΔΔCt. Ο πίνακας στο ένθετο (C) επιβεβαιώνει την επικύρωση των miRNA προφίλ δεδομένων με τη δοκιμασία αστάρι miScript. Επικύρωση των miRNA προφίλ των δεδομένων έγινε από ένα πραγματικό χρόνο SYBR Green RT-PCR ανάλυση των επιλεγμένων miRNAs. Ως Normalizer, SNORD6 χρησιμοποιήθηκε ως καθαριότητας miRNA. (Δ) Η αποτελεσματικότητα της θεραπείας συνδυασμού για την αποκατάσταση του miR 200 c και 34a προσδιορίσθηκε με κατεργασία κυττάρων DU145-TXR με ΡΤΧ (0,5 μΜ) και CYA (10 μΜ) συνδυασμός για 48 ώρες μετά από την οποία εκχυλίζεται το συνολικό RNA, μετατρέπεται σε cDNA και χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για δοκιμασία εκκινητή miScript για τον προσδιορισμό της έκφρασης των miRNAs 200c και 34α. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα DU145-TXR χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος για τον υπολογισμό φορές αλλαγή μετά από SYBR Green πραγματικού χρόνου ανιχνεύσεως RT-PCR. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD (η = 3). *

σ

& lt?. 0,05 έναντι μη επεξεργασμένο έλεγχο

Η

Real time RT-PCR

Το συνολικό RNA εξήχθη από διαλεγμένα και μη ταξινομημένα κύτταρα καρκίνου του προστάτη χρησιμοποιώντας RNeasy RNA κιτ απομόνωσης (Qiagen, MD), που ακολουθείται από προσδιορισμό της ποιότητάς της κατά μέσο Nanodrop 2000. Στη συνέχεια μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA εκμαγείο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. cDNA (100 ng) στη συνέχεια ενισχύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας SYBR Green χρωστική καθολική κύριο μείγμα με ένα ελαφρύ Cycler 480 όργανο (Roche, Indianapolis, ΙΝ) με χρήση των εκκινητών για γονίδια ενδιαφέροντος για σαράντα κύκλοι Σχετική ποσότητα του mRNA σε σύγκριση με S19 (γονίδιο καθαριότητας) επίπεδο υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τις τιμές σημείου διέλευσης (Cp) και κλιμακώνεται σε σχέση με τον έλεγχο των δειγμάτων που ορίζεται σε μια τιμή 1. Αποτελέσματα για την έκφραση του γονιδίου σε πειραματικά δείγματα απεικονίζονται σε σύγκριση με τον έλεγχο.

Πολλά γονίδια που εμπλέκονται σε σχετικά με τον καρκίνο των βιολογικών διαδικασιών και γνωστών στόχων των διαφορικά εκφρασμένων miRNAs στη μελέτη μας έχουν μεταβληθεί σε ανθεκτικά PTX κύτταρα DU145 TXR. Μετά την εκχύλιση του RNA και σε πραγματικό χρόνο με βάση SYBR Green RT-PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές γονιδίου, τιμές Cp υπολογίστηκαν και ανθεκτικά κύτταρα DU145 χρησιμοποιήθηκαν για την εξομάλυνση της έκφρασης των μεμονωμένων γονιδίων. Δεδομένων αντιπροσωπεύει τη μέση τιμή ± SD (n = 3).

Η

microRNA (miRNA) προφίλ και επικύρωση των δεδομένων

Το συνολικό RNA που περιλαμβάνει μικρά μη-κωδικοποίησης miRNA απομονώθηκε από μη επεξεργασμένα και τα ναρκωτικά κατεργασμένα DU145-TXR και τα κύτταρα DU145 ή PC3 και PC3-TXR κύτταρα χρησιμοποιώντας κιτ απομόνωσης RNA miRNEasy (Qiagen MD) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα ίδια αντιδραστήρια χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση ολικού RNA από ανθρώπινο ιστό προστάτη. Εν συντομία, flash κατεψυγμένα ιστός αιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης και υποβάλλεται σε προσεκτική αποσύνθεση χρησιμοποιώντας ένα φορητό ηλεκτρικό ομογενοποίησης για την δεκαετία του ’30 σε μια ρύθμιση χαμηλής-μέσης ταχύτητας. Το ομογενοποίημα φυγοκεντρήθηκε για 3 λεπτά στους 4 ° C και το υπερκείμενο χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση ολικού RNA. Μετα-απομόνωση, η ποιότητα του RNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα Nanodrop 2.000 όργανο.

(Α) Ανθρώπινη προστάτη καρκινικό ιστό μετετράπη σε εναιωρήματα μονών κυττάρων, όπως περιγράφεται στο «Μέθοδοι». Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Hoechst χρωστική ουσία και αναλύονται όπως περιγράφεται προηγουμένως. Σχεδόν το 1% του συνολικού πληθυσμού βιώσιμων κυττάρων περιφραγμένο ως το κλάσμα SP. (Β) Ολικό RNA απομονώθηκε από ένα άλλο σύνολο ανθρώπινων ιστών του προστάτη (καρκίνος και καλοήθης) χρησιμοποιώντας miRNEasy RNA κιτ απομόνωσης. SYBR Green βάση οδού εστιασμένη miScript miRNA PCR Array (Qiagen, MD) χρησιμοποιήθηκε για miRNA προφίλ μελέτες. Οι πλάκες τρέχουν σε όργανο ενός Roche Light Cycler 480® και η έκφραση των μεμονωμένων miRNAs αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τους λαμβανόμενους C

t αξιών και τη μέθοδο ΔΔCt. Οι φορές αλλαγές στους ιστούς του όγκου κανονικοποιήθηκαν σε σχέση με την καλοήθη ιστό προστάτη. (Γ) Ο πίνακας στο ένθετο επιβεβαιώνει την επικύρωση των miRNA προφίλ δεδομένων με τη δοκιμασία αστάρι miScript. Επικύρωση των miRNA προφίλ των δεδομένων έγινε με την εκτίμηση RT-PCR των επιλεγμένων miRNAs200c, 34α και 29β. SNORD6 χρησιμοποιήθηκε ως καθαριότητας miRNA για την κανονικοποίηση των δεδομένων.

Η

Για τις μελέτες προφίλ miRNA, χρησιμοποιήθηκε SYBR πράσινο βασίζεται οδού εστιασμένη miScript miRNA PCR Array (Qiagen, MD). Η σειρά οδός καρκίνου (αριθμός καταλόγου 102ZF) επιτρέπει την ταυτόχρονη ανίχνευση των 84miRNAs προηγουμένως εντοπιστεί σε ανθρώπινους καρκίνους, καθώς και κατάλληλες αναλύσεις καθαριότητας και ελέγχους ποιότητας του RNA. Η δοκιμασία διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τριακόσια νανογραμμάρια (ng) του ολικού RNA μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας miScript II RT Kit. Το αραιωμένο cDNA αναμίχθηκε με καθολικό εκκινητή και SYBR Green χρωστική και προστέθηκαν στα φρεάτια πλακών 96 φρεατίων που περιέχουν λυοφιλισμένο εκκινητή. Οι πλάκες τρέχει σε ένα 480®instrument Roche Light Cycler και η έκφραση των μεμονωμένων miRNAs αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τους λαμβανόμενους C

t αξίες. Η αλλαγή φορές για κάθε miRNA υπολογίστηκε συνδέοντας τα C

σ τιμές σε web-based λογισμικό του κατασκευαστή. κύτταρα DU145 ή κύτταρα PC3, καθώς και καλοήθη δείγματα προστάτη θεωρήθηκαν ως «ελέγχους», προκειμένου να υπολογίσει την πτυχή αλλαγή στα κύτταρα και καρκινικό ιστό του προστάτη DU145-TXR και PC3-TXR, αντίστοιχα. Υπάρχει ενδογενής ελέγχους, RT θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες, και γονιδιωματικό έλεγχοι μόλυνσης DNA ελέγχθηκαν επίσης για κάθε συστοιχία.

Σημαντικές αλληλεξάρτηση μεταξύ χημειοαντίσταση, επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβαση και μετάσταση, η οποία αρνητικά αποτελέσματα αντίκτυπο θεραπεία. Χημειοαντίσταση, ένα βασικό χαρακτηριστικό των ΚΕΠ και των κυττάρων που υποβάλλονται σε EMT, ρυθμίζεται από την απορρύθμιση των miRNAs. προτεινόμενη θεραπεία συνδυασμού μας με ΡΤΧ και CYA στοχεύει ταυτόχρονα ΚΕΠ και χύμα καρκινικά κύτταρα, αντιστρέφει EMT και αποκαθιστά την έκφραση των miRNAs μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια της παραγωγής του χημειοαντίσταση και είναι μια βιώσιμη στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη ανθεκτικά στα φάρμακα.

Η

επικύρωση των miRNA προφίλ των δεδομένων έγινε με PCR πραγματικού χρόνου εκτίμηση των επιλεγμένων miRNAs. Για κάθε ένα από τα επιλεγμένα miRNA, ένα miScript έναυσμα PCR αγοράσθηκε από Qiagen. Αυτή στόχους δοκιμασία ωριμάζουν μόνο miRNAs, δεν προδρόμων τους. Ως Normalizer, SNORD6 χρησιμοποιήθηκε ως καθαριότητας miRNA. Εν συντομία, αραιωμένο cDNA που χρησιμοποιήθηκαν για miRNA προφίλ χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο σε παρουσία SYBR Green χρωστική, καθολικό εκκινητή και miScript εκκινητή. Η πλάκα διεξάγεται όπως περιγράφεται παραπάνω και πολλαπλές μεταβολές στην έκφραση miRNA υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το C

t τιμή του ελέγχου normalizer. Μια παρόμοια προσέγγιση χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η έκφραση του miR200c και miR 34a σε DU 145-TXR κύτταρα που κατεργάζονται με 0,5 μΜ ΡΤΧ + 10 μΜ ΟΥΑ. Μετά την επεξεργασία, το συνολικό RNA απομονώθηκε, αντίστροφη μεταγραφή σε cDNA και να χρησιμοποιηθούν για να μετρηθεί η έκφραση miRNA όπως περιγράφεται παραπάνω.

Στατιστική Ανάλυση

Όλες οι τιμές στα σχήματα και το κείμενο εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD . Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν και μεμονωμένα μέσα ομάδας συγκρίθηκαν με το μη ζευγαρωμένο Student

t-τεστ

. Ένα

σ

αξίας τουλάχιστον 0,05 θεωρήθηκε σημαντική και σημειώνονται με αστερίσκο (*).

Αποτελέσματα

Συνδυασμός CYA και ΡΤΧ μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων και ενισχύει την απόπτωση στον καρκίνο του προστάτη φάρμακο κύτταρα ανθεκτικά

Η ικανότητα του συνδυασμού χημειοθεραπείας να αναστέλλουν την ανάπτυξη του ΡΤΧ ανθεκτικών προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή αξιολογήθηκε με τη βιωσιμότητα των κυττάρων και προσδιορισμού της απόπτωσης. Παρατηρήθηκε ότι ο συνδυασμός του ΡΤΧ και CYA σημαντικά (

σ

αξία & lt? 0,05) μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων στο 40% σε σύγκριση με είτε ΡΤΧ ή ΟΥΑ μόνο (Σχήμα 1, πάνελ Α-Ρ.). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε ποσοτικό προσδιορισμό κυτταρικού θανάτου αννεξίνης V όπου τα αποτελέσματα της θεραπείας συνδυασμού σε ένα σημαντικά υψηλότερο κυτταρικό θάνατο, σε σύγκριση με τη χημειοθεραπεία και μόνο παράγοντα (Σχ. 1, G). Ενώ ένας συνδυασμός ΡΤΧ και CYA οδήγησε σε σχεδόν 70% των κυττάρων πεθαίνουν, το ποσοστό κυτταρικού θανάτου που παρατηρείται με ΡΤΧ ή μονοθεραπεία ΟΥΑ ήταν 15% και 25% αντίστοιχα. Ωστόσο, η θεραπεία με 25 μΜ ΟΥΑ ήταν σημαντικά πιο αποτελεσματική από τον έλεγχο και οδήγησε σε σχεδόν το 40% κυτταρικό θάνατο.

υπάρχουν κλάσματα Side Πληθυσμός σε ΡΤΧ ανθεκτικών κυττάρων καρκίνου του προστάτη και έχουν μοναδικές γονιδιακής έκφρασης

τα σχήματα 2 και 3 δείχνουν την ανάλυση SP κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη DU145-TXR και PC3-TXR, αντίστοιχα, καθώς και η επίδραση της θεραπείας με ΡΤΧ και CYA. Τα κύτταρα ελέγχου DU145 έχει ελάχιστες ποσότητες SP (0,2%, Σχ. 2Α), ενώ ΡΤΧ ανθεκτική κυτταρική γραμμή DU145-TXR έχει ~3.2% των SP κύτταρα (Σχ. 2Β), όπως υποδεικνύεται με χρώση Hoechst (

ρ

& lt ? 0,05 σε σύγκριση με DU 145 κύτταρα). Σε περίπτωση των κυττάρων PC3-TXR, σχεδόν 2% των βιώσιμων κυττάρων περιφραγμένο ως SP (Σχ. 3Α). Βεραπαμίλη, ένας γνωστός καταστολέας των αντλιών εκροής χρησιμοποιήθηκαν σε αυτές τις μελέτες ως μάρτυρας για να ρυθμίσετε τις πύλες στα οικόπεδα dot FACS. Όπως φαίνεται στα σχήματα. 2C και 3Β, η θεραπεία βεραπαμίλη μείωσε σημαντικά κλάσματα SP στα κύτταρα DU145-TXR στο 0,89% και στο 0,6% στα κύτταρα PC3-TXR. Αυτά τα δεδομένα είναι σε συμφωνία με την χρήση του verapamil ως φάρμακο ελέγχου για τον εντοπισμό και την περίφραξη Hoechst-φως κυττάρων σε διάφορα καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη. Ενώ η θεραπεία με 1 μΜ ΡΤΧ για 12 ώρες αύξησε το κλάσμα SP σε 7,8%, η θεραπεία με 20 μΜ ΟΥΑ, ένας συνδυασμός ΟΥΑ και ΡΤΧ 24 ώρες μετά την απομάκρυνση του ΡΤΧ για παρόμοιο χρόνο μειωμένο κλάσμα SP σε ~ 2% (Σχ. 2 , πάνελ D, Ε και F, αντιστοίχως) (

ρ

& lt? 0,05 σε όλα τα δείγματα). Σε κύτταρα PC3-TXR, το κλάσμα SP ήταν σημαντικά μειωμένη μετά από αγωγή με ΟΥΑ (Σχ. 3C) ή ΟΥΑ και ΡΤΧ συνδυασμού (Σχ. 3D). Πραγματικού χρόνου ανάλυση RT PCR υποδεικνύει υψηλότερη έκφραση των δεικτών πλειοδυναμίας Oct4 και Nanog, και δείκτες κυττάρων του καρκίνου βλαστικών CD133 και ΑΙ_ϋΗ1 στα κλάσματα SP σε σύγκριση με μη-SP (NSP) κλάσματα τόσο DU145-TXR και τα κύτταρα PC3-TXR. Μετα-διαφοροποίηση μοίρα των κυττάρων SP μελετήθηκε με πραγματικού χρόνου χρώση RT-PCR και Hoechst μετά την απομόνωση τους και την εκ νέου καλλιέργεια. Αυτά τα κύτταρα διαφοροποιούνται σε έναν πληθυσμό που περιλαμβάνει μίγμα SP και τα κλάσματα NSP που διέφερε σε φαινότυπο τους (Εικ. 4, πλαίσια Α και Β, αντίστοιχα). ανάλυση της έκφρασης των μετα-διαφοροποίησης αναμειγνύονται-πληθυσμούς δείχνει μειωμένη μεταγραφές του ABC-μεταφορέα και βλαστική ικανότητα καρκίνο ABCG2 δείκτη και υψηλότερη έκφραση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού συντήρησης μικροχρωμόσωμα δείκτη 7 (MCM7) σε σύγκριση με αδιαφοροποίητη SP-κλάσματα (Σχ. 4D). Περαιτέρω κατεργασία των πληθυσμών SP μετα-διαφοροποίησης με 25 μΜ ΟΥΑ επί 48 ώρες είχε ως αποτέλεσμα το κλάσμα SP μειώνεται σημαντικά από 15,8% (πίνακας Ε) σε 0,6% (πίνακας F,

ρ

& lt? 0,05). Ο Πίνακας 1 δείχνει την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου της ροής ταξινομημένο SP και τα κύτταρα NSP. Παρατηρήθηκε ότι, το 62% των κυττάρων NSP ήταν στο G0-G1 και 30% στην S φάση σε αντίθεση με 71,5% και 21% για τα κύτταρα SP, αντίστοιχα (

ρ

& lt? 0,05).

Gene και η έκφραση πρωτεΐνης σε DU 145-TXR κύτταρα

η έκφραση της P-γλυκοπρωτεΐνης (P-gp) εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western. Σύκο.