Αφηρημένο

Η ανάπτυξη του καρκίνου περιλαμβάνει τη γενετική προδιάθεση και μια ποικιλία των περιβαλλοντικών εκθέσεων. Γονιδίωμα-ευρύ αναλύσεις διασύνδεσης παρέχουν αποδεικτικά στοιχεία για τη σημαντική σύνδεση πολλών ασθενειών με την ευαισθησία τόπους στο χρωμόσωμα 8ρ23, η θέση της ομάδας γονιδίων αμυντοσίνη άνθρωπο. Ανθρώπινη β-αμυντίνων (hBDs) είναι σημαντικά μόρια της φυσικής ανοσίας. Αυτή η μελέτη σχεδιάστηκε για να αναλύσει την έκφραση και γενετικές παραλλαγές σε hBDs (hBD-1, hBD-2, hBD-3 και hBD-4) και υποθετικές ένωσή τους με τον καρκίνο του παχέος εντέρου. γονιδιακή έκφραση hBD και σχετική έκφραση πρωτεΐνης αξιολογήθηκαν με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (qPCR) και ανοσοϊστοχημεία, αντίστοιχα, από 40 φυσιολογικούς ασθενείς και 40 ασθενείς της ίδιας ηλικίας με καρκίνο του παχέος εντέρου σε Σαουδικής Αραβίας. Επιπλέον, πολυμορφισμοί hBD γονότυπος με προσδιορισμό της αλληλουχίας του εξωνίου και με μεθυλίωση προαγωγού. hBD-1, hBD-2, hBD-3 και hBD-4 βασικής έκφρασης αγγελιοφόρου RNA ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε ιστούς όγκων σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς. Αρκετές μεταλλάξεις παρεμβολής ανιχνεύθηκαν σε διαφορετικά εξώνια των αναλύθηκαν hBDs. Ωστόσο, δεν μεθυλίωση σε οποιαδήποτε υποστηρικτές hBDs ανιχνεύθηκε λόγω του περιορισμένου αριθμού των CpG νησίδων σε αυτές τις περιοχές. Δείξαμε για πρώτη φορά μια σύνδεση μεταξύ της έκφρασης hBD και του καρκίνου του παχέος εντέρου. Αυτό δείχνει ότι υπάρχει σημαντική σχέση μεταξύ της φυσικής ανοσίας απορρύθμιση μέσω διακοπής της κατιονικά πεπτίδια (hBDs) και την πιθανή ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Semlali Α, Al Amri Α, Azzi Α, Al Shahrani O, Arafah Μ, Kohailan Μ, et al. (2015) Έκφραση και τη Νέα εξόνιο μεταλλάξεις του Ανθρώπου Beta αμυντοσίνες και την ένωσή τους σε Colon την ανάπτυξη του καρκίνου. PLoS ONE 10 (6): e0126868. doi: 10.1371 /journal.pone.0126868

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Isabelle Α Chemin, CrCl-INSERM, Γαλλία

Ελήφθη: 25 Ιουλίου, 2014? Αποδεκτές: 8 Απριλίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 3 Ιουνίου 2015

Copyright: © 2015 Semlali et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς επεκτείνουν την εκτίμησή τους προς την Κοσμητεία της Επιστημονικής έρευνας στο King Saud University για τη χρηματοδότηση του έργου μέσω του προγράμματος ερευνητικής ομάδας αριθ: RGP-VPP-260 και με επιχορήγηση από το Fonds Émile-Beaulieu (Ίδρυμα του Πανεπιστημίου Laval)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου ( CRC) είναι η τρίτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται ο καρκίνος στους άνδρες και η τέταρτη πιο συχνή στις γυναίκες σε όλο τον κόσμο [1]. Η Αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία εκτιμά, θα υπάρξουν πάνω από 96.000 νέες περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου που οδηγεί σε περίπου 50.000 θανάτους το 2014 (αμερικανική κοινωνία καρκίνου το 2014). Στο Βασίλειο της Σαουδικής Αραβίας (KSA), καρκίνος του παχέος εντέρου είναι μία από τις πιο συχνές νόσους [2], με μέση ηλικία των 60 ετών για τους άνδρες και 58 χρόνια για τις γυναίκες [3]. ανάπτυξη του καρκίνου έχει αναφερθεί να εμπλέξει γενετικούς παράγοντες [4] και επίσης μια ποικιλία από περιβαλλοντικής έκθεσης [5]. Γενετική ευαισθησία στον καρκίνο είναι πολυπαραγοντική, συμπεριλαμβανομένων σωματικών γενετικές αλλοιώσεις, όπως οι μεταλλάξεις σε ογκογονίδια ή γονίδια καταστολής όγκου [6], και οι αλλαγές στην γονιδιακή έκφραση προφίλ ή DNA μεθυλίωση. Gene προφίλ έκφρασης έχει προσφέρει ένα νέο τρόπο για να ταξινομήσει ανθρώπινους όγκους [7]. Με βάση τα επίπεδα έκφρασης του mRNA συγκεκριμένων γονιδίων, μπορούν να ταυτοποιηθούν διαφορετικοί υπότυποι του καρκίνου. Μεθυλίωση του DNA είναι η πιο ευρέως μελετηθεί επιγενετικό δείκτης [8]. DNA υπερμεθυλίωση επαγόμενη γονιδιακή σίγηση είναι ένα κοινό συμβάν σε πολλές κακοήθειες, που χρησιμεύει ως ένας εναλλακτικός μηχανισμός για γενετική μετάλλαξη να επηρεάσει την απώλεια των λειτουργιών ογκοκατασταλτικών [9,10]. Η ανακάλυψη της παγκόσμιας υπομεθυλίωσης DNA σε ανθρώπινους όγκους ακολουθήθηκε από την ταυτοποίηση των υπερμεθυλιωμένων ογκοκατασταλτικών γονιδίων, και πρόσφατα, η αδρανοποίηση του microRNA (miRNA) από το DNA μεθυλίωση έχει επίσης περιγραφεί [11,12]. Αυτή η μορφή των επιγενετικών αλλαγή μπορεί να συμβάλει στην έναρξη και την εξέλιξη του όγκου μέσω μεταγραφικής σίγησης των ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Πράγματι, αρκετές γονίδια έχουν δειχθεί ότι είναι επιγενετικώς αδρανοποιημένο ina ευρύ φάσμα όγκων [13]? Έτσι, η έννοια του «προφίλ υπερμεθυλίωση» των όγκων μπορεί να έχει πιθανές κλινικές εφαρμογές [14-16]. Υπερμεθυλίωση γονίδια μπορεί να περιλαμβάνουν όσους εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου (p16INK4a, p15, Rb) [17], την επιδιόρθωση του DNA (BRCA 1, MGMT), την αντίσταση (MGMT), την κυτταρική διαφοροποίηση, την αγγειογένεση (THBS1) και μετάσταση [13]. Ωστόσο, υπάρχουν περιορισμένες πληροφορίες σχετικά με το ρόλο της απορρύθμισης της έμφυτης ανοσίας γονιδίων και εύλογη σχέση τους με τον καρκίνο του παχέος εντέρου. Επιπλέον, τα στοιχεία για το ρόλο του φυσικού ανοσοποιητικού συστήματος για την προστασία από την ανάπτυξη του όγκου έχει αποδειχθεί από μελέτες που περιλαμβάνουν ανοσοκατασταλμένους ασθενείς [18]. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι μια αδύναμη ανοσοαπόκριση έχει άμεση και αντίστροφη συσχέτιση με πολλούς τύπους καρκίνου [19,20]. Όλα τα κύτταρα στο ανθρώπινο σώμα έχουν πολλαπλές γραμμές άμυνας ενάντια κυτταρικού μετασχηματισμού, και το ανθρώπινο ανοσοποιητικό σύστημα είναι ένα θαυμάσιο και καλά συντονισμένο δίκτυο των κυττάρων, οργάνων και αδένων που προστατεύει τον οργανισμό από ακατάλληλο φυσιολογικό απορρυθμίσεις. Μια βελτιστοποιημένη ανοσοποιητικό σύστημα είναι το κλειδί για την καλή υγεία και μακροζωία. Επιπλέον, η έμφυτη ανοσοαπόκριση έχει σημαντική εξειδίκευση έναντι διατηρημένων μοριακών μοντέλων των συστατικών μικροοργανισμών, οι οποίες ονομάζονται μοριακά μοτίβα παθογόνο που σχετίζεται (PAMPs). Οι υποδοχείς στα κύτταρα του ανοσοποιητικού που αναγνωρίζουν PAMPs ονομάζονται υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων (PRRs). Toll-όπως υποδοχείς (TLRs) είναι μια σημαντική κατηγορία PRRs, και κάθε TLR αναγνωρίζει ένα διαφορετικό PAMP [21-23]. Η ενεργοποίηση μιας έμφυτης ανοσοαπόκρισης προχωρά όμως δέσμευση σε υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων όπως TLRs. Αυτοί οι TLRs αποτελούν βασικούς αισθητήρες της εισβολής παθογόνων, ενεργοποιείται σε μεγάλο βαθμό από την έμφυτη παράγοντες ανοσία, όπως επιθηλιακά κύτταρα [23]. Ο καταρράκτης σηματοδότησης TLR μπορεί να περιλαμβάνει την ενεργοποίηση του μορίου προσαρμογέα MyD88, και οι δύο καταρράκτες οδηγήσει στην ενεργοποίηση του NF-κΒ για την προώθηση της μεταγραφής των προ-φλεγμονωδών κυτοκινών, χημειοκινών και κατιονικά πεπτίδια επίσης γνωστή ως ανθρώπινη β-αμυντίνες (hBDs). Αυτά hBDs ανήκουν σε μία οικογένεια αντιμικροβιακών πεπτιδίων που αποτελούν σημαντικό μέρος του έμφυτου ανοσοποιητικού άμυνα. Μέχρι σήμερα, έχουν τέσσερα hBDs (1-4) έχουν ταυτοποιηθεί σε ανθρώπινους ιστούς. hBD-1 συστατικώς παράγεται από διάφορους επιθηλιακών ιστών όπως της αναπνευστικής οδού και του δέρματος [24], ενώ οι εκφράσεις του hBDs είναι επαγώγιμοι [25]. Συγκεκριμένα, hBD-2 εκφράζεται έντονα σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα μετά από επαφή με μικροοργανισμούς ή κυτοκίνης (ΤΝΡ-α και IL-1) διέγερση [26,27].

γονιδιωματική δομή τους αποτελείται από δύο εξώνια και ένα εσώνιο. Το πρώτο εξόνιο κωδικοποιεί το πεπτίδιο σήμα, και ο δεύτερος κωδικοποιεί ένα ώριμο πεπτίδιο προηγείται μια σύντομη ανιονικό προπεπτίδιο. Το ώριμο πεπτίδιο που λαμβάνεται μετά την πρωτεολυτική διάσπαση της αλληλουχίας σήματος. Παρά τα χαμηλά ομοιότητες αλληλουχίας μεταξύ αυτών των πρωτεϊνών, 3D δομές τους έχουν μια παρόμοια αμυντοσίνη-όπως τοπολογικές φορές αποτελείται από τρία-κλώνων διατεταγμένα σε τρία φύλλα αντι-παράλληλο περιορίζεται από τρεις γέφυρες ενδο-μοριακό δισουλφιδικό [28,29]. Β-αμυντίνες έχουν ένα σύμπλεγμα από κατιονικά κατάλοιπα (Lys, Arg) κοντά στο καρβοξυλο άκρα των πεπτιδίων. Τα C-τερματικό θετικά φορτισμένα αμινοξέα παίζουν καθοριστικό ρόλο στην αντιμικροβιακή δράση [30,29]. Το θετικό καθαρό φορτίο και υδρόφοβες ιδιότητες προώθηση hBDs αλληλεπίδραση με μικροβιακές μεμβράνες. hBDs ασκούν άμεση αντιμικροβιακή δράση και είναι δραστικές έναντι βακτηριδίων, μυκήτων και ιών? Παράλληλα, σύμφωνα με πρόσφατα δεδομένα, διαθέτουν πολλαπλές βιολογικές δραστηριότητες, ιδιαίτερα, εκείνων που ρυθμίζουν το ανοσοποιητικό [29], και εμπλέκονται στην απόκριση κατά του όγκου.

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί η απορρύθμιση του προφίλ hBDs γονιδιακής έκφρασης, μεταλλάξεις εξόνιο hBDs, και μεθυλίωση υποστηρικτής της hBDs καθώς και η συσχέτιση των ευρημάτων αυτών με την προώθηση καρκίνο του παχέος εντέρου στον άνθρωπο. Από κλινική άποψη, πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε αυτές τις οδούς μπορούν να χρησιμεύσουν ως στόχοι για τη θεραπεία του καρκίνου, μέσω της δυνητική χρήση hBD /TLR-ανοσοθεραπεία.

Αποτελέσματα

Κλινικά δεδομένα των ασθενών διαγνωστεί με καρκίνο του παχέος εντέρου μέσω κολονοσκόπησης

Τα κλινικά χαρακτηριστικά των 40 Σαουδικής ασθενών, συμπεριλαμβανομένης της ηλικίας, εθνικότητας, το οικογενειακό ιστορικό, το κάπνισμα, το στάδιο του καρκίνου του παχέος εντέρου, τα φάρμακα και η παρουσία άλλων νόσων, συλλέχθηκαν και σύγκριση μεταξύ του καρκίνου του παχέος εντέρου και να ελέγχουν τους ασθενείς. Το εγγράφονται πληθυσμός περιλαμβάνει τους μη καπνιστές χωρίς οικογενειακό ιστορικό καρκίνου του παχέος εντέρου και χωρίς αλλεργίες. Η ηλικία του πληθυσμού της μελέτης κυμαινόταν μεταξύ 45 και 75 ετών, με μέσο όρο 60 ± 16,56 χρόνια για τους άντρες και 55 ± 13,74 χρόνια για τις γυναίκες (Πίνακας 1). Είναι επίσης ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι ένας μεγάλος αριθμός των συμμετεχόντων που πάσχουν από καρκίνο του παχέος εντέρου δεν υποβάλλονται σε χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία.

Η

Διαφορικές hBD γονιδιακής έκφρασης στο παχύ έντερο καρκινικούς ιστούς

Για να αναλυθεί η έκφραση των διαφορετικών hBDs (1-4) στο επίπεδο mRNA, ποσοτική πραγματικού χρόνου αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου και φυσιολογικούς ιστούς που απομονώθηκαν από τον ίδιο ασθενή. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1, τα επίπεδα έκφρασης όλων των hBDs μειώθηκαν σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς. Συγκεκριμένα, τα επίπεδα hBD-1 μειώθηκε σημαντικά (ρ & lt? 0,0001) από 0.99 ± 0.02 στους φυσιολογικούς ιστούς σε 0,29 ± 0,14 σε ιστούς καρκίνου (Σχήμα 1Α). επίπεδα hBD-2 μειώθηκε από 1,03 ± 0,08 στην ομάδα ελέγχου σε 0,36 ± 0,18 στους ιστούς του καρκίνου, με ρ & lt? 0,0001 (Σχήμα 1Β). hBD-3 μειώθηκε από 1,11 ± 0,11 σε ιστό ελέγχου για να 0.48 ± 0.09 στους ιστούς καρκίνου (Σχήμα 1 C), και hBD-4 μειώθηκε από 0,99 ± 0,03 σε ιστούς ελέγχου σε 0,46 ± 0,10 σε ιστούς καρκίνου (Σχήμα 1D) .

το ολικό κυτταρικό RNA εκχυλίστηκε προσφάτως από την κανονική και καρκινικούς ιστούς παχέος εντέρου μεταγράφηκε ανάστροφα σε cDNA και στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για να μετρηθεί η έκφραση hBD mRNA (Panel1A έως 1Δ).

η

Ανοσοϊστοχημική σύγκριση μεταξύ διαφορετικά αντιμικροβιακά πεπτίδια

Για να επιβεβαιώσετε τα στοιχεία της έκφρασης mRNA, προσδιορίσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης hBDs με ανοσοϊστοχημεία. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2Α, θετική ανοσο-χρώση για τις hBDs γενικά παρατηρήθηκε σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του κόλου και επίσης σε ορισμένες στρωματικά κύτταρα. Ωστόσο, η ένταση της χρώσης για όλα τα hBDs ήταν χαμηλότερη στους ιστούς του όγκου αδενοκαρκινώματος κόλου. Για να προσδιοριστεί ποσοτικά η διαφορική έκφραση του hBDs σε ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς, μετρήσαμε τα θετικά κύτταρα και προσδιορίζεται ένα αυθαίρετο επίπεδο έκφρασης, όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 2Β σε 2D. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν τα χαμηλά επίπεδα hBDs σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς. Η παρατηρούμενη χαμηλό επίπεδο των πρωτεϊνών hBD επιβεβαιώνει την διαπίστωση των χαμηλών επιπέδων της έκφρασης του γονιδίου hBD.

Οι ιστοί ανοσοβαφή χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα hBD (Πίνακας 2Α). hBD- θετικά κύτταρα στους ιστούς εκτιμήθηκαν ως ακολούθως: 0 βαθμοί, κανένα θετικό χρώμα? 1 πόντο, & lt? 20% θετική χρώση? 2 πόντους, 21-50% θετική χρώση? 3 πόντους, 51-75% θετική χρώση? και 4 μονάδες, & gt? 75% θετική χρώση. Αυτό παρουσιάζεται στον Πίνακα Β

Η

Επικράτηση της HBD μεταλλάξεις εξόνιο σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου

Για να διερευνήσουν τη σύνδεση των μεταλλάξεων hBD και κάτω την έκφρασή τους σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, αλληλουχίας εξόνιο για όλα τα hBDs αναλύθηκε. Η

de novo

ρυθμός μετάλλαξης hBDs έχει υπολογιστεί στον Πίνακα 2, για hBD-1? τρεις μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν στο εξόνιο 1 (δύο στην περιοχή 5’UTR πριν από τη μεταφρασμένη αλληλουχία και ένας στην υποκινητή). Αυτές οι μεταλλάξεις δεν επηρεάζουν την πρωτεϊνική δομή, αλλά μπορεί να επηρεάσει την έκφραση και τη σταθερότητα του mRNA. Δύο άλλες μεταλλάξεις παρεμβολής ανιχνεύθηκαν στο μεταφρασμένη περιοχή του εξονίου 2 που οδήγησαν σε ένα ανώριμο πρωτεΐνη. Βρήκαμε επίσης πέντε μεταλλάξεις στο 3′-αμετάφραστη περιοχή (3’UTR). Το 3’UTR είναι γνωστό ότι περιέχει ρυθμιστικά στοιχεία που είναι απαραίτητα για την κατάλληλη έκφραση διαφόρων γονιδίων. ανιχνεύθηκαν Δύο τύποι μεταλλάξεων: 8 (80%) ήταν ενθέσεις και 2 (20%) ήταν μεταβάσεις. Όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα 2, ο ίδιος ασθενής μπορεί να περιέχει μία ή περισσότερες μεταλλάξεις στην περιοχή hBD1 (π.χ. Τ17 = καρκίνο του παχέος εντέρου αριθμός ασθενής 17 είχε 3 διαφορετικές μεταλλάξεις του γονιδίου hBD-1). Η μετάβαση μετάλλαξη στο 3’UTR του γονιδίου hBD-1 δεν σχετίζεται με τον καρκίνο του παχέος εντέρου, αλλά αντ ‘αυτού συνδέεται με το Saudi πληθυσμού, όπως διαπιστώθηκε σε όλες τις κανονικές και τον καρκίνο συμμετέχοντες εκτός από μία περίπτωση (Τ4).

hBD-2, τέσσερα συνολικά μεταλλάξεις ανιχνεύτηκαν σε ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου, αλλά όχι σε φυσιολογικούς ιστούς: τρία στον υποκινητή (μία μετάβαση μετάλλαξη και δύο μεταλλάξεις εισαγωγής), χωρίς μεταλλάξεις στα μεταφρασμένες αλληλουχίες για το εξόνιο 1 και το εξόνιο 2, και δύο μετάβαση μεταλλάξεις στην περιοχή 3’UTR (μία μετάβαση στην 3’UTR δεν σχετίζεται με τον καρκίνο του παχέος εντέρου, αλλά με την Saudi πληθυσμού). Σε hBD-2, ανιχνεύθηκαν τρεις τύποι μεταλλάξεων: 1 (20%) ήταν ένα αμφιμετατροπή, 2 (20%) ήταν μία εισαγωγή και 3 (60%) ήταν μεταλλάξεις μετάβαση. Όλες οι μεταλλάξεις ανιχνεύονται σε hBD-2 δεν έχουν καμία επίπτωση στην πρωτεϊνική δομή, αλλά μπορούν να επηρεάσουν hBD-2 έκφραση και τη σταθερότητα των γονιδίων. Σε hBD-3, όλες οι μεταλλάξεις (100%) που ανιχνεύθηκαν ήταν οι μεταλλάξεις εισαγωγής (Πίνακας 2): μία εισαγωγή ανιχνεύθηκε στην περιοχή 5’UTR, μία ένθεση βρέθηκε στην μεταφρασμένη αλληλουχία του εξονίου 1, επάγει μια πλήρη αλλαγή ακολουθία ξεκινώντας από υπόλειμμα 4, καθώς και τρεις άλλες μεταλλάξεις στην μεταφρασμένη περιοχή του εξονίου 2 (ένα από αυτά τα ενθέσεις ήταν κοντά στο κωδικόνιο λήξης), και τρία ενθέσεις ανιχνεύθηκαν στην περιοχή 3’UTR του γονιδίου hBD-3. Εισαγωγές 7 και 8 ήταν ειδικά για την Saudi πληθυσμό και δεν σχετίζονται με τον καρκίνο του παχέος εντέρου? όλοι οι όγκοι και όλους τους φυσιολογικούς ιστούς που παρουσιάζονται αυτές τις μεταλλάξεις (Πίνακας 2). Σε hBD-4, τρεις σύνολο μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν: μία στην 5’UTR που δεν επηρεάζει τη δομή πρωτεΐνης hBD-4 και δύο στο εξόνιο 2 που παράγουν ατελή αλληλουχία, με πλήρη αλλαγή ακολουθία ξεκινώντας από υπολείμματα 22 και 56. Δύο τύποι μεταλλάξεων ανιχνεύτηκαν σε hBD-4: 1 (30%) ήταν ένα μεταβατικό και 2 (60%) ήταν ενθέσεις (Πίνακας 2). Ωστόσο, δεν μεθυλίωση σε οποιαδήποτε υποστηρικτές hBDs ανιχνεύθηκε λόγω του περιορισμένου αριθμού των CpG νησίδων σε αυτές τις περιοχές.

Δομή-Λειτουργία Ανάλυση

Έχουμε εξετάσει το γονίδιο προϊόν κάθε εξόνιο που επηρεάζονται από μια μετάλλαξης μετατόπισης πλαισίου, ως συνέπεια των παρατηρούμενων εισαγωγές νουκλεοτιδίων. Τα προκύπτοντα μεταφράσεις ακολουθία για κάθε hBD με επηρεαζόμενων προϊόντων εξόνιο που απεικονίζεται στα Σχήματα 3 και 4. Τα δύο ενθέσεις σε εξώνιο 2 του hBD-1, όπως αναφέρεται στον πίνακα 2, προκαλεί μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου μετά την ακολουθία σήματος πεπτίδιο (σχήμα 3Α) . Κατά συνέπεια, δεν ώριμη πρωτεΐνη hBD1 μπορούν να συντεθούν. Δεν επιτρέπεται η εισαγωγή βρέθηκε σε εξώνιο 2 για το ανθρώπινο γονίδιο hBD-2 (Σχήματα 3Β και 4Β). Πέντε προσθήκες βρέθηκαν στο γονίδιο hBD-3 σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Εισαγωγή 1 επιφέρει μετάλλαξης μετατόπισης πλαισίου από το υπόλειμμα 3 στην αλληλουχία σήματος πεπτιδίου, χωρίς ώριμο hBD-3 σύνθεση (Εικόνα 3C). Εισαγωγής 2 προκαλεί μια μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου που επηρεάζουν 5 από 6 C-τελικά κατάλοιπα, C63 → L, R64 → P, R65 → K και K66 → E (Σχήμα 3C). Επιπλέον, ένα παρεμβάλλονται ισολευκίνη βρίσκεται στην ακολουθία του μεταλλαγμένου HDB-3 στο C-τερματικό άκρο (Εικ 3C). Για την αξιολόγηση, ως συνέπεια της μετάλλαξης για τη δομή του hBD-3, φτιάξαμε ένα μοριακό μοντέλο hBD-3 με τις μεταλλάξεις που επηρεάζουν το C-τερματικό άκρο. Σχήμα 4C και 4D, απεικονίζει τις θέσεις των μεταλλάξεων σε ένα τρισδιάστατο μοντέλο του hBD-3 σε σύγκριση με την πρωτεΐνη άγριου τύπου. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4Γ και 4Δ, σε καρκινικό ιστό, μεταλλαγμένο 2 λείπει το τρίτο δισουλφιδικό δεσμό Cys63-Cys45, λόγω της μετάλλαξης Cys63 → Leu. Προβλέπουμε ότι αυτή η μεταλλαγμένη θα έχει μια λιγότερο σταθερή δομή από αυτή του άγριου τύπου πρωτεΐνη. S3 πίνακας παραθέτει τα αποτελέσματα των άλλων μεταλλάξεων. Έχουμε υπολογίσει τις προβλέψεις της σταθερότητας της πρωτεΐνης στη μοριακή δομή των hBD-3, χρησιμοποιώντας τόσο την ποπ μουσικής [31] και CUPSAT [32] προγράμματα. Σχ 3C και σχήμα 4Γ και 4Δ αναφέρει τα παρατηρούμενα τύπους μετάλλαξης μετατόπισης πλαισίου και των αντίστοιχων σταθεροποιητικά /αποσταθεροποιητικά αποτελέσματα στη δομή hBD-3. Μεταλλάξεις Cys63 → Leu και Arg64 → Pro επηρεάζουν τα αμινοξέα που είναι θαμμένα στη δομή και προσδιορίστηκαν να είναι ενεργειακά αποσταθεροποιητικές, γεγονός που υποδηλώνει μια μείωση της σταθερότητας της πρωτεΐνης. Μεταλλάξεις Arg66 → Lys και Lys67 → Pro επηρεάζουν διαλύτη εκτεθειμένα κατάλοιπα και ήταν αποφασισμένοι να είναι ενεργειακά σταθεροποίηση (Πίνακας 3). Η εισαγωγή 3 σχετικά με το εξόνιο 2 που παράγεται Lys67 → Glu και το πρόσθετο I68 υπόλειμμα, το οποίο δεν έχουν καμία επίδραση στη σταθερότητα δομής. Εισαγωγής 4-2 θα παράγει μια πρωτεΐνη με ένα επιπλέον C-τελική λευκίνη (Σχήμα 3C).

Οι μεταλλάξεις επισημαίνονται με κόκκινο χρώμα για κάθε γονίδιο hBDs.

Η

Η

Όσον αφορά hBD-4, εισαγωγή 1 μπορεί να προκαλέσει μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου αρχίζοντας δύο υπολείμματα μετά την ακολουθία πεπτιδίου σήματος, με αποτέλεσμα την αναστολή της ώριμης πρωτεϊνικής σύνθεσης hBD-4. Εισαγωγής 2 εισάγει μια μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου, αρχής γενομένης από κατάλοιπα 55-63, παράγει μια περικομμένη μεταλλαγμένη πρωτεΐνη hBD-4

Συζήτηση

καρκίνος του παχέος εντέρου αποτελεί ένα σημαντικό κίνδυνο για τη δημόσια υγεία? έχει βρεθεί ότι είναι η δεύτερη πιο συχνή κακοήθεια στη Σαουδική πληθυσμού [33] και κατέλαβε την δεύτερη θέση στα ποσοστά θανάτου από καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες [34]. Πολλές γενετικές και επιγενετικές μηχανισμοί έχουν προσδιοριστεί να συμβάλλουν στον καρκίνο του παχέος εντέρου, συμπεριλαμβανομένων των CpG υπερμεθυλίωση, μη-κωδικοποίησης RNA τροποποιήσεις, σωματικές μεταλλάξεις και λυσίνης ακετυλίωση των ιστονών [35]. Πολύ λίγες μελέτες έχουν εστιάσει στις επιγενετικές τροποποιήσεις υπεύθυνοι για την ανάπτυξη αυτής της νόσου. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε για πρώτη φορά μια σαφής σύνδεση μεταξύ hBD έκφρασης /παραγωγής και του καρκίνου του παχέος εντέρου. Τα δεδομένα μας έδειξαν σημαντική μείωση της hBDs σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς. Τα στοιχεία αυτά είναι ευνοϊκές για όσους έχουν αναφερθεί στο παρελθόν με hBD-1.Στην νεφρική ή καρκίνο του προστάτη [36-38] και επίσης σε στοματικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (OSCC) [39,40]. Είναι ενδιαφέρον ότι, παρόμοια δεδομένα αναφέρθηκαν με hBD-2, που δείχνει ότι hBD-2 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης μειώθηκαν σημαντικά στον καρκίνο σιελογόνων αδένων [41]. Άλλες μελέτες χρησιμοποιώντας διαφορετικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου έδειξαν επίσης ότι hBD-2 μπορεί να ελέγχει την ανάπτυξη των κυττάρων μέσω σύλληψη του G1 /S μετάβαση και την ενεργοποίηση του pRB σε κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα [42]. hBD-3 είναι γνωστό ότι καταστέλλει τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων [43]. Σε στοματικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, ανθρώπινη βήτα-αμυντίνων 1, 2 και 3 εμφανίζουν αντίθετα αποτελέσματα επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Ως εκ τούτου, hBD-1 θα μπορούσε να οριστεί ως ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο, ενώ hBD-2 και -3 μπορεί να είναι πρωτο-ογκογονίδια [44].

Η απορρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου αναμένεται να επηρεάσει 1-3% του ο μεταγραφικό [45], συμπεριλαμβανομένων έμφυτη ανοσία γονίδια των οποίων η έκφραση κατά κύριο λόγο τα κάτω ρυθμισμένη σε καρκινικούς ιστούς. Μεθυλίωσης του DNA των περιοχών προαγωγού CpG πλούσιων κερδίζει την αναγνώριση ως βασικός μηχανισμός στην αδρανοποίηση των ίδιων γονιδίων που εμπλέκονται ως έμφυτη γονίδια ασυλία και ογκοκατασταλτικών στα καρκινικά κύτταρα [46]. Ένας άλλος μηχανισμός για την απενεργοποίηση του γονιδίου είναι σωματικές μεταλλάξεις. Διατριβές μεταλλάξεις συμβάλλουν στο σχηματισμό του καρκίνου. Η υπόθεσή μας ήταν ότι τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου hBD στο παχύ έντερο καρκινικούς ιστούς μπορεί να οφείλεται στην παρουσία των επιγενετικών τροποποιήσεων, ιδίως μεταλλάξεις στα εξόνια hBD. Αντ ‘αυτού, δεν υπήρχε ανιχνεύσιμη μεθυλίωση σε όλες τις hBDs υποκινητές των φυσιολογικών ιστών του παχέος εντέρου και του καρκίνου του καρκίνου του παχέος εντέρου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό μπορεί να οφείλεται στο μειωμένο αριθμό των CpG νησίδων σε υποκινητές hBD. Έχουμε επιβεβαιώσει ότι σε ασθενείς με μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου, η πρωτεΐνη HBDs ήταν εντελώς απούσα. Το αυξανόμενο ενδιαφέρον για βήτα αμυντίνων σταθερά ενισχύοντας τις γνώσεις μας σχετικά με διάφορες πτυχές των μοντέλων τους θέσης και της έκφρασης των γονιδίων και των παραγόντων μεταγραφής εμπλέκονται στη ρύθμισή τους. Η γονιδιωματική δομή hBD αποτελείται από δύο εξώνια και ένα εσώνιο. Το πρώτο εξόνιο κωδικοποιεί το πεπτίδιο σήμα, και ο δεύτερος κωδικοποιεί ένα ώριμο πεπτίδιο προηγείται μια σύντομη ανιονικό προπεπτίδιο. Εκτός από την κατοχή παρόμοια αναδίπλωση πρωτεΐνης και δομή, τις δομές του hBD-1, -2, και -3 έχουν επίσης αποκαλύψει ότι κάθε πρωτεΐνη σταθεροποιείται από τρεις δισουλφιδικές γέφυρες μεταξύ διατηρημένων κυστεϊνών. Σε αυτή τη μελέτη, πολλές νέες μεταλλάξεις, ενθέσεις γενικά, ανιχνεύθηκαν σε διαφορετικές εξώνια (1/2). Αυτές οι μεταλλάξεις συμβάλλουν σε σημαντικές αλλαγές στην πρωτεΐνη δομή του hBDs (δηλαδή, hBD-1, hBD-3 και hBD-4). hBD-1 μεταλλάξεων και μετάλλαξης 1 του hBD-3 είναι τα πλέον επιβλαβή επειδή οδηγούν σε κολοβωμένη προ-πρωτεϊνών με καμία προβλεπόμενη ώριμη πρωτεϊνική σύνθεση hBD-1. hBD-3 πρωτεΐνη μετάλλαξης 2 είναι σε μεγάλο βαθμό αποσταθεροποιηθεί λόγω της απουσίας μιας γέφυρας δισουλφιδίου που προκαλείται από την υποκατάσταση του Cys63 → Leu. Επιπλέον, στην ίδια μετάλλαξη, Lys67 → Glu υποκατάσταση εισάγει μια αρνητικά φορτισμένη, όξινο κατάλοιπο σε ένα θετικά φορτισμένο, υδρόφοβο Ο-τερματικό τμήμα. Όπως προσδιορίστηκε ότι η συσσωμάτωση των θετικών φορτίων στο Ο-τερματικό τμήμα είναι σημαντική για αντιμικροβιακή δραστηριότητα [47], η εισαγωγή ενός αρνητικά φορτισμένου υπολείμματος προβλέπεται να επηρεάσει τη λειτουργία της πρωτεΐνης. Και οι δύο hBD-4 μεταλλάξεις προβλέπεται να έχουν κανένα λειτουργικό πεπτίδιο λόγω των αλλαγών στην αλληλουχία της πρωτεΐνης. Αριθ πρόβλεψη δομής θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί για αυτό το μεταλλαγμένο επειδή η δομή του δεν είναι διαθέσιμο. Οι άλλες μεταλλάξεις που βρέθηκαν στην περιοχή του υποκινητή hBD προβλέπεται να επηρεάσει την έκφραση /σταθερότητα των ρυθμιστικών περιοχών (5’UTR και 3’UTR) σε ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου, γεγονός που εξηγεί γιατί η έκφραση αυτών των hBDs μειώθηκαν σε ιστούς καρκίνου του κόλου σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς. Αρκετές άλλες μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν στα εσώνια όλων hBDs, η οποία είτε υπήρχε κατά κύριο λόγο σε όλους τους ιστούς του Saudi πληθυσμό (φυσιολογικών και καρκινικών) ή βρέθηκαν μόνον σε ιστούς από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτές οι μεταλλάξεις ιντρονίου μπορεί να έχει ένα πιθανό ρόλο στον καρκίνο του παχέος εντέρου, και το εύρημα αυτό απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Επειδή hBDs διαδραματίσει ενεργό ρόλο στο έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα, η παρουσία των μεταλλάξεων εξόνιο στο hBDs μπορεί να οδηγήσει σε απορύθμιση της φυσικής ανοσίας και στη συνέχεια να παρεμποδίσει το ανοσοποιητικό επιτήρησης κατά την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

Γενικά αντιδραστήρια

Η σκάλα RNA λήφθηκε από τεχνολογίες Ambion /ζωή (Burlington, ON, Καναδάς). κιτ DNA /RNA ήταν από την Qiagen (Hilden, Germany). Εκκινητές ελήφθησαν από τις τεχνολογίες της Ζωής /Invitrogen (Burlington, ON, Καναδάς). Το cDNA υψηλής χωρητικότητας ανάστροφης κιτ μεταγραφής ήταν από την Applied Biosystems (Warrington, USA). SYBR Green λήφθηκε από την Bio-Rad (Mississauga, ΟΝ, Canada). hBD αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA, USA.). hBD-1 (Ν-20) είναι αντι-κουνελιού IgG για Ν τερματικό, hBD-2 (C-17) είναι αντι-αίγας IgG για Ν τερματικό. hBD-3 (FL-67) είναι αντι-κουνελιού IgG για Ν τερματικό. hBD-4 (FL-72) είναι αντι-κουνελιού IgG για Ν τερματικό. Το Mega κιτ BACE για αλληλουχίας αποκτήθηκε από την GE Healthcare Life Science (Buckinghamshire, Ηνωμένο Βασίλειο), και το κιτ EpiTect Bisulfite για μεθυλίωσης του DNA λήφθηκε από Qiagen (Τορόντο, Καναδάς).

Τα δείγματα ασθενών

τα δείγματα συλλέχθηκαν από 40 ασθενείς που διαγνώστηκαν ότι έχουν καρκίνο του παχέος εντέρου (24 άνδρες και 16 γυναίκες, μεταξύ 45 και 75 ετών, με μέση τιμή 60 ± 16,56 χρόνια για τους άντρες και 55 ± 13,74 χρόνια για τις γυναίκες και 40 ίδιας ηλικίας κανονικούς ελέγχους με δεν τον καρκίνο. Η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review της Επιτροπής Δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου King Khalid στο Ριάντ, αριθμός KSA 12/3352 /IRB. Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες.

Κανονική ιστούς το μακρινό περιθώριο στον όγκο συλλέχθηκαν κατά τη στιγμή της ενδοσκόπησης. η διάγνωση του καρκίνου βασίστηκε σε καθιερωμένες κλινικές, ενδοσκοπικές, ακτινολογικών και ιστολογικών κριτηρίων. κλινικά και δημογραφικά χαρακτηριστικά καταγράφηκαν, μεταξύ των οποίων η ηλικία κατά τη διάγνωση, το φύλο, το οικογενειακό ιστορικό, το κάπνισμα συνήθειες, τη συμπεριφορά της νόσου, τη θέση της νόσου, καθώς και την ανάγκη για χειρουργική (Πίνακας 1). Τα δείγματα ιστού που χρησιμοποιούνται για την εκχύλιση RNA, ανοσοϊστοχημεία, και γονιδιώματος εκχυλίσεις DNA.

Δείγματα ιστού που πρέπει να χρησιμοποιούνται για την ανάλυση του RNA ήταν αμέσως βυθίζεται σε RNA διάλυμα αργότερα (Ambion, Courtabeuf, France).

απομόνωση RNA, αντίστροφη μεταγραφή και την έκφραση του γονιδίου με πραγματικού χρόνου RT-PCR

το ολικό RNA ιστού εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το DNA /RNA Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany). Η συγκέντρωση, καθαρότητα, και την ποιότητα του απομονωμένου RNA ήταν όλοι προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα Bio-αναλυτή Agilent 2100 και κιτ ανάλυσης Agilent Μικρό RNA σύμφωνα με τις οδηγίες που παρέχονται από τον κατασκευαστή (τεχνολογίες Agilent, Waldbronn, Germany).

Το RNA (1 μg από κάθε δείγμα) μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας ένα cDNA υψηλής χωρητικότητας ανάστροφης μεταγραφής kit (Applied Biosystems, Warrington, USA). Οι συνθήκες για την παρασκευή των προπλασμάτων cDNA για ανάλυση PCR ήταν 10 λεπτά στους 25 ° C, 2 ώρες στους 37 ° C, και 5 λεπτά στους 85 ° C. Ποσοτική PCR (qPCR) εκτελέστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [48-50]. Τα ποσά των μεταγραφών mRNA μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης PCR Applied Biosystems 7500 Fast πραγματικό χρόνο. Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας PCR SYBR Green Supermix από την Applied Biosystems. Οι εκκινητές προστέθηκαν στο μίγμα της αντίδρασης σε μια τελική συγκέντρωση 250 ηΜ. Πέντε μικρολίτρα από κάθε δείγμα cDNA προστέθηκαν σε ένα 20-μΙ μίγματος PCR που περιέχει 12.5 μΐ SYBR Green Supermix και 0,5 μΙ ειδικών εναρκτήρων (HBDs ή GAPDH (S1 Πίνακας)) και 7 μΙ RNase- /άνευ ϋΝάσης ύδωρ. Κάθε αντίδραση διεξήχθη σε 7500 γρήγορο πραγματικού χρόνου PCR Thermal Cycler. Οι συνθήκες θερμικού κύκλου για τους hBDs καθορίστηκαν ως 5 λεπτά στους 95 ° C, που ακολουθείται από 36 κύκλους των 15 s στους 95 ° C, 30 s στους 63 ° C (εκτός από HBD3 στους 52 ° C), και 30 s στους 72 ° C, με κάθε αντίδραση έγινε εις τριπλούν. Η ειδικότητα του κάθε ζεύγους εκκινητή επαληθεύτηκε με την παρουσία ενός μόνο κορυφή θερμοκρασία τήξης. GAPDH παράγεται ομοιόμορφη επίπεδα έκφρασης μεταβάλλοντας κατά λιγότερο από 0,5 CTs μεταξύ συνθήκες δείγμα και ως εκ τούτου χρησιμοποιείται ως γονίδιο αναφοράς για την παρούσα μελέτη. Τα ενισχυμένα προϊόντα τρέχτηκαν σε πηκτή αγαρόζης για να επιβεβαιωθεί ότι δεν υπήρχαν πλαστή προϊόντα ενισχύθηκαν κατά την διάρκεια των κύκλων. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τη χρήση του 2

-ΔΔCt (Livak) σε σχέση μέθοδος έκφρασης.

Παρασκευή βιοψιών για ανοσοϊστοχημεία

εγκλεισμένα σε παραφίνη τμήματα ιστού καρκίνου του παχέος εντέρου και του φυσιολογικού ιστού του παχέος εντέρου δείγματα κόπηκαν σε 3-μm πάχους τομές. Οι τομές τοποθετήθηκαν σε αλατούχο επικαλυμμένα πλακίδια και επωάζονται για 15 έως 20 λεπτά σε ένα φούρνο θερμού αέρα στους 60 ° C. Τομές ιστού αποπαραφινοποιήθηκαν με EZ Prep (Ventana, Arizona, USA) στους 75 ° C, θερμική προ-επεξεργασία στο Cell Conditioning 1 (CC1? Ventana, Arizona, USA) χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο «πρότυπο κλιματισμού κύτταρο» για ανάκτηση αντιγόνου σε 100 ° C, και στη συνέχεια επωάστηκαν με μία σταγόνα διαλύματος αναστολέα για τέσσερα λεπτά στους 37 ° C και στη συνέχεια πλένονται. Οι πλάκες επωάστηκαν για 32 λεπτά στους 37 ° C με ένα από τα ακόλουθα αντισώματα (αραιωμένα 1: 100): αντι-ανθρώπινο-hBD-1, αντι-ανθρώπινο-hBD-2, αντι-ανθρώπινο-hBD-3 ή αντι- ανθρώπου-hBD-4 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Στη συνέχεια, προστέθηκε το δευτερεύον Ultraview αντίσωμα καθολική HRP πολυμερές. Η immunolocalizedhBD-1, hBD-2, hBD-3 και hBD-4 πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μία αντίδραση DAB χαλκού-ενισχυμένη. Αρνητικά κενό μάρτυρες παρασκευάστηκαν κατά τη διάρκεια της χρώσης, στην οποία το πρώτο αντίσωμα παραλείφθηκε και αντικαταστάθηκε με PBS. Οι πλάκες αντι-βάφτηκαν με Αιματοξυλίνη II και του Αντιδραστηρίου Bluing (Ventana, Arizona, USA) για 30 λεπτά στους 4 ° C, και στη συνέχεια, το υγρό κάλυμμα ολίσθησης (LCS) προστέθηκε σαν ένα φράγμα μεταξύ του υδατικού αντιδραστήρια και αέρα για να εμποδιστεί η εξάτμιση, παρέχοντας έτσι δείγματος σταθερότητας. Μετά από αυτό, τα δείγματα για τοποθέτηση σε DPX αφυδατώθηκαν με διαδοχικές πλύσεις σε διαβαθμισμένες αλκοόλες: 70% αιθανόλη, 96% αιθανόλη και απόλυτη αιθανόλη και δύο αλλαγές σε ξυλόλιο. Μετά από αυτό, έχουμε προσθέσει μια μικρή σταγόνα DPX με το υπόδειγμα που ανέρχονται μέσα μαζικής ενημέρωσης. Τα τμήματα ανοσο-χρώση αναλύθηκαν με ένα ελαφρύ μικροσκόπιο της Olympus BX51 και ψηφιακή φωτογραφική μηχανή DP72 Ολύμπου (μεγέθυνση 200Χ και 400Χ) (Olympus America Inc, Κέντρο Valley, PA, USA).

Οι βαθμολογίες δόθηκαν ανάλογα με το επίπεδο και το εύρος του χρώματος ως εξής: 0 πόντους, κανένα θετικό χρώμα? 1 πόντο, & lt? 20% θετική χρώση? 2 πόντους, 21-50% θετική χρώση? 3 πόντους, 51-75% θετική χρώση? και 4 μονάδες, & gt?. 75% θετική χρώση

Bisulfite θεραπεία

Για να ελέγξετε την κατάσταση μεθυλίωσης της περιοχής προαγωγού θειώδους επεξεργασίας και ανάκτησης των δειγμάτων πραγματοποιήθηκαν με το κιτ EpiTect Bisulfite (QIAGEN) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 2 μα DNA σε όγκο 20 μL χρησιμοποιήθηκε για κάθε αντίδραση και αναμίχθηκε με 85 μι διθειώδες μίγματος και 35 μL DNA προστατεύουν ρυθμιστικού. Μετατροπή διθειώδους εκτελέστηκε σε θερμοκυκλοποιητή ως εξής: 99 ° C για 5 λεπτά, 60 ° C για 25 λεπτά, 99 ° C για 5 λεπτά, 60 ° C για 85 λεπτά, 99 ° C για 5 λεπτά, 60 ° C για 175 min και 20 ° C επ ‘αόριστον. Η κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA ανακτήθηκε με στήλη σπιν EpiTect και ακολούθως αλληλουχίας για να επιβεβαιωθεί η αποτελεσματικότητα της διθειώδους μετατροπής. Το εκλουσμένο γονιδιωματικό DNA χρησιμοποιήθηκε για ενίσχυση περιοχή υποκινητή και αλληλούχιση.

αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης και αλληλούχιση

Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από όλα τα δείγματα χρησιμοποιώντας κιτ DNA από Qiagen (Hilden, Germany). Η συγκέντρωση DNA του κάθε δείγματος μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο υπεριώδους NanoVue. Όλα τα εξόνια των hBDs (1, 2, 3 και 4) ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) (S2 πίνακα). Τα ζεύγη εκκινητών τα εμπρός και αντίστροφη εξόνιο που χρησιμοποιούνται στις αντιδράσεις PCR που περιγράφονται στο S2 Πίνακα. Το μίγμα PCR περιείχε 50 ng DNA, 5 pmol /L κάθε εκκινητή, 2.5nmol /mL το καθένα dNTP, και 1,25 μονάδες Taq DNA πολυμεράσης σε 20 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος με 0,04 μmol /L Mg2 +. Μετά από ένα αρχικό στάδιο μετουσίωσης στους 94 ° C για 5 λεπτά, διεξήχθησαν 35 κύκλοι PCR, η οποία περιελάμβανε 45 s για μετουσίωση στους 94 ° C, 30 s για ανόπτηση στους 60 ° C, και 45 δευτερόλεπτα επέκτασης στους 68 ° C. Τα προϊόντα της PCR αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1%. Μετά την παρατήρηση σαφή και ακριβή μεγέθους συγκροτήματα, τα προϊόντα ενίσχυσης στη συνέχεια καθαρίστηκαν και αλληλουχήθηκαν απευθείας σε ένα σύστημα ανίχνευσης ακολουθίας Sanger (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, ΡΑ, USA).

Δομική ανάλυση των μεταλλάξεων

το 3D δομή του ανθρώπινου βήτα αμυντίνων (Protein Data Bank εισόδου 1KJ6) [51] χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η επίδραση των μεταλλάξεων μετατόπισης πλαισίου επιλεγμένου γονιδίου για τη δομή του ενζύμου.