Αφηρημένο

Ο καρκίνος του προστάτη είναι μια κλινικά ετερογενής νόσος, που κυμαίνονται από νωχελικός ασυμπτωματική νόσο σε πολύ επιθετικό μεταστατικό και απειλητική για τη ζωή μορφές της νόσου. Distant μετάσταση αποτελεί την κύρια θανατηφόρος αιτία του καρκίνου του προστάτη. Η πιο κρίσιμη κλινική πρόκληση στη διαχείριση των ασθενών είναι η αναγνώριση των εν λόγω ατόμων σε κίνδυνο ανάπτυξης μεταστατικής νόσου. Για την κατανόηση των μοριακών μηχανισμών της μετάστασης του καρκίνου του προστάτη και τον προσδιορισμό δεικτών με μεταστατικό δυναμικό, έχουμε αναλύσει την έκφραση της πρωτεΐνης σε δύο συγγενικά κύτταρα καρκίνου του προστάτη γραμμές PC3-Ν2 και PC3-ML2 χρησιμοποιώντας ισοβαρή ετικετών για σχετική και απόλυτη επισήμανση ποσοτικοποίηση και πολυδιάστατη ταυτοποίηση πρωτεϊνών υγρή χρωματογραφία τεχνολογία υποβοηθούμενη από μήτρα εκρόφησης λέιζερ ιονισμού διαδοχικής φασματομετρίας μάζας. PC3-N2 είναι ταπεινός μεταστατικό ενώ PC3-ML2 εξαιρετικά μεταστατικό. Ένα σύνολο 1.756 πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν στις αναλύσεις με 130 πρωτεΐνες που δείχνει τα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης (ρ & lt? 0,01) στις δύο κυτταρικές σειρές. Από αυτές, 68 πρωτεΐνες βρέθηκαν να είναι σημαντικά πάνω ρυθμισμένα ενώ 62 είναι σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε κύτταρα PC3-ML2 σύγκριση με PC3-N2 κύτταρα. Η προς τα πάνω ρύθμιση plectin και βιμεντίνης, που ήταν η πιο σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων επικυρώθηκαν από κηλίδα Western και λειτουργική ενδιαφέρον τους σε σχέση με την εισβολή και τη μετανάστευση καθορίστηκε με γονιδιακή σίγηση siRNA. Για τις γνώσεις μας, αυτή η μελέτη είναι η πρώτη που αποδεικνύει ότι πάνω ρύθμιση της βιμεντίνης και plectin έκφραση συσχετίζεται θετικά με την εισβολή και τη μετάσταση των ανδρογόνων-ανεξάρτητο PCA

Παράθεση:. Burch TC, Watson MT, Nyalwidhe JO ( 2013) Μεταβλητό μεταστατικός Δυναμικά συσχετίζονται με Διαφορικό Plectin και βιμεντίνης Έκφραση σε συγγενικά ανδρογόνων Ανεξάρτητη κύτταρα του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 8 (5): e65005. doi: 10.1371 /journal.pone.0065005

Επιμέλεια: Gnanasekar Munirathinam, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6η Σεπτεμβρίου 2012? Αποδεκτές: 24 Απριλίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: May 22, 2013

Copyright: © 2013 Burch et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από κεφάλαια εκκίνησης από την Ανατολική Virginia Medical School (EVMS) με τον Δρ Julius O. Nyalwidhe. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

στην Ευρώπη και τις ΗΠΑ, τον καρκίνο του προστάτη (PCA) είναι ο συχνότερος καρκίνος στους άνδρες και η τρίτη πιο κοινή αιτία του καρκίνου που σχετίζονται-θανάτους. Το 2011 υπήρχαν περίπου 240.890 νέες περιπτώσεις και 33.720 θάνατοι από την ασθένεια στις ΗΠΑ [1]. Για τις τελευταίες 2 δεκαετίες, η έγκαιρη ανίχνευση και διαλογή προστάτη έχει βασιστεί κυρίως στην ανίχνευση του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) σε ορό εκτός από δακτυλική εξέταση (DRE), και ιστολογική εκτίμηση του transrectal υπερήχων (TRUS) καθοδηγούμενη βιοψία υλικό [2]. Αν και οι περισσότερες από τις περιπτώσεις ανιχνεύονται σε πρώιμο στάδιο, η ασθένεια είναι κλινικά ετερογενής, που κυμαίνονται από νωχελικός ασυμπτωματική ασθένεια σε πολύ επιθετικό μεταστατικών και απειλητικές για τη ζωή μορφές της νόσου. Πάνω από το 7% των περιπτώσεων που εντοπίστηκαν τελικά να αναπτύξει μακρινό μεταστατική νόσο [3]. Η πρόγνωση για αυτούς τους άνδρες είναι κακή και έχουν ένα μέσο χρόνο επιβίωσης 24 σε 48 μήνες [3]. Η πιο κρίσιμη κλινική πρόκληση για τη διαχείριση της νόσου του προστάτη είναι να καθοριστεί ποια από τις δύο αυτές διαφορετικές μορφές της νόσου ο ασθενής αναπτύξει. Η πιο κοινή θέση για προστάτη μετάσταση είναι τα οστά? -90% Των ασθενών με προχωρημένο προστάτη έχουν σκελετικών μεταστάσεων [4]. Οστών μεταστάσεις προστάτη είναι σχεδόν ανίατη και συνδέεται με σοβαρή νοσηρότητα πριν από το θάνατο, αυτές περιλαμβάνουν πόνο στα οστά, παθολογικά κατάγματα, σύνδρομα συμπίεσης νεύρων, και υπερασβεστιαιμία [4]. Επί του παρόντος, οι διαθέσιμες θεραπευτικές επιλογές για τους ασθενείς με μεταστατική νόσο είναι παρηγορητική. Η πρόγνωση /διάγνωση των οστών μεταστατικών βλαβών αυτή τη στιγμή καθορίζεται από την απεικόνιση χρησιμοποιώντας τη σάρωση των οστών ισότοπο, αξονική τομογραφία (CT), μαγνητική τομογραφία (MRI), ή βιοψία οστού. Ο προσδιορισμός της βιοψίας του προστάτη ή με βάση βιοδεικτών (ες) του ορού για την πρόβλεψη της ευαισθησίας των ανδρών να αναπτύξουν μετάσταση θα δυνητικά καλύτερη διάκριση των πιο επιθετικό μεταστατικό μορφές της νόσου και έτσι παρέχουν καλύτερη μεταχείριση και ευκαιρίες κλινική διαχείριση της νόσου.

με τα χρόνια η χρησιμότητα του PSA ως βιοδείκτη για τον καρκίνο του προστάτη υπήρξε αμφιλεγόμενη σε σχέση με την ανικανότητά της να διακρίνει βραδείας από επιθετικές μορφές της νόσου [5], [6]. PSA συνδέεται επίσης με υψηλά ποσοστά ψευδώς θετικών και ψευδώς αρνητική δοκιμασία, καθώς τα επίπεδα μπορεί να είναι αυξημένα σε μη καρκινικό συνθήκες του προστάτη, συμπεριλαμβανομένης καλοήθους προστατικής υπερπλασίας (ΒΡΗ) και προστατίτιδας [7] – [10]. Πρόσφατα η ΗΠΑ Υπηρεσία Πρόληψης Task Force (USPSTF) συνιστάται κατά της PSA προσυμπτωματικό έλεγχο για PCA σε όλες τις ηλικίες δηλώνοντας ότι τα οφέλη δεν αντισταθμίζουν τις επιβλαβείς συνέπειες της διαλογής και της επεξεργασίας [11]. Αυτή η αδυναμία να προβλέψει με ακρίβεια την επιθετικότητα του καρκίνου του προστάτη βασίζεται αποκλειστικά στην τυπική κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά υπογραμμίζει σαφώς την ανάγκη να διερευνηθεί η ικανότητα των βιοδεικτών όγκου με βάση την ενίσχυση πρόβλεψη αποτελέσματος σε βιοψία και να κατανοήσουν τη μοριακή βάση της μετάστασης του καρκίνου του προστάτη. Ως εκ τούτου, επιπλέον βιοδείκτες χρειάζονται επειγόντως για να βελτιωθεί η διαγνωστική ειδικότητα του PSA και να προβλέψει τη δυνατότητα εξέλιξης της νόσου.

Για την καλύτερη κατανόηση των μοριακών μηχανισμών της μετάστασης του καρκίνου του προστάτη, είναι σημαντικό να προσδιοριστούν οι δείκτες που σχετίζονται με μεταστάσεων. Proteomics έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα χρήσιμο και επιτυχή προσέγγιση σε όγκο διαλογής και μεταστάσεις πρωτεϊνικών δεικτών [12] που σχετίζονται. Υπάρχουν αρκετές πρωτεομική τεχνολογίες που έχουν εφαρμοστεί στον προσυμπτωματικό έλεγχο και εντοπισμό πιθανών δεικτών καρκίνου. Οι «ισοβαρή Ετικέτες για σχετική και η απόλυτη ποσοτικοποίηση» (iTRAQ) πλατφόρμα έχει τα πλεονεκτήματα του να είναι σχετικά υψηλή απόδοση και μπορεί να πολυπλέκονται για να παρέχει πληροφορίες σχετικά με πεπτίδιο /πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση και ταυτοποίηση, όπως αναφέρθηκε σε προηγούμενες μελέτες [13], [14] . Σε αυτή την προσέγγιση πολλαπλά δείγματα από διαφορετικές των πρωτεϊνών μειώνεται, αλκυλιωμένα και πρωτεολυτικά πέψη για την παραγωγή πεπτιδίων. Τα πεπτίδια επισημαίνονται με ένα σύνολο αντιδραστηρίων iTRAQ (σε μορφή 4 ή 8-plex), συνενώθηκαν και κλασματοποιήθηκε με ισχυρή ανταλλαγή κατιόντων (SCX). Τα κλάσματα στη συνέχεια αναλύονται με υγρή χρωματογραφία διαδοχικής φασματομετρίας μάζας (LC-MS /MS), με τις προκύπτουσες φάσματα μάζας παροχή πληροφοριών ακολουθίας (από τα πεπτιδικά θραύσματα), και η σχετική ποσοτικοποίηση (από τα ιόντα ομάδα αναφοράς).

σε μια προσπάθεια να αναγνωριστούν νέες πρωτεΐνες που σχετίζονται με την μεταστατική εξέλιξη του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη, έχουμε πραγματοποιήσει μια 4-plex ανάλυση iTRAQ χρησιμοποιώντας δύο συγγενικά κύτταρα καρκίνου του προστάτη PC3 γραμμές-Ν2 και PC3-ML2 τα οποία έχουν διαφορετικές μεταστατικό δυναμικό. PC3-N2 είναι ταπεινός μεταστατικό ενώ PC3-ML2 είναι ιδιαίτερα μεταστατικό. Μετά τη συγκριτική ανάλυση ποσοτικών δεδομένων, βρέθηκαν να είναι σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενο σε κύτταρα PC3-ML2 σε σύγκριση με PC3-N2 κύτταρα πολλοί υποψήφιοι. Δύο από τους υποψηφίους που προσδιορίζονται ως σημαντικά up-ρυθμίζονται σε PC3-ML2 είναι plectin και βιμεντίνης. Αυτές οι πρωτεΐνες ερευνήθηκαν περαιτέρω με κηλίδα Western και siRNA νοκ ντάουν. Τα επίπεδα έκφρασης συσχετίζονται με ανοσοϊστοχημεία εικόνες από την κανονική και το αδενοκαρκίνωμα του προστάτη δείγματα ιστών. Τα διαφορικά ρυθμίζονται πρωτεΐνες που εντοπίζονται στη μελέτη, συμπεριλαμβανομένων plectin και βιμεντίνης, συζητήθηκαν στο πλαίσιο της σημασίας τους για την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη.

Πειραματικές Διαδικασίες

Υλικά | τροποποιημένων

ϋυΐββοοο Eagle media (ϋΜΕΜ) και εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), αντιβιοτικά-αντιμυκητιακά, 4-12% γέλες NuPAGE® Bis-Tris και 2 χ Laemmli ρυθμιστικού ήταν από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Πλήρεις Αναστολείς πρωτεάσης ™ αγοράσθηκαν από τη Roche Applied Sciences (Indianapolis, ΙΝ), βαθμού αλληλούχιση θρυψίνη ήταν από την Promega (Madison, WI), και μεμβράνη Immobilon-FL PDVF ήταν από την Millipore (Billerica, ΜΑ). BCA κιτ δοκιμασίας συγκέντρωση πρωτεΐνης και το ρυθμιστικό διάλυμα μπλοκαρίσματος χωρίς πρωτεΐνες ήταν από την Thermo Scientific (Rockford, IL). Τα πρωτογενή αντισώματα για βιμεντίνη (ab20346), plectin (ab83497) ήταν από Abcam (Boston, MA), και plectin (sc-7572), GAPDH (SC-25778), pERK 1/2 (Thr 202 /Tyr 204) SC- 16982, ERK 1/2 (MK1) SC-135900, και CDC2 Ρ34 (sc 53) ήταν από την Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). CDC2 (Cat # 9112) αντίσωμα ήταν από τη Cell Signaling Technology. IRDye συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα (αίγας αντι-ποντικού IR680 Cat. # 926 – 3.220, Goat αντι IR800CW κουνέλι Cat. # 926 έως 32211, Goat anti IR680 κουνέλι (Cat. # 926-32221), Donkey αντι-κατσίκας IR680 (Cat. # 926-32224), Goat αντι-ποντικιού IR800CW (Cat. # 926 – 3.220) ήταν από Li-COR Βιοεπιστημών (Lincoln, PA) και Alexa Fluor δευτερογενή αντισώματα για μικροσκοπία ανοσοφθορισμού συνεστιακή ήταν από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Έλεγχος siRNA- Α (SC-37007), βιμεντίνη (h) (sc-29522) και plectin siRNA (h) (sc-29453) ήταν από την Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA).

κυτταρικές σειρές και Cell Culture

Γονική PC3 είχαν αρχικά ληφθεί από μια σκελετική μετάσταση σε ένα ασθενή με πρωτοπαθή αδενοκαρκίνωμα του προστάτη. Οι δύο sublines PC3-N2 και PC3-ML2 ήταν ευγενική δωρεά σε μας από την ομάδα του Δρ Stearns »στο Πανεπιστήμιο Drexel και αναπτύχθηκαν όπως περιγράφεται από τους Wang και Stearn [15]. Οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν με βάση την διεισδυτικότητα τους

in vitro

και μεταστατικό δυναμικό

in vivo

. Αμφότερα τα κύτταρα ήταν ογκογόνα όταν ενίεται υποδορίως σε SCID ποντίκια. Ωστόσο, N2 κύτταρα δεν μπόρεσαν να μεταναστεύσουν μέσω μιας μεμβράνης Matrigel επικαλυμμένα

in vitro

καθώς επάγουν μεταστάσεων σε ποντίκια SCID, ενώ τα κύτταρα ML2 ήταν ιδιαίτερα επεμβατική

in vitro

και επάγεται σκελετικές μεταστάσεις σε περισσότερο από το 80% των περιπτώσεων [15] – [17]. PC3 κύτταρα-N2 και PC3-ML2 καλλιεργήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% αντιβιοτικά στους 37 ° C με 5% CO

2. Τα κύτταρα στη συνέχεια διαχωρίστηκαν από την πλαστική επιφάνεια, χρησιμοποιώντας 5 mM EDTA σε PBS. Το μη-ένζυμο ρυθμιστικό διάστασης διατηρεί μορίων κυτταρικής επιφάνειας και η κυτταρική βιωσιμότητα.

Protein Extraction πέψη και ITRAQ Labeling

Για το σύνολο των πειραμάτων κυτταρικής λύσης PC3-N2 και τα κύτταρα PC3-ML2 καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο ανάπτυξης μέχρι 80% συρροή. Τα κύτταρα αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας 5 mM EDTA σε PBS και πλύθηκαν με PBS και το σφαιρίο επαναιωρήθηκε σε 160 μΐ ρυθμιστικό διάλυμα διάλυσης που περιείχε 100 mM ΝΗ

4HC0

3 και TFE (1:01 ν /ν). Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υπερήχους για 20 δευτερόλεπτα τρεις φορές και επωάζονται στους 60 ° C για 1 ώρα. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν για να απομακρυνθούν τα κυτταρικά υπολείμματα και τα μη σπασμένα κύτταρα πριν από τη συλλογή του υπερκειμένου. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με δοκιμασία BCA και κανονικοποιήθηκε για κάθε δείγμα. 100 μα κλάσματα των δειγμάτων ξηραίνονται σε SpeedVac και υποβλήθηκαν σε πέψη με θρυψίνη και την επισήμανση του πεπτιδίου με αντιδραστήρια iTRAQ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (iTRAQ Αντιδραστήρια Multiplex Kit? ABSciex, Foster City, CA). Εν συντομία, 100 μg των πρωτεϊνών ήταν ξηραίνεται υπό κενό και επαναιωρήθηκε σε 20 μΐ ρυθμιστικού διαλυτοποίησης και 1 μΙ μετουσιωτή σε RT. Δείγματα μειώθηκαν, αλκυλιώνεται και επεξεργασία με θρυψίνη με 5 μg τροποποιημένης τρυψίνης ποιότητος αλληλούχησης (Promega, Madison, WI, USA) για 18 ώρες στους 37 ° C. Η θρυψίνη πέψη δείγματα σημάνθηκαν με τέσσερα διαφορετικά αντιδραστήρια iTRAQ διαλύονται σε 70 μΐ αιθανόλης σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Οι αντιδράσεις αποσβέστηκε με 10 mM γλυκίνη. Τα δείγματα ήταν ως εξής: Τα δείγματα PC3-N2 κυττάρων με 114 και 115 ετικέτες και τα δείγματα PC3-ML2 με 116 και 117 ετικέτες. Η στρατηγική αυτή παρέχει εσωτερική τεχνική επαναλήψεις για τους δύο τύπους δειγμάτων. Όλα τα τέσσερα σημασμένα δείγματα συνενώθηκαν, ξηραίνεται υπό κενό και κλασματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μία ισχυρή κατιονανταλλακτική στήλη (SCX).

2D-LC Separations

Στην πρώτη διάσταση, SCX διαχωρισμοί διεξήχθησαν σε ένα HPLC σύστημα παθητικοποιημένο Waters 600Ε, χρησιμοποιώντας μία στήλη mm πολυσουλφοαιθυλ ασπαρταμιδίου 4. × 250 (ΡοΙνΕΟ, Columbia, MD) σε ρυθμό ροής 1 ml /min. Ρυθμιστικό Α περιείχε 10 mM μυρμηκικό αμμώνιο, ρΗ 2.7, σε 20% ακετονιτρίλιο /80% νερό. Ρυθμιστικό Β περιείχε 666 mM μυρμηκικού αμμωνίου, ρΗ 2.7, σε 20% ακετονιτρίλιο /80% νερό. Η κλίση ήταν ρυθμιστικό Α σε 100% (0-22 λεπτά μετά την έγχυση του δείγματος), 0% → 40% Ρυθμιστικό Β (16-48 λεπτά), 40% → 100% Ρυθμιστικό Β (48-49 λεπτά), στη συνέχεια ισοκρατικό 100% Ρυθμιστικό Β (49-56 λεπτά), στη συνέχεια σε 56 λεπτά επανέρχεται στο 100% Α για την εκ νέου εξισορρόπηση για την επόμενη ένεση. Τα πρώτα 26 ml του μέσου έκλουσης (που περιέχει όλο ροή διαμέσου κλασμάτων) συνδυάστηκε σε μία κλάσμα, και στη συνέχεια συλλέχθηκαν 14 επιπλέον 2-ml κλασμάτων. Όλα 15 αυτών των κλασμάτων SCX ξηράνθηκαν κάτω εντελώς για τη μείωση του όγκου και για την απομάκρυνση των πτητικών αλάτων μυρμηκικού αμμωνίου, στη συνέχεια επαναιωρήθηκε σε 9 μΐ 2% (ν /ν) ακετονιτρίλιο, 0,1% (ν /ν) τριφθοροοξικό οξύ και διηθείται πριν από τη ανάστροφης φάσης διαχωρισμού C18 λεπτής ροής-LC. Για την 2η διάσταση διαχωρισμό με ανάστροφης LC λεπτής ροής φάση, κάθε κλάσμα SCX αυτομάτως εγχύθηκε σε μια στήλη Chromolith CapRod (150 × 0,1 mm, Merck) χρησιμοποιώντας 5 μl εγχυτήρα βρόχου σε ένα σύστημα MALDI Εντοπισμός Tempo LC (ΑΒΙ-MDS /Sciex) . Ρυθμιστικό Ο ήταν 2% ακετονιτρίλιο, 0,1% τριφθοροξικό οξύ, και Ρυθμιστικό Α ήταν 98% ακετονιτρίλιο, 0,1% τριφθοροξικό οξύ. Η βαθμιδωτή έκλουση ήταν 95% C /5% D (2 μΙ ανά λεπτό ταχύτητα ροής από 0-3 λεπτά, στη συνέχεια 2,5 μΐ ανά λεπτό από 3-8.1 λεπτά), 5% D → 38% D (8,1 έως 40 min), 38% D → 80% Α (41-44 λεπτά), το 80% D → 5% D (44-49 λεπτά) (αρχικές συνθήκες). ρυθμός ροής ήταν 2,5 μΙ /λεπτό κατά τη διάρκεια της βαθμίδος, και ένα ίσο ροή του διαλύματος μήτρας MALDI προστέθηκε μετά τη στήλη (7 mg /ml ανακρυσταλλώθηκε CHCA (α-κυανο-υδροξυκινναμωμικού οξέως), 2 mg /ml φωσφορικό αμμώνιο, 0,1% τριφθοροξικό οξύ, 80% ακετονιτρίλιο). Το συνδυασμένο εκλουστικό αυτόματα εντοπίστηκε σε ένα από ανοξείδωτο χάλυβα MALDI πλάκα στόχο κάθε 6 δευτερόλεπτα (0,6 μl ανά σημείο), για συνολικά 370 σημεία ανά αρχικό κλάσμα SCX.

Φασματομετρίας Μάζας Ανάλυση

Η δείγμα κηλίδες στέγνωσαν και βαθμονόμησης κηλίδες (ABI 4700 Mix) προστίθενται σε κάθε πλάκα με το χέρι. Οι πλάκες MALDI στόχου (15) αναλύθηκαν σε έναν τρόπο που εξαρτάται από τα δεδομένα σε έναν ΑΒΙ 5800 MALDI TOF-TOF μετά τη βαθμονόμηση. φασματομετρία μάζας φάσματα (MS) αποκτήθηκαν από κάθε σημείο του δείγματος χρησιμοποιώντας το πρόσφατα επικαιροποιημένο προεπιλεγμένη βαθμονόμηση, χρησιμοποιώντας 500 βολές λέιζερ ανά σημείο. Μια ερμηνεία πλάκα σε επίπεδο αυτομάτως εκτελείται για να επιλέξετε την υψηλότερη κορυφή της κάθε παρατηρούμενη τιμή m /z για τις επόμενες παράλληλα ανάλυση MS /MS. Μέχρι 2500 πυροβολισμούς λέιζερ σε ισχύ του λέιζερ 4200, με τον αέρα που προκαλείται από σύγκρουση διάστασης (CID) αέριο σε 1.2 έως 1.3 × 10

-6 Torr είχαν συσσωρευτεί για κάθε MS /MS φάσμα. Μετά την απόκτηση MS και MS /MS, φάσματα από όλες τις 15 πλάκες στο δείγμα χρησιμοποιήθηκαν για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών και ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο Paragon όπως εφαρμόζεται σε πρωτεΐνη Pilot 4,0 λογισμικού (ΑΒΙ-Sciex) [18]. Τα φάσματα αναζήτηση ενάντια στην ανθρώπινη υποσύνολο (συν κοινή ρυπαντές) της NCBI μη πλεονασματική βάση δεδομένων συνενώνονται με αντιστραφεί «δόλωμα» εκδοχή η ίδια βάση δεδομένων χρησιμοποιώντας την πιο πρόσφατη από αυτές τις βάσεις δεδομένων FASTA, το οποίο λαμβάνεται από το http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/sites/entrez?db=Taxonomy & amp? cmd = αναζήτησης & amp? όρος =. . (Βάση δεδομένων Ref Seq Ανθρωπίνων 20.120.204 αλληλουχίες που περιέχουν 29.766 Ακολουθίες Πρωτεΐνης, συν 389 ρυπαντές κοινό εργαστήριο Οι παράμετροι Pilot Πρωτεΐνη αναζήτηση ήταν: Methyl methanethiosulfonate (mMTS) αλκυλιωμένη υπολείμματα κυστεΐνης, 4-plex τροποποίηση iTRAQ της λυσίνης και το Ν-τελικό άκρο με ένα στοιχείο αναγνώρισης επικεντρωθεί σε βιολογικές τροποποιήσεις και αντικαταστάσεις αμινοξέων χρησιμοποιώντας την ενδελεχή προσπάθεια αναζήτησης. το False Discovery Rate (FDR) εκτίμηση προσδιορίστηκε με ταυτόχρονη αναζήτηση της βάσης δεδομένων συνεχόμενα δόλωμα [19].

Διαδρομή Ανάλυση

Τα δεδομένα που παράγονται από πρωτεομική ανάλυση φασματομετρίας μάζας αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Ingenuity ανάλυση Pathway (ΜΠΒ? Ingenuity συστήματος, πόλη Redwood, CA, www.ingenuity.com) εργαλείο της Γνωσιακής Βάσης της Ingenuity χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό βιολογική λειτουργία και κανονικών μονοπατιών που περιλαμβάνουν και τη συμμετοχή των διαφορικά ρυθμίζονται πρωτεΐνες.. IPA είναι ένα ενημερώνεται τακτικά βάση δεδομένων που χρησιμοποιεί την τρέχουσα γνώση διαθέσιμη στις γονίδια, πρωτεΐνες, φυσιολογική κυτταρική και παθολογικές διαδικασίες, σηματοδότησης και μεταβολικές οδούς, που απαιτούνται για την κατασκευή της οδού.

πρωτεΐνη Προετοιμασία για την επικύρωση

Η PC3 κύτταρα-N2 και PC3-ML2 καλλιεργήθηκαν σε 80% συρροή και αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας 5 mM EDTA σε PBS. Για εκχύλιση πρωτεϊνών, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και λύθηκαν σε τροποποιημένο ρυθμιστικό διάλυμα ΚΙΡΑ [50 mM Tris-HCl (ρΗ 7.4), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton Χ-100, 0.25% δεοξυχολικό νάτριο] που περιέχει μια πρωτεάση κοκτέιλ αναστολέα (Complete, Μίνι, Roche) στους 4 ° C για 15 λεπτά. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε κατεργασία υπερήχων για 1 λεπτό και φυγοκεντρήθηκε στις 14.000 g για 15 λεπτά στους 4 ° C, και το υπερκείμενο συλλέχθηκε. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (BCA Protein Assay Kit, Pierce) από κάθε δείγμα διαχωρίστηκαν σε 4-12% Τπδ-γλυκίνης δωδεκυλοθειϊκού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου με ηλεκτροφόρηση (SDS-PAGE), ακολουθούμενη από μεταφορά κηλίδος Western σε PVDF. Για την ανάλυση Western, ηλεκτροφόρηση οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF, δεσμεύτηκαν με Οδύσσεια Ρυθμιστικό Δέσμευσης (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, ΡΑ), ανιχνεύθηκαν με τα πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Μετά την πλύση, οι μεμβράνες επωάστηκαν με τα αντίστοιχα συζευγμένα IRDye δευτερογενή αντισώματα και κατέστη ορατή χρησιμοποιώντας ένα σύστημα υπέρυθρης απεικόνισης Οδύσσεια (Li-ΕΤΠ Βιοεπιστημών, Λίνκολν, Νεμπράσκα).

η επιμόλυνση και κατασιγάσει του Plectin και βιμεντίνης από siRNA

siRNA δίπολα χρησιμοποιήθηκαν για να φιμώσουν plectin και βιμεντίνη έκφρασης. Ένα μη-στόχευσης 20-25 siRNA duplex χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. SiRNA διπόλων διαμολύνθηκαν στην PC3 κυτταρικές σειρές με το αντιδραστήριο διαμόλυνσης siRNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Μετά την επιμόλυνση για 72 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε στύπωμα Western και ανάλυσης ανοσοφθορισμού για την ανίχνευση της αποτελεσματικότητας των βιμεντίνη και plectin knockdown και να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα της knockdown για την μετανάστευση και την επεμβατική ιδιότητες των κυττάρων.

Συνεστιακή Μικροσκοπία Ανάλυση

κύτταρα PC3-Ν2 και PC3-ML2 σπάρθηκαν πάνω σε πλάκες 6-φρεατίων που περιέχουν καλυπτρίδες από γυαλί και καλλιεργήθηκαν σε 10% FBS /DMEM για 2 ημέρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS, μονιμοποιήθηκαν με παγωμένη μεθανόλη για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, τα στερεωμένα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και βάφτηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα ενάντια plectin, βιμεντίνη, και CDK2 όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Τα πρωτογενή αντισώματα απομακρύνθηκαν και τα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS πριν από χρώση με Alexa Fluor συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. TOPRO λεκέ περιλήφθηκε με τα δευτερογενή αντισώματα για την πυρηνική χρώση. Τα δευτερογενή αντισώματα και πυρηνική λεκέδες πλένονται μακριά και οι καλυπτρίδες τοποθετούνται στις διαφάνειες με μέσο διάνυσμα Ασπίδα περιέχει DAPI χρώση (Vector Labs, Burlingame, CA), και σφραγισμένο με βερνίκι νυχιών. Φθορίζουσες εικόνες εξετάστηκαν και κατέλαβε χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο (Carl Zeiss, Thornwood, NY).

κυτταρικού πολλαπλασιασμού Δοκιμασία

κύτταρα PC3-N2 και PC3-ML2 σε πιάτα 24 φρεατίων σε πυκνότητα 2 × 10

4 κύτταρα και τα επιμολυσμένα με μη στόχευση και plectin /βιμεντίνης ειδικές siRNA σε μια τελική συγκέντρωση 20 ηΜ. Τόσο επισυνάπτεται και επιπλέοντα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από φυγοκέντρηση χαμηλής ταχύτητας και θρυψίνωση. Τα κύτταρα βάφτηκαν με Trypan blue, και ο αριθμός των Trypan blue-θετικά κύτταρα μετρήθηκαν τις ημέρες 2, 4, 6 μετά την επιμόλυνση.

ξυστό Δοκιμασία /Επούλωση Invasion Δοκιμασία

Η μετανάστευση ικανότητα των δύο κυτταρικών γραμμών, αξιολογήθηκε με δοκιμασία επούλωση του τραύματος. Εν συντομία, τα κύτταρα PC3-Ν2 και PC3-ML2 απλώθηκαν σε 6-φρεατίων σε μία πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα και επιμολύνθηκαν με μη στόχευση και plectin /βιμεντίνης ειδικές siRNA σε μια τελική συγκέντρωση των 20 ηΜ για 72 ώρες. Μια τεχνητή πληγή δημιουργήθηκε προσεκτικά σε 0 h με ρύγχος πιπέτας 200 μl για να χαράξει το μονοστοιβάδα συρρεόντων κυττάρων εις τριπλούν για κάθε κατάσταση. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και καλλιεργήθηκαν σε 10% FBS-DMEM σε 5% CO2 και 37 ° C. Μια φωτομικρογραφία ελήφθη αμέσως μετά το ξύσιμο (χρόνος 0 ώρες) και 24 ώρες αργότερα κάτω από 10 × αντικειμενικό φακό χρησιμοποιώντας ανεστραμμένο Zeiss AxioObserver.A1 μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (Zeiss, Oberkochen, Germany). Οι αποστάσεις της μετανάστευσης στις τριπλούν φρεάτια μετρήθηκαν και ο μέσος και το τυπικό σφάλμα τιμές σε σύγκριση μεταξύ του ελέγχου και της plectin και vimentin νοκ ντάουν κύτταρα.

Trans καλά Αναλύσεις Μετανάστευσης

Για τη διερεύνηση της εισβολής των οι δύο κυτταρικές σειρές, ένα σύστημα καλλιέργειας εισβολή μεμβράνη χρησιμοποιείται ως ακολούθως. Κύτταρα τα οποία προεπεξεργασία με siRNA ελέγχου ή βιμεντίνη και plectin siRNAs στερήθηκαν τροφής όλη τη νύκτα σε ϋΜΕΜ μέσο με 0.5% FBS, στη συνέχεια, θρυψινοποιήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε DMEM που περιέχει 0.5% αλβουμίνη βόειου ορού. Κύτταρα (1 χ 10

5) προστέθηκαν στην αρχή θαλάμους των πλακών 24 φρεατίων transwell (Corning, 8 μm μέγεθος πόρου), και DMEM με 10% FBS και LPS προστέθηκε στους θαλάμους πυθμένα. Κάτω θάλαμοι πληρώθηκαν με μέσο καλλιέργειας που περιέχει είτε 0.5% FBS ως έλεγχος ή που περιέχει 10% LPS ως προσελκυστικό. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Στο τέλος της περιόδου επώασης, η άνω επιφάνεια της μεμβράνης σκουπίζεται με ένα applicator βαμβάκι-tip για την απομάκρυνση μη-μεταναστευτικά κύτταρα. Τα κύτταρα που μετανάστευσαν στην κάτω πλευρά της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη για να απεικονίσει πυρήνες. Τα κύτταρα ποσοτικοποιήθηκαν μετρώντας πέντε πεδία υψηλής ισχύος κάτω από 100 × μεγέθυνση, και τα μέσα για κάθε θάλαμο προσδιορίστηκαν εις τριπλούν. Ποσοστό εισβολή παρουσιάστηκε ως μέσος αριθμός κυττάρων που μεταναστεύουν διαμέσου της μεμβράνης για την plectin και βιμεντίνης σιγήσει κυττάρων σε σχέση με το μη-στόχευσης siRNA.

Συσχέτιση Plectin και βιμεντίνης Expression χρησιμοποιώντας ανθρώπινα Proteome Atlas

η ανθρώπινη πρωτεΐνη βάση δεδομένων Atlas εμφανίζει η έκφραση και ο εντοπισμός πρότυπα των πρωτεϊνών σε ένα μεγάλο μέρος των ανθρώπινων ιστών και οργάνων με έμφαση στις στρατηγικές για την επικύρωση των προτύπων έκφρασης πρωτεΐνης ανοσοϊστοχημεία βάση για την έρευνα για τον καρκίνο έργα. Οι απώτεροι στόχοι του έργου περιλαμβάνουν τη δημιουργία μιας βάσης δεδομένων με πληροφορίες των προτύπων έκφρασης πρωτεΐνης σε κανονικούς ανθρώπινους ιστούς, στα κύτταρα και στον καρκίνο, και αξιοποιώντας δημιουργούνται αντισώματα και τα δεδομένα της έκφρασης της πρωτεΐνης ως εργαλεία για τον εντοπισμό κλινικά χρήσιμη βιοδείκτες [20], [21] .Η βάση δεδομένων περιέχει εικόνες υψηλής ανάλυσης σχολιασμένο από Ορκωτό παθολόγους. Η ανθρώπινη πρωτεΐνη Atlas χρησιμοποιήθηκε για την διαλογή για την έκφραση του plectin και βιμεντίνης εστιάζοντας στην ανοσοϊστοχημεία του φυσιολογικού και καρκινικού προστατικού ιστού. Οι συγκριτικές αναλύσεις, σε συνδυασμό με τα δεδομένα που δημιουργούνται στην παρούσα μελέτη θα αποτελέσει τη βάση των μελλοντικών υπόθεση οδηγείται έρευνες του ρόλου των πρωτεϊνών αυτών στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη της νόσου.

Στατιστική Ανάλυση

Κάθε ένα από Αυτά τα πειράματα διεξήχθη εις τριπλούν. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (S.E.M.). Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας SPSS 13.0 στατιστικού λογισμικού (SPSS, Inc. Chicago, IL, USA).

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

Αναγνώριση των διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών σε PC3-Ν2 και PC3-ML2 Γραμμές κυττάρων Χρήση iTRAQ Σήμανση και 2D LC-MS /MS

Έχουμε αναλύσει την proteome των συγγενικών καρκίνου του προστάτη κυττάρων PC3-N2 και PC3-ML2 από 2D LC-MS /MS χρησιμοποιώντας iTRAQ, να παράγουν δεδομένα των διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών. Η συνολική πειραματική ροή εργασίας παρουσιάζεται στη συμπληρωματική Εικόνα S1. Ένα σύνολο από 1756 μη περιττές πρωτεΐνες επανειλημμένα τα οποία προσδιορίζονται από δύο αντίτυπα επισήμανση iTRAQ και 2Δ αναλύσεις LC-MS /MS, εκ των οποίων το 95% εντοπίστηκαν με & gt? 2 αγώνες πεπτιδίου. Το ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) για την ταυτοποίηση των πρωτεϊνών με βάση την αναζήτηση κατά ενός αντιστραφεί βάση δεδομένων ήταν 1%. Οι λεπτομερείς πληροφορίες, συμπεριλαμβανομένων πληροφοριών αλληλουχιών πεπτιδίου, ημερομηνία ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών, μέση αναλογία iTRAQ, και διακριτή και κοινές πεπτίδια με μια ομάδα πρωτεϊνών για αυτές τις ταυτοποιημένες πρωτεΐνες φαίνεται στον Πίνακα S1. Για την ταυτοποίηση διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών σε PC3-Ν2 και PC3-ML2 που μπορεί να σχετίζονται με την εισβολή και μετάσταση, συγκρίθηκαν τα προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών. Οι πρωτεΐνες που πληρούν τα ακόλουθα κριτήρια αυτοπεποίθηση θεωρείται ως διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών: (i) πρωτεΐνες επανειλημμένα προσδιορίζεται από τα πειράματα εις διπλούν? (Ii) οι πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν με βάση on≥2 πεπτίδια? (Iii) πρωτεΐνες έδειξαν μια μέση αναλογία φορές change≥1.5 or≤0.667 στα διπλούν πειράματα μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών (

t

δοκιμής,

ρ

& lt? 0,05). Χρησιμοποιώντας αυτά τα κριτήρια, 130 πρωτεΐνες βρέθηκαν να εκφράζονται διαφορικά σε PC3-N2 και τα κύτταρα PC3-ML2. Από αυτές τις πρωτεΐνες, 62 βρέθηκαν να είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα ενώ 68 ρυθμισμένα προς τα κάτω. Τα ονόματα αυτών των 130 πρωτεϊνών και τα επίπεδα έκφρασής τους φαίνονται στον Πίνακα S1. Μερικά από τα MS /MS φάσματα που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό και την ποσοτικοποίηση των PLEC1 και VIM με σημαντικά υψηλή αναλογία φορές αλλαγές στα κύτταρα PC3-ML2 σε σύγκριση με PC3-N2 γραμμές φαίνονται στα Σχήματα 2Α και S S 2Β. Το φάσμα MS /MS για GAPDH που δεν είχαν φορές αλλαγές στις δύο κυτταρικές γραμμές φαίνεται στο Σχήμα S 2C. EphA2 είναι ένα παράδειγμα μιας πρωτεΐνης η οποία ρυθμίζεται προς τα κάτω σε PC3-ML2 vs PC3-Ν2 και αυτό φαίνεται στο σχήμα S 2D. Ένα υψηλό σύμπτωση παρατηρήθηκε μεταξύ των δύο εντάσεων ιόντων ρεπόρτερ για ένα δεδομένο πεπτίδιο για σχεδόν όλα τα πεπτίδια που προσδιορίζονται. Η μέση πολλαπλή μεταβολή για μία πρωτεΐνη ελήφθη με τη χρήση όλων των πεπτιδίων εντοπισμό αυτής της πρωτεΐνης. Ως εκ τούτου ταυτοποιήσεις πρωτεΐνη μας και ποσοτικοποίηση είναι συνεπείς και υψηλής εμπιστοσύνης. Αυτό το υποσύνολο των 130 διαφορικά ρυθμίζονται πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκε για όλα τα μετέπειτα ανάλυση βιοπληροφορικής, βιολογικών σχολιασμούς και ερμηνεία.

Διαδρομή Ανάλυση

Χρησιμοποιώντας το λογισμικό Ingenuity τα διαφορικά ρυθμίζονται πρωτεΐνες αποδίδεται υποκυτταρικό εντοπισμό, μοριακή και κυτταρικές λειτουργίες, και η πιθανή εμπλοκή τους σε ασθένειες και διαταραχές. Σχήματα 1Α, Β και Γ εμφανίζουν υπο-κυτταρικό εντοπισμό τους, κυτταρική και μοριακή τις λειτουργίες τους, καθώς και των κύριων νόσων και διαταραχών που εκπροσωπούν αντίστοιχα. Οι πίνακες S2 και S3 συνοψίσει τις διαφορετικές λειτουργικές κατηγορίες και σ αξίες τους. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι διαφορικά ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες μεταξύ των δύο συγγενικά κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη εμπλέκονται κυρίως στον καρκίνο, δερματολογική πάθηση, γενετικές διαταραχές, γαστρεντερικές παθήσεις, και ανοσολογικών ασθενειών. Χρησιμοποιώντας το εργαλείο γνωστικής βάσης ΙΡΑ, έχουμε εντοπίσει τα κορυφαία δίκτυα και κανονικών μονοπατιών που υποδεικνύουν τις κύριες πιθανές λειτουργίες των πρωτεϊνών που εκφράζονται διαφορικά σε δύο κυτταρικές σειρές. Όπως υποδεικνύεται στον Πίνακα S4 και το Σχήμα S3, η κορυφή του δικτύου είναι η μορφολογία των κυττάρων, την ανάπτυξη του συνδετικού ιστού και τη λειτουργία, και την κυτταρική κίνηση.

Ingenuity ανάλυση βάση γνώσεων χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η υπο-κυτταρικό εντοπισμό, μοριακή και βιολογικές λειτουργίες και παθολογικές διεργασίες που σχετίζονται με τις πρωτεΐνες που ρυθμίζονται διαφορικά μεταξύ PC3-N2 και τα κύτταρα PC3-ML2. Οι αριθμοί των πρωτεϊνών φαίνεται στο x-άξονα και στους πίνακες S2 και S3.

Η

Εκκαθάριση των διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών προσδιορίζονται από Πρωτεομική

Μεταξύ των 130 πρωτεΐνες με αλλοιωμένη έκφραση, εμείς επικεντρώθηκε σε δύο πρωτεΐνες plectin και βιμεντίνης, η οποία ήταν πολύ σημαντικά υπερεκφράζεται σε PC3-ML2 vs PC3-Ν2. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασής τους δεν έχουν καλά μελετηθεί σε καρκίνο του προστάτη. Κηλίδωση Western Διεξήχθη για την ανίχνευση των εκφραστική επίπεδα των δύο πρωτεϊνών σε πειράματα εις τριπλούν. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, PLEC1 και τα επίπεδα έκφρασης VIM έχουν αυξηθεί σημαντικά σε PC3-ML2 vs PC3-N2, το οποίο είναι συμβατό με δεδομένα MS ανάλυση. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης plectin κανονικοποιημένη και βιμεντίνης με επίπεδο GAPDH αναγράφεται δίπλα στην κηλίδωση Western εικόνας. Σε συμπληρωματικές αναλύσεις, ανιχνεύσεις ανοσοφθορισμού επαληθεύει αποτελεσματική χτυπήσει κάτω του plectin και περαιτέρω επικυρώνει τα δεδομένα φασματομετρίας μάζας, όπως φαίνεται στο Σχήμα 3 πάνελ Α, όπου η ένταση της plectin χρώσης φαίνεται να είναι σημαντικά υψηλή έκφραση σε PC3-ML2 σε σύγκριση με PC3-Ν2. Το ίδιο παρατηρήθηκε για τις βιμεντίνη knockdown κυττάρων (Σχήμα S4)

Σύνολο κυτταρολύματα (40 μα) των κυττάρων Ν2 και ML2 υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE. Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν με ανάλυση στυπώματος Western για την ανίχνευση plectin και βιμεντίνη όπως περιγράφεται. ανίχνευση GAPDH συμπεριλήφθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με έλεγχο siRNA ή ειδικού γονιδίου Plectin siRNA για 3 ημέρες και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν, επωάστηκαν με πολυκλωνικό κουνελιού αντι-plectin και μονοκλωνικά αντι-CDK2 πρωτογενούς αντισώματα πριν από την «κηλίδωση» με δευτερογενή αντισώματα Alexa Fluor συζευγμένο γαϊδάρου αντι-κουνελιού (πράσινο), δευτερογενή αντισώματα αντι-ποντικού αιγός (κόκκινο) και η πυρηνική χρώση TOPRO (μπλε). Πίνακας Α δείχνει τις εικόνες για siRNA ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα και τα πάνελ Β δείχνει τα επιμολυσμένα κύτταρα Plectin siRNA.

Η

Plectin και βιμεντίνης Νοκ ντάουν αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των PC3-ML2 Γραμμές κυττάρων

Εμείς εξέτασε κατά πόσον plectin και βιμεντίνης συμβάλλουν στην πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη χρησιμοποιώντας την τεχνική RNAi. Μετά την εισαγωγή του plectin και βιμεντίνης siRNA σε κύτταρα PC3-ML2 για 72 ώρες, η καταστολή της plectin και βιμεντίνης επιβεβαιώθηκαν με κηλίδωση Western, ενώ το siRNA ελέγχου μη-στόχευση δεν είχε σημαντική επίδραση στην ενδογενή plectin και έκφραση βιμεντίνης (Σχήμα 4). Η έκφραση του plectin και βιμεντίνης μειώθηκαν κατά 72% και 99,9% αντίστοιχα, σε σύγκριση με τους ελέγχους (

ρ

& lt? 0,05). Η σχετική έκφραση GAPDH στους ελέγχους και plectin /vimentin στοχευμένες knockdowns siRNA είναι πανομοιότυπα. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων PC3-ML2 εξετάστηκε με κύτταρο μετρώντας 2-6 ημέρες μετά τη θεραπεία siRNA. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η πολλαπλασιασμό των κυττάρων μειώθηκε σημαντικά τόσο από plectin και βιμεντίνης knockdown (Σχήμα 5). Δεδομένα από συμπληρωματικές δοκιμασίες δεν δείχνουν σημαντικές διαφορές στην βιωσιμότητα και των δύο κυτταρικών σειρών (Εικόνα S5).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με έλεγχο siRNA, plectin ή γονίδιο βιμεντίνη συγκεκριμένες siRNA. λύματα Σύνολο κυττάρων (40 μg) των κυττάρων ML2 υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE. Οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν με ανάλυση στυπώματος Western για την ανίχνευση plectin και βιμεντίνη όπως περιγράφεται.